CN103344770B - 牛布鲁氏菌间接elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，由以下试剂构成：（1）预包被ELISA反应板，由包被液、包被抗原和封闭液构成，包被抗原为Virb8蛋白；（2）PBST洗涤液；（3）酶标二抗；（4）终止液；（5）显色液。本发明涉及的Virb8蛋白仅在布鲁氏菌感染的早期特异性表达，该蛋白对应产生的抗体处于感染早期，且产生的抗体存在时间较长，因此，克隆表达布鲁氏菌Virb8蛋白并建立相应的间接ELISA检测方法能够更特异、灵敏地判断是否存在布鲁氏菌感染和定量感染后引起的抗体滴度，可以为布鲁氏菌病的血清学早期诊断提供一种快速准确的方法，对解决大批量样品的布鲁氏菌现场检测技术具有重要的现实意义。

Description

牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，属于生物技术和兽医学领域。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人兽共患的传染病，在全世界范围内呈明显流行趋势，对人类健康和公共卫生构成了巨大的威胁和损害。相关研究表明，布鲁氏菌毒力基因Virb8蛋白是布鲁氏菌感染的早期特异性蛋白，位于布鲁氏菌细胞膜外，可引起机体早期的体液免疫反应。

在布病检测的实际操作中，传统的虎红平板凝集试验，试管凝集试验操作要求比较严格，灵敏度也比较低，而ELISA方法具有快速定性和定量、灵敏度高、适用范围广、结果判定客观、成本低和可同时进行数千份样品的检测等优点。虽然,已有针对平滑型布鲁氏菌脂多糖建立起来的竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒（公开号为CN101592661A的中国发明专利申请），但该方法基于脂多糖，抗体产生后存在时间较短，而且竞争ELISA在诊断中仅能够对是否感染布鲁氏菌进行定性判断。

发明内容

针对上述现有技术，本发明公开了一种牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，可用于牛布鲁氏菌的批量、快速血清学检测，具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，由以下试剂构成：

（1）预包被ELISA反应板：数量为5块，处理方法为：取100μl用包被液稀释至工作浓度的包被抗原加入ELISA板的反应孔中，4℃过夜包被后，用110μl封闭液37℃封闭2小时；包被液中，Na₂CO₃的浓度为1.59g/L，2.93g NaHCO₃的浓度为2.93g/L，制备方法为：将1.59gNa₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后（用1M的氢氧化钠溶液调整），加去离子水定容为1L，即得；包被抗原为Virb8蛋白，工作浓度为1.16μg/mL，工作条件为4℃包被过夜；封闭液为10%马血清（体积分数）；

（2）25倍PBST洗涤液：体积为60ml，同时也作为样品稀释液；体积为1L的25倍PBST洗涤液制备方法为：将准确称量的200g NaCl、5.0g KCl、35.5g Na₂HPO₄和6.75g KH₂PO₄充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7.4（通过滴加1M盐酸的方式调pH），然后加去离子水定容至1L，再加入500μL Tween-20，即得；

（3）酶标二抗：体积为60μl，辣根过氧化物酶HRP标记兔抗牛IgG，工作浓度为1:1000，已根据原浓度做1:12稀释；工作条件为：37℃孵育60min；

（4）终止液：体积为60ml，2mol/L的硫酸溶液；制备方法为：10.87mL的浓硫酸与89.13mL的去离子水混合，配制成2M的H₂SO₄溶液；

（5）显色液：体积为60ml的TMB显色液。

所述（1）中包被抗原的制备方法为：

从牛布鲁氏菌S2弱毒疫苗（购自中国兽医药品监察所，商品名称为S2疫苗）中提取菌体DNA作为模板，利用设计合成的特异性引物（见实施例2），对布鲁氏菌进行Ⅳ型分泌系统Virb8基因的PCR扩增，并将目的基因回收连接到T载体转化DH5α大肠杆菌；测序鉴定后，将Virb8基因连接到pET-32a(+)质粒（该质粒为现有技术中已有的常规质粒）中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化目的蛋白（布鲁氏菌Virb8蛋白），通过Western-blotting对蛋白进行鉴定,用紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度。

利用上述牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒检测的方法如下：

（1）洗涤液与样品稀释液的准备：将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水作25倍稀释后备用；

（2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准阳性孔和标准阴性孔以及待测样品孔；将标准阳性血清、标准阴性血清和样品血清按1:1500稀释后，在酶标包被板的反应孔内准确加样100μl，空白孔直接加100μl样品稀释液；加样时，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，加样后，轻轻晃动混匀；

（3）温育：用封板膜封板后置37℃温育1小时；

（4）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加300μl洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

（5）酶标二抗的稀释：根据实验需要计算用量，用PBST将酶标二抗按1:1000稀释后备用，需现用现配；

（6）加入二抗：每孔加入100μl稀释好的酶标二抗，空白孔除外；

（7）温育：操作同（3）；

（8）洗涤：操作同5；

（9）显色：每孔先加入100μl TMB显色剂，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

（10）终止：每孔加100μl终止液，终止反应（此时蓝色立转黄色）；

（11）测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）；测定应在加终止液后15分钟以内进行；

结果判定：标准阳性血清OD_450nm值大于1.0，标准阴性血清OD450nm值小于0.30时，实验结果判定为合格；反之，为不合格，需要重新检测；待测样品的OD450nm值大于0.39时为阳性，小于或等于0.39时为阴性。

本发明的布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒的分析原理是：

酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原（布鲁氏菌Virb8蛋白），加入稀释好的待测样品（血清），样品中的Virb8抗体能够通过抗原抗体反应给合到固相上，再加入酶标二抗。当样品中的针对Virb8蛋白的抗体浓度高的时候，结合的抗体就越多，结合的酶标二抗体就越多，用洗涤液洗涤后加入显色液，显色反应就越深，用酶标仪检测的OD值越高，表明待测样品中的Virb8抗体含量越高，当反应的OD值高于临界值时，就判定为阳性；反之，则为阴性。

本发明的牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，涉及的Virb8蛋白仅在布鲁氏菌感染的早期特异性表达，该蛋白对应产生的抗体处于感染早期，且产生的抗体存在时间较长，因此，克隆表达布鲁氏菌Virb8蛋白并建立相应的间接ELISA检测方法能够更特异、灵敏地判断是否存在布鲁氏菌感染和定量感染后引起的抗体滴度，可以为布鲁氏菌病的血清学早期诊断提供一种快速准确的方法。

本发明的牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测牛血清中的布鲁氏菌抗体，从而对样品进行定性判断。样品的前处理过程简单，耗时少，敏感性好，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。本发明对解决大批量样品的布鲁氏菌现场检测技术具有重要的现实意义。

附图说明

图1：virb8基因的PCR扩增示意图，其中，M为Marker2000，1为Virb8基因。

图2：重组质粒pET-32a/virb8的双酶切鉴定示意图，其中，M为Marker2000，1为双酶切鉴定。

图3：Virb8蛋白的SDS-PAGE分析示意图，其中，其中：M为Protein Marker，1为空载体未诱导，2为空载体诱导6h，4为重组载体未诱导，5为重组载体诱导1h，6为重组载体诱导2h，7为重组载体诱导4小时，8为重组载体诱导6h。

图4：重组蛋白Virb8的纯化示意图，其中，M为Protein Marker，1为纯化的空载体，2为诱导2h后纯化的Virb8蛋白，3为诱导4h后纯化的Virb8蛋白，4为诱导6h后纯化的Virb8蛋白，5为纯化的未转染对照。

图5：irb8重组蛋白的Western-blotting检测示意图，其中，1为pET-32空载，2和3为Virb8蛋白。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，从牛布鲁氏菌S2弱毒疫苗中PCR扩增获得Virb8基因，通过大肠杆菌原核表达系统获得纯度较高的Virb8蛋白。以获得的目的蛋白（布鲁氏菌Virb8蛋白）作为包被抗原，以马血清作为封闭液，建立间接ELISA检测方法，组装成试剂盒，从而完成本发明。

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明有关内容。下列实例中未注明的具体试验方法，通常按照分子克隆实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商提供的条件。

实施例1

材料和方法

菌株和质粒：牛布鲁氏菌S2弱毒菌疫苗由中国兽医药品监察所提供，pET32a(+)表达载体质粒由山东省农业科学院奶牛研究中心实验室保存，PEASY-T3Cloning Vector和Trans5a、DH5a、BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

试剂：rTaq酶、T4DNA连接酶、dNTP、DL2000Marker和限制性内切酶BamHⅠ、HindIII、IPTG、X-Gal购自大连宝生物制品有限公司；Gel/PCR extraction Kit、plasmid Miniprep Kit购自BIOMIGA公司；蛋白上样缓冲液、低分子量蛋白Marker购自Fermentas公司；Ni-NTA SpinKit购自QIAGEN。

实施例2

PCR扩增布鲁氏菌Virb8基因及其测序

在GenBank中查到布鲁氏菌Virb8（GenBank:AF226278.1）的基因，应用Primer5设计一对特异性引物如下：

上游引物  5’—GGATCCATGTTTGGACGCAAACAATCTCC—3’；

下游引物  5’—AAGCTTTCATTGCACCACTCCCATTTCTGG—3’，如序列表中序列1、2所示；

上游引入BamHI酶切位点，下游引入HindIII酶切位点，引物由华大基因公司合成。

用煮沸法提取牛布鲁菌弱毒疫苗株S2基因组DNA，以其为模板扩增Virb8基因。反应程序:94℃预变性4min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸2min。扩增后取PCR产物5μl于1%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，PCR产物大小与目的条带大小一致。PCR产物用小量胶回收试剂盒Gel/PCR extraction Kit回收纯化。

将PCR回收产物与PEASY-T3载体连接，转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒。挑取阳性克隆，用带氨苄青霉素抗性的LB培养基扩增培养。按质粒提取试剂盒(plasmid Miniprep Kit)说明书提取质粒，对重组质粒进行PCR及双酶切鉴定，阳性质粒命名为PEASY-T3/Virb8，送华大基因生物工程公司测序，测序结果用DNAstar软件进行比对，测序结果显示无突变。

实施例3

重组表达质粒pET-32a/Virb8的构建及鉴定

用限制性内切酶BamH I酶与Hind III酶双酶切并测序正确的重组质粒PEASY-T3/Virb8与载体pET-32a(+)同时双酶切，分别回收纯化Virb8和线性化的pET32a(+)基因片段。用T4DNA连接酶16℃连接16h后转化入感受态细胞DH5α，构建重组质粒pET-32a/Virb8。扩大培养后提取质粒，并进行酶切鉴定，结果见图2。实验结果表明目的片段已插入到质粒中且酶切位点无突变产生，提取的质粒为阳性质粒，可进一步用于重组蛋白的表达。

实施例4

布鲁氏菌Virb8蛋白的诱导表达、纯化与鉴定

将重组质粒pET-32a/Virb8转化大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆菌，接种于LB培养基。于37℃摇床200r/min振荡培养过夜，按1：100的比例接种至5mlLB培养基中。培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达6h后收菌。将1.5ml菌液离心，取沉淀，加入80ul1%SDS和20ul蛋白上样缓冲液，振荡混匀后，沸水煮5min，稍离心，取上清10ul进行12%SDS-PAGE分析，结果见图3.按照Ni-NTA蛋白纯化试剂盒操作说明提纯蛋白，结果见图4。使用电转印仪在60mA条件下，4℃转移过夜，将SDS胶面蛋白转移至PVDF硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉PBST封闭液4℃封闭过夜，然后将膜装入内有His免血清一抗(1：1000稀释)的无菌小塑料袋中，孵育结合2h，用TBST室温摇床上脱色，洗3次，每次5min。再加入二抗(1:10000稀释，羊抗兔IgG-HRP购自Novagen公司)，室温孵育结合2h，然后用TBST在摇床上洗3次，每次5min。DAB显色，结果见图5。图3、4和5的实验结果表明，含有阳性重组载体的大肠杆菌在IPTG诱导下表达，不同诱导时间的产物经SDS-PAGE检测，在大约48KD处可见表达条带，与预期蛋白大小相一致，而未诱导菌和空载体菌诱导后，均没有出现此蛋白条带纯化的蛋白为所要表达的目的蛋白。

实施例5

最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定

（1）抗原包被：将纯化后的蛋白溶液用包被液1:400,1:600,1:800,1:1000,1:1500,1:2000稀释，横向包被酶标板，100μL/孔，每个浓度包被1列，设置空白对照。

（2）封闭：将4℃过夜的96孔板取出后用PBST洗涤三次，每次2分钟，拍干，加入含10%马血清的PBST封闭液，100μL/孔，37℃作用1h。

（3）加入待检血清样品：将血清以1:1000，1:1200，1:1500，1:2000开始纵向稀释组成方阵，100μL/孔，37℃作用1h。

（4）加酶标二抗：将酶标板从温箱中取出，用PBST洗涤3次，每次2min。加入山羊抗牛IgG-HRP（1:12000稀释），每孔100μL，37℃作用1h。

（5）加底物液：用PBST洗涤3次，每次2min。在避光的环境下加入新鲜配置的TMB底物液，每孔100μL，室温避光作用15min。

（6）加终止液：每孔加入100μL2M H₂SO₄终止液，混匀，读取450nm处的吸光度。

实验结果显示，最佳血清稀释度为1:1500，抗原的最佳稀释度为1:600。

实施例6

抗原最佳包被条件的确定

采用最佳包被浓度和最佳血清稀释度，以①37℃2h②37℃1h加4℃过夜③4℃过夜3种不同条件包被重组蛋白，用布鲁氏菌阳性血清和阴性血清进行iELISA测定，确定抗原的最佳包被条件为4℃过夜包被。

实施例7

酶标二抗最佳工作浓度的确定

采用最佳抗原包被浓度、最佳包被条件及最佳血清稀释度，将山羊抗牛IgG-HRP以1：10000、1:12000、1:15000、1:18000，1:20000、1:40000的比例稀释，确定酶标二抗的工作浓度为1：12000。

实施例8

间接ELISA阴性和阳性临界值的确定

取本实验室保存的44份牛血清（已知布鲁氏菌抗体阴性）进行iELISA检测。每份样品重复2孔，结果取其平均值，计算样本OD_450nm值的平均值和标准方差（s），根据统计学原则，当样本的OD_450nm值>阴性样本OD_450nm值的时，可以在99.9%的水平上判定阳性。实验结果显示，求的平均值为0.254，标准差s为0.068，确定阴阳性临界点为254+0.136=0.390。即待测样品的OD450nm值大于0.390时为阳性，小于或等于0.390为阴性。

实施例9

敏感性、重复性和对比试验

对牛布鲁氏菌标准血清做1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500、1:4000稀释，其他条件按照最佳反应条件进行敏感性试验，实验结果显示当阳性血清稀释到1:4000时，血清检测结果阳性检测值低于阴性值。

对30份牛血清（已知布鲁氏菌抗体阳性）采用2次包被的酶标板，各进行3次重复试验，计算其变异系数，以评价该方法的重复性。实验结果显示，重复试验中变异系数最大为6.90%，最小为2.19%，30份血清变异系数都较小，具有良好的重复性。

用建立的间接ELISA检测临床血清样品，按照实施例7和8确定的最佳包被浓度和最佳血清稀释度，根据实施例9确定的阴阳性临界值为标准，检测235份奶牛血清，并用传统的虎红平板凝集试验进行比较，比较的结果显示见表1。

表1.iELISA与RBPT方法的比较结果

实施例10  制备并应用牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒

由以下试剂构成：

（1）预包被ELISA反应板：数量为5块，处理方法为：取100μl用包被液稀释至工作浓度的包被抗原加入ELISA板的反应孔中，4℃过夜包被后，用110μl封闭液37℃封闭2小时；包被液中，Na₂CO₃的浓度为1.59g/L，2.93g NaHCO₃的浓度为2.93g/L，制备方法为：将1.59gNa₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后（用1M的氢氧化钠溶液调整），加去离子水定容为1L，即得；包被抗原为Virb8蛋白，工作浓度为1.16μg/mL，工作条件为4℃包被过夜；封闭液为10%马血清（体积分数）；

（2）25倍PBST洗涤液：体积为60ml，同时也作为样品稀释液；体积为1L的25倍PBST洗涤液制备方法为：将准确称量的200g NaCl、5.0g KCl、35.5g Na₂HPO₄和6.75g KH₂PO₄充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7.4（通过滴加1M盐酸的方式调pH），然后加去离子水定容至1L，再加入500μL Tween-20，即得；

（3）酶标二抗：体积为60μl，辣根过氧化物酶HRP标记兔抗牛IgG，工作浓度为1:1000，已根据原浓度做1:12稀释；工作条件为：37℃孵育60min；

（4）终止液：体积为60ml，2mol/L的硫酸溶液；制备方法为：10.87mL的浓硫酸与89.13mL的去离子水混合，配制成2M的H₂SO₄溶液；

（5）显色液：体积为60ml的TMB显色液。

所述（1）中包被抗原的制备方法为：

从牛布鲁氏菌S2弱毒疫苗（购自中国兽医药品监察所，商品名称为S2疫苗）中提取菌体DNA作为模板，利用设计合成的特异性引物（见实施例2），对布鲁氏菌进行Ⅳ型分泌系统Virb8基因的PCR扩增，并将目的基因回收连接到T载体转化DH5α大肠杆菌；测序鉴定后，将Virb8基因连接到pET-32a(+)质粒（该质粒为现有技术中已有的常规质粒）中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化目的蛋白（布鲁氏菌Virb8蛋白），通过Western-blotting对蛋白进行鉴定,用紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度。

利用上述牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒检测的方法如下：

（1）洗涤液与样品稀释液的准备：将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水作25倍稀释后备用；

（2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准阳性孔和标准阴性孔以及待测样品孔；将标准阳性血清、标准阴性血清和样品血清按1:1500稀释后，在酶标包被板的反应孔内准确加样100μl，空白孔直接加100μl样品稀释液；加样时，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，加样后，轻轻晃动混匀；

（3）温育：用封板膜封板后置37℃温育1小时；

（4）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加300μl洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

（5）酶标二抗的稀释：根据实验需要计算用量，用PBST将酶标二抗按1:1000稀释后备用，需现用现配；

（6）加入二抗：每孔加入100μl稀释好的酶标二抗，空白孔除外；

（7）温育：操作同（3）；

（8）洗涤：操作同5；

（9）显色：每孔先加入100μl TMB显色剂，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

（10）终止：每孔加100μl终止液，终止反应（此时蓝色立转黄色）；

（11）测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）；测定应在加终止液后15分钟以内进行；

结果判定：标准阳性血清OD_450nm值大于1.0，标准阴性血清OD450nm值小于0.30时，实验结果判定为合格；反之，为不合格，需要重新检测；待测样品的OD450nm值大于0.39时为阳性，小于或等于0.39时为阴性。

Claims (3)

1.一种牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：由以下试剂构成：

(1)预包被ELISA反应板：数量为5块，由包被液、包被抗原和封闭液构成，其中，包被液中，Na2CO₃的浓度为1.59g/L，2.93g NaHCO₃的浓度为2.93g/L；包被抗原为Virb8蛋白，工作浓度为1.16μg/mL，工作条件为4℃包被过夜；封闭液为10％马血清；

(2)25倍PBST洗涤液：体积为60ml，体积为1L的25倍PBST洗涤液制备方法为：将准确称量的200g NaCl、5.0g KCl、35.5g Na₂HPO₄和6.75g KH₂PO₄充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7.4，然后加去离子水定容至1L，再加入500μL Tween-20，即得；

(3)酶标二抗：体积为60μl，辣根过氧化物酶HRP标记兔抗牛IgG，工作浓度为1:1000，工作条件为：37℃孵育60min；

(4)终止液：体积为60ml，2mol/L的硫酸溶液；

(5)显色液：体积为60ml的TMB显色液；

所述(1)中，包被抗原的制备方法为：从牛布鲁氏菌S2弱毒疫苗中提取菌体DNA作为模板，利用设计合成的特异性引物，对布鲁氏菌进行Ⅳ型分泌系统Virb8基因的PCR扩增，并将目的基因回收连接到T载体转化DH5α大肠杆菌；测序鉴定后，将Virb8基因连接到pET-32a(+)质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化目的蛋白；

所述特异性引物如下：

上游引物5’—GGATCCATGTTTGGACGCAAACAATCTCC—3’；

下游引物5’—AAGCTTTCATTGCACCACTCCCATTTCTGG—3’，如序列表中序列1、2所示；

上游引入BamHI酶切位点，下游引入HindIII酶切位点。

2.根据权利要求1所述的一种牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述(1)中，预包被ELISA反应板的处理方法为：取100μl用包被液稀释至工作浓度的包被抗原加入ELISA板的反应孔中，4℃过夜包被后，用110μl封闭液37℃封闭2小时。

3.根据权利要求1所述的一种牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述(1)中，包被液的制备方法为：将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L，即得。