CN105891306B - 一种抗体修饰纳米微球电泳流动型elisa的方法 - Google Patents

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Abstract

一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，属于生物材料领域。第一抗体吸附在多孔膜表面，再进行封闭剂蛋白吸附；抗原‑第一抗体反应；电泳驱动抗体修饰纳米微球，进行第二抗体‑抗原反应，对酶标第二抗体进行显色定量：电泳驱动第二抗体‑抗原反应后，将多孔膜清洗，所得多孔膜基片放入第二抗体标识酶的底物溶液中，进行显色；通过检测吸光度，进行抗原定量分析。采用正电性PDDA/PSS修饰醋酸纤维素膜PEMs‑CA，羧基聚苯乙烯纳米微球为酶标第二抗体修饰的载体。PEMs修饰降低了非特异性吸附，抗体修饰纳米微球起到信号放大的作用，电泳驱动力使第二抗体短时间内局部浓缩到抗原周围，实现了快速灵敏的检测。

Description

一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，特别涉及抗体修饰纳米微球(NP-Ab)的制备，及电泳驱动NP-Ab流动检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法。
背景技术
酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)，酶(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记在抗原或者抗体上，由于抗原和抗体的特异性反应和酶催化底物作用结合，通过其颜色变化检测和定量少量蛋白质的试验方法，其检测限(LOD)为0.1ng到1μg/mL，广泛应用于食品、工业、环境监测、和临床医学等诸多领域。由于近年来越来越多蛋白质标志物的出现，对疾病检测的要求也越来越高。但是ELISA在常规的聚苯乙烯基板(polystyrene：PS)基板上的静态温育反应存在以下几个问题：(1)在PS上的第一抗体容易变性，并且与抗原反应的部位不容易裸露在基片表面；(2)封闭效果不佳，导致抗原及第二抗体的非特异性吸附，影响了ELISA系统的灵敏度；(3)在抗原抗体反应过程中，抗原需要长时间的自由扩散，长时间的温育反应成为限速步骤，导致缓慢的结合速度，影响了分析的灵敏度和动态量程。虽然有很多通过纳米材料制备来提高ELISA系统灵敏度的研究，但其操作复杂及成本过高，导致难以实际应用。另外，微细加工芯片牌组器、微阵列芯片、微流体技术，却由于其表面修饰技术的欠缺、操作的复杂性等弊端不能广泛的应用于高灵敏度的临床检测。针对以上ELISA系统的检测弊端，因此，寻找一种可以“快速-灵敏-简便”检测ELISA系统显得尤为重要。将抗体修饰纳米微球与电泳技术有机融合在ELISA系统中，解决常规ELISA体系非特异性吸附高、反应效率低、混合样品检测困难等问题，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于解决ELISA系统中样品检测低效率问题并进一步解决低灵敏度的问题，而提供一种聚电解质多层膜基片电泳流动型ELISA方法，尤其提供一种NP-Ab电泳流动型ELISA方法，以解决背景技术中存在的问题。本发明所提供一种NP-Ab电泳流动型ELISA方法中，表面羧基化纳米微球修饰酶标识抗体，在抗原抗体特异性反应中起到信号放大的作用，大大提高了检测灵敏度。其次电泳技术作为ELISA体系中NP-Ab流动检测的驱动方式，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。
本发明所提供的一种NP-Ab电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将第一抗体吸附到聚电解质修饰的多孔膜基片上；
(2)吸附第一抗体的多孔膜基片再进行封闭剂蛋白吸附；
(3)抗原-第一抗体反应：将步骤(2)第一抗体和封闭剂蛋白吸附后的多孔膜基片加入到抗原溶液中，进行抗原-第一抗体反应；
(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应：将步骤(3)抗原-第一抗体反应后的多孔膜基片固定在电泳装置中，在电泳装置中所述的多孔膜基片一侧注入NP-Ab磷酸盐缓冲液即电泳溶液，插入负电极，多孔膜基片另一侧注入磷酸盐缓冲溶液，插入正电极；正电极和负电极加电压，进行抗原-第二抗体反应；
(5)对酶标第二抗体进行显色定量：将步骤(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应后的多孔膜基片放入到第二抗体标识酶的底物溶液中，进行显色；通过检测吸光度，进行抗原定量分析。
优选上述步骤(1)多孔膜基片是聚电解质多层膜修饰的醋酸纤维素多孔膜(PEMs-CA)，PEMs-CA是依次利用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰的CA多孔膜且修饰的最外层是聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，得到正电性的PDDA/PSS修饰CA，即PEMs-CA，优选PEMs-CA中聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰7层，通过其表面电荷性提高第一抗体与封闭剂(卵清蛋白ovalbumin:OVA)的吸附量，提高抗原与抗体反应的密度(信号)、抑制抗原和第二抗体的非特异性吸附(噪音)，进而大幅度提高灵敏性(信号与噪音比例)。上述多孔膜基片选取醋酸纤维素(cellulose acetate,CA)多孔膜基片，醋酸纤维素多孔膜的孔径优选450nm；选取PDDA/PSS修饰的醋酸纤维素膜为PEMs-CA作为检测溶液透过基片。
进一步优选步骤(4)NP-Ab为：羧基化聚苯乙烯纳米微球(微球直径优选为200nm)，通过化学方法将纳米微球表面的羧基和酶标抗体分子的氨基偶联，进行偶联时酶标抗体分子浓度为15-240μg/mL，微球浓度为1-5mg/mL；BγG作为模型蛋白优化酶标第二抗体及纳米微球偶联浓度条件，优选酶标抗体分子浓度与微球浓度分别为60μg/mL，1mg/mL，得到每个纳米微球表面修饰酶标第二抗体的数量约48个。
进一步优选步骤(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应的电泳电压和电泳时间，电泳的电压大小决定NP-Ab的移动速度；电泳时间的长短影响NP-Ab与抗原的结合效率。所以进一步调节电泳的电压与时间，从而进一步提高检测灵敏度。电泳电压与时间优化范围为25-35V和1-5min，进一步优选电泳电压与时间为30v、2min。
在此电泳流动型ELISA系统中，NP-Ab浓度可进行调节，通过正交试验对NP-Ab浓度进行最优化，确定NP-Ab的最佳浓度为100μg/mL。利用此浓度检测抗原的定量曲线，得到最低检测限为0.13pM。比传统ELISA检测水平高出254倍，检测速度提高了30倍。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明所提供的NP-Ab电泳流动型ELISA的方法，创制电泳环境中能够高效抑制ELISA非特异性吸附的PEMs。
2)本发明所提供的NP-Ab电泳流动型ELISA的方法，创制能够起到信号放大作用的NP-Ab。
3)本发明所提供的NP-Ab电泳流动型ELISA的方法，创制灵敏、快速、简便的电泳流动型ELISA系统。电泳驱动型有效控制带负电NP-Ab向正极电极方向流动，所以在短时间的流动过程中使NP-Ab局部浓缩到多孔膜(即抗原)近旁，完成灵敏、快速的抗体-抗原反应，与传统ELISA相比，既提高了灵敏度又大幅度缩短了反应时间。
附图说明
图1本发明实施例所用电泳装置示意图。
图2NP-Ab流动型ELISA的检测曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。如所用溶液的浓度、pH值等可根据需要调节等。
本发明实施例采用的电泳装置见图1。电泳装置为一平放发的圆桶结构，多孔膜位于中间将圆桶一分为二，多孔膜的一侧为NP-Ab溶液，端面设有溶液进口和电极；另一侧为PB缓冲液，端面设有溶液进口和电极。
实施例1
1.溶液的配置：
a)50mM Tris-HCl@0.15M NaCl溶液的配置：将1.15175g Tris-base固体溶于125mL超纯水中，取0.84mL HCl溶于100mL超纯水中得0.1M HCl溶液，待溶解后将HCl溶液滴加入Tris-base溶液中调pH＝7.4为止，定容至250mL，称量2.208g NaCl固体加入Tris-HCl中。
b)pH＝7.4浓度为0.15M磷酸盐缓冲液(PB)的配置：称取10.74g Na2HPO4·12H2O固体加入到200mL超纯水中,称取4.68g NaH2PO4·2H2O固体加入到200mL超纯水中，待溶解后将NaH2PO4溶液加入到Na2HPO4溶液中，调pH＝7.4。
c)0.05％Tween 20@0.03M PB配置：取250μL Tween-20加入到500mL 0.03M PB缓冲液中。
d)2M H2SO4配置：取8mL超纯水加入1mL浓H2SO4(98％)。
2.抗体修饰纳米微球的制备方法：
活化缓冲液：0.1M PB，pH 6.3
偶联缓冲液：0.1M PB，pH 7.4
封闭液：5mg/ml卵清蛋白(OVA)溶液
活化剂：10mg/ml碳化二亚胺盐酸(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
1)配置微球溶液：取一定质量羧基化聚苯乙烯微球(体积根据固含量计算)置于离心管中(羧基化聚苯乙烯微球粒径为200nm)，加入活化缓冲液稀释，超声混匀，离心(14000rpm，13min)，随后加入活化缓冲液，超声混匀。
2)活化聚苯乙烯表面的羧基：采用活化缓冲液配置EDC和NHS溶液，将一定体积的EDC和NHS溶液迅速加入微球溶液中，漩涡混匀，静置20分钟。
3)清洗微球：将活化后的纳米微球离心，弃去上清液，加入偶联缓冲液超声分散，上述步骤重复两次。
4)偶联酶标抗体：将步骤3)得到的纳米微球中加入酶标抗体溶液，(微球浓度1mg/mL，酶标抗体浓度60μg/mL)立刻涡旋混匀，并超声分散，随后室温反应2h。
5)封闭未反应羧基：将步骤4)微球超声分散，加入封闭液，室温反应1h，反应后离心清洗两次。
3.PEMs修饰CA多孔膜制备
1)配制PDDA与PSS溶液。分别称取PDDA和PSS固体各2mg，分别溶于10mL 50mMTris-HCl@0.15M NaCl pH＝7.4的溶液中，得PDDA和PSS浓度为0.2mg/mL。
2)PEMs修饰CA多孔膜制备。超纯水浸湿的CA膜(孔径450nm)放入PDDA溶液中，室温下浸渍2min，之后用超纯水清洗30s，洗去未吸附的聚电解质溶液。然后放入PSS溶液中，室温下浸渍2min，之后用超纯水清洗30s，以上PDDA与PSS交替进行，制备7层正电性的自组装多层膜PEMs((PDDA/PSS)3PDDA)。
4.NP-Ab电泳流动型ELISA检测
1)第一抗体吸附实验。将PEMs-CA基片浸泡在60μg/mL兔抗鼠IgG抗体(rabbitanti-mouse IgG@0.03M PB)溶液中，室温下吸附2h后，将CA膜用0.03M PB缓冲液清洗3次。
2)封闭剂蛋白(卵清蛋白，OVA)吸附实验。第一抗体吸附的PEMs-CA基片放入1mg/mL OVA溶液中，37℃下吸附1h，将PEMs-CA基片用0.03M PB缓冲液清洗3次。
3)抗原与第一抗体反应。将带有第一抗体及OVA的PEMs-CA基片放入抗原溶液(mouse IgG@0.03M PB)中，37℃下吸附1h后，用0.03M PB缓冲液清洗3次，不加抗原的溶液PEMs-CA为对照组；
4)优化电泳电压与时间，电泳驱动NP-Ab-抗原反应。将吸附第一抗体与抗原的PEMs-CA基片固定在玻璃分离腔中央(图1)，分离腔入口侧注入1mL 100μg/mLNP-Ab溶液，分离腔出口处加入0.03M PB溶液。入口侧接入电源负极，出口侧接入电源正极。分别调节电压为25V、30V、35V，时间为1min、2min、5min，进行抗原-抗体反应。将电泳后的PEMs-CA基片，经过0.05％Tween-20@0.03M PB缓冲液清洗1次、0.03M PB缓冲液清洗3次；
5)酶标显色定量。将PEMs-CA基片加入到0.4mL的四甲基联苯胺溶液(TMB)，室温下避光反应30min后，再加入0.4mL 2M H2SO4溶液，终止反应。通过检测450nm处吸光度，进行抗原定量。
6)PEMs-CA基片电泳流动型ELISA检测曲线测定。通过测定不同电压与时间下的检测灵敏度(信噪比值(S/N))(信号S即为抗原存在时的第二抗体反应信号；噪音N即为无抗原时，第二抗体非特异性吸附的信号)，得到最优的电压与时间条件为30v，2min。再此条件下，检测不同浓度抗原的信号，获得PEMs-CA基片电泳流动型ELISA检测曲线(图2)。

Claims (10)

1.一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，(1)将第一抗体吸附到聚电解质修饰的多孔膜基片上；
(2)吸附第一抗体的多孔膜基片再进行封闭剂蛋白吸附；
(3)抗原-第一抗体反应：将步骤(2)第一抗体和封闭剂蛋白吸附后的多孔膜基片加入到抗原溶液中，进行抗原-第一抗体反应；
(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应：将步骤(3)抗原-第一抗体反应后的多孔膜基片固定在电泳装置中，在电泳装置中所述的多孔膜基片一侧注入抗体修饰纳米微球磷酸盐缓冲液即电泳溶液，插入负电极，多孔膜基片另一侧注入磷酸盐缓冲溶液，插入正电极；正电极和负电极加电压，进行抗原-第二抗体反应；
(5)对酶标第二抗体进行显色定量：将步骤(4)电泳驱动抗体修饰纳米微球-抗原反应后的多孔膜基片放入到第二抗体标识酶的底物溶液中，进行显色；通过检测吸光度，进行抗原定量分析。
2.按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，步骤(1)多孔膜基片是聚电解质多层膜修饰的醋酸纤维素多孔膜PEMs-CA，PEMs-CA是依次利用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰的CA多孔膜且修饰的最外层是聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，得到正电性的PDDA/PSS修饰CA，即PEMs-CA。
3.按照权利要求2所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，PEMs-CA中聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰7层。
4.按照权利要求2所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，醋酸纤维素多孔膜的孔径优选450nm。
5.按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，步骤(4)NP-Ab为：羧基化聚苯乙烯纳米微球，通过化学方法将纳米微球表面的羧基和酶标抗体分子的氨基偶联，进行偶联时酶标抗体分子浓度为15-240μg/mL，微球浓度为1-5mg/mL。
6.按照权利要求5所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，BγG作为模型蛋白优化酶标第二抗体及纳米微球偶联浓度条件，得到酶标抗体分子浓度与微球浓度分别为60μg/mL、1mg/mL，每个纳米微球表面修饰酶标第二抗体的数量约48个。
7.按照权利要求5所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，微球直径为200nm。
8.按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，电泳电压与时间范围为25-35V和1-5min。
9.按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，电泳电压与时间为30V、2min。
10.按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，NP-Ab的浓度为100μg/mL。
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