CN101839917A - I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，同时还涉及一种该试剂盒的检测方法和应用，其中试剂盒包括：经重组VP1蛋白包被的酶标板、辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG抗体、TMB底物显色液、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。本发明利用聚合酶链反应从DHV-1基因组中扩增出VP1基因，构建了含VP1基因的重组表达质粒pET32a-VP1，该质粒转化入宿主菌BL21(DE3)，体外表达VP1蛋白经镍柱纯化后作为抗原，建立酶联免疫吸附试验检测试剂盒，阳性血清为I型鸭肝炎病毒标准阳性血清，阴性对照为鸭标准阴性血清。检测试剂盒特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要应用价值。

Description

I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及一种I型鸭肝炎病毒（Duckhepatitisvirustype-1，DHV-1）血清抗体酶联免疫法ELISA检测试剂盒，同时还涉及一种该试剂盒的检测方法和应用，属于禽类免疫学技术领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎是幼龄雏鸭的一种高度致死性的急性传染病，此病的特征是发病急，传播快，死亡率高，临诊表现为角弓反张，病理变化为肝炎和出血，此病常给养鸭场造成严重的经济损失。此病最先在美国发现，并用鸡胚分离到病毒，其后在英国、加拿大、德国等许多养鸭国家陆续发现此病。我国大部分省市和地区亦有此病的发生且呈上升趋势。鸭肝炎病毒（Duckhepatitisvirus，DHV），在分类上属微RNA病毒科，病毒大小约20～40nm，在电镜下观察感染细胞，病毒在胞浆中呈晶格状排列，病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶和pH3.0均有抵抗力，56℃加热60min仍可存活，但62℃的条件下30min即被灭活。病毒在1%福尔马林或2%氢氧化钠中2h（15～20℃）或在2%漂白粉溶液中3h或者是在0.2%福尔马林或0.25%β-丙内酯中37℃30min均可被灭活。病毒可在污染的孵化器内至少存活10周，在阴凉处的湿粪中可存活37d以上，在4℃条件下可存活2年以上，在-20℃则可长达9年。此病主要感染鸭，在自然条件下不感染鸡、火鸡和鹅。此病的主要通过接触传播，经呼吸道亦可感染，据推测不发生与蛋的传递。在野外和舍饲条件下，此病可迅速传播给鸭群中的全部易感小鸭，表明它具有极强的传染性，感染多由从发病场或有发病史的鸭场购入带病毒的雏鸭引起。由参观人员、饲养人员的串舍以及污染的用具、垫料和车辆等引起的传播经常发生，鸭舍内的鼠类在传播病毒方面亦起重要作用。野生水禽可能成为带毒者，成年鸭感染不发病，但可成为传染来源。雏鸭的发病率与病死率均很高，1周龄内的雏鸭病死率可达95%，1～3周龄的雏鸭病死率为50%或稍低，4～5周龄的小鸭发病率与病死率较低。

鸭病毒性肝炎有三种类型，Ⅰ型呈世界性分布，Ⅱ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎分别局限于英国和美国。鸭病毒性肝炎Ⅰ型（DVH-Ⅰ）引起雏鸭的严重死亡，主要侵害4周龄以内的雏雅，死亡率高达90％。目前国内流行的主要是DHV-Ⅰ，是严重危害鸭子的主要传染病之一。成年鸭在自然条件下被DHV-I感染后，可长期带毒和排毒而不出现临床症状，但进入环境中的DHV-I对4周龄内的雏鸭却有高致病性，从而导致该病毒在鸭群中广泛传播。因此，建立快速、敏感、特异的诊断方法是有效预防和控制该病的关键措施之一。目前，对DHV-I的诊断主要依靠流行病学资料、临床症状、病理变化及病毒的分离和鉴定。但这些方法用于检测感染DHV-I的死亡鸭组织中的病原时存在不足，如检测所需时间长、敏感性较低等，临床应用受到一定的限制。因此，研制开发适用于鸭病毒性肝炎抗体检测的特异的、敏感的、生物安全度高的、适合于基层使用的诊断检测的工具，对鸭免疫水平进行实时监控和建立科学、灵活的鸭病毒性肝炎的免疫程序，以及对疫病的预防和控制有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种试剂盒的检测方法以及在I型鸭病毒性肝炎的检测、流行病学调查和免疫监测方面的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，包括：经重组VP1蛋白包被的酶标板，辣根过氧化酶HRP标记的兔抗鸭IgG抗体，TMB底物显色液，阳性血清，阴性血清。

所述的包被酶标板所用的抗原即重组VP1蛋白是由基因工程菌株BL21体外诱导表达获得，该菌株含表达质粒pET32a-VP1，重组表达质粒pET32a-VP1含有大肠杆菌复制子ori、启动子PT7、外源VP1基因和抗性筛选基因氨苄青霉素Amp基因，其表达式为：-ori-PT7-VP1gene-Ampgene-。

其重组表达质粒pET32a-VP1的构建中，设计并合成的一对特异性引物为：

上游引物P1：5′-CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3′

下游引物P2：5′-GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3′。   

所述的阳性血清为经I型鸭肝炎病毒VP1蛋白免疫获得的I型鸭肝炎病毒标准阳性血清，OD450nm≥1.00。

所述的阴性对照为经筛选获得的鸭标准阴性血清，OD450nm≤0.100。

所述的TMB底物显色液包括显色液A和显色液B，其中显色液A的配制方法如下：200mg四甲基联苯胺（TMB），用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000mL，配制成显色液A；显色液化B的配制如下：称取21g无水柠檬酸，28.2g无水磷酸氢二钠（Na₂HPO4），6.4mL0.75%过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调PH值到4.5-5.0，配制成显色液B。

本发明的技术方案还采用了一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

（1）将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；

（2）将待检血清用样品稀释液作1:100稀释，按100μL孔加入抗体检测板即经重组VP1蛋白包被的酶标板中，同时设只加100μL样品稀释液的空白、鸭标准阴性作为阴性对照、I型鸭肝炎病毒标准阳性血清作为阳性对照，37℃孵育60分钟，甩干；

（3）每孔加洗涤液200μL洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；

（4）每孔加100μL的辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，空白不加，37℃孵育30分钟，甩干；

（5）每孔加洗涤液200μL，洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；

（6）依次加入50μL底物TMB显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育10分钟；

（7）加50μL终止液(2MH₂SO₄)，用酶标仪在450nm波长下读取每孔：

（8）以待测样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值（P/N），大于或等于3判为阳性，小于或等于1.5为阴性，介于1.5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。

另外，本发明的技术方案还采用了I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查方面以及免疫监测方面的应用。

本发明中：

VP1蛋白的制备（即制备包被酶标板所用的抗原）

第一方面构建了表达载体pET32a-VP1。根据GenBank发表的DHV-1的VP1基因序列（序列号：EF653378），利用DNAStar软件分析，设计一对特异性引物，引物两端分别加限制性酶切位点EcoRI和XbaI及保护性碱基（Takara公司合成），下划线部分为酶切位点。

上游引物P1：5′-CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3′EcoRI

下游引物P2：5′-GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3′XbaI

通过PCR获取VP1基因，将获取的VP1基因克隆入pMD18-T载体并进行序列测定，将pMD18-T载体上的目的片段酶切后克隆入pET32a载体，构建重组表达质粒pET32a-VP1，将重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细胞，并用双酶切和PCR进行鉴定，鉴定阳性的质粒即为重组表达质粒pET32a-VP1。

第二方面通过重组表达质粒pET32a-VP1体外高效表达，表达蛋白经镍柱纯化后，测定蛋白浓度，以纯化蛋白为抗原研制ELISA试剂盒。

VP1蛋白的最佳包被条件（即抗体检测板的最佳制备条件）

用PH8.5的0.05MTris-HCl缓冲液作包被液，将上述基因工程表达的VP1蛋白稀释为10μg/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按100μL/孔加入含1%牛血清白蛋白（双（三甲基硅基）乙酰胺BSA），37℃封闭4小时，洗涤甩干，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存。

辣根过氧化酶（HRP）标记的兔抗鸭IgG抗体的制备过程如下：

（1）用超纯水配制辣根过氧化酶（HRP）溶液；加入0.06M过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入160mM乙二醇，室温反应30-60分钟，加入PH4.4的醋酸缓冲液2-8℃透析过夜，换液两次；

（2）将纯化的兔抗鸭IgG加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mMPH9.6的碳酸缓冲液中透析，4℃搅拌过夜，换液两次；

（3）透析液吸至离心管中，加现配的0.05M硼氢化钠溶液，4℃反应2小时，加入等量的饱和硫酸铵溶液4℃放置30-60分钟，4℃4000rpm离心10-20分钟，弃上清，将沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02MPBS（PH7.4）透析，4℃过夜；

（4）收集透析袋中液体，4000rpm离心10-20分钟，上清液即为辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，将其与等量甘油混合，-20℃冻存，以含0.1%双（三甲基硅基）乙酰胺BSA，0.05%吐温-20，0.01%硫柳汞钠，PH7.4的磷酸缓冲液按1:200-5000稀释冻存。

I型鸭肝炎病毒血清抗体ELISA检测试剂盒，其检测程序为：

（1）将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；

（2）将待检血清用样品稀释液作1:100稀释，按100μL孔加入抗体检测板中，同时设只加100μL样品稀释液的空白、鸭标准阴性作为阴性对照、I型鸭肝炎病毒标准阳性血清作为阳性对照，37℃孵育60分钟，甩干；

（3）每孔加洗涤液200μL洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；

（4）每孔加100μL的辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，空白不加，37℃孵育30分钟，甩干；

（5）每孔加洗涤液200μL，洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；

（6）依次加入50μL底物TMB显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育10分钟；

（7）加50μL终止液(2MH₂SO₄)，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值（OD450nm）。

I型鸭肝炎病毒血清抗体ELISA检测试剂盒，其检测样本的判定标准为：

以待测样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值（P/N），大于或等于3判为阳性，小于或等于1.5为阴性，介于1.5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。

本发明是通过构建一个在原核细胞中表达的高效重组表达质粒，利用重组表达质粒的表达产物为抗原，研制检测I型鸭肝炎病毒血清抗体的ELISA试剂盒，专用于I型鸭病毒性肝炎的检测、流行病学调查和免疫监测。本发明试剂盒操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用。本发明ELISA试剂盒在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有很重要的应用价值，可以指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治，因此具有广阔的市场情景和较大的经济、社会效益。

本发明的特点和优点如下：

（1）特异性强，敏感性高，安全性好

本发明重组VP1蛋白为非全病毒抗原、安全性好，不含无关杂蛋白，只与相应亚型I型鸭肝炎病毒阳性血清特异结合，不与鸭其它疫病阳性血清发生交叉反应，具有良好抗原性，因此具有很高的特异性和敏感性，重组表达载体pET32a-VP1的表达产物具有良好的抗原性；

（2）操作简便快速、结果判定准确

使用I型鸭肝炎病毒血清抗体检测试剂盒检测I型鸭肝炎病毒血清抗体时，无需另配其它试剂，样品无需无菌处理，按试剂盒说明书在1-2小时内即可判定检测结果，ELISA检测试剂盒以显色的深浅显示检测结果，即检测孔出现蓝色显色为阳性，中止后成黄色，无色为阴性，采用酶标仪机读数，减少主观性，准确可靠；

（3）成本低，制备简单

I型鸭肝炎病毒血清抗体ELISA检测试剂盒可批量检测，基因工程菌株BL21（DE3）（pET32a-VP1）表达的VP1蛋白表达量很高，可占菌体蛋白60%以上；重组VP1蛋白以可溶性形式存在于菌体内部，收集和纯化比较方便；同时纯化的重组VP1蛋白不需要进行蛋白复性可用于ELISA试剂盒的研制。

I型鸭肝炎病毒结构蛋白VP1位于DHV-1基因组的2103-2816位，VP1全基因由714个核苷酸组成，编码238个氨基酸。3D位于DHV1基因组的6012-7373位，VP1全基因由1362个核苷酸组成，编码454个氨基酸。VP1蛋白大部分暴露在病毒的里面，是决定病毒抗原性的主要成分，VP1蛋白是主要结构蛋白，含有可诱导T、B淋巴细胞反应的多个抗原表位，能诱导机体产生保护性的中和抗体。

本发明利用PCR技术从I型鸭肝炎病毒基因组中扩增出VP1基因，构建了含VP1基因的重组表达质粒pET32a-VP1，该质粒转化入宿主菌BL21（DE3），体外表达VP1蛋白经镍柱亲和层析纯化后作为抗原，建立间接ELISA检测方法，并优化ELISA的反应条件形成检测试剂盒，该试剂盒可在DVH-I的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要应用价值。

附图说明

图1 VP1基因的PCR扩增及重组表达质粒pET32a-VP1的鉴定图谱；

泳道1为DL2000Marker；泳道2为VP1基因的PCR扩增产物；泳道3为pET32a-VP1/EcoRI、XbaI双酶切；泳道4为DL15000Marker；

图2为重组VP1蛋白SDS-PAGE电泳及western-blot分析；

泳道1为低分子蛋白Marker；泳道2为大肠杆菌BL21（重组质粒pET32a-VP1）诱导表达产物；泳道3为大肠杆菌BL21（空质粒pET32a）诱导表达产物；泳道4为重组VP1蛋白western-blot结果；泳道5为重组VP1蛋白western-blot结果；大肠杆菌BL21（空质粒pET32a）诱导表达产物western-blot结果；

图3为灭活疫苗免疫鸭体内抗体的动态变化。

具体实施方式

1、引物设计

根据GenBank发表的DHV-1的VP1基因序列（序列号：EF653378），利用DNAStar软件分析，设计一对特异性引物，引物两端分别加限制性酶切位点EcoRI和XbaI及保护性碱基（Takara公司合成），下划线部分为酶切位点。

上游引物P1：5′-CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3′EcoRI

下游引物P2：5′-GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3′XbaI

2、VP1基因的PCR扩增

PCR反应条件：94℃预热5min，94℃变性1min，55℃退火30sec，72℃延伸50sec，30个循环，最后一个循环后再延伸10分钟。将PCR产物经含有溴化乙锭（EthidiumBromide，EB）1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒（大连TaKaRa公司）使用说明进行回收，并对回收产物进行电泳鉴定约714bp大小片段即为VP1基因（图1）。

3、表达VP1基因的基因工程菌株构建

用EcoRI和XbaI对VP1基因和质粒载体pET-32a进行双酶切，并置于37℃水浴作用2h，酶切产物同样经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行回收鉴定。经过酶切的VP1基因和pET-32a载体按1：3的摩尔比4℃过夜连接。取连接产物加入含有100μL感受态DH5α的聚丙烯离心管中，轻轻混匀后冰浴30min。将聚丙烯离心管从冰中取出后42℃热休克90sec，然后立即冰浴2min。加入800μL37℃预热的LB培养基，于37℃振摇（100～150rpm）45min。取100μL菌液均匀涂布含氨苄青霉素(Amp)50μg/ml的琼脂LB平板，在37℃正置20min后，倒置培养16~20h。按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取质粒。对提取质粒进行EcoRI和XbaI双酶切鉴定。以酶切出现714bp左右大小DNA片段的质粒为阳性质粒（图1）。并将阳性质粒命名为pET32a-VP1。送上海Invitrongen公司测序。采用CaCl₂转化法，将重组质粒pET32a-VP1转化进入大肠杆菌BL21（DE3）中，筛选阳性克隆，即为基因工程菌株。

4、VP1蛋白的诱导表达与免疫转印

挑取基因工程菌株单菌落接种到盛有3mlLB液体培养基（50μg/ml氨苄青霉素）试管中，于37℃振摇培养过夜，第二天从中取出一定量的菌体加到另一盛有3mlLB液体培养基中，使菌体浓度达到OD₆₀₀≈0.1，37℃振摇培养2~4小时，当菌体浓度OD₆₀₀≈0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达4~6h，每隔1小时收集100μL菌液。4000rpm，离心10min，收集菌体，将收集的菌体用100μLPBS重悬后，加等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液（100mmol/LTris??Cl(pH6.8)；200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；4%SDS(电泳级)；0.2%溴酚蓝；20%甘油），100℃煮沸5min以使蛋白质变形，取10μL加样进行SDS-PAGE凝胶电泳，SDS-PAGE电泳凝胶的配制及电泳条件参照分子克隆手册。表达产物诱导3小时即可产生分子量约为43KD的目的条带（图2）。取3小时的培养物超声波处理，12,000r/min、4℃离心5min分离上清和沉淀，用10%SDS-PAGE鉴定，表达蛋白以可溶性形式存在于菌体内部。并进行转印，然后以鸭抗DHV-1血清为一抗，HRP标记的兔抗鸭IgG为二抗作免疫转印鉴定，最后用DAB显色试剂盒显色，在醋酸纤维素膜上可见目的条带（图2）。

5、VP1表达蛋白纯化及蛋白浓度测定

将诱导表达的菌液于12000rmp离心10min收获沉淀，以洗涤液（5mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH7.9）重悬菌体，后经超声波裂解10min，随后12000rmp离心10min收获包涵体沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表达。将此上清用蛋白质Ni柱亲和层析进行纯化，具体操作过程可参照Novagen公司His·bindpurificationkit的说明书，VP1表达蛋白经镍柱纯化后，测定该蛋白浓度。

6、VP1表达纯化蛋白ELISA试剂盒的研制

6.1、ELISA试剂盒的组成成分和最佳反应条件

 1）抗原最佳包被浓度：用PH8.5的0.05MTris-HCl缓冲液作包被液，将上述基因工程表达的VP1蛋白稀释为10μg/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，

 2）洗涤液：PBST/Tween-20（NaCL8g，Na₂HPO₄12H₂O3.6g，KCL0.2g，KH₂PO₄0.2g，Tween-200.5mL，去离子水1000mL）

 3）最佳封闭液：1%牛血清白蛋白（BSA）。

4）血清稀释液：0.01M的PBS（NaCL8g，Na₂HPO₄12H₂O3.6g，KCL0.2g，KH₂PO₄0.2g，Tween-200.5mL，去离子水1000mL），PH7.2

5）血清的最佳稀释浓度：100倍稀释

6）血清与抗原的结合时间：60分钟

7）酶标二抗的最佳稀释浓度和反应时间：2000倍稀释，30分钟

8）显色系统：称取200mg四甲基联苯胺（TMB），用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000mL，配制显色液A；称取21g无水柠檬酸，28.2g无水磷酸氢二钠（Na₂HPO4），6.4mL0.75%过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调PH值到4.5-5.0，配制显色液B;

9）终止液：2MH₂SO₄。

6.2、ELISA的操作程序

（1）将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；

（2）将待检血清用样品稀释液作1:100稀释，按100μL孔加入抗体检测板中，同时设只加100μL样品稀释液的空白、鸭标准阴性作为阴性对照、I型鸭肝炎病毒标准阳性血清作为阳性对照，37℃孵育60分钟，甩干；

（3）每孔加洗涤液200μL洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；

（4）每孔加100μL的辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，空白不加，37℃孵育30分钟，甩干；

（5）每孔加洗涤液200μL，洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；

（6）依次加入50μL底物TMB显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育10分钟；

（7）加50μL终止液(2MH₂SO₄)，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值（OD450nm）。

6.3、判定标准的确定

以待测样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值（P/N），大于或等于3判为阳性，小于或等于1.5为阴性，介于1.5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。

6.4、保存期试验

 按照上述ELISA确定的条件，抗原包被、封闭后，分别在4℃和-20℃保存，于不同时间取出进行ELISA试验，包被ELISA板的保存期在4℃可保存6个月，而在-20℃可保存12个月。

7、本发明ELISA试剂盒的使用说明书

 1）加入100倍稀释液好的血清样品，100μL/孔，每次设阳性、阴性和空白对照，37℃孵育60分钟，取出洗涤5次，每次1分钟；

2）加酶标记的二抗，100μL/孔，37℃孵育30分钟，取出洗涤5次，每次1分钟；

3）依次加入50μL底物TMB显色液A和50μL显色液B，37℃孵育10分钟，2M的浓硫酸终止反应，50μL/孔，酶标仪测吸光值（波长450nm）；

4）以待测样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值（P/N），大于或等于3判为阳性，小于或等于1.5为阴性，介于1.5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。

8、ELISA试剂盒的应用

8.1、ELISA试剂盒检测I型鸭肝炎病毒灭活疫苗鸭血清样品

I型鸭肝炎病毒灭活苗免疫20只7日龄健康雏鸭（试验前检测I-DHV抗体阴性），收集免疫后0d、5d、10d、15d、20d、25d、30d、35d血清；在结果显示I-DHV抗体阴性的10日龄鸭经免疫接种后5天ELISA就可以检测到相应的抗体，25天后OD值下降，表明本发明的ELISA试剂盒中VP1纯化的表达蛋白具有良好的抗原性，能特异性地检测到免疫鸭血清中的抗VP1抗体（图3）。

8.2、ELISA试剂盒检测临床血清样品

应用本发明所研制的试剂盒对来自河南、山东、江苏等地发病鸭群的2100份鸭血清进行了I型鸭肝炎病毒血清抗体的检测，结果检出抗体阳性鸭血清1839份，为了进一步检测该方法的特异性和敏感性，我们先后从抗体阳性鸭中随机抽取了200份发病肝脏，通过9-11日龄鸭胚进行了病毒的分离鉴定。结果，200份从发病的肝脏分离物通过RT-PCR试验检测证明均为病毒阳性，二者的符合率达100%。说明本发明的试剂盒在实际应用中具有良好的特异性和敏感性。同时也表明本发明所研制的试剂盒可以检测I型鸭肝炎病毒感染，可以指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治，本试剂盒在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要的应用价值。

Claims (10)

1.一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，包括：经重组VP1蛋白包被的酶标板，辣根过氧化酶HRP标记的兔抗鸭IgG抗体，TMB底物显色液，阳性血清，阴性血清。

2.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述的包被酶标板所用的抗原即重组VP1蛋白是由基因工程菌株BL21体外诱导表达获得，该菌株含表达质粒pET32a-VP1，重组表达质粒pET32a-VP1含有大肠杆菌复制子ori、启动子PT7、外源VP1基因和抗性筛选基因氨苄青霉素Amp基因，其表达式为：-ori-PT7-VP1gene-Ampgene-。

3.根据权利要求2所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，其重组表达质粒pET32a-VP1的构建中，设计并合成的一对特异性引物为：

上游引物P1：5′-CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3′

下游引物P2：5′-GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3′。

4.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性血清为经I型鸭肝炎病毒VP1蛋白免疫获得的I型鸭肝炎病毒标准阳性血清，OD450nm≥1.00。

5.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述的阴性对照为经筛选获得的鸭标准阴性血清，OD450nm≤0.100。

6.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：辣根过氧化酶HRP标记的兔抗鸭IgG抗体的制备方法为：

（1）用超纯水配制辣根过氧化酶HRP溶液，加入0.06M过碘酸钠溶液4℃避光1-2小时，加入160mM乙二醇，室温反应30-60分钟，加入pH4.4的醋酸缓冲液2-8℃透析过夜，换液两次；

（2）将纯化的兔抗鸭IgG加入步骤（1）经活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mMpH9.6的碳酸缓冲液中透析，4℃搅拌过夜，换液两次；

（3）透析液吸至离心管中，加0.05M硼氢化钠溶液，4℃反应1-2小时，加入等量的饱和硫酸铵溶液4℃放置30-60分钟，4℃4000rpm离心10-20分钟，弃上清，将沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02MPBS（pH7.4）透析，4℃过夜；

（4）收集透析袋中液体，4000rpm离心10-20分钟，上清液即为辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，将其与等量甘油混合，-20℃保存。

7.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述的TMB底物显色液包括显色液A和显色液B。

8.根据权利要求7所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述的显色液A的配制方法如下：200mg四甲基联苯胺（TMB），用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000mL，配制成显色液A；所述的显色液化B的配制如下：称取21g无水柠檬酸，28.2g无水磷酸氢二钠（Na₂HPO4），6.4mL0.75%过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调PH值到4.5-5.0，配制成显色液B。

9.如权利要求1—8中任一条所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；

（2）将待检血清用样品稀释液作1:100稀释，按100μL孔加入抗体检测板即经重组VP1蛋白包被的酶标板中，同时设只加100μL样品稀释液的空白、鸭标准阴性作为阴性对照、I型鸭肝炎病毒标准阳性血清作为阳性对照，37℃孵育60分钟，甩干；

（3）每孔加洗涤液200μL洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；

（4）每孔加100μL的辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，空白不加，37℃孵育30分钟，甩干；

（5）每孔加洗涤液200μL，洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；

（6）依次加入50μL底物TMB显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育10分钟；

（7）加50μL终止液(2MH₂SO₄)，用酶标仪在450nm波长下读取每孔：

（8）以待测样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值（P/N），大于或等于3判为阳性，小于或等于1.5为阴性，介于1.5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。

10.如权利要求1—8中任一条所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免疫监测方面的应用。

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