CN103995123B - 检测布氏杆菌抗体的一种elisa试剂盒的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法，属于生物技术检测领域，将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板；再将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru‑5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中；并同时分别将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru‑5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中，水浴后用PBST洗涤，再向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应，测得各板孔的OD450值，计算各板孔的抑制率。本发明利用建立的cELISA方法对小肠结肠炎耶尔森菌O9和大肠杆菌O157高免阳性血清进行检测，PI值均低于30%，可以有效地排除假阳性结果的发生。

Description

检测布氏杆菌抗体的一种ELISA试剂盒的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及对牛、羊的布鲁氏菌病的一种检测技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患病，反刍动物特别是牛和羊容易感染。根据抗原型和宿主类型将布鲁氏菌分为6类，患病母畜一般症状是流产，雄性则引起不育等生殖障碍。近几年在世界范围内布病呈现出反弹的趋势，在中国，牛种布鲁氏菌(B. abortus)和羊种布鲁氏菌(B.melitensis)造成的危害尤为广泛和严重，该病给畜牧业和公共卫生事业造成巨大经济损失，加强对布病的防控具有重要的现实意义。
对布病进行准确诊断是防止该病蔓延的首要措施，常见的布病血清学诊断方法主要有凝集试验、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光偏振试验（FPA）。由于牛种布鲁氏菌和某些杆菌（最主要的是小肠结肠炎耶尔森菌O9、大肠杆菌O157）在脂多糖链(LPS)上存在共同的抗原位点，一般认为这些抗原位点属于脂多糖上可溶的蛋白类物质，因此血清学检测中往往因为交叉反应的存在而造成假阳性结果。相对而言，凝集试验的特异性和敏感性均较低，在一些发达国家已停止使用。CFT虽然特异性和敏感性均比较高，但由于操作繁琐，不适合常规检验，更不适合高通量检测，往往只用于确诊或作为其它诊断方法的仲裁。利用单克隆抗体（Mab）建立的检测动物血清中抗体的竞争ELISA（cELISA）方法已然成为目前检测布病的可靠方法之一。
目前为止，已制备针对位于脂多糖O链上(O-LPS)的A抗原、M抗原、C抗原和C/Y抗原的单克隆抗体；另一方面，学者们发现某些特定的外膜蛋白也存在免疫原性，如OMP31等利用这些单克隆抗体建立的cELISA方法早已应用于对布病的血清学检测，但由于不同单抗灵敏度和特异性等因素的限定，以及交叉反应的干扰，在实际检测当中往往会出现漏检、错检的结果。事实上，经本发明人研究发现，利用补体结合实验（CFT）和已建立的cELISA方法在检测临床样品时存在一定的不吻合率，特别是对一些介于阴性和阳性之间的疑似样品的判定。
发明内容
本发明目的是提出一种能够提高检测准确性的竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法。
本发明的技术方案包括以下步骤：
1）将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板；
2）将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中；并同时分别将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中，37℃水浴1小时后，用PBST洗涤，再向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应；
3）测得各板孔的OD450值；
4）由公式100×（1-OD阴性对照/OD待检样品）%分别计算各板孔的抑制率；
其中，OD阴性对照为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和已知的阴性血清的D450值；OD待检样品为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的OD450值；
5）判定待检血清样品：抑制率≥30%，则判定待检血清样品为阳性。
本发明采用单克隆抗体Bru-5C10建立的cELISA通过软件的ROC分析给出的最佳临界值PI=25%，此时特异性为96.3%，敏感度为99.1%；为了提高检测过程中的特异性，本发明选择PI=30%作为临界值，此时特异性为98.8%， 敏感度为96.2%。
本发明利用建立的cELISA方法对小肠结肠炎耶尔森菌O9和大肠杆菌O157高免阳性血清进行检测，PI值均低于30%，说明本发明可以有效地排除假阳性结果的发生。
为了建立更准确的检测布病的cELISA方法，本发明利用灭活的牛种布鲁氏菌2308免疫小鼠，通过细胞融合技术获得1株对牛种布鲁氏菌有良好反应性的单克隆抗体，命名为单克隆抗体bru-5C10。本发明的单克隆抗体bru-5C10为杂交瘤细胞株 bru-5C10分泌获得。
本发明的单克隆抗体bru-5C10，于2014年5月7日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC No.9219，
生物材料：Bru-5C10，分类命名：杂交瘤细胞株。
另外，将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99按1.75µg/孔溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中，100µl/孔加入酶标版中，4℃孵育12h，弃去酶标板中的液体后，用PBST配制的5%脱脂乳，100µl/孔加入酶标版中，封闭后于37℃放置，3h后弃去封闭液，再用PBST洗涤2次，即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。该酶标板包被抗原的获得采用超声裂解法，相对于热酚法降低了繁琐度并保证了有效性；其中包被过程中，各条件的选择都采用控制单一变量原则经实验分析得出，保证了最佳反应性。
所述超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是：用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(简称：TSA，由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化钠、琼脂等组成)上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80℃水浴灭活2h后调节菌液浊度，使其浊度约为1×1010CFU/ml；然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3～4次，15min/次。
本研究所建立的检测牛布氏杆菌病的cELISA方法，通过对320份临床牛血清样品的检测并与商品化布病cELISA试剂盒（Svanova公司）比较，结果显示两者的符合率为95.6%，且经第三方实验（补体结合实验）验证不吻合样品，本研究所建立的方法有更高的符合率。其意义在于本方法对布氏杆菌病的血清学检测特异性更强，敏感性更好。
附图说明
图1为单抗Bru-5C10的免疫印迹试验图。
具体实施方式
一、通过细胞融合技术获得对牛种布鲁氏菌有良好反应性的单克隆抗体bru-5C10：
取经过常规免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照标准程序进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用间接酶联免疫吸附实验法(iELISA)筛选与牛种布鲁氏菌A99粗提的LPS具有强反应，而与小肠结肠炎耶尔森菌O9粗提的LPS无反应的阳性杂交瘤细胞株。按照有限稀释法进行2次亚克隆获得单克隆抗体bru-5C10。
二、单克隆抗体bru-5C10的保存证明信息：
保藏号CGMCC No.9219，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日：2014年5月7日。生物材料：Bru-5C10，分类命名：杂交瘤细胞株。
三、制作牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板：
用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(简称：TSA。胰蛋白胨大豆琼脂培养基由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化钠、琼脂等组成)上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80℃水浴灭活2h，调节菌液浊度，使其浊度约为1×1010CFU/ml；然后再利用超声裂解破碎菌体：超声频率为30HZ，15min/次，进行3～4次。
将超声裂解处理过的牛种布鲁氏菌A99按1.75µg/孔溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中，100µl/孔加入酶标版中，4℃孵育12h。弃去酶标板中的液体后，用PBST配制的5%脱脂乳，100µl/孔加入酶标版中，封闭后于37℃放置，3h后弃去封闭液，再用PBST洗涤2次，即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。
四、检测试验：
以PBST为缓冲液，将待检样本稀释20倍，待用。
以PBST为缓冲液，分别将牛的阴性血清和阳性血清稀释20倍，待用。
向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的各孔分别加入50µl稀释后的待检样品和50µl用PBST按照1:4000进行稀释的单克隆抗体Bru-5C10。
同时取标准阴性血清和阳性血清作为阴阳对照组，向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的A1-A2孔中分别加入50µl稀释后的阴性血清和50µl工作浓度的单克隆抗体bru-5C10，向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的A3-A4孔中分别加入50µl稀释后的阳性血清和50µl工作浓度的单克隆抗体bru-5C10。
分别将各孔中的体系充分混匀后，将酶标板在37℃孵育30min后，再分别以PBST洗涤4次。再向每孔加入100µl HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30min后，以PBST洗涤5次。然后加入底物显色液室温作用10min，以2M硫酸终止。
分别读取各孔的OD450值。
OD阴性对照为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和已知的阴性血清的板孔的OD450值；OD待检样品为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的OD450值。
并根据公式100×（1-OD阴性对照/OD待检样品）%分别计算抑制率(PI)。
计算结果：已知的阳性血清相应的抑制率(PI)≥30%，已知的阴性血清相应的抑制率(PI)＜30%。
以此为标准，将待检样本各孔的抑制率(PI)进行加合后求平均值，如平均值为≥30%，则待检样本为阳性；如平均值为＜30%，则待检样本为阴性。
五、cELISA 的重复性：经重复性实验结果证明，本发明所建立的cELISA批内重复性的平均变异系数为2.2%；批间重复性的平均变异系数为5.9%，表明该cELISA方法具有良好的可重复性。
六、试剂盒中的单克隆抗体与小肠结肠炎耶尔森菌O9、大肠杆菌O157没有交叉反应。
如图1的单抗Bru-5C10的免疫印迹试验图所示，其中：
1显示了牛种布鲁氏菌S2308超声裂解后的上清液与单抗Bru-5C10反应结果；
2显示了牛种布鲁氏菌A99超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果；
3显示了小肠结肠炎耶尔森菌O9超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果；
4显示了大肠杆菌O157超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果。

Claims (3)

1.一种ELISA试剂盒在检测布氏杆菌抗体中的应用，其特征在于包括以下步骤：
1）将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板；
2）将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中；并同时将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中，37℃水浴后，用PBST洗涤，向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应；
3）测得各板孔的OD450值；
4）由公式100×（1-OD阴性对照/OD待检样品）%分别计算各板孔的抑制率；
其中，OD阴性对照为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和已知的阴性血清的板孔的OD450值；OD待检样品为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的OD450值；
5）判定待检血清样品：抑制率≥30%，则判定待检血清样品为阳性；
所述单克隆抗体bru-5C10为由保藏号为CGMCC No.9219的杂交瘤细胞株分泌。
2.根据权利要求1所述一种ELISA试剂盒在检测布氏杆菌抗体中的应用，其特征在于将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99按1.75µg/孔溶于pH为9.6的碳酸盐缓冲液中，100µl/孔加入酶标板中，4℃孵育12h，弃去酶标板中的液体后，用PBST配制的5%脱脂乳，100µl/孔加入酶标板中，封闭后于37℃放置，3h后弃去封闭液，再用PBST洗涤2次，即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。
3.根据权利要求1或2所述一种ELISA试剂盒在检测布氏杆菌抗体中的应用，其特征在于所述超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是：用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80℃水浴灭活2h后调节菌液浊度，使其浊度约为1×1010CFU/ml；然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3～4次，15min/次。
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