CN109212188A - 一种便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）该试剂盒主要由ProGRP校准品、包被ProGRP抗体的磁微粒混悬液、辣根过氧化物酶标记的ProGRP酶结合物和ProGRP样品稀释液组成。本发明可辅助用于肺癌，特别是小细胞肺癌的早期诊断、疾病进程监测及治疗效果评价等。本发明提供的试剂盒有两个优点：1、检测样本在2～8℃可以稳定保存5天，保存时间显著长于市面上的同类试剂盒，更便于临床应用；2.校准品是液态的，避免了因校准品复溶引入的检测误差，检测结果更准确，更便于临床应用。

Description

一种便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测领域，尤其是涉及一种便于临床应用的胃泌素释放肽前体（ProGRP）含量测定的试剂盒。
背景技术
胃泌素释放肽（GRP）是由McDonald等在1978年从猪的胃组织细胞中分离出的一种具有促胃泌素分泌作用的胃肠道激素，由27个氨基酸组成，是有效的促分泌素或调节肽，广泛分布于哺乳动物的胃肠道神经系统和肺呼吸道。肺癌的癌细胞本身亦可产生并分泌GRP，以自分泌的方式调节自身的生长，并且也可以通过局部弥散的方式与周围的肿瘤细胞膜上相应的受体结合，刺激肿瘤的生长。低水平GRP即可刺激小细胞肺癌（SCLC）细胞DNA合成，因而GRP被认为是SCLC的自主生长因子。但由于GRP很容易被肽链端解酶快速降解，活性部分在血液中不稳定，半衰期＜3分钟，从血液中直接提取可靠的GRP较困难，因而难以在临床上应用。
ProGRP是GRP的前体结构，普遍存在于非胃窦组织神经纤维脑和肺的神经内分泌细胞中，ProGRP根据其部分氨基酸的变异，可分为3种生物大分子，它们具有共同的羧基末端序列31～98序列片段，能够在血液中稳定表达ProGRP，半衰期19～28h，是GRP基因编码的产物。
研究证实，ProGRP羧基末端31～98序列片段水平能够代表GRP水平和GRP基因表达，是一种新的肿瘤标志物。特别针对于小细胞型肺癌，ProGRP和NSE（神经元特异性烯醇化酶）检测SCLC的敏感性分别为73%和60%，特异性分别为98%和92%，相比较NSE诊断早期SCLC的敏感性仅36%，而ProGRP诊断早期SCLC的敏感性可达63%。故通过动态监测，可辅助判断疾病的进程、治疗效果和复发。
在临床上，样本首次检测后，一般会在2～8℃冷藏保存3～5天，以便结果异常时对样本进行复测。然而，目前国内外知名的体外诊断试剂生产商提供的ProGRP检测试剂盒对检测样本的保存时间要求非常苛刻，给临床检测造成了很大的不便。如雅培公司的ProGRP检测试剂盒说明书规定，在2～8℃血清样本只能保存3h，血浆样本也只能保存24h，超过规定时间，检测结果会不同程度的较真值偏低。此外，其说明书还规定样本不能使用含促凝剂的采血管，否则检测结果也会偏低。康乃格公司的ProGRP检测试剂盒只检测血清样本，其说明书规定，在2～8℃血清样本只能保存24h。而且其试剂盒采用的酶联免疫法，反应时间较长（2.5h），操作相对繁琐。罗氏公司的ProGRP试剂盒说明书规定，其样本在2～8℃可以保存72h，基本可以满足临床的需求。但是，作为进口试剂盒，其价格较为昂贵，成本较高。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术所存在的缺陷，提供了一种便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，使用该试剂盒，检测样本可在2～8℃保存5天，大大方便了临床操作。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，包括如下组分： ProGRP校准品、包被ProGRP抗体的磁微粒混悬液、辣根过氧化物酶标记的ProGRP酶结合物和ProGRP样品稀释液。
所述包被抗体和酶标抗体均为单克隆抗体或多克隆抗体，针对的ProGRP位点不同。
所述ProGRP校准品是将ProGRP抗原按照一定浓度溶解在校准品稀释液中，配制成浓度在0～5000pg/mL之间的6个不同浓度点。
所述磁微粒混悬液中的磁微粒是由ProGRP抗体按照0.2～0.8ug/T包被而成。
所述ProGRP酶结合物是由辣根过氧化物酶标记的ProGRP抗体与酶结合物稀释液按照1/1000~1/5000的比例稀释制成。
所述酶结合物稀释液为PH 7～8的Tri-NaCl缓冲液，其中含有Proclin300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的防腐剂，含有酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上的蛋白质类稳定剂。
所述样品稀释液为PH7～8的PBS缓冲液，其中含有Proclin300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的防腐剂，含有酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上的蛋白质类稳定剂，含有Trotion X-100、Tween20、Tween60或辛基酚聚氧乙烯醚中的一种或两种以上的表面活性剂。
所述样品稀释液中还包括0.01%～0.05%的阻断剂，用于消除反应过程中嗜异性抗体干扰引起的假阳性或假阴性。
本发明采用夹心法原理进行检测。用ProGRP抗体包被磁微粒，辣根过氧化物酶标记ProGRP抗体制备酶结合物，通过免疫反应形成抗体—抗原—抗体—酶复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与ProGRP的含量成正比。
本发明试剂盒可辅助用于肺癌，特别是小细胞肺癌的早期诊断、疾病进程监测及治疗效果评价等。本发明提供的试剂盒有两个优点：1、检测样本在2～8℃可以稳定保存5天，保存时间显著长于市面上的同类试剂盒，更便于临床应用；2. 校准品是液态的，避免了因校准品复溶引入的检测误差，检测结果更准确，更便于临床应用，且使用成本较低。
附图说明
图1是本发明试剂盒与现有试剂盒的相关性对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释和说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本实施例中所用的试剂和仪器均为市售产品，所用的检测方法为本领域常规方法。
实施例1 制备胃泌素释放肽前体检测试剂盒
1、制备磁微粒混悬液
1.1 取30ul混匀后的磁微粒原液用300ul的PBS缓冲液洗涤5次；
1.2 用20mg/ml的偶联剂对磁微粒活化2小时；
1.3 用PH4～5 的MES缓冲液将活化后的磁微粒洗涤2次；
1.4 按照0.3ug/测试的量加入抗体，包被2小时；
1.5 用5 mol/L的乙醇胺终止反应1h；
1.6 用封闭液封闭3次；
1.7 加入3ml封闭液保存。
所用的封闭液由0.01M的PH7～8的PBS缓冲液配制，其中含有1～3‰（w/v）的防腐剂（可采用Proclin 300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的混合物），1～3‰（w/v）的蛋白质类稳定剂（可采用酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物）和5～15%（w/v）的甘油。
2、制备酶结合物溶液
酶结合物稀释液由0.05M的PH7～8的Tris-NaCl缓冲液配制，其中含有1～3‰（w/v）的防腐剂（可采用Proclin 300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的混合物），1～3‰（w/v）蛋白质类稳定剂（酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物），0.1-0.5‰的胭脂红色素。
将由辣根过氧化物酶标记的ProGRP抗体按照体积比1:1000~1:5000的比例稀释到酶结合物稀释液中，得到酶结合物溶液备用。
3、制备校准品和质控品
用校准品稀释液将ProGRP纯品依次稀释为浓度0pg/mL、20pg/mL、80pg/mL、400pg/mL、1250pg/mL、5000pg/mL，分别记为校准品S0、S1、S2、S3、S4、S5；同样，用校准品稀释液将ProGRP纯品稀释为100pg/mL、500pg/mL，记为质控品Q1、Q2。
校准品稀释液由0.05M的PH7～8的Tris-NaCl缓冲液配制，其中含有1～3‰（w/v）的防腐剂（可采用Proclin 300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的混合物），1～3‰（w/v）蛋白质类稳定剂（可采用酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物），0.1~0.5‰的日落黄或柠檬黄色素。
4、制备样品稀释液
样品稀释液是由0.01M的PH7～8的PBS缓冲液配制，其中含有1～3‰（w/v）的防腐剂（可采用Proclin 300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的混合物），1～3‰（w/v）蛋白质类稳定剂（可采用酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物），1~5‰（w/v）的表面活性剂（可采用Trotion X-100、Tween20、Tween60或辛基酚聚氧乙烯醚中的一种或两种以上混合物），0.1-0.5‰的果绿色素。
实施例2 用于本试剂盒测试的样本保存时间
将2~8℃保存的样本分别在第0天、第1天、第2天、第3天、第5天、第7天采用本发明试剂盒进行测试，将第1天、第2天、第3天、第5天、第7天样本测得的值与第0天的作对比，见下表1：
表1
由表1数据可以看出，前5天样本降幅均小于10%，说明用于本发明试剂盒测试的样本可保存5天。
实施例3 本发明试剂盒的性能评价
1、灵敏度检测
LoB，准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；LoD，准备5份浓度范围为1~4倍LOB的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；FS：采用LoD实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、SD和CV%，最接近20%的浓度为功能灵敏度，结果见表2；
表2
从表2结果可以看出，第一批能够准确检测出的浓度是4.125pg/mL，第二批能够准确检出的浓度是4.376pg/mL，均满足要求。
2、精密度测试
取两批试剂进行精密度实验，分别用配套质控品高/中/低值样本和临床高/中/低值样本，各测20次计算测定浓度的变异，测定结果如图表3、表4所示。
表3
表4
表3、表4结果表明，变异系数均小于7%。
3、准确度测定
本项目暂无国家或国际标准品，采用回收试验的方法评价试剂盒的准确度。10份在线性范围内的血清高值，用接近0值的混合血清样本按照1:9的比例混合，求回收率；
表5
由表5结果可以看出，回收率在85%～115%之间，均满足要求。
4、特异性测定
内源性（血红蛋白、胆红素）干扰
准备高低值样本各一份，高值浓度约为1000pg/mL，低值浓度约为95pg/mL。血红蛋白分别用高值和低值样本配制（1000、500、400、300、200、0）mg/dL六个浓度梯度；甘油三脂分别用高值和低值样本配制（5000、4000、3000、2000、1000、0）mg/dL六个浓度梯度；胆红素需先溶到二甲基甲砜（DMSO）中，分别用高值和低值样本配制（60、50、40、30、20、0）mg/dL六个浓度梯度，并做DMSO对照实验，每个浓度分别重复三次一天内完成考核两批；结果见表6、表7、表8：
表6
表7
表8
由表6、表7、表8可以看出，当血红蛋白浓度≤500mg/dl时干扰＜10%，当甘油三脂浓度≤3000mg/dl时干扰＜10%，当胆红素浓度≤50mg/dl时干扰＜10%。
5、临床性能考核
用本发明试剂盒和国外罗氏试剂盒同时测量257例临床样本，结果如图1和表9所示。
表9
与罗氏阳性符合率达到96.95%，阴性符合率达到94.44%，总符合率达到95.72%；与罗氏相关性：y=0.9886x+3.3637，r2=0.9835，说明本试剂盒可以用来对小细胞肺癌肿瘤标志物ProGRP进行检测，同时本发明试剂盒检测的样本可保存5天，要优于目前市面上的ProGRP检测试剂盒。

Claims (8)

1.一种便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括如下组分： ProGRP校准品、包被ProGRP抗体的磁微粒混悬液、辣根过氧化物酶标记的ProGRP酶结合物和ProGRP样品稀释液。
2.根据权利要求1所述的便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗体和酶标抗体均为单克隆抗体或多克隆抗体，针对的ProGRP位点不同。
3.根据权利要求1所述的便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述ProGRP校准品是将ProGRP抗原按照一定浓度溶解在校准品稀释液中，配制成浓度在0～5000pg/mL之间的6个不同浓度点。
4.根据权利要求1所述的便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述磁微粒混悬液中的磁微粒是由ProGRP抗体按照0.2～0.8ug/T包被而成。
5.根据权利要求1所述的便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述ProGRP酶结合物是由辣根过氧化物酶标记的ProGRP抗体与酶结合物稀释液按照1/1000~1/5000的比例稀释制成。
6.根据权利要求5所述的便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述酶结合物稀释液为PH 7～8的Tri-NaCl缓冲液，其中含有Proclin300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的防腐剂，含有酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上的蛋白质类稳定剂。
7.根据权利要求1所述的便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为PH7～8的PBS缓冲液，其中含有Proclin300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的防腐剂，含有酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上的蛋白质类稳定剂，含有Trotion X-100、Tween20、Tween60或辛基酚聚氧乙烯醚中的一种或两种以上的表面活性剂。
8.根据权利要求1所述的便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液中还包括0.01%～0.05%的阻断剂。
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