CN103073642A

CN103073642A - Crp单克隆抗体纳米乳胶微球组合物及制备工艺

Info

Publication number: CN103073642A
Application number: CN2012103112194A
Authority: CN
Inventors: 王雷; 李一凡
Original assignee: SHENZHEN BIOMAT TECH PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN BIOMAT TECH PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2012-08-29
Filing date: 2012-08-29
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2032-08-29
Also published as: CN103073642B

Abstract

本发明公开了一种CRP单克隆抗体、CRP抗体纳米乳胶微球组合物及制备工艺；所述CRP抗体纳米乳胶微球组合物为不同抗原表位的CRP单克隆抗体，与不同粒径的羧基化聚苯乙烯微球共价交联形成偶联物，然后将不同偶联物按一定比例混合制成CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物。本发明所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物与全自动生化分析仪、特种蛋白分析仪匹配，可全量程测定人全血和血清中C反应蛋白浓度，应用于细菌与病毒性感染的鉴别诊断、药物治疗监测及心血管疾病的风险评估。

Description

CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物及制备工艺

技术领域

本发明属于医学免疫领域，涉及C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)单克隆抗体(Monoclonal antibody，McAb)的制备，涉及C反应蛋白单克隆抗体纳米乳胶微球的偶联，涉及不同C反应蛋白抗体纳米乳胶微球偶联物的组合，还涉及C反应蛋白的检测应用。

背景技术

C反应蛋白是可在急性炎症病人血清中浓度升高的可以结合肺炎球菌细胞壁C多糖的蛋白质。人类C反应蛋白至少可以有两种存在形式，一种是由五个相同的亚基以非共价键形成五聚体(pentameric CRP，pCRP)，这是血清中CRP主要存在形式；另一种为单个亚基的单体(modified/monomeric CRP，mCRP)，可由五聚体在活化的血小板膜上分解形成。作为一种急性时相反应蛋白，血浆中CRP浓度在正常人中含量极微，一般新生儿血清CRP水平小于2mg/L，儿童和成人小于10mg/L，但在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著的增高，可达正常水平数百倍甚至上千倍。CRP上升速度、幅度和持续时间与病情和组织损伤的严重程度密切相关，因此作为炎症和组织损伤的非特异性标志物被广泛应用于临床疾病诊断和风险评估。

CRP浓度的临床检测方法主要有胶乳凝集法、免疫层析法、化学发光法、放射免疫法、酶联免疫吸附法及乳胶增强比浊法等，其中乳胶增强比浊法是目前公认检测效率最高的方法。CRP检测按其浓度检测范围大致分为两类：第一类是普通CRP检测，检测范围通常在3-200mg/L，但其线性范围不能覆盖微量CRP。第二类是高敏CRP(high-sensitivity CRP，hs-CRP)检测，它比常规检测方法更敏感，灵敏度可低于0.3mg/L，能准确定量0.1~10mg/L浓度范围内的CRP，临床上用于评估心脏病发病风险，但是高敏CRP试剂无法检测更高浓度的CRP。

目前在国内用乳胶增强免疫比浊法测定CRP的试剂盒中，其致敏乳胶微球的抗体大多为CRP多克隆抗体(Polyclonal antibody，PcAb)，或是采用两种粒径微球分别偶联CRP多克隆抗体后混合作为反应试剂。这些试剂盒有以下不足：首先，虽然多克隆抗体乳胶微球比单克隆抗体乳胶微球具有更高的灵敏度，但线性范围较窄，单独使用不易达到CRP全程测量的要求；其次，单一粒径的微球偶联CRP多克隆抗体制备乳胶微球增强免疫比浊试剂，无法同时测定高浓度和低浓度水平下的CRP含量。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术上的不足，提供多株互补配对的CRP单克隆抗体及多克隆抗体，并与纳米乳胶微球偶联，偶联物按比例混合制成组合物，应用于CRP免疫定量试剂盒的制备，可与全自动生化分析仪、特种蛋白分析仪等仪器匹配进行免疫透射和免疫散射比浊测定人全血、血清CRP浓度，实现CRP全量程检测。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：选择高亲和力的CRP单克隆抗体的多株互补配对亚型，用特殊工艺分别与合适粒径的羧基化聚苯乙烯微球偶联，制成CRP单克隆抗体纳米乳胶微球偶联物，该偶联物可按不同的比例与CRP多克隆抗体乳胶微球偶联物混合，从而提高CRP检测的性能指标。

本发明可应用于免疫比浊法（散射免疫/透射免疫比浊）测定人血CRP浓度。

本发明的具体步骤如下：

1，从人血清纯化天然CRP作为免疫原，制备高特异性、高亲和力、高纯度的CRP单克隆抗体。

2，选择合适粒径的羧基化聚苯乙烯微球，通过1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDAC)活化微球表面的羧基，生成活性酯，再与CRP单克隆抗体上的伯胺基反应，形成共价键，完成交联，获得CRP单克隆抗体乳胶微球偶联物。

3，选择合适的储存液悬浮CRP单克隆抗体乳胶微球偶联物，或将不同CRP抗体乳胶微球偶联物按一定比例混合，配制成适合CRP检测的试剂，使其同时满足高灵敏度和宽线性范围的要求，用于临床上乳胶增强免疫比浊法检测CRP浓度。

步骤1所述的CRP单克隆抗体是用人C反应蛋白免疫，可以是人源性、鼠源性或兔源性等，但并不限于此。CRP单克隆抗体来源可以是杂交瘤细胞免疫动物的腹水，也可以是CHO细胞表达，或杂交瘤无血清培养。纯化方式为硫酸铵沉淀和亲和柱纯化。所获得的抗体具有互补配对的不同抗原识别表位，可以是不同的抗体亚型，其抗原抗体亲和力(affinity)Ka≥1×10⁸M^-1。

步骤2所述的交联方法为碳二亚胺法。碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使羧基与氨基脱水形成酰胺键。本发明选用EDAC作为交联剂，它属于碳二亚胺类中可溶于水的一种，适用于蛋白质的偶联。EDAC与羧基反应形成O-酰基异硫脲中间体，该中间体易于水解，在水溶液中很不稳定。该中间体(O-酰基异硫脲)在N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)存在的情况下，可以形成具有与氨基反应活性的NHS-活性酯，这种NHS-活性酯中间体非常稳定。因此，本发明选用EDAC和Sulfo-NHS活化羧基微球，可提高活化效率。

步骤2所述的聚苯乙烯微球粒径在50-500nm。其中，小粒径微球偶联弱亲和力单克隆抗体，可提高测试的线性范围。大粒径微球偶联强亲和力单克隆抗体，可提高检测灵敏度。与每毫克聚苯乙烯微球交联的抗体量可根据检测需要进行调整，范围可以是0.03-1毫克。

步骤3所述的偶联物，是指CRP单克隆抗体和羧基聚苯乙烯微球共价交联的偶联物，该偶联物可以是同种微球偶联不同亚型的CRP单克隆抗体，也可以是不同粒径微球偶联不同亚型的CRP单克隆抗体。将几种偶联物悬液按不同比例混合，可拓宽CRP乳胶增强免疫比浊法检测的线性范围。

本发明所述CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物还涉及乳胶微球的悬浮缓冲液(储存液)和与抗原反应的缓冲液(反应液)。

本发明所涉及缓冲液可选用具有相似性质的一种或几种：磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液及甘氨酸缓冲液等。

储存液可选择上述一种合适缓冲液，盐浓度在20-300mM。其中可添加蛋白稳定剂，如蔗糖(参考浓度5-15%)、SDS(参考浓度0.005-0.03%)等，还可添加非离子表面活性剂，如TritonX-100(参考浓度0.005-0.05%)。

反应液可选择上述一种合适缓冲液，其中可添加非离子表面活性剂和加速反应的增浊剂，如聚乙二醇4000(参考浓度0.05-3%)和吐温20(参考浓度0.01-0.05%)等。溶血剂在检测样本为全血时也可添加。

储存液和反应液中可添加防腐剂如叠氮钠(参考浓度小于0.1%)和小牛血清蛋白(参考浓度0.05-1%)。

本发明具有以下特性与效果：

1.本发明所涉及的CRP单克隆抗体所使用的免疫原是从人血清纯化而来，比CRP重组蛋白有更多天然抗原表位。通过动物免疫、细胞融合、筛选和克隆化，优选出7C1(IgG)和5D1(IgG)两种互补配对的杂交瘤细胞亚型。经细胞培养或接种小鼠，获得高亲和力的单抗，其抗原亲和力均高于1×10⁸M^-1。本项目建立的杂交瘤细胞大规模培养工艺，使生产的CRP单克隆抗体在不同生产批次间差异小，质量稳定。单克隆抗体的纯化采用硫酸铵初步沉淀捕获抗体，随后用蛋白G亲和层析柱精细纯化，使其纯度大于99%。CRP单克隆抗体可作为ELISA、免疫沉淀、免疫层析和化学发光等CRP检测试剂盒的原料，用途广泛。

2.本发明所涉及的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球，是用活化剂EDAC和Sulfo-NHS将乳胶微球上的羧基转化为稳定中间体，使抗体上的伯胺与之能稳定高效的形成肽键，从而将CRP单克隆抗体偶联于合适粒径的羧基化聚苯乙烯微球上。通过调节偶联物储存缓冲液的配方，CRP乳胶微球可在4℃条件下稳定保存二年。

3.CRP纳米乳胶微球根据需要可调配成普通、高敏及全量程乳胶增强免疫比浊试剂，它由不同乳胶微球混合配制实现。如要配制全量程CRP乳胶增强免疫比浊试剂，制备步骤为：两种亚型的CRP单克隆抗体分别偶联，或混合偶联同一微球或不同微球；CRP多克隆抗体血清用抗原亲和柱纯化，先用低酸性洗脱液洗脱弱亲和力的多抗部分，然后降低洗脱液pH值，洗脱下强亲和力的多抗部分，将弱亲和力多抗和强亲和力多抗分别与不同微球偶联。将这些抗体偶联物分别与CRP抗原进行免疫比浊反应测试，筛选高灵敏度和宽线性范围的偶联物，将其按比例两两混合，确定符合临床检测需要的同时具有高灵敏度和宽线性范围的最佳偶联物比例。

4.本发明所涉及的CRP纳米乳胶微球组合物具有灵活、普适的特点，可用于血清及全血CRP的检测。通过调节CRP抗体纳米乳胶微球组合物配方及其比例，可以满足免疫比浊透射和散射检测的需要，为试剂盒生产提供可靠原料。

附图说明

图1a直接ELISA法对C反应蛋白(CRP)单克隆抗体7C1亲和力常数的测定。

图1b直接ELISA法对C反应蛋白(CRP)单克隆抗体5D1亲和力常数的测定。

图2夹心ELISA法检测单克隆抗体7C1与5D1的抗原表位互补性。7C1作为捕获抗体，HRP-5D1为检测抗体。

图3a CRP抗体乳胶颗粒组合物测定线性范围曲线(透射比浊法，浓度范围0-350mg/L)。

图3b CRP抗体乳胶颗粒组合物测定线性范围曲线(透射比浊法，浓度范围0-20mg/L)。

图4CRP抗体乳胶颗粒组合物测定线性范围曲线(散射比浊法)。

图5激光粒度分析仪分析CRP抗体纳米乳胶颗粒偶联物的直径分布(动态光散射法)。

具体实施方式

实施例1

CRP单克隆抗体的制备

1人血清CRP的分离纯化

1.1硫酸铵沉淀总蛋白

用饱和度为80%的硫酸铵沉淀人血清样本(CRP>100mg/L)中的总蛋白，4℃沉淀过夜；次日，以8000rpm，4℃离心30min，用基础缓冲液(20mM Tris-HCl,pH7.8)溶解沉淀，充分透析，除去硫酸铵。

1.2初级纯化CRP

取适量活化好的DEAE填料(Diethylaminoethyl cellulose)装柱，用上述基础缓冲液平衡。将上述预处理的样品上样，通过改变离子强度进行梯度洗脱(洗脱液中NaCl浓度分别为80mM、120mM、250mM)，分别收集洗脱液，用紫外分光光度计测定蛋白浓度，至A_280nm<0.002。洗脱液进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测，以确定CRP所在的洗脱液区段。

1.3亲和层析精细纯化CRP

用1mM HCl对1g CNBr-activated Sepharose 4B(Sigma)填料进行溶胀和洗涤，加入30mg用偶联缓冲液(100mM NaHCO₃，500mM NaCl，pH8.3)充分透析的CRP多克隆抗体，4℃搅拌偶联过夜；次日，用1M的乙醇胺封闭2小时；以缓冲液A(100mM NaAc,500mM NaCl,pH4.0)与缓冲液B(100mM Tris-HCl,500mMNaCl,pH8.0)交替洗涤3次，然后装柱。同时将上述初级纯化的目的蛋白用结合缓冲液(20mM Tris-HCl,120mM NaCl,pH7.8)充分透析后，上样于上述亲和层析柱，然后以洗脱液(100mM NaAc,500mM NaCl,pH2.9)充分洗脱，收集洗脱液，至紫外分光光度计测量值A_280nm<0.002，采用BCA蛋白定量试剂盒(PIERCE)测定纯化的CRP浓度，使用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定。所获得的纯化CRP用于后述CRP抗原免疫小鼠和其他相关检测。

2CRP单克隆抗体的制备

2.1CRP抗原免疫小鼠

首先饲养6-8周龄及体重为20-25g的BALB/c小鼠用于实验。取健康BALB/c小鼠3只，第1次用50μg纯化的人CRP与等体积的完全福氏佐剂混合至完全乳化，经颈背部皮下、腋下及腹股沟多点注射。以后每隔3周，以不完全福氏佐剂加50μg纯化CRP蛋白溶液用相同方法加强免疫1次，重复3次。细胞融合前3天，取相同的抗原量在尾静脉注射追加免疫1次，作为加强免疫。然后进行效价测定，用血清多抗的稀释度表示。如果免疫后的小鼠血清与抗原样品有特异性结合(Western blot)，抗血清效价在1：10000以上(Dot blot方法)，则进入下列步骤。

2.2免疫脾细胞的制备和NS-1小鼠骨髓瘤细胞的培养

免疫脾淋巴细胞的制备：上述加强免疫3天后，用颈椎脱臼法将小鼠处死，然后将小鼠浸泡于75%酒精5分钟。以下在超净台中无菌操作：取出小鼠脾脏，浸泡于PBS，在脾脏表面用注射器制造5-10个小孔，随后将装满5ml PBS的注射器插入脾脏，逐步用PBS冲洗脾脏内部，淋巴细胞从脾脏表面小孔流出到培养皿溶液中。最终收集1×10⁸个淋巴细胞。

NS-1骨髓瘤细胞的培养：选择对数生长期的细胞进行传代培养。为避免细胞返祖，每隔3个月用含有8-氮鸟嘌呤(8-AG)的培养液中培养一次。细胞密度适宜(0.1～1×10⁶个/ml)，经台盼蓝染色，活细胞数应>90％。

2.3细胞融合

将上述准备好的淋巴细胞和骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行细胞融合。融合方法：将NS-1骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞的比例为1：2～5混合，将1ml 50%的PEG4000(无菌，预温37℃)在1分钟内滴完，静置90秒，然后立即将事先准备的10ml细胞培养液逐滴加入，停止PEG作用。

2.4杂交瘤细胞的选择培养

由于骨髓瘤细胞带有两种基因的突变，在HAT培养液(hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium)中不能生长；而脾淋巴细胞没有上述两种基因突变，能在HAT培养液中存活，但自身体外无法增殖，只有二者形成的杂交瘤细胞才能繁殖。根据细胞数量加入HAT培养基，使96孔板中每孔细胞数为(0.5-1.5)×10⁵个。融合后7天，换用HT培养液。HT是次磺嘌呤(Hypoxanthine，10mM)和胸腺嘧啶核苷(Thymidine，1.6mM)的混合剂，作为DNA补救合成途径的补充剂，用以克服细胞内残留氨基喋呤(Aminopterin)对DNA经典合成途径的抑制作用。

如果由于细胞密度过低不利于细胞生长繁殖，可用小鼠腹腔细胞作饲养细胞，其存活一般不超过2周，不影响随后杂交瘤细胞的纯化。

2.5杂交瘤细胞的筛选

用HAT选择培养基培养4-7天后，当细胞集落约20%左右时，利用已包被好CRP抗原的酶标板，采用间接ELISA方法，进行阳性克隆筛选，然后用Western blot鉴定。将两种筛选均为阳性的细胞株进行克隆化培养，以确保产生的抗体具有较高特异性。

首先进行间接ELISA法鉴定单抗的特异性。用人CRP包被酶标板(每孔10ng)，以筛选得到的杂交瘤细胞培养上清为一抗，以NS-1细胞培养上清作为阴性对照，37℃孵育1.5小时，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，37℃孵育1小时，最后以TMB显色，测A_450OD值。其中CRP蛋白包被板A₄₅₀值高于空白对照板A₄₅₀值2.1倍以上的融合细胞株视为阳性。

通过以上ELISA初筛的克隆，用Western blot法进行鉴定。取纯化的人CRP蛋白，进行SDS-PAGE电泳后，转移至NC膜上；用50g/L的脱脂奶粉室温封闭2小时；以筛选所得的杂交瘤细胞培养上清为一抗,4℃孵育过夜；二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，1∶1000稀释于50g/L的溶于PBS的脱脂奶粉，37℃孵育1小时。用ECL或ECL plus试剂盒(Amersham公司)显色，成像。

2.6杂交瘤细胞的克隆化

上一步骤产生的细胞可能是分泌不同单抗的杂交瘤细胞的混合，或混有其他细胞，需要进一步克隆以获取分泌单一抗体的杂交瘤细胞系。选取检测结果强阳性且细胞状态佳的融合孔，通过有限稀释法克隆化。细胞悬液通过系列稀释，每个培养孔含预测细胞数目0.5-1个，然后再次筛选。如此重复，直到用间接ELISA检测阳性率达100%。将阳性细胞扩大培养，收集上清并冻存融合细胞。

2.7单克隆抗体的生成和纯化

单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。接种前1周对BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，一周后取(0.5～1.0)×10⁶个杂交瘤细胞接种于该小鼠，1-3周内形成腹水，腹水中单克隆抗体浓度可达5-10mg/ml。

在CRP单克隆抗体纯化之前，需对腹水进行预处理，这是为了去除腹水中细胞及其残渣、小微球物质、以及脂肪滴等。用二氧化硅吸附法，将新鲜采集的腹水(或冻存的腹水)，2000rpm/min 15分钟，除去细胞成分(或冻存过程中形成的固体物质)等。取上层清亮的腹水，等量加入pH7.2巴比妥缓冲盐水(VBS；0.004M巴比妥，0.15M NaCl，0.8mM Mg²⁺，0.3mM Ca²⁺)稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

经上述预处理的腹水，进一步用亲和纯化法进行纯化。用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体Sepharose交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。葡萄球菌A蛋白可与IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外分光光度计粗略测量，小鼠IgG单克隆抗体溶液A₂₈₀为1．44时相当于l mg/ml。为保持纯化抗体的活性，需在收集管内预置pH中和液，抗体经过低pH值洗脱液洗脱于该收集管内。

2.8单克隆抗体的鉴定

抗体Ig亚类鉴定：取杂交瘤培养上清及腹水单抗，用Sigma公司的小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(IsoQuick^TM kit for mouse monoclonal isotyping)进行鉴定，方法按说明书进行。所得两个单克隆抗体7C1和5D1亚型都是IgG1。

特异性测定：用Western blot方法检测确定人血清除CRP外的其他抗原与所检测单克隆抗体没有非特异性结合。

效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示。筛选所得的McAb细胞培养上清为一抗，两个单克隆抗体7C1和5D1抗血清效价在1：10000以上。

2.9单克隆抗体的大量制备

采用发酵罐式生物反应器大规模制备单克隆抗体，并采用无血浆培养基技术以减少污染，简化抗体提纯，从而既可保证制备高纯度抗体，提高试剂盒灵敏度，又可保证大规模生产的需要，能直接运用于企业大规模生产。

实施例2

直接ELISA法测定CRP单克隆抗体亲和力常数

实验材料：鼠抗人CRP单克隆抗体，来自CRP单克隆抗体细胞株培养上清液，0.22μm滤膜过滤，经Sepharose Protein G亲和纯化、Superdex 200凝胶过滤，收集200kD-100kD的分离组分，超滤浓缩至一定浓度后，0.22μm滤膜过滤，-20℃储存于PBS缓冲液加20%(v/v)甘油中。间接ELISA法测定效价为2.5×10⁶。

实验步骤：用非竞争酶免疫试验检测单克隆抗体亲和力常数。上述纯化所获得人CRP蛋白以每个反应孔0.1μg和0.2μg铺板固定，分别用单克隆抗体7C1和5D1作为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)偶联的兔抗鼠IgG为二抗，在OD_450nm读数，分别检测并计算单克隆抗体7C1和5D1的亲和力常数。以获得的数据作图1a和图1b，其纵坐标均为OD450值，横坐标均为单克隆抗体浓度(μg/ml)的对数。图1a和图1b分别显示单克隆抗体7C1和5D1不同抗体浓度在两个抗原浓度(0.1μg和0.2μg)条件下的OD值曲线，将曲线接近平台(表示全部抗体被结合)OD值的50%时结合抗体的浓度数值，代入公式Ka=(n-1)/2[n(Ab’)t-(Ab)t]，求出亲和力常数Ka。其中，CRP单克隆抗体7C1亲合力常数Ka=1.1×10⁸M^-1，5D1亲合力常数Ka=1.8×10⁸M^-1。

实施例3

夹心ELISA法鉴定CRP单克隆抗体7C1和5D1具有不同抗原表位

实验材料：见实施例2。

实验步骤：选择两株互补配对的单克隆抗体7C1和5D1，检测它们的抗原表位是否不同。每个反应孔用0.2μg单克隆抗体7C1作为捕获抗体包被固相载体，每个反应孔用0.02μg辣根过氧化物酶(HRP)偶联的单克隆抗体5D1作为检测抗体。人C反应蛋白纯化后用BCA法定量，然后用PBS缓冲液稀释至不同浓度，进行夹心ELISA法检测。以OD_450nm读数检测。检测结果见表1。以表1数据作图2。图2纵坐标为OD_450nm的测量数值，横坐标为不同CRP抗原浓度(mg/L)的对数值。

表1

CRP浓度(mg/L)	OD₄₅₀
		0	0.071
0.2	0.125
		0.39	0.161
0.78	0.257
		1.56	0.394
3.12	0.718
		6.25	1.313
12.5	2.093
		25	2.513

实施例4

CRP单克隆抗体与微球偶联物的制备

实验材料：

1.鼠抗人CRP单克隆抗体5D1，见实施例2。

2.羊抗人CRP多克隆抗体，来自羊抗人CRP血清(购自美国IIC公司)的亲和纯化。具体方法为：2mg CRP抗原偶联到1mg NHS活化琼脂糖凝胶柱(购自GE公司)上，制成NHS-CRP抗原亲和柱。将羊抗人CRP血清稀释后过柱，用PBS缓冲液和0.1M pH4.0柠檬酸缓冲液清洗杂蛋白，0.1M pH2.5甘氨酸缓冲液洗脱，0.22μm滤膜过滤后，-20℃储存于含20%(v/v)甘油的PBS缓冲液中。间接ELISA法测定效价为5×10⁶。

3.聚苯乙烯微球：260nm、233nm、90nm和60nm微球购自伊普西隆公司；220nm和120nm微球购自BangsLab公司；73nm微球购自Invitrogen公司。

实验步骤：

1.微球悬液制备：取2.7mg 220nm或80nm聚苯乙烯微球悬液，分别加入20mM 2-吗啉乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonic Acid,MES)pH6.1溶液，分别混匀，17000rpm 2-10℃离心清洗2-3次(220nm,微球粒径≥150nm)；或5500rpm 2-10℃超滤稀释大于一百倍(80nm,微球粒径＜150nm)；最终沉淀悬于240μL 20mM MES pH6.1溶液。在该微球悬液中先后加入32.57g/L Sulfo-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液和19.2g/L EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐)溶液各15μL，室温旋转摇床孵育40min；17000rpm 2-10℃离心30min，弃上清，沉淀中加入0.3-1mL 20mM MES pH6.1溶液清洗1-2次，然后将微球悬于90μL 20mM MES pH6.1溶液中，水浴超声振荡混悬，即制成微球悬液，于4℃保存备用。

2.抗体溶液制备：先后向20mM MES pH6.1溶液中添加BSA溶液和单克隆抗体或多克隆抗体溶液，使BSA终浓度为2mg/mL，抗体终浓度为1mg/mL，且偶联抗体溶液总体积为180μL。

3.抗体乳胶微球制备：

在上述220nm微球悬液中加入180μL CRP多克隆抗体,在上述80nm微球悬液中CRP单克隆抗体溶液，立即混匀，室温旋转摇床孵育2小时。然后加入1M Tris-HCl pH9.0使Tris-HCl终浓度为0.1M，室温旋转摇床孵育1小时。

于抗体乳胶微球悬液中加入封闭液(终浓度含20mM Tris pH8.0，0.1%BSA，0.09%NaN₃，0.03%TritonX-100)，室温旋转摇床孵育20min。17000rpm 2-10℃离心20-40min，弃上清，然后加洗涤液(终浓度含20mM Tris pH8.0,0.05%SDS，0.09%NaN₃，0.03%TritonX-100)超声混悬，室温旋转摇床孵育20min。17000rpm2-10℃离心20-40min，弃上清，用储存液定容至1mL。最终获得抗体乳胶微球为每毫克微球偶联67微克CRP抗体。

实施例5

CRP抗体乳胶微球组合物用于透射比浊法及反应线性测定

根据实施例4，得到220nm微球和CRP多克隆抗体偶联物(记为220CRPpAb)和80nm微球和CRP单克隆抗体偶联物(记为80CRPmAb)，二者以1:3体积比混合，即为C反应蛋白抗体乳胶微球组合物。

校准品为溶于PBS pH7.4(含1%BSA)的C反应蛋白溶液，浓度见表2a和表2b。

检测仪器为迈瑞BS-120全自动生化分析仪，可在340nm和700nm波长处用透射比浊法测定免疫复合物浊度。

采用两点速率法，即观察在零级反应期内两个时间点的吸光度，用两个点的吸光度的差值(ΔOD)除以时间(分钟)，计算出每分钟的吸光度变化值。

表2a和表2b为不同浓度范围C反应蛋白校准品所对应的吸光度差值的变化。

表2a

表2b

依据表2a制做图3a，回归方程为y=0.0038x+0.0057，相关系数为R²=0.9982。

根据表2b制作图3b，回归方程为y=0.004x-0.001，相关系数为R²=0.9987。

该C反应蛋白抗体微球组合物检测灵敏度为0.25mg/L，线性范围为1.5-247mg/L。

实施例6

CRP单克隆抗体与微球偶联物的制备

实验材料：见实施例2。

实验步骤：

1.微球悬液制备：

取1mg 233nm和60nm微球悬液，用活化缓冲液(20mM MES pH5.5)清洗2-3次，最后分别悬于50μL活化缓冲液中。

用活化缓冲液配制15mM EDAC溶液和15mM Sulfo-NHS溶液。于50μL微球悬液中先后加入5μL EDAC溶液(终浓度为1.1mM)和5μL Sulfo-NHS溶液(终浓度为1.1mM)，室温旋转摇床孵育20min。

17000rpm，2-10℃，离心30min，弃上清，沉淀用活化缓冲液清洗，水浴超声振荡混匀，然后17000rpm，2-10℃，离心30min，弃上清，将微球悬于50μL活化缓冲液中，水浴超声振荡混匀备用。

2.抗体溶液制备：用活化缓冲液稀释CRP单克隆抗体或CRP多克隆抗体，终浓度至3mg/mL。

3.抗体乳胶微球制备：于微球悬液加入50μL抗体溶液，室温旋转摇床孵育2h，期间水浴超声10s，冰上放置30s，共3-4次；加入2M甘氨酸缓冲液pH11溶液，使甘氨酸缓冲液终浓度为50mM，室温旋转摇床孵育30min。17000rpm，2-10℃，离心20-40min，弃上清，向沉淀中加封闭液(含1%BSA的PBS pH7.4溶液)，室温旋转摇床孵育30min；17000rpm，2-10℃，离心20-40min，弃上清；再清洗1-2次，用储存液定容至1mL，超声振荡混匀，使悬液终浓度为0.1%。

实施例7

CRP抗体乳胶微球组合物用于散射比浊法测定

根据实施例6，得到233nm微球与C反应蛋白多克隆抗体偶联物(记为233CRPpAb)和60nm微球与C反应蛋白单克隆抗体偶联物(记为60CRPmAb)，二者按1:3体积比混合。

标准品为溶于PBS pH7.4(含1%BSA)的C反应蛋白溶液，浓度见表3。

检测仪器为国赛Nephstar Plus特定蛋白分析仪，使用散射比浊法测定。Nephstar Plus特定蛋白分析仪UPC模式下默认反应时间为30s/60s，其中读取时间为30s。

于测量杯中加入620μL反应液(含CRP稀释液)，再加2μL上述不同浓度CRP标准品溶液，混合后放入测量通道，加60μL实施例6获得的CRP单克隆抗体乳胶微球组合物悬液，按反应启动键立即反应，读取吸光值。

表3

表3是对不同浓度的C反应蛋白校准品进行散射测试，每个标准品分别测试三次所得到的吸光度值。根据表3中每个标准品浓度的三次吸光度读数取平均值，制作图4。

实施例8

为了鉴定偶联过程对纳米微球大小的影响，我们对单克隆抗体与纳米微球(50-500nm)偶联物用激光粒度分析仪(Malvern Zetasizer Nano-ZS)分析其微球大小分布情况。该仪器采用动态光散射法(Dymanic Light Scattering,DLS)，或称光子相关光谱法(PCS,Photon Correlation Spectroscopy)，其基本原理是依据微球大小与布朗运动的关系：即液体中纳米微球大小(Size)与布朗运动是相关的，即大微球布朗运动慢，小微球布朗运动快；微球受激光照射后会产生散射光信号(Intensity)，由于液体中微球做布朗运动，该散射光信号随微球的布朗运动而波动，大微球布朗运动慢故散射光信号变化慢，小微球布朗运动较快故散射光信号变化快，仪器在极短的时间间隔(如百万分之一秒或十亿分之一秒)连续检测散射光信号，由于检测间隔时间极短，这些散射光信号是有相关性的，但随着检测间隔时间增加，该相关性必然下降，由此可做该相关系数(correlation)(范围：1-0)与检测时间(范围：0秒-无限大)的曲线，在该曲线上，大微球该相关系数下降速度慢，小微球该相关系数下降快，由此可经软件计算出各类微球的大小和比例。

以260nm乳胶微球与CRP单克隆抗体5D1偶联物为例，测试结果显示，经过抗体偶联后，偶联物直径峰值为263.6nm，直径分布宽度为85.55nm。Z-Average(d.nm)值为299.7，PdI(Polydispersity Index)为0.310。测试系统条件为，温度：25摄氏度，读数时间(Duration Used):10秒，测量位置(Measurement Position):4.65mm，激光弱化参数(Attenuator):10。测试结果见图5，纵坐标为散射光信号(Intensity)的相对值，横坐标为单克隆抗体纳米乳胶微球偶联物的微球直径(nm)的对数。

实施例9

C反应蛋白单克隆抗体纳米微球组合物包括储存液和反应缓冲液。

储存液包括以下组分：3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)25mM，NaCl 150mM，小牛血清蛋白(BSA)0.1%，叠氮钠(NaN₃)0.09%，TritonX-100 0.03%，十二烷基磺酸钠(SDS)0.02%，蔗糖10%。

反应液包括以下组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)20mM，吐温-20(Tween-20)0.03%，NaCl 75mM，NaN₃ 0.09%，PEG-4000 1.5%。

实施例10

C反应蛋白单克隆抗体纳米微球组合物包括储存液和缓冲液。

储存液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷(Tris)50mM，NaCl 100mM，BSA0.15%，NaN₃ 0.09%，TritonX-100 0.03%，SDS 0.02%，蔗糖5%。

反应缓冲液包括以下组分：HEPES 20mM，Tween-20 0.03%，NaCl 100mM，NaN₃ 0.09%，PEG-4000 3%。

实施例11

C反应蛋白单克隆抗体纳米微球组合物包括储存液和缓冲液。

储存液包括以下组分：NaH₂PO₄.2H₂O 10mM，Na₂HPO₄.12H₂O 50mM，NaCl175mM，BSA 0.2%，NaN₃0.09%，TritonX-1000.03%，SDS 0.005%，蔗糖8%。

反应缓冲液包括以下组分：HEPES 25mM，Tween-20 0.03%，NaCl 100mM，NaN₃ 0.09%，PEG-6000 4%。

Claims

1.一种C反应蛋白（CRP）抗体，其特征是：所述CRP抗体为人血清纯化天然CRP作为免疫原，制备而得的互补配对单克隆抗体或多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的CRP抗体，其特征是：所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株为7C1和5D1。

3.一种CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是：所述纳米乳胶微球组合物为权利要求1或者2所述的单克隆抗体，分别与合适粒径大小的羧基化聚苯乙烯微球在缓冲液中混合，在活化剂的作用下，聚苯乙烯微球上的羧基与抗体上的氨基缩合形成偶联物。

4.如权利要求3所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是：所述CRP单克隆抗体是用人血清中C反应蛋白天然抗原免疫小鼠，筛选多个亲和力不同的细胞株，优选互补配对的具有不同抗原识别表位的抗体亚型，其亲和力在1×10⁶- 1×10⁸M^-1之间或以上。

5.如权利要求3所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是：C反应蛋白单克隆抗体的不同种亚型，分别偶联不同直径的聚苯乙烯微球，或者以混合偶联同一种直径的聚苯乙烯微球。

6.如权利要求3-5任一项所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是：所述的羧基化聚苯乙烯微球直径范围在50-500nm。

7.如权利要求3-5任一项所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是：所述每毫克聚苯乙烯微球交联抗体的量是0.03-1毫克。

8.如权利要求3-5任一项所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是：所述缓冲液选用磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液及甘氨酸缓冲液中的一种或几种。

9.如权利要求7所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是：所述缓冲液包括添加物：所述的添加物为蛋白稳定剂、表面活性剂、防腐剂和/或小牛血清蛋白中的一种或几种。

10.一种制备CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物的方法，包括步骤：

A）纯化人血清CRP抗原；

B）单克隆抗体制备和鉴定；

C）单克隆抗体与聚苯乙烯微球偶联，抗体乳胶微球偶联物混合形成组合物；

D）抗体乳胶微球组合物应用于免疫透射比浊和免疫散射比浊检测人血清CRP浓度。