CN103913573A - 一种基于纳米金和氧化石墨烯的双信号放大elisa检测方法 - Google Patents

一种基于纳米金和氧化石墨烯的双信号放大elisa检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米金和氧化石墨烯的新用途。该新用途具体为在放大ELISA检测信号中的应用。本发明还公开了一种ELISA检测方法，包括如下步骤：（1）向载有包被原的酶标板中加入与所述包被原特异结合的待测物；（2）向所述酶标板中加入纳米金标记物；所述纳米金标记物为将纳米金与蛋白甲（与所述待测物质特异结合）和蛋白乙（与所述待测物质不结合）同时结合所得的物质；（3）向所述酶标板中加入氧化石墨烯标记物；所述氧化石墨烯标记物为将氧化石墨烯与蛋白丙（同时与所述蛋白甲和所述蛋白乙结合）结合所得的物质。本发明将纳米金和氧化石墨烯同时引入传统ELISA方法中，实现了双信号放大，对蛋白检测信号放大10倍以上，同时还大大降低了成本。

Description

一种基于纳米金和氧化石墨烯的双信号放大ELISA检测方法
技术领域
本发明涉及一种纳米金和氧化石墨烯的新用途，特别涉及一种纳米金和氧化石墨烯在放大ELISA检测信号中的应用。
背景技术
酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是各生物、化学实验室以及临床检测中常用的分析检测方法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。但是昂贵的抗体价格和非足够低的检测限已不能满足当前实际应用的要求。
目前，纳米材料在各领域的应用较为广泛，尤其是纳米金的应用多年来一直得到大家的认可。纳米金即指金的微小颗粒，其直径在1～100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。
氧化石墨烯是近几年才被大家关注的，在材料学领域得到了越来越广泛的应用，但是其在生命科学领域的应用还鲜有报道。
目前尚未有将纳米金和氧化石墨烯同时用于ELISA检测中的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米金和氧化石墨烯的新用途。
本发明所提供的纳米金和氧化石墨烯的新用途，具体为纳米金和氧化石墨烯在放大ELISA检测信号中的应用。所述ELISA检测信号的放大可理解为在相同的检测条件下，反应结束后反应液颜色更深，或OD值更大，可进一步理解为检测灵敏度的提高。
在所述应用中，所述纳米金的颗粒直径可为10－100nm，如10-20nm。在本发明的一个实施例中，所述纳米金的颗粒直径具体为16nm。所述氧化石墨烯为单原子层结构。
本发明的另一个目的是提供一种ELISA检测方法。
本发明所提供的ELISA检测方法，依次包括如下步骤：
（1）向载有包被原的酶标板中加入能与所述包被原特异结合的待测物质；
（2）向所述酶标板中加入纳米金标记物；所述纳米金标记物为将纳米金与蛋白甲和蛋白乙结合所得的物质；所述蛋白甲是与所述待测物质特异结合的蛋白，所述蛋白乙是与所述待测物质不结合的蛋白；
（3）向所述酶标板中加入氧化石墨烯标记物；所述氧化石墨烯标记物为将氧化石墨烯与蛋白丙结合所得的物质；所述蛋白丙为与所述蛋白甲和所述蛋白乙结合的另一种蛋白。
所述方法中，在步骤（1）、（2）和（3）之后均包括用洗涤液进行洗涤的步骤；所述洗涤液为ELISA检测常用洗涤液。在步骤（3）后还包括加入显色液进行显色反应，以及加入终止液进行终止反应的步骤。在本发明的一个实施例中，所述显色液具体为TMB，所述终止液为2M硫酸。
所述方法中，所述纳米金的颗粒直径可为10－100nm。在本发明的一个实施例中，所述纳米金的颗粒直径具体为16nm。所述氧化石墨烯为单原子层结构。
所述方法中，各蛋白均为ELISA检测中所涉及的抗原或抗体，当然所述抗原也包括半抗原与载体蛋白的偶联物。
在本发明中，所述ELISA检测方法具体为改良的双抗夹心法，相应的，所述包被原为抗体；所述待测物质为与所述包被原特异结合的抗原；所述蛋白甲为与所述待测物质特异结合的一抗，所述蛋白乙为与所述待测物质不结合的一抗；所述蛋白丙为抗所述蛋白甲和所述蛋白乙的酶标二抗。
更加具体的，所述包被原为抗HSP70蛋白的一种抗体，如HSP70-Ab1(mouse IgG)，为santa cruz biotechnology，inc.产品，目录号：HSP70(F-3):sc sc-373867。所述待测物质为与所述包被原（抗体HSP70-Ab1(mouse IgG)）特异结合的抗原HSP70，如Abcam公司的HSP70蛋白标准品，其目录号为ab78434。所述蛋白甲为与所述待测物质（抗原HSP70）特异结合的一抗，如HSP70-Ab1(rabbit IgG)，santa cruz biotechnology，inc.产品，目录号：HSP70(k-20):sc-1060，记作HSP70-Ab1(rabbit IgG)。所述蛋白乙为与所述待测物质（抗原HSP70）不结合的一抗GST-Ab1，为康为世纪公司产品，目录号：cw0085A。所述蛋白丙为同时抗所述蛋白甲（特异性一抗HSP70-Ab1(rabbit IgG)）和所述蛋白乙（辅助一抗GST-Ab1）的HRP酶标山羊抗兔IgG，为康为世纪公司产品，目录号：CW0103。
所述方法中，所述纳米金是通过自身的静电吸附作用，将所述蛋白甲和所述蛋白乙结合在其表面。由于是依靠纳米金自身的静电吸附作用将所述蛋白甲和所述蛋白乙结合在其表面的，所以所述蛋白甲和所述蛋白乙与纳米金的结合能力相同。
所述方法中，由于纳米金和氧化石墨烯的比表面积较大，故而在单位面积上能结合更多的蛋白。一方面，通过引入所述纳米金扩大一抗与抗原的比例；另一方面，通过引入所述氧化石墨烯扩大酶标二抗与一抗的比例，进而实现ELISA检测信号的逐级放大。
实际应用中，通常首先通过单独使用与所述待测物质（如抗原）特异结合的所述蛋白甲（不经纳米金标记的抗原特异性抗体），确定所需一抗的最小用量；然后再选择比所述蛋白甲（特异性一抗）价格相比更加便宜的所述蛋白乙（辅助一抗），在如上确定的一抗最小用量的范围内，通过调节所述蛋白乙（辅助一抗）和所述蛋白甲（特异性一抗）的加入比例达到控制两种一抗与纳米金的结合比例，进而找到成本的降低幅度和检测信号的放大倍数的最佳结合点。
本发明将纳米金和氧化石墨烯同时引入到传统ELISA检测方法中，实现了双信号放大，实现了对蛋白检测信号放大10倍以上的高灵敏度检测，同时还大大降低了成本。另外，本发明还具有以下优点：
1、纳米金的制备为较成熟的实验室操作技术，一般实验室都能够制备出高质量的纳米金颗粒；
2、纳米金与抗体的结合为静电吸附，易于实现；
3、氧化石墨烯与抗体结合条件较为温和，可以在实验室条件下实现；
4、ELISA方法是较为经典的生物样本检测方法，具有较强的普遍适用性，只需在传统方法的基础上进行几步抗体的修饰，既能达到优化改进的目的，较容易实现；
5、本发明重复性较好，所用试剂，价廉易得，能满足不同目的的分析需求。
附图说明
图1为纳米金或氧化石墨烯与抗体的结合图。其中，A为纳米金颗粒和纳米金与一抗结合物的透射电镜图：a为纳米金颗粒的透射电镜图，b为纳米金与一抗结合物的透射电镜图；B为氧化石墨烯和结合有二抗的氧化石墨烯的透射电镜图：a为氧化石墨烯的透射电镜图，b为结合有二抗的氧化石墨烯的透射电镜图；C为氧化石墨烯和结合有二抗的氧化石墨烯的X射线光电子谱图：a为氧化石墨烯与二抗结合后的X射线光电子谱图，b为氧化石墨烯的X射线光电子谱图。
图2为本发明ELISA检测方法的操作流程示意图。其中，a为传统ELISA检测方法的操作流程；b为本发明优化改进后的ELISA检测方法操作流程。其中的HSP70-aAb1即为GST-Ab1。
图3为本发明优化改进后ELISA检测方法对待测物质的检测结果图。其中，A为一抗最小用量的测定结果；B为辅助一抗和特异性一抗比例的优化测定结果；C为传统ELISA检测方法与本发明优化改进后ELISA检测方法对同一样本检测结果对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
抗原GST：Abcam公司，目录号ab70456。
HSP70蛋白标准品：Abcam公司，目录号ab78434。
作为包被原的抗HSP70蛋白的一抗：鼠源，santa cruz biotechnology，inc.产品，目录号：HSP70(F-3):sc sc-373867，记作HSP70-Ab1(mouse IgG)。
HSP70蛋白的特异性一抗：兔源，santa cruz biotechnology，inc.产品，目录号：HSP70(k-20):sc-1060，记作HSP70-Ab1(rabbit IgG)。
HSP70蛋白的辅助一抗：GST蛋白的特异性一抗，兔源，记作GST-Ab1，购自康为世纪公司，目录号：cat：cw0085A。
GST蛋白的辅助一抗：cellular myelocytomatosis oncogene primary antibody，兔源，记作C-MYC-Ab1，来自康为世纪公司，目录号：CW0089。
辣根过氧化酶标记的二抗：HRP标记的山羊抗兔IgG抗体，记作HRP-IgG，康为世纪公司产品，目录号：CW0103。
下述实施例中所涉及的纳米金标记抗体的制备均按照如下方法操作：
（1）纳米金颗粒（AuNPs）的制备
首先将所用器皿用王水（质量分数31%的浓盐酸与质量分数98%的浓硝酸以体积比3：1进行混合）浸泡，然后用双蒸水冲洗，烘干待用。
将l mL浓度为l%（质量百分数）的氯金酸水溶液加入到100ml双蒸水中，有力搅拌并加热至沸腾，迅速加入4.5mL浓度为l%（质量百分数）的柠檬酸钠水溶液，充分搅拌，保持沸腾10min。这期间溶液颜色由灰变蓝再变紫，最后为酒红色。移去热源，再搅拌15min，自然冷却至室温，即制得平均粒径为16nm的金胶（用透射电镜表征），4℃下保存备用。纳米金颗粒的透射电镜图如图1中A中a所示。
（2）纳米金-抗体结合物的制备
pH7.4的PBS溶液：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。
一抗：GST-Ab1与HSP70-Ab1(rabbit IgG)的混合物，质量比为3：2。
在缓慢搅拌下，将30μg上述一抗加入到1mL pH9.0（用0.1M的NaOH调pH）的胶体金溶液中，混合液在室温下静置1h。然后加入0.2mL浓度为5%（5g/100ml）的牛血清白蛋白（BSA）溶液（溶剂为pH7.4的PBS溶液），再放置30min后，于16000r/min离心10min，溶液分为两层：上层是无色或淡红色的上清液，下层是松散的暗红色沉淀。移去上清液，将沉淀用PBS-BSA溶液（用pH7.4的PBS作溶剂，配置而成的含有5g/100mL的BSA溶液）洗涤一次，最后将沉淀悬浮在1mL的PBS-BSA溶液中，于4℃下保存。纳米金与一抗结合物的透射电镜图如图1中A中b所示。
下述实施例中所涉及的氧化石墨烯（GO）标记抗体的制备均是将氧化石墨烯上的键氧化为羧基，进而通过该羧基与抗体上的氨基反应，生成酰胺键，具体按照如下方法操作：
（1）将50mg的NaOH和50mg的ClCH2COONa加到1mL浓度为1mg/mL的氧化石墨烯（GO）悬浮液（水溶液）中；氧化石墨烯的透射电镜图如图1中B中a所示；
（2）声裂水浴（在水浴中超声处理，40KHz，250W）2h，所得溶液为母液；
（3）用稀HCl中和母液至pH为7，得到GO-COOH，反复用水清洗和离心，直到产物在去离子水中均匀分散；
（4）用去离子水透析GO-COOH悬浮液48h以上以除去所有离子，得到浓度为1.12mg/mL的GO-COOH，待用；
（5）将1mL浓度为1.12mg/mL的GO-COOH、10mL浓度为400mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）、10mL浓度为100mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）和1mL pH5.2的MES缓冲液混合，反应30min；因为后面还要将多余的EDC,MES等通过离心除去，所以对于其体积要求不是很严格，只要过量就行。
（6）以13000rpm离心5min，除去悬浮液，然后用MES缓冲液反复冲洗除去EDC和NHS；
（7）得到的产物分散于pH7.4的1.0mL的PBS中，超声处理5min，得到均匀分散的分散液；
（8）保存于4℃备用，放置3周仍能保持酶活性；
（9）加入50μL辣根过氧化酶标记的二抗（HRP-IgG），搅拌过夜（4℃），用PBS洗涤、离心5min（3次）；
（10）将沉淀重溶于1.0mL的PBS-BSA溶液中，即得氧化石墨烯功能化修饰过的HRP酶标二抗，将其放在4℃备用。结合有二抗的氧化石墨烯的透射电镜图如图1中B中b所示；氧化石墨烯和结合有二抗的氧化石墨烯的X射线光电子谱图如图1中C所示。
实施例1、利用纳米金和氧化石墨烯进行ELISA检测的方法
本发明基于纳米金和氧化石墨烯的双信号放大ELISA检测中所用材料和试剂如下：
（1）酶标板。
（2）包被原：HSP70-Ab1(mouse IgG)。
（3）待测物质：HSP70蛋白标准品。
（4）纳米金标记的一抗：被纳米金标记的一抗为与待测物质（HSP70蛋白）特异结合的一抗（HSP70-Ab1(rabbit IgG)）和不与待测物质（HSP70蛋白）特异结合的辅助一抗（GST-Ab1）的混合物（质量比2：3）。
（5）氧化石墨烯标记的酶标二抗：被氧化石墨烯标记的二抗为HRP-GSTAb2。
（6）显色液：TMB（碧云天公司，产品目录号：P0209）。
（7）终止液：2mol/L硫酸。
（8）洗涤液：PBS和PBST。其中，PBS的配方为：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L；PBST为向PBS中加入体积分数为0.05%的吐温-20后所得的溶液。
（9）样品稀释液：PBS（配方同上）；
（10）封闭液：向PBS（配方同上）中加入终浓度为0.5g/100mL的牛血清白蛋白（BSA）后所得的溶液。
本发明的ELISA检测是在传统ELISA检测的基础上引入了纳米金和氧化石墨烯，从而实现检测信号的双重放大，操作步骤具体如下（其操作流程如图2中b所示）：
1）包被：在96孔酶标板中加入100μl浓度为0.1μg/mL HSP70-Ab1(mouse IgG)溶液（用包被稀释液进行稀释），同时设置无包被原的对照，4℃包被过夜，用洗涤液洗涤3次。
2）封闭：加入150μL/孔的封闭液，在37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。
3）加待测物质：吸取100μl一定浓度的待测物质（抗原HSP70），加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，用洗涤液洗板4次，拍干。
同时设置以PBS代替待测物质的对照（阴性对照孔）。
4）加纳米金标记的抗体：吸取100μl的纳米金标记的抗体溶液（用样品稀释液进行稀释），其中HSP70-Ab1(rabbit IgG)的含量为1.668×10-5mg，GST-Ab1的含量为2.502×10-5mg，37℃孵育120min，用洗涤液洗板4次，拍干。
5）加氧化石墨烯标记的酶标二抗：吸取100μl浓度为1mg/mL的氧化石墨烯标记的酶标二抗HRP-GST Ab2（用样品稀释液进行稀释），37℃孵育45min，用洗涤液洗板4次，拍干。
6）显色：将20×TMB稀释至1×TMB，按100μl/孔加入，37℃显色15-30min。
7）终止：加入终止液（2M H2SO4）50μl/孔。
8）读数：以450nm单波长测定各孔OD值。
一、条件优化
为了降低成本，需要采用价格更低的辅助一抗（GST-Ab1）代替部分与待测物质（抗原HSP70）特异结合的一抗（HSP70-Ab1(rabbit IgG)）。具体思路如下：首先，测得相对于固定量的待测物质（抗原HSP70），所需一抗的最小用量；然后，固定两种一抗的总量不变，不断调整两种一抗的比例，由于辅助一抗（GST-Ab1）不能直接与待测物质（抗原HSP70）结合，所以随着辅助一抗（GST-Ab1）的量不断增加，检测信号会逐渐降低，同时考虑到检测信号和成本，选择检测信号没有明显减弱，而成本得到最大程度降低的比例作为平衡点。具体如下：
A．一抗最小用量的测定
1）包被：在96孔酶标板中加入100μl浓度为128ng/m L的抗原GST溶液（用包被稀释液进行稀释），同时设置无包被原的对照，4℃包被过夜，用洗涤液洗涤3次。
2）封闭：加入150μL/孔的封闭液（配方同上），在37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。
3）加一抗：将原浓度1mg/mL的一抗GST-Ab1稀释300倍（用样品稀释液进行稀释，样品稀释液配方同上）后待用，再依次进行2倍稀释，得到由8个具体浓度组成的系列浓度梯度。分别吸取100μl的8个浓度的一抗GST-Ab1，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，用洗涤液洗板4次，拍干。计算8个浓度的一抗GST-Ab1的对应用量依次为3.33×10-4mg、1.67×10-4mg、8.33×10-5mg、4.17×10-5mg、2.08×10-5mg、1.04×10-5mg、5.21×10-6mg、2.60×10-6mg。同时设置以PBS代替一抗的对照（阴性对照孔）。
4）加酶标二抗：吸取100μl浓度为1mg/mL的酶标二抗HRP-GST Ab2（用样品稀释液进行稀释，样品稀释液配方同上），37℃孵育45min，用洗涤液洗板4次，拍干。
5）显色：将20×TMB稀释至1×TMB，按100μl/孔加入，37℃显色15-30min。
6）终止：加入终止液（2M H2SO4）50μl/孔。
7）读数：以450nm单波长测定各孔OD值。
结果如图3中A所示，每个孔中的GST抗原的用量均相同，从左至右逐步降低一抗的用量，从OD值可以看出，在左数第四个孔所对应的OD值与左面的OD值相差不大，而与右面的值相差较大，所以认为第四个孔所需的一抗的量（4.17×10-5mg）为所需一抗的最小用量。实验共设置了3次重复，3次重复实验的结果均相同。
B.两种一抗比例的优化
ELISA检测的具体操作步骤参照如步骤A所述，其中一抗为GST-Ab1和C-MYC-Ab1的混合物，两种一抗的总量为步骤A中所得到的最小用量（4.17×10-5mg），两种一抗的比例设置如表1所示。实验重复3次。
表1两种一抗各自用量的质量百分比设置情况（单位：%）
结果如图3中B所示，从OD值可以看出，g点所对应的OD值与左面的OD值相差不大，而与右面的值相差较大，同时考虑到检测信号和成本，选择g点为两种一抗最佳配比点（即辅助一抗与特异性一抗的使用质量比例为3:2），此时的信号没有明显减弱，而且成本得到最大程度降低。3次重复实验的结果均相同。
二、本发明ELISA检测方法与传统ELISA检测方法的比较
本发明ELISA检测方法采用步骤一前所述的基于纳米金和氧化石墨烯的双信号放大ELISA检测方法，其中纳米金标记的两种一抗采用实施例1中优化后的用量，即两种一抗总量为4.17×10-5mg（辅助一抗GST-Ab1的用量为2.502×10-5mg、特异性一抗HSP70-Ab1(rabbit IgG)的用量为1.668×10-5mg）。传统ELISA检测方法所用一抗不经纳米金标记，仅为特异性一抗HSP70-Ab1(rabbit IgG)（用量为4.17×10-5mg）；所用二抗不经氧化石墨烯标记，但用量与本发明中的基于纳米金和氧化石墨烯的双信号放大ELISA检测方法相同；其余操作步骤及相关试剂均与本发明基于纳米金和氧化石墨烯的双信号放大ELISA检测方法中相同。两种ELISA检测方法中，待测物质（抗原HSP70）的浓度均从同一浓度25.6μgmL-1依次进行两倍稀释，从而比较两种ELISA检测方法的灵敏度。两种方法均同时设置以PBS代替待待测物质（抗原HSP70）的阴性对照。
结果如图3中C所示，a行（本发明ELISA检测方法）和c行（传统ELISA检测方法）中，第一个孔中抗原HSP70的浓度均为25.6μgmL-1，然后依次两倍稀释，在c行中，只能检测到第四个孔（HSP70的浓度为3.2μg mL-1）的有效信号，而在a行中能检测到第八个孔（HSP70的浓度为0.2μg mL-1）的有效信号，且作为阴性对照的b行（本发明ELISA检测方法）和d行（传统ELISA检测方法）均基本上未检测到信号，证实实验结果可信。综合以上结果，与传统ELISA检测方法比较，本发明改进后的ELISA检测方法中信号可放大16倍。3次重复实验的结果均相同，可见本发明改进后的ELISA检测方法重复性好，有较好的实用价值。

Claims (4)

1.纳米金和氧化石墨烯在放大ELISA检测信号中的应用。
2.ELISA检测方法，依次包括如下步骤：
（1）向载有包被原的酶标板中加入待测物质，所述待测物质能与所述包被原特异结合；
（2）向所述酶标板中加入纳米金标记物；所述纳米金标记物为纳米金与蛋白甲和蛋白乙的结合物；所述蛋白甲能与所述待测物质特异结合，所述蛋白乙不能与所述待测物质结合；
（3）向所述酶标板中加入氧化石墨烯标记物；所述氧化石墨烯标记物为氧化石墨烯与蛋白丙的结合物；所述蛋白丙能与所述蛋白甲和所述蛋白乙结合。
3.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2所述的方法，其特征在于：所述纳米金的颗粒直径为10－100nm。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述包被原为抗体；所述待测物质为与所述包被原特异结合的抗原；所述蛋白甲为与所述待测物质特异结合的一抗，所述蛋白乙为与所述待测物质不结合的一抗；所述蛋白丙为抗所述蛋白甲和所述蛋白乙的酶标二抗。
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