CN104880424A - 一种用于检测amacr的双功能纳米探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测AMACR的双功能纳米探针、试剂盒及方法，该双功能纳米探针由纳米金粒子表面同时修饰辣根过氧化物酶和能够识别目标蛋白的核酸适体制得，所述纳米金粒子粒径为10～20nm，纳米金粒子与辣根过氧化物酶原料用量之比为7nmol：10～15mg，纳米金粒子与核酸适体原料用量之比为7nmol：100～150nmol。本发明双功能纳米探针合成简单、容易修饰、设计灵活，用于蛋白质检测，方法简单、效果良好。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种用于检测α-甲基酰基辅酶A消旋酶(AMACR)的生物识别与信号引发双功能纳米探针，检测AMACR的试剂盒以及检测方法。
(二)背景技术
纳米金探针是纳米金物理特性与生物分子化学特性的耦合体，通过纳米金探针放大检测信号的途径主要有银染、荧光标记、酶标记等，并由此发展了多种检测途径，如荧光检测、分光光度检测、电化学检测等。目前许多科研团体都致力于发展纳米金探针定性定量的快速免疫测技术。Nam等以检测抗体和巯基寡核苷酸修饰纳米金形成纳米金探针，通过银染反应检测蛋白质含量，或者用荧光基团修饰纳米金探针上的巯基寡核苷酸，通过荧光检测测定蛋白质含量，同时他们还利用纳米金在不同的聚合状态下颜色会发生显著变化的特性建立了比色法检测蛋白质含量的方法。Stoeva等利用纳米金探针建立了同时检测多种蛋白质的方法，表明通过纳米金探针可以实现多目标检测，很有发展价值。这些方法都显著地提高了蛋白质检测的灵敏度，但就从临床应用来说，涉及到银染或者荧光检测，操作步骤繁多或仪器昂贵，有碍于推广应用。
AMACR是一种代谢酶，在支链脂肪酸及其衍生物的β氧化中发挥着至关重要的作用。研究表明，AMACR在前列腺癌细胞中过表达，可作为前列腺癌诊断的特异性生物标志物。目前，AMACR的检测主要是以抗体作为识别元件，而抗体具有制备困难、成本高，制备的批间误差大，对环 境敏感、易失活等缺点。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种合成简单、容易修饰、设计灵活的生物识别与信号引发双功能纳米探针，及其在AMACR检测中的应用，方法简单、效果良好。
本发明采用的技术方案是：
一种用于检测AMACR的生物识别与信号引发双功能纳米探针，由纳米金粒子(AuNPs)表面同时修饰辣根过氧化物酶和能够识别目标蛋白的核酸适体制得，所述纳米金粒子为球状结构、粒径为10～20nm(同时修饰核酸适体和HRP后，纳米金的粒径增大到50～70nm)，纳米金粒子与辣根过氧化物酶原料用量之比为7nmol：10～15mg，纳米金粒子与核酸适体原料用量之比为7nmol：100～150nmol；修饰所用的核酸适体原料序列：5'-CCTACGGCGCTAACCCATGCTACGAATTCGTTGTTAAACAATAGGCCACCGTGCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH-3'。该核酸适体末端连接了20个A碱基，以减小空间位阻的影响。
核酸适体是用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从随机序列库中筛选出来的一条单链DNA或RNA，对其特定识别的蛋白质具有很高的亲和力。本发明纳米金同时修饰辣根过氧化物酶(HRP)与核酸适体(aptamer)，这样不仅避免了生物识别分子与信号引发分子之间的共价修饰，还能实现信号放大从而提高检测效果。
具体的，所述双功能纳米探针可由如下方法制备得到：
(1)取浓度为14nM的AuNPs混悬液用Na2CO3调pH值至9.0；
(2)加入浓度为10mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，震荡反应0.5～2h， 离心浓缩至原体积的1/4～1/6，AuNPs混悬液与辣根过氧化物酶溶液体积用量之比为1:0.002～0.003；
(3)加入浓度为100μM的核酸适体溶液，震荡反应18～28h，AuNPs混悬液与辣根过氧化物酶溶液体积用量之比为1:0.002～0.003；
(4)加入NaCl溶液至其终浓度为0.1M，震荡反应0.5～2h；
(5)加入牛血清白蛋白至其终浓度为1％，封闭1～2h；
(6)离心、洗涤2～3次，即得所述生物识别与信号引发双功能纳米探针；离心参数如下：13000rpm、30min，洗涤液为10mM、pH7.4磷酸缓冲液。
本发明还涉及一种检测AMACR的试剂盒，主要包括生物识别与信号引发双功能纳米探针以及检测用试剂(本领域常规蛋白检测所用检测试剂，如包被稀释液、洗涤液、封闭液、显色缓冲液和终止液等)，所述生物识别与信号引发双功能纳米探针由纳米金粒子表面同时修饰辣根过氧化物酶和能够识别目标蛋白的核酸适体制得，所述纳米金粒子为球状结构、粒径为10～20nm，纳米金粒子与辣根过氧化物酶原料用量之比为7nmol：10～15mg，纳米金粒子与核酸适体原料用量之比为7nmol：100～150nmol；修饰所用的核酸适体原料序列如下：5'-CCTACGGCGCTAACCCATGCTACGAATTCGTTGTTAAACAATAGGCCACCGTGCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH-3'。
具体的，所述检测用试剂由包被稀释液、洗涤液、封闭液、显色缓冲液和终止液组成，所述包被稀释液为6.7mM、pH7.4的PBS；所述洗涤液组成如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.05％tween-20，溶剂为50mM、pH7.4的PBS；所述封闭液为1％BSA，溶剂为前述洗涤液；所述显色缓 冲液组成如下：1mM TMB，1mM H2O2，溶剂为0.1M、pH＝5.0的柠檬酸缓冲液；所述终止液为2M H2SO4溶液。
本发明还涉及一种利用所述试剂盒检测AMACR的方法，所述方法如下：
(1)包被：将待测蛋白样品用包被稀释液稀释，分别取100μL加入96孔板中并置于37℃下2h，弃去孔中液体，用洗涤液洗3遍；
(2)封闭：将封闭液加满各反应孔并置于37℃2h，封闭结束后用洗涤液洗3遍；
(3)孵育纳米生物探针：将所述双功能纳米探针稀释后每孔加100μL，置于37℃1h；弃去孔中液体，用洗涤液洗5遍；
(4)显色反应：各反应孔加入显色缓冲液100μL，37℃反应10min，然后加50μL终止液终止反应；
(5)检测：测量各孔溶液在450nm波长处的吸收值或者测量其在350nm～600nm波长范围内的吸收光光谱；
(6)标准曲线绘制：取梯度浓度的AMACR标准溶液，按照前述步骤(1)～(5)方法进行检测，绘制标准曲线；
(7)结果判定：根据待测蛋白样品的检测结果，对照标准曲线，获得待测蛋白样品的浓度数据。
本发明的有益效果主要体在：本发明双功能纳米探针合成简单、容易修饰、设计灵活，用于蛋白质检测，方法简单、效果良好。
(四)附图说明
图1为合成的纳米金TEM表征图；
图2为动态光散射仪测量的不同修饰状态下的纳米金的粒径分布图；
图3为HRP和aptamer双功能化得纳米金用于AMACR检测的原理示意图图；
图4为AuNPs是否aptamer修饰对检测的影响；
图5为分别对AMACR、BSA、HSA、Hb以及GPC3进行检测并考察对应的信号增强情况；
图6为纳米金以及双功能化纳米金加入NaCl(终浓度分别为20mM与200mM)时，溶液的吸收以及颜色变化；
图7为检测不同浓度AMACR时，溶液在450nm波长处的吸收变化情况以及标准曲线；
图8为检测特定浓度＝AMACR时，溶液在350～600nm波长范围内的吸收光谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：双功能纳米探针合成及表征
纳米金的合成：
1mL1％HAuCl4加50mL水搅拌沸腾后加入6mL0.0479M柠檬酸三钠溶液，继续反应20min后自然冷却至室温，即得AuNPs，其TEM表征图参见图1，显示制得纳米金为球状结构。
纳米金修饰HRP和核酸适体(aptamer)：
(1)1mL AuNPs(约14nM)用Na2CO3调pH值到9.0；
(2)加入2μL10mg/mL HRP振荡反应1h，离心浓缩至200μL；
(3)加入2μL100μM aptamer溶液振荡反应24h；
(4)加入NaCl溶液至终浓度为0.1M，振荡反应1h；
(5)加入牛血清白蛋白至其终浓度为1％，封闭1h；
(6)离心洗涤2次，即得所述生物识别与信号引发双功能纳米探针(AuNPs-HRP-aptamer)；离心参数：13000rpm、30min，洗涤液为10mM磷酸缓冲液(pH＝7.4)。
修饰所用的核酸适体原料序列为：5'-CCTACGGCGCTAACCCATGCTACGAATTCGTTGTTAAACAATAGGCCACCGTGCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH-3'。
同时按照上述方法，省去步骤(3)，得到仅修饰HRP的纳米探针(AuNPs-HRP)作为对照，动态光散射仪测量的不同修饰状态下的纳米金的粒径分布图参见图2，由图可见，单独纳米金的粒径为15.32±0.542nm；修饰HRP后的纳米金粒径为34.06±0.507nm；而同时修饰核酸适体和HRP后，纳米金的粒径进一步增大到60.69±0.267nm。该结果说明纳米金成功修饰上了HRP与核酸适体。
原理验证实验：
图3为HRP和aptamer双功能化得纳米金用于AMACR检测的原理图，当目标蛋白存在时，通过核酸适体与目标蛋白之间的特异性结合，双功能纳米金能够连接在孔板上。通过连接上的双功能纳米金表面HRP的催化显色反应，该方法可实现对目标蛋白的信号放大检测。
分别用AuNPs-HRP-aptamer与AuNPs-HRP作为纳米生物探针来进行AMACR检测(1μg/mL)，考察是否aptamer修饰对检测的影响，结果见图4，由图可见，目标蛋白是通过核酸适体进行识别，也只有目标蛋白存在时，检测信号才会显著增大。
特异性实验时：
分别用BSA(牛血清白蛋白)、HSA(人血清白蛋白)、Hb(血红蛋白)与GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)代替AMACR进行检测，并测量对应的信号增强情况，结果见图5，结果显示，由于AMACR与其对应核酸适体的特异性识别，因此该纳米探针应用于AMACR的检测具有较好的特异性。
抗盐能力研究：
100μL合成的纳米金以及双功能化的纳米金溶液分别滴加1M的NaCl溶液，至其终浓度分别为20mM和200mM。然后分别测量滴加前后两种溶液的吸收光谱图，并拍照观察溶液变色情况，结果见图6，结果显示，纳米金修饰HRP与核酸适体后，粒径增大、吸收红移，而且纳米金的抗盐能力增强。
实施例2：AMACR的检测
(1)溶液配制
蛋白包被稀释液：6.7mM PBS(pH7.4)；
洗涤液：50mM PBS(pH7.4)+8g/L NaCl+80.2g/L KCl+80.05％(w/w)tween-20；
封闭液：1％(w/w)BSA，用洗涤液配制；
显色缓冲液：0.1M、pH＝5.0柠檬酸缓冲液+1mM TMB+1mM H2O2；
终止液：2M H2SO4。
(2)检测过程
包被：将所测蛋白质用包被稀释液稀释到适当浓度，分别取100μL加入96孔板中并置于37℃2h，弃去孔中液体，用洗涤液洗3遍。
封闭：将封闭液加满各反应孔并置于37℃2h，封闭结束后用洗涤液 洗3遍。
孵育纳米生物探针：合成的纳米生物探针稀释6倍后每孔加100μL，置于37℃1h。弃去孔中液体，用洗涤液洗5遍。
显色反应：各反应孔加入显色缓冲液100μL，37℃反应10min。然后加50μL终止液终止反应。
检测：测量各孔溶液在450nm波长处的吸收值或者测量其在350nm～600nm波长范围内的吸收光光谱。
标准曲线绘制：取梯度浓度的AMACR标准溶液，按照前述步骤进行检测，绘制标准曲线；
结果判定：根据待测蛋白样品的检测结果，对照标准曲线，获得待测蛋白样品的浓度数据。
检测不同浓度目标蛋白(AMACR)时，溶液在450nm波长处的吸收变化情况以及标准曲线参见图7，检测特定浓度AMACR时，溶液在350～600nm波长范围内的吸收光谱图参见图8，结果显示可检出10pg/mL的AMACR。
实验总结：
基于抗体检测方法的缺点：抗体制备较难、成本高，制备的批间误差大，对环境敏感、易失活等。
本发明方法优点：(1)核酸适体是用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从随机序列库中筛选出来的一条单链DNA或RNA，对其特定识别的蛋白质具有很高的亲和力。与抗体相比，核酸适体具有合成简单、热稳定性好、容易修饰、设计灵活等优点。(2)纳米金同时修饰辣根过氧化物酶(HRP)与核酸适体(aptamer)，这样不仅避免了生物识别分子与 信号引发分子之间的共价修饰，还能实现信号放大从而提高检测效果。方法简单、效果良好。
Claims (5)
1.一种用于检测α-甲基酰基辅酶A消旋酶的生物识别与信号引发双功能纳米探针，由纳米金粒子表面同时修饰辣根过氧化物酶和能够识别目标蛋白的核酸适体制得，所述纳米金粒子为球状结构、粒径为10～20nm，纳米金粒子与辣根过氧化物酶原料用量之比为7nmol：10～15mg，纳米金粒子与核酸适体原料用量之比为7nmol：100～150nmol；修饰所用的核酸适体原料序列如下：5'-CCTACGGCGCTAACCCATGCTACGAATTCGTTGTTAAACAATAGGCCACCGTGCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH-3'。
2.如权利要求1所述的双功能纳米探针，其特征在于所述双功能纳米探针由如下方法制备得到：
(1)取浓度为14nM的AuNPs混悬液用Na2CO3调pH值至9.0；
(2)加入浓度为10mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，震荡反应0.5～2h，离心浓缩至原体积的1/4～1/6，AuNPs混悬液与辣根过氧化物酶溶液体积用量之比为1:0.002～0.003；
(3)加入浓度为100μM的核酸适体溶液，震荡反应18～28h，AuNPs混悬液与辣根过氧化物酶溶液体积用量之比为1:0.002～0.003；
(4)加入NaCl溶液至其终浓度为0.1M，震荡反应0.5～2h；
(5)加入牛血清白蛋白至其终浓度为1％，封闭1～2h；
(6)离心、洗涤2～3次，即得所述生物识别与信号引发双功能纳米探针；离心参数如下：13000rpm、30min，洗涤液为10mM、pH7.4磷酸缓冲液。
3.一种检测α-甲基酰基辅酶A消旋酶的试剂盒，主要包括生物识别与信号引发双功能纳米探针以及检测用试剂，其特征在于：所述生物识别与信号引发双功能纳米探针由纳米金粒子表面同时修饰辣根过氧化物酶和能够识别目标蛋白的核酸适体制得，所述纳米金粒子为球状结构、粒径为10～20nm，纳米金粒子与辣根过氧化物酶原料用量之比为7nmol：10～15mg，纳米金粒子与核酸适体原料用量之比为7nmol：100～150nmol；修饰所用的核酸适体原料序列：5'-CCTACGGCGCTAACCCATGCTACGAATTCGTTGTTAAACAATAGGCCACCGTGCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH-3'。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述检测用试剂由包被稀释液、洗涤液、封闭液、显色缓冲液和终止液组成，所述包被稀释液为6.7mM、pH7.4的PBS；所述洗涤液组成如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.05％tween-20，溶剂为50mM、pH7.4的PBS；所述封闭液为1％BSA，溶剂为前述洗涤液；所述显色缓冲液组成如下：1mM TMB，1mM H2O2，溶剂为0.1M、pH＝5.0的柠檬酸缓冲液；所述终止液为2M H2SO4溶液。
5.一种利用权利要求3所述试剂盒检测α-甲基酰基辅酶A消旋酶的方法，所述方法如下：
(1)包被：将待测蛋白样品用包被稀释液稀释，分别取100μL加入96孔板中并置于37℃下2h，弃去孔中液体，用洗涤液洗3遍；
(2)封闭：将封闭液加满各反应孔并置于37℃2h，封闭结束后用洗涤液洗3遍；
(3)孵育纳米生物探针：将所述双功能纳米探针稀释后每孔加100μL，置于37℃1h；弃去孔中液体，用洗涤液洗5遍；
(4)显色反应：各反应孔加入显色缓冲液100μL，37℃反应10min，然后加50μL终止液终止反应；
(5)检测：测量各孔溶液在450nm波长处的吸收值或者测量其在350nm～600nm波长范围内的吸收光光谱；
(6)标准曲线绘制：取梯度浓度的α-甲基酰基辅酶A消旋酶标准溶液，按照前述步骤(1)～(5)方法进行检测，绘制标准曲线；
(7)结果判定：根据待测蛋白样品的检测结果，对照标准曲线，获得待测蛋白样品的浓度数据。
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