CN104155443A

CN104155443A - 一种基于弓形虫基质蛋白1的间接elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN104155443A
Application number: CN201410383382.0A
Authority: CN
Inventors: 杜爱芳; 卓洵辉; 张智; 赵现锋; 周前进
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-08-06
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明提供一种基于弓形虫MAG1蛋白的间接ELISA检测试剂盒，由96孔酶标板、底物包被品、标准品、对照品、底物溶液、脱脂奶粉、样本稀释液、洗涤液、反应液、显色液、终止液组成。本发明的试剂盒能够识别人、兔、猪、狗、猫、猴、小鼠等多种哺乳动物IgG，较快速地检测弓形虫的感染，特异性和灵敏度高，特别是临床大规模检测时可极大提高工作效率。该方法无需昂贵的PCR检测仪等设备，只需紫外分光光度计、恒温箱等设备，操作简单，特异性强、重复性好、结果清晰稳定，且待检样本极易获得。

Description

一种基于弓形虫基质蛋白1的间接ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术，涉及一种基于弓形虫基质蛋白1（MAG1）的间接ELISA检测试剂盒及应用，可以检测人、猪、猫、狗、小鼠等的弓形虫感染。

背景技术

弓形虫是一种世界范围内分布的细胞内寄生的原虫，可以感染包括人在内的各种温血动物，引起弓形虫病。广泛的宿主群使其成为最为成功的一种寄生虫(Boothroyd, 2009)。在人类患者中，弓形虫病大多呈隐性感染，伴有淋巴结肿大、发低烧、全身乏力、喉咙痛以及昏睡。在免疫抑制的患者体内则呈现较为严重症状，包括弓形虫脑炎、心肌炎、肺炎、肝炎以及系统器官障碍(Utsuki et al., 2011)。在孕妇体内，先天性的感染可以导致流产、新生儿畸形、失明等。在动物中，弓形虫病在世界范围内在成巨大经济损失，它能够导致流产、死胎。此外，在畜产品中的组织包囊是弓形虫感染给人的重要来源(Brown and Patterson, 2011)。

弓形虫的血清学诊断对于正常宿主的急性感染是可行的，但对受到免疫抑制的病畜很难应用。所以在使用这种方法时不仅要选取特异性抗原，还要求弓形虫感染者体内针对该抗原的血清抗体滴度较高。此外，在设计此方法时，应充分考虑到抗体类型、在体内持续时间、抗体滴度随时间的变化等，力求敏感性、特异性和重复性俱佳。在弓形虫的保护性抗原中， SAG1、SAG2、GRA2、MAG1几种抗原刺激机体产生抗体滴度较高(Gamble, H.R. et al., 2000)。一些研究显示，GRA6、GRA7、P35重组蛋白可以用来检测弓形虫感染急性期产生的IgG抗体，效果比慢性期的好(Pietkiewicz, H.,et al., 2004; Hiszczynska-Sawicka,et al.,2005)。在Holec等人的研究中，针对重组MAG1的特异性兔抗血清能与弓形虫速殖子裂解物中的65 kDa虫体天然MAG1抗原产生反应(Pfrepper, K.I.,et al., 2005)，这就为MAG1蛋白在免疫和诊断上的广泛应用提供了理论基础。使用重组MAG1蛋白来检测天然MAG1抗原刺激犬血清内产生的抗体，建立的间接ELISA方法具有操作简单、特异性好、灵敏度高等特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于弓形虫基质蛋白1（MAG1）的间接ELISA检测试剂盒，可快速有效的检测弓形虫感染的抗体水平，从分子生物学的角度，为预防、诊断弓形虫病奠定基础，本发明同时提供检测试剂盒中包被抗原的重组蛋白MAG1的制备方法和基因序列。

本发明试剂盒包含：96孔酶标板、底物包被品（冻干品）、标准品、对照品、底物溶液、脱脂奶粉、样本稀释液、洗涤液、反应液、显色液、终止液。

底物包被品（冻干品）为含0.15 mg MAG1重组蛋白，其核苷酸序列为: SEQ ID No：3。

标准品为犬弓形虫阳性血清。

对照品为犬弓形虫阴性血清。

底物溶液1×10 ml/瓶，为pH为9.6的10 mM PBS溶液（NaCl 0.08 g， KCl 0.002 g，Na₂HPO₄.12H₂O 0.029 g, KH₂PO₄ 0.002 g,加去离子水定容至10 ml）。

脱脂奶粉5 g。

样本稀释液1×100 ml/瓶，为pH为7.4的10 mM PBS溶液。

洗涤液1×10 ml/瓶，为含0.2% Tween20 pH为7.4的0.6 M PBS溶液，使用前用去离子水按1：60稀释。

显色液1×10 ml/瓶（配制方法：2.43 ml 0.1 M 柠檬酸溶液，2.57 ml 0.2M Na₂HPO₄溶液，5 ml ddH₂O，加入4 mg OPD粉末溶解，再加入15 μl 30% H₂O₂溶液混匀）。

反应液1×10 ml/瓶，含HRP-SPA酶标物。

终止液1×10 ml/瓶，内含2 mol/L H₂SO₄。

其中，底物包被品（冻干品）、标准品、对照品、反应液保存于-20 ℃，尽量减少反复冻融，显色液避光保存。

本发明试剂盒使用方法：

1. 标本的采集及保存

血清：全血标本请于37 ℃放置2小时或4 ℃ 过夜后于离心机中1000 g离心10分钟，取上清检测。

2. 操作步骤

（1）底物包被品用底物溶液溶解，充分混匀并尽量避免起泡。加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，每孔100 μl。37 ℃放置2小时或4 ℃过夜。

（2）弃去液体，甩干。将洗涤液用去离子水按1：60稀释。每孔250 μl，洗涤5次，每次3分钟，甩干。

（3）将脱脂奶粉用样本稀释液稀释，每孔250 μl，37 ℃放置1小时。

（4）弃去液体，甩干，洗5次，同步骤2。

（5）将待检样本用样本稀释液按1：50稀释，每孔100 μl。同时，设立阳性对照（标准品）及阴性对照（对照品）。37 ℃放置1小时。

（6）弃去液体，甩干，洗5次，同步骤2。

（7）加反应液，每孔100 μl。37 ℃放置1小时。

（8）弃去液体，甩干，洗5次，同步骤2。

（9）加显色液，每孔100 μl，37 ℃避光显色15分钟。

（10）加终止液，每孔50 μl，轻轻摇晃，迅速使用紫外分光光度计在492nm波长下测各孔OD值。

（11）结果判定：样本的OD值≥0.789时，判断为阳性；样本的OD值＜0.789时，判断为阴性。

本发明的重组蛋白MAG1的制备方法如下：

（1）以弓形虫DNA为模板，以上游引物（5’-CGGGGTACCGTGCCAGAGCTACCAGAAGTGG-3’）和下游引物（5’-CGCGAATTCCGCCAGATCCCTGAACCCTTAG-3’）进行PCR扩增，扩增片段为529 bp，核苷酸序列见序列表SEQ ID No：3。PCR产物回收后与质粒pET28b一起用Kpn Ⅰ及EcoR Ⅰ进行双酶切，构建原核表达质粒pET28b-MAG1。

（2）将原核表达质粒pET28b-MAG1转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，以IPTG对重组蛋白进行诱导表达。

（3）对诱导表达获得的重组蛋白进行纯化处理，得到可用于制备试剂盒的抗原蛋白。

本发明的优点：

（1）抗原来源容易，重组蛋白MAG1可在实验室大量制备。

（2）本试剂、试剂盒及检测技术能够识别人、兔、猪、狗、猫、猴、小鼠等多种哺乳动物IgG，较快速地检测弓形虫的感染。

（3）特异性好，敏感性高，该试剂盒的抗原是弓形虫MAG1重组蛋白，成分单一，不含无关杂蛋白，具有较高的特异性和敏感性，稳定性好。

（4）操作简单，成本低廉，重复性好，结果清晰，且待检样本极易获得。

附图说明

图1 是MAG1的PCR扩增结果。

图2 是SDS-PAGE检测重组蛋白MAG1 的诱导表达。

图3 是MAG1蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例一弓形虫MAG1蛋白的原核表达及纯化

1. 材料

10× PCR Buffer、Taq DNA polymerase、dNTP等PCR反应所需试剂，DNA Marker DL2000，凝胶纯化回收试剂盒，购自爱思进公司；Ni-FF亲和层析柱，购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司；限制性内切酶Kpn Ⅰ及EcoR Ⅰ，T4 DNA连接酶，核酸电泳染料GoldView，购自赛百盛生物公司；Biometra T-Gradient Thermoblock 梯度PCR仪，电泳仪，北京市六一仪器厂产品；凝胶成像分析系统，上海培清科技有限公司；恒温摇床，超声裂解仪，生化培养箱，微量振荡器，移液枪，移液枪枪头。

2. MAG1片段的扩增及纯化回收

以上述虫种目的基因序列为模板，使用Primer Premier 5.0软件进行分析、设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序列见表1。以弓形虫DNA为模板，用上游引物TgMAG1f及下游引物TgMAG1r进行PCR扩增。反应体系为：10×PCR buffer 2.5 μl, dNTP 2 μl, 上游引物TgMAG1f 0.5 μl, 下游引物TgMAG1r 0.5 μl, Taq DNA polymerase0.13 μl, 模板DNA 1 μl, 加ddH₂O至25 μl。反应程序为：95 ℃预变性5 分钟，然后94 ℃变性45秒, 63 ℃退火45秒，72 ℃延伸45秒，30个循环后再72 ℃延伸8分钟，取PCR产物在50 ppm（V/V） GoldView的1 % 琼脂糖凝胶、0.5×TBE缓冲液中电泳，紫外灯下观察并用干净的解剖刀在紫外灯下把含有与目的条带大小一致的PCR产物割下，结果参见图1，图中M为DNA marker DL2000，1为PCR扩增产物， 2为阴性对照。按照凝胶纯化回收试剂盒说明书回收PCR产物。

3. 原核表达载体的构建

将实验室保存的pET28b质粒与PCR回收产物一起用Kpn Ⅰ及EcoR Ⅰ进行双酶切，回收酶切产物,将酶切产物用T4 DNA连接酶连接,体系为:PCR产物4.5 μl, pET28b 0.5 μl, T4 DNA连接酶 5 μl。将连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,挑取阳性菌斑送华大基因进行测序,序列正确的质粒命名为pET28b-MAG1。

4. 重组蛋白的诱导表达及纯化

将鉴定为阳性的重组菌按1:100的比例接种于50 mL的LB培养液,37 °C 230r/min 3 h后用终浓度为1mM的IPTG诱导表达，用SDS-PAGE分析基因表达情况。如图2所示,图中M为Protein molecular weight Marker； 1为BL21-pET28b对照； 2-5为BL21-pET28b-MAG1分别用1mM IPTG诱导0 h、4 h、6 h、8 h。结果显示诱导出的重组蛋白大小为43左右,与预期相符,且在4 h后即大量产生重组蛋白。将收集的菌体经超声破碎后12 000 g离心10 min，裂解上清液用于Ni-FF镍柱纯化MAG1重组蛋白。蛋白纯化按北京韦氏博慧色谱科技有限公司的Ni-FF镍柱说明书操作。取 4 mLNi-FF镍柱填料装柱，用50 mM的PBS (含0.15M NaCl， pH7.4)缓冲液充分平衡，裂解上清液以2 mL/min流速上样，反复结合3次。然后用50mM的PBS 洗去杂蛋白，再以100、 200、 400 mM咪唑进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，经SDS-PAGE进行鉴定,如图3所示,其中1-3分别为100、 200、 400 mM咪唑洗脱的蛋白, M为Protein molecular weight Marker,100mM咪唑洗脱的蛋白杂蛋白较少。

5. 结果

正确构建了原核表达载体pET28b-MAG1,IPTG诱导4小时后诱导出大量重组蛋白并进行纯化。

实施例二弓形虫MAG1蛋白的间接ELISA检测技术特异性检测结果

1. 材料

生化培养箱，微量振荡器，湿盒，移液器，NanoDrop ND-1000紫外分光光度计。本实验室保存的弓形虫重组MAG1蛋白和弓形虫犬阳性血清、弓形虫犬阴性血清及大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、犬细小病毒阳性血清。HRP酶标SPA（干粉购自生工生物科技有限公司），OPD，30% H₂O₂溶液，0.2 M Na₂HPO₄溶液，0.1 M柠檬酸溶液，脱脂奶（购自光明乳业），Tween20，2 M H₂SO₄溶液，0.01M pH为7.4的PBS溶液。

2. 重组蛋白的稀释

将实验室保存的MAG1蛋白用pH为9.6的10 mM PBS稀释为15 μg/ml，每孔100 μl进行包被。

3. 血清的稀释

将弓形虫犬阳性血清、弓形虫犬阴性血清及大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、犬细小病毒阳性血清用含5%脱脂奶粉的pH为7.4的10 mM PBS按1：50稀释，作为一抗使用。

4. 特异性检测

MAG1蛋白包被至96孔板后，37 ℃放置2小时，用含0.2% Tween20 pH为7.4的10 mM PBS溶液洗涤5次。用含5%脱脂奶粉的pH为7.4的10 mM PBS进行封闭，37 ℃放置1小时，洗涤5次后，将稀释好的一抗加入96孔板，每孔100 μl，37 ℃放置1小时。洗涤5次，加100 μl 按1：5000稀释好的SPA-HRP酶标二抗，37 ℃放置1小时。洗涤5次，加入100 μl OPD显色液（配制方法：2.43 ml 0.1 M 柠檬酸溶液，2.57 ml 0.2M Na₂HPO₄溶液，5 ml ddH₂O，加入4 mg OPD粉末溶解，再加入15 μl 30% H₂O₂溶液混匀），37 ℃放置15分钟，加入 50 μl 2 mol/L H₂SO₄终止反应，使用紫外分光光度计在492nm波长下测各孔OD值。

5. 结果

特异性检测结果见表2。除了犬弓形虫阳性血清检测结果为阳性外，其余血清检测结果均为阴性，该方法的特异性良好。

实施例三弓形虫MAG1蛋白的间接ELISA检测技术重复性性检测结果

1. 阳性血清的稀释

取14份犬血清，用含5%脱脂奶粉的pH为7.4的10 mM PBS按1：50稀释，作为一抗使用。

2. 重复性检测

方法同实施例一。取7份稀释好的血清，连续4天做4次试验，比较试验结果差异，计算板间差异系数；另取7份稀释好的血清，每份血清在同一块板上做3个重复，比较结果差异，计算板内差异系数。

3. 检测结果

检测结果如表3及表4所示，板间差异系数小于3%，板内差异系数小于10%，本方法具有良好的重复性。

实施例四本试剂盒对采集的部分样本检测结果

方法同实施例一，随机采集45份犬血清，用含5%脱脂奶粉的pH为7.4的10 mM PBS按1：50稀释，作为一抗使用。检测结果如表5所示，按照判定标准样本的OD值≥0.789时，判断为阳性；样本的OD值＜0.789时，判断为阴性，检测结果中有16份高于临界值，判断为阳性。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

<110>浙江大学

<120>一种基于弓形虫基质蛋白1的间接ELISA检测试剂盒

<160>3

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>弓形虫（Toxoplasmagondii）

<220>

<221>RRNA

<400>1

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gatcaggttgtgtatattctaagggttcagggatctggcggaattcgcg 529

Claims

1.一种基于弓形虫基质蛋白1的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由96孔酶标板、底物包被品、标准品、对照品、底物溶液、脱脂奶粉、样本稀释液、洗涤液、反应液、显色液、终止液组成，其中底物包被品为含基质蛋白1重组蛋白的冻干品，标准品为犬弓形虫阳性血清，对照品为犬弓形虫阴性血清，底物溶液为pH为9.6的PBS溶液，脱脂奶粉，样本稀释液为pH为7.4的PBS溶液，洗涤液为含0.2% Tween20 pH为7.4的PBS溶液，反应液含HRP-SPA酶标物，终止液为 H₂SO₄，基质蛋白1重组蛋白的核苷酸序列为: SEQ ID No：3。

2.根据权利要求1所述的一种基于弓形虫基质蛋白1的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，洗涤液使用前用去离子水按1：60稀释。

3.根据权利要求1所述的一种基于弓形虫基质蛋白1的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，显色液配制方法：2.43 ml 0.1 M 柠檬酸溶液，2.57 ml 0.2M Na₂HPO₄溶液，5 ml ddH₂O，加入4 mg OPD粉末溶解，再加入15 μl 30% H₂O₂溶液混匀。

4.根据权利要求1所述的一种基于弓形虫基质蛋白1的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，底物包被品、标准品、对照品、反应液保存于-20 ℃，尽量减少反复冻融，显色液避光保存。