CN103995123B - 检测布氏杆菌抗体的一种elisa试剂盒的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法,属于生物技术检测领域,将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板;再将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru‑5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中;并同时分别将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru‑5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中,水浴后用PBST洗涤,再向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体,孵育洗涤后,进行显色反应,测得各板孔的OD450值,计算各板孔的抑制率。本发明利用建立的cELISA方法对小肠结肠炎耶尔森菌O9和大肠杆菌O157高免阳性血清进行检测,PI值均低于30%,可以有效地排除假阳性结果的发生。
Description
技术领域
本发明属于生物技术检测领域,具体涉及对牛、羊的布鲁氏菌病的一种检测技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患病,反刍动物特别是牛和羊容易感染。根据抗原型和宿主类型将布鲁氏菌分为6类,患病母畜一般症状是流产,雄性则引起不育等生殖障碍。近几年在世界范围内布病呈现出反弹的趋势,在中国,牛种布鲁氏菌(B. abortus)和羊种布鲁氏菌(B.melitensis)造成的危害尤为广泛和严重,该病给畜牧业和公共卫生事业造成巨大经济损失,加强对布病的防控具有重要的现实意义。
对布病进行准确诊断是防止该病蔓延的首要措施,常见的布病血清学诊断方法主要有凝集试验、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光偏振试验(FPA)。由于牛种布鲁氏菌和某些杆菌(最主要的是小肠结肠炎耶尔森菌O9、大肠杆菌O157)在脂多糖链(LPS)上存在共同的抗原位点,一般认为这些抗原位点属于脂多糖上可溶的蛋白类物质,因此血清学检测中往往因为交叉反应的存在而造成假阳性结果。相对而言,凝集试验的特异性和敏感性均较低,在一些发达国家已停止使用。CFT虽然特异性和敏感性均比较高,但由于操作繁琐,不适合常规检验,更不适合高通量检测,往往只用于确诊或作为其它诊断方法的仲裁。利用单克隆抗体(Mab)建立的检测动物血清中抗体的竞争ELISA(cELISA)方法已然成为目前检测布病的可靠方法之一。
目前为止,已制备针对位于脂多糖O链上(O-LPS)的A抗原、M抗原、C抗原和C/Y抗原的单克隆抗体;另一方面,学者们发现某些特定的外膜蛋白也存在免疫原性,如OMP31等利用这些单克隆抗体建立的cELISA方法早已应用于对布病的血清学检测,但由于不同单抗灵敏度和特异性等因素的限定,以及交叉反应的干扰,在实际检测当中往往会出现漏检、错检的结果。事实上,经本发明人研究发现,利用补体结合实验(CFT)和已建立的cELISA方法在检测临床样品时存在一定的不吻合率,特别是对一些介于阴性和阳性之间的疑似样品的判定。
发明内容
本发明目的是提出一种能够提高检测准确性的竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法。
本发明的技术方案包括以下步骤:
1)将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板;
2)将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中;并同时分别将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中,37℃水浴1小时后,用PBST洗涤,再向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体,孵育洗涤后,进行显色反应;
3)测得各板孔的OD450值;
4)由公式100×(1-OD阴性对照/OD待检样品)%分别计算各板孔的抑制率;
其中,OD阴性对照为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和已知的阴性血清的D450值;OD待检样品为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的OD450值;
5)判定待检血清样品:抑制率≥30%,则判定待检血清样品为阳性。
本发明采用单克隆抗体Bru-5C10建立的cELISA通过软件的ROC分析给出的最佳临界值PI=25%,此时特异性为96.3%,敏感度为99.1%;为了提高检测过程中的特异性,本发明选择PI=30%作为临界值,此时特异性为98.8%, 敏感度为96.2%。
本发明利用建立的cELISA方法对小肠结肠炎耶尔森菌O9和大肠杆菌O157高免阳性血清进行检测,PI值均低于30%,说明本发明可以有效地排除假阳性结果的发生。
为了建立更准确的检测布病的cELISA方法,本发明利用灭活的牛种布鲁氏菌2308免疫小鼠,通过细胞融合技术获得1株对牛种布鲁氏菌有良好反应性的单克隆抗体,命名为单克隆抗体bru-5C10。本发明的单克隆抗体bru-5C10为杂交瘤细胞株 bru-5C10分泌获得。
本发明的单克隆抗体bru-5C10,于2014年5月7日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号CGMCC No.9219,
生物材料:Bru-5C10,分类命名:杂交瘤细胞株。
另外,将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99按1.75µg/孔溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中,100µl/孔加入酶标版中,4℃孵育12h,弃去酶标板中的液体后,用PBST配制的5%脱脂乳,100µl/孔加入酶标版中,封闭后于37℃放置,3h后弃去封闭液,再用PBST洗涤2次,即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。该酶标板包被抗原的获得采用超声裂解法,相对于热酚法降低了繁琐度并保证了有效性;其中包被过程中,各条件的选择都采用控制单一变量原则经实验分析得出,保证了最佳反应性。
所述超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是:用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(简称:TSA,由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化钠、琼脂等组成)上生长的牛种布鲁氏菌S2308,置于80℃水浴灭活2h后调节菌液浊度,使其浊度约为1×1010CFU/ml;然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3~4次,15min/次。
本研究所建立的检测牛布氏杆菌病的cELISA方法,通过对320份临床牛血清样品的检测并与商品化布病cELISA试剂盒(Svanova公司)比较,结果显示两者的符合率为95.6%,且经第三方实验(补体结合实验)验证不吻合样品,本研究所建立的方法有更高的符合率。其意义在于本方法对布氏杆菌病的血清学检测特异性更强,敏感性更好。
附图说明
图1为单抗Bru-5C10的免疫印迹试验图。
具体实施方式
一、通过细胞融合技术获得对牛种布鲁氏菌有良好反应性的单克隆抗体bru-5C10:
取经过常规免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照标准程序进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清,用间接酶联免疫吸附实验法(iELISA)筛选与牛种布鲁氏菌A99粗提的LPS具有强反应,而与小肠结肠炎耶尔森菌O9粗提的LPS无反应的阳性杂交瘤细胞株。按照有限稀释法进行2次亚克隆获得单克隆抗体bru-5C10。
二、单克隆抗体bru-5C10的保存证明信息:
保藏号CGMCC No.9219,保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏日:2014年5月7日。生物材料:Bru-5C10,分类命名:杂交瘤细胞株。
三、制作牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板:
用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(简称:TSA。胰蛋白胨大豆琼脂培养基由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化钠、琼脂等组成)上生长的牛种布鲁氏菌S2308,置于80℃水浴灭活2h,调节菌液浊度,使其浊度约为1×1010CFU/ml;然后再利用超声裂解破碎菌体:超声频率为30HZ,15min/次,进行3~4次。
将超声裂解处理过的牛种布鲁氏菌A99按1.75µg/孔溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中,100µl/孔加入酶标版中,4℃孵育12h。弃去酶标板中的液体后,用PBST配制的5%脱脂乳,100µl/孔加入酶标版中,封闭后于37℃放置,3h后弃去封闭液,再用PBST洗涤2次,即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。
四、检测试验:
以PBST为缓冲液,将待检样本稀释20倍,待用。
以PBST为缓冲液,分别将牛的阴性血清和阳性血清稀释20倍,待用。
向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的各孔分别加入50µl稀释后的待检样品和50µl用PBST按照1:4000进行稀释的单克隆抗体Bru-5C10。
同时取标准阴性血清和阳性血清作为阴阳对照组,向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的A1-A2孔中分别加入50µl稀释后的阴性血清和50µl工作浓度的单克隆抗体bru-5C10,向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的A3-A4孔中分别加入50µl稀释后的阳性血清和50µl工作浓度的单克隆抗体bru-5C10。
分别将各孔中的体系充分混匀后,将酶标板在37℃孵育30min后,再分别以PBST洗涤4次。再向每孔加入100µl HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育30min后,以PBST洗涤5次。然后加入底物显色液室温作用10min,以2M硫酸终止。
分别读取各孔的OD450值。
OD阴性对照为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和已知的阴性血清的板孔的OD450值;OD待检样品为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的OD450值。
并根据公式100×(1-OD阴性对照/OD待检样品)%分别计算抑制率(PI)。
计算结果:已知的阳性血清相应的抑制率(PI)≥30%,已知的阴性血清相应的抑制率(PI)<30%。
以此为标准,将待检样本各孔的抑制率(PI)进行加合后求平均值,如平均值为≥30%,则待检样本为阳性;如平均值为<30%,则待检样本为阴性。
五、cELISA 的重复性:经重复性实验结果证明,本发明所建立的cELISA批内重复性的平均变异系数为2.2%;批间重复性的平均变异系数为5.9%,表明该cELISA方法具有良好的可重复性。
六、试剂盒中的单克隆抗体与小肠结肠炎耶尔森菌O9、大肠杆菌O157没有交叉反应。
如图1的单抗Bru-5C10的免疫印迹试验图所示,其中:
1显示了牛种布鲁氏菌S2308超声裂解后的上清液与单抗Bru-5C10反应结果;
2显示了牛种布鲁氏菌A99超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果;
3显示了小肠结肠炎耶尔森菌O9超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果;
4显示了大肠杆菌O157超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果。
Claims (3)
1.一种ELISA试剂盒在检测布氏杆菌抗体中的应用,其特征在于包括以下步骤:
1)将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板;
2)将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中;并同时将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中,37℃水浴后,用PBST洗涤,向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体,孵育洗涤后,进行显色反应;
3)测得各板孔的OD450值;
4)由公式100×(1-OD阴性对照/OD待检样品)%分别计算各板孔的抑制率;
其中,OD阴性对照为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和已知的阴性血清的板孔的OD450值;OD待检样品为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的OD450值;
5)判定待检血清样品:抑制率≥30%,则判定待检血清样品为阳性;
所述单克隆抗体bru-5C10为由保藏号为CGMCC No.9219的杂交瘤细胞株分泌。
2.根据权利要求1所述一种ELISA试剂盒在检测布氏杆菌抗体中的应用,其特征在于将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99按1.75µg/孔溶于pH为9.6的碳酸盐缓冲液中,100µl/孔加入酶标板中,4℃孵育12h,弃去酶标板中的液体后,用PBST配制的5%脱脂乳,100µl/孔加入酶标板中,封闭后于37℃放置,3h后弃去封闭液,再用PBST洗涤2次,即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。
3.根据权利要求1或2所述一种ELISA试剂盒在检测布氏杆菌抗体中的应用,其特征在于所述超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是:用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长的牛种布鲁氏菌S2308,置于80℃水浴灭活2h后调节菌液浊度,使其浊度约为1×1010CFU/ml;然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3~4次,15min/次。
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