CN108663513B - 一种降低侧流层析试纸检测限的方法 - Google Patents

一种降低侧流层析试纸检测限的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低侧流层析试纸检测限的方法，属于快速检测技术领域。本发明方法包括依次线性排列地设置样品垫、层析膜、吸收垫(不含结合垫)，然后在样品垫上载样品溶液使目标检测物在层析膜的检测区(T区)预先富集，再在样品垫和层析膜之间插入结合垫，随后，继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。本发明方法实现了检测限的大幅度降低。与其他基于样品富集浓缩以降低侧流层析试纸检测限的方法相比，本发明不涉及其他扩增试剂、材料和设备，不增加检测成本，具有显著的简单、便捷、高效等优势。

Description

一种降低侧流层析试纸检测限的方法
技术领域
本发明涉及一种降低侧流层析试纸检测限的方法，属于快速检测技术领域。
背景技术
基于侧流层析技术制备的快检试纸即侧流层析试纸可用于现场快速检测小分子、蛋白和核酸等生物大分子以及微生物。此检测方法易于操作，成本低廉，检测结果肉眼可见，在临床诊断、环境监测和食品安全分析等领域已被广泛应用。目前，主流的侧流层析试纸由四个部分组成：样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，将这四部分叠加于支撑底板上就构成了一个侧流层析试纸条。样品垫为经过处理的纤维膜或玻璃棉，用于快速吸收待检样品，使其利用毛细管作用向结合垫方向侧向流动；结合垫为纤维膜或玻璃棉，吸附有标记的生物活性材料(如金标抗体)，它可与待检样品溶液里的检测靶标结合形成肉眼可见的免疫复合物从而被检测区捕获(基于夹心检测机理)并使检测区颜色随目标物浓度增加而增强，或从而逃离检测区的捕获(基于竞争检测机理)并使检测区颜色随目标物浓度增加而减弱；层析膜大都为硝酸纤维素膜，它是侧流分析技术中的关键材料，为分析物之间的反应提供了平台，其上固定有一条或多条具有生物活性物质(如抗原或抗体)的检测线或检测区以及一条不反应样品差异、恒定显色的质控线或质控区，用于拦截带标记的免疫复合物，并可直观地显示检测结果；吸水垫为吸水纸板，用于吸收流过层析膜的待检样品，以平衡层析膜两边的压差，促使更多待检样品在层析膜上侧向流动。
现有的侧流层析试纸主要存在着灵敏度不足、检测限偏高的缺点，然而，检测低浓度分析物的技术需求却在日益增加。因此，努力降低侧流层析试纸的检测限，这是目前侧流层析技术发展的热点。目前有以下几方面的研究以试图降低侧流层析试纸的检测限，例如：用荧光量子点替代金纳米粒子作为标记物，用仪器检测荧光信号代替裸眼检测显色信号；当目标物使核酸序列时，在试纸上样分析前采用基于酶的扩增技术提高检测靶标浓度；利用基于多级探针信号增强技术、温湿度技术和流体控制技术。虽然，这些先进的平台实现了比直接上样法更低的检测限，但它们基本都使用了如酶等高成本的生化试剂，外部设备或者多步复杂的操作。
在检测之前快速地浓缩、富集固定体积的样品，对于提高侧流层析技术定量检测的灵敏度是一种理想方案。例如，纸基等速电泳已被用于基于其电泳迁移率同时分离和浓缩山羊抗小鼠IgG，其在侧流层析检测中产生400倍的信号增强。但是，这种富集技术需要额外的高压电源，不适合在远程、现场的快速检测中使用。此外，有研究者使用聚乙二醇(PEG)或TritonX-114双水相体系浓缩检测靶标体积，能够使检出限降低一个数量级。然而，这些富集步骤或者需要额外的缓冲液添加步骤，或者需要在垂直放置的条带底部附近保留粘稠的胶束富集相，这将影响下游分析并使操作过程更复杂。因此，有必要进一步改进侧流层析技术，使之在降低检测限的同时更简化并更具成本效益，以便更好地用于实时检测。
经典侧流层析的上样方式有以下两种，一种是将修饰有识别分子的金纳米粒子(AuNPs-DP)干燥于结合垫，将结合垫组装至试纸条后在样品垫上载样品(后面称之为直接上样法)，另一种是将AuNPs-DP与样品混合后上载于样品垫(后面称之为预混上样法)。对于直接上样法，检测结果表现出明显的浓度依赖性，相同上样体积下检测区信号只对浓度有响应；由于AuNPs-DP是在液体最前沿流经检测区和对照区，实际发挥作用的响应体积可能小于10微升，因而增大上样体积并不会对降低检出限有任何帮助。对于预混上样法，首先，操作极微小体积的AuNPs-DP溶液对于现场检测并不现实，其次，AuNPs-DP的浓度被大幅稀释，大体积的AuNPs-DP源源不断的流经检测区很可能会导致假阳性出现从而影响检测结果的判断，因此并不是理想的上样方式。
为此，本发明开发了一种新的纸上原位富集技术，通过改进侧流层析试纸上样方式，有效地降低了侧流层析试纸检测限。
发明内容
为了解决侧流层析试纸技术存在的检出限偏高、现有富集浓缩方法不够简便的问题，本发明通过对侧流层析试纸的结构、组装顺序和上样方式做出改进，提供了一种在侧流层析试纸上对目标物预富集增敏的方法，达到了简便、显著降低裸眼检出限的效果。
本发明的第一个目的是提供一种待组装型侧流层析试纸，至少包括样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫；所述侧流层析试纸至少包括3个不接触的独立单元；其中，样品垫和结合垫，分属于不同的独立单元。
在一种实施方式中，第一独立单元中包含样品垫且不含有结合垫、层析膜、吸收垫；第二独立单元中包含结合垫，且不含有样品垫、层析膜、吸收垫。
在一种实施方式中，所述层析膜和吸收垫组合到一起，成为第三独立单元或其一部分。
在一种实施方式中，所述层析膜、吸收垫，均为不接触的独立单元。
在一种实施方式中，所述样品垫可以是能够用于侧流层析试纸中的任意一种形式的样品垫。样品垫用于快速吸收待检样品，使其利用毛细管作用向结合垫/层析膜方向侧向流动；可选地，样品垫为经过处理的纤维膜或玻璃棉。
在一种实施方式中，所述结合垫可以是能够用于侧流层析试纸中的任意一种形式的结合垫。结合垫吸附有标记的生物活性材料(如金标抗体)，它可与待检样品溶液里的检测靶标以及检测区固定化的识别分子结合形成肉眼可见的复合物从而被检测区捕获(基于夹心检测机理)并使检测区颜色随目标物浓度增加而增强，或与检测靶标竞争结合检测区固定化的识别分子从而被检测区捕获(基于竞争检测机理)，并使检测区颜色随目标物浓度增加而减弱直至消失。可选地，结合垫为纤维膜或玻璃棉。
在一种实施方式中，所述层析膜可以是能够用于侧流层析试纸中的任意一种形式的层析膜。层析膜是侧流分析技术中的关键材料，为分析物之间的反应提供了平台，其上固定有一条或多条具有生物活性物质(如抗原或抗体、核酸)的检测线或检测区以及一条不反应样品差异、恒定显色的质控线或质控区，用于拦截带标记的免疫复合物，并可直观地显示检测结果。可选地，层析膜是硝酸纤维素膜。
在一种实施方式中，所述层析膜上包被有质控线和检测线。
在一种实施方式中，所述吸收垫可以是能够用于侧流层析试纸中的任意一种形式的吸收垫。吸收垫用于吸收流过层析膜的待检样品，以平衡层析膜两边的压差，促使更多待检样品在层析膜上侧向流动。可选地，所述吸收垫为吸水纸板。
在一种实施方式中，所述待组装型侧流层析试纸还包括底板。
在一种实施方式中，所述待组装型侧流层析试纸为基于夹心检测机理或者基于竞争检测机理(检测区固定化目标物识别分子)的侧流层析试纸。
本发明的第二个目的是提供一种侧流层析检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫；所述侧流层析试纸至少包括3个不接触的独立单元；其中，样品垫和结合垫，分属于不同的独立单元。
在一种实施方式中，所述试剂盒内还存在一个记载有文字的标签，所述标签上的文字描述的意思包括：先按照样品垫、层析膜、吸收垫的顺序组装得到不含结合垫的预组装试纸，在预组装试纸上载样品，然后在样品垫和层析膜之间插入结合垫，再继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
在一种实施方式中，所述试剂盒的其他成分，可以与本发明所描述的待组装型侧流层析试纸中包含的成分一致。
本发明的第三个目的是提供一种所述待组装型侧流层析试纸或者侧流层析检测试剂盒的使用方法。
在一种实施方式中，所述使用方法包括：先按照样品垫、层析膜、吸收垫的顺序依次排列得到不含结合垫的预组装试纸，在预组装试纸上载样品，然后在样品垫和层析膜之间插入结合垫，再继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
在一种实施方式中，所述使用方法是基于非疾病诊断的使用方法。
本发明的第四个目的是提供所述待组装型侧流层析试纸或者侧流层析检测试剂盒的非疾病的诊断的应用。
在一种实施方式中，所述应用，包括用于检测核酸、蛋白质、具有适配体或抗体的小分子、金属离子和微生物等目标物。
本发明的第五个目的是提供一种降低侧流层析试纸检测限的方法，所述方法包括：依次线性排列地设置样品垫、层析膜、吸收垫(不含结合垫)，然后在样品垫上载样品溶液使目标检测物在层析膜的检测区(T区)预先富集，再在样品垫和层析膜之间插入结合垫，随后，继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
可选地，涉及到样品在试纸检测区原位富集，试纸使用者可根据对测试检测限具体需求决定富集时间和富集体积。可选地，当富集以体积计量时，盛放样品所用容器为1.5毫升箭头塑料离心管，为使样品充分吸收富集需将侧流层析试纸接触样品的样品垫底端修剪为尖角；而当富集以时间计量时无需修剪样品垫。可选地，当样品预富集体积大于100微升时，为避免吸水垫吸水饱和，可以在吸水垫处以长尾夹固定多层吸水纸巾以增加吸水垫的吸水能力。
在一种实施方式中，所述方法是基于非疾病诊断的降低侧流层析试纸检测限的方法。
在本发明中，所述结合垫为含有金纳米粒子的结合垫。
在本发明中，所述目标检测物为模拟微RNA miR-210的DNA序列或者凝血酶。
本发明的方法，实现了在侧流层析试纸上对目标物预富集增敏，具体为：不按直接上样法中侧流层析试纸传统结构将含有干燥的金纳米粒子的结合垫预先组装在试纸上，也不按预混上样法将金纳米粒子与样品混合一起上样，而是先在不含结合垫的试纸上载样品，使目标检测物在检测区(T区)预先富集，然后在样品垫和层析膜之间插入含有干燥金纳米粒子的结合垫，再继续在样品垫上载样品溶液或缓冲溶液，以将结合垫上的金纳米粒子溶解并携带迁移经过硝酸纤维素膜的检测区和质控区。本发明适用于基于夹心检测机理、类似夹心检测机理及基于竞争检测机理(检测区固定化目标物识别分子)检测核酸、蛋白质、具有适配体或抗体的小分子、金属离子和微生物等目标物的侧流层析试纸降低检测限与预富集增敏，不适用于基于竞争法检测机理的侧流层析试纸降低检测限。
本发明的优点和效果：
(1)本发明的待组装型侧流层析试纸/试剂盒，至少包括3个不接触的独立单元，并将样品垫和结合垫设置于不同的独立单元。在实际使用时，操作者可以对不同的独立单元进行重新组装，灵活性高；可以采用以下使用方法：依次线性排列地设置样品垫、层析膜、吸收垫(不含结合垫)，然后在样品垫上载样品溶液使目标检测物在层析膜的检测区(T区)预先富集，再在样品垫和层析膜之间插入结合垫，随后，继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
(2)与经典侧流层析的结构组装和直接上样法相比，本发明方法仅通过交换结合垫组装与样品上载二者的顺序，使样品先在试纸检测区原位富集，即实现了检测限的大幅度降低。与其他基于样品富集浓缩以降低侧流层析试纸检测限的方法相比，本发明不涉及其他扩增试剂、材料和设备，不增加检测成本，具有显著的简单、便捷、高效等优势。
(3)而且，基于本发明中所述技术改进的侧流层析方法，富集不同体积会使检测限有不同程度的降低，试纸使用者可根据对测试检测限具体需求灵活决定富集时间和富集体积。举例说明本方法的优势如下：按经典侧流层析的直接上样法上载50μL样品，需要5-10min的时间测定结束；而按本发明的改进技术，在试纸上预先富集50μL样品需要5-10min，加结合垫后需要5-10min的时间测定结束，整个流程仅增加不多于10min的预富集时间，然而却能实现一个数量级的检测限降低；而如果将样品富集体积增加至100μL，整个检测流程大约需要增加10-30min，检测限能够降低大约两个数量级；富集体积增加至400μL，整个检测流程大约需要增加60-90min，检测限大约降低三个数量级。继续延长富集时间并增加富集体积，检测限会继续降低。
附图说明
图1为本发明所涉及侧流层析检测流程。
图2为实施例1的直接上样法与预富集不同体积目标物的结果对比。
图3为实施例2的直接上样法与预富集不同体积目标物的结果对比。
具体实施方案
下面是对本发明进行具体描述。
实施例1
一种降低侧流层析试纸(基于夹心检测机理)检测限的方法，检测目标物为模拟微RNAmiR-210的DNA序列5'-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3'(序列如SEQ ID NO:1所示)，检测机理为类似夹心检测机理，包括以下步骤：
1)金纳米粒子的合成
将49mL超纯水和1mL 50mM氯金酸水溶液在100mL圆底烧瓶中煮沸，然后，快速将圆底烧瓶底部热的电磁搅拌加热套替换成平板电磁搅拌器，在搅拌的状态下趁热尽快将5mL38.8mM柠檬酸三钠水溶液加入上述圆底烧瓶中，烧瓶内溶液由黄色变蓝再变深红色，在搅拌下冷却至室温。即得到金纳米颗粒水溶胶。将上述水溶胶通过0.45μm聚醚砜水系过滤器过滤，并作为金纳米粒子储备溶液保存在4℃冰箱中。
2)制备金纳米粒子-探针偶联物(AuNPs-DP)及结合垫
在10mL塑料离心管中进行DNA探针(序列为5’-HS-(CH2)6-AAA AAA AAA AGT AAAACG ACG GCC AGT-3'，序列如SEQ ID NO:2所示)与金纳米颗粒的偶联。将50μL100μM硫醇化DNA与1mL AuNPs储备溶液混合，电磁搅拌下避光反应12h，将1mL pH 8.2的10mM三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐缓冲液加入到上述混合物中，再向其中加入2mL 0.4mM NaCl使AuNPs-DP避光搅拌老化24小时。产物4℃以18407rcf离心15min，弃上清并用超纯水洗涤沉淀三次，最后沉淀即为AuNPs-DP。将此沉淀溶于500μL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中(含4％牛血清白蛋白，0.25％吐温20)，利用三维喷点平台将每250μL上述AuNPs-DP储备液喷布于结合垫(0.65cm×30cm)上并真空干燥得到结合有AuNPs-DP的结合垫,储存在4℃的干燥器中待用。
3)试纸条组装和检测
①传统直接上样法：在8cm×30cm带胶塑料底板上依次粘贴硝酸纤维素膜(140s/cm，2.5cm×30cm)、吸水垫(3.0cm×30cm)、含有干燥AuNPs-DP的结合垫(0.65cm×30cm)和样品垫(2.7cm×30cm)，其中，吸水垫和样品垫分别覆盖硝酸纤维素膜0.2cm，样品垫覆盖结合垫0.2cm。用切条机将上述组装好的试纸切割成8cm×0.4cm试纸条。在每张试纸条上滴加探针，具体操作为在硝酸纤维素膜上距离吸水垫0.5cm(质控区)和1.0cm(检测区)处分别滴加0.5μL 100μM质控捕获探针(核酸序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACT GGC CGT CGT TTT AC-3'，序列如SEQ ID NO:3所示)和0.5μL 100μM检测捕获探针(核酸序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAA GTA AAA CGA CGG CCA TCA GCC GCT GTC ACA CGC ACAGAC TGG CCG TCG TTT TAC-3'，序列如SEQ ID NO:4所示)，然后在烘箱内65℃烘30min，暂时不使用的试纸条储存在4℃的干燥器中待用。向上述试纸条的样品垫滴加50μL含有样品的缓冲溶液(pH7.4，含1×PBS(1.47mM KH2PO4，8.10mM Na2HPO4，137.92mM NaCl，2.67mMKCl)和0.49mM MgCl2，4％牛血清白蛋白，1％十二烷基磺酸钠)，利用毛细作用使样品溶液溶解并携带结合垫上的AuNPs-DP迁移经过硝酸纤维素膜进行纸上分离分析，过量液体被吸水垫吸收。5min后试纸条显色完成，即可实现裸眼检测。以上述基于夹心检测机理直接上样法检测miR-210的裸眼检出限为100nM。
②本发明的方法：在8cm×30cm带胶塑料底板上依次粘贴硝酸纤维素膜(140s/cm，2.5cm×30cm)、吸水垫(3.2cm×30cm)和样品垫(2.7cm×30cm)，其中，吸水垫和样品垫分别覆盖硝酸纤维素膜0.2cm。用切条机将上述组装好的试纸切割成8cm×0.4cm试纸条。在每张试纸条上滴加探针，具体操作为在硝酸纤维素膜上距离吸水垫0.5cm(质控区)和1.0cm(检测区)处分别滴加0.5μL 100μM质控捕获探针(核酸序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACT GGC CGT CGT TTT AC-3'，序列如SEQ ID NO:3所示)和0.5μL 100μM检测捕获探针(核酸序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAA GTA AAA CGA CGG CCA TCA GCC GCT GTCACA CGC ACA GAC TGG CCG TCG TTT TAC-3'，序列如SEQ ID NO:4所示)，然后在烘箱内65℃烘30min，暂时不使用的试纸条储存在4℃的干燥器中待用。将上述由吸水垫、硝酸纤维素膜和样品垫(无结合垫)组成的试纸条插入样品溶液(pH7.4，含1×PBS(1.47mM KH2PO4，8.10mMNa2HPO4，137.92mM NaCl，2.67mM KCl)和0.49mM MgCl2，4％牛血清白蛋白，1％十二烷基磺酸钠)的1.5mL塑料离心管中，样品垫浸没在液体中，但液体上沿低于硝酸纤维素膜，样品通过毛细作用吸附迁移流经硝酸纤维素膜被吸水垫吸收进行纸上检测区浓缩和成分分离。为了提高吸水垫的吸水能力，用长尾夹将另一片经折叠的吸水纸固定在试纸条的吸水垫上。15min预富集50μL样品，30min富集100μL样，2h富集400μL样品。然后将一片含有干燥AuNPs-DP的结合垫插入硝酸纤维素膜和样品垫之间(如图1所示)，再将试纸条的样品垫端插入样品中，利用毛细作用使样品溶液溶解并携带AuNPs-DP迁移经过硝酸纤维素膜。5min后试纸条显色完成，即可实现裸眼检测。以上述基于夹心检测机理预富集法检测miR-210，富集50μL样品，裸眼检出限为10nM，比直接上样法检测限降低一个数量级；富集100μL样品，裸眼检出限为1nM，比直接上样法检测限降低两个数量级；富集400μL样品，裸眼检出限为0.1nM，比传统直接上样法检测限降低三个数量级(如图2所示)。
上述步骤1)、步骤2)和步骤3)①是做胶体金试纸的通用步骤。本实施例的关键在于步骤3②，通过采用如下步骤有效地降低了侧流层析试纸检测限：依次线性排列地设置样品垫、层析膜、吸收垫(不含结合垫)，然后在样品垫上载样品溶液使目标检测物在层析膜的检测区(T区)预先富集，再在样品垫和层析膜之间插入结合垫，随后，继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
实施例2
一种降低侧流层析试纸(基于竞争检测机理)检测限的方法，检测目标物为模拟微RNA miR-210的DNA序列5'-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3'(序列如SEQ ID NO:1所示)，检测机理为竞争检测机理，包括以下步骤：
1)金纳米粒子的合成
将24.5mL超纯水和0.5mL 50mM氯金酸水溶液在50mL圆底烧瓶中煮沸，然后，快速将圆底烧瓶底部热的电磁搅拌加热套替换成平板电磁搅拌器，在搅拌的状态下趁热尽快将2.5mL 38.8mM柠檬酸三钠水溶液加入上述圆底烧瓶中，烧瓶内溶液由黄色变蓝再变深红色，在搅拌下冷却至室温。即得到金纳米颗粒水溶胶。将上述水溶胶通过0.45μm聚醚砜水系过滤器过滤，并作为金纳米粒子储备溶液保存在4℃冰箱中。
2)制备金纳米粒子-探针偶联物(AuNPs-DP)及结合垫
在10mL塑料离心管中进行DNA探针(序列为5’-HS-(CH2)6-AAAAAAAAAACTGTGCGTGTGACAGCGGCTGAGTAAAACGACGGCCAGT-3'，序列如SEQ ID NO:5所示)与金纳米颗粒的偶联。将25μL100μM硫醇化DNA与0.5mL AuNPs储备溶液混合，电磁搅拌下避光反应12h，将0.5mL pH8.2的10mM三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐缓冲液加入到上述混合物中，再向其中加入1mL0.4mM NaCl使AuNPs-DP避光搅拌老化24小时。产物4℃以18407rcf离心15min，弃上清并用超纯水洗涤沉淀三次，最后沉淀即为AuNPs-DP。将此沉淀溶于250μL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中(含4％牛血清白蛋白，0.25％吐温20)，利用三维喷点平台将上述AuNPs-DP储备液喷布于结合垫(0.65cm×30cm)上并真空干燥得到结合有AuNPs-DP的结合垫,储存在4℃的干燥器中待用。
3)试纸条组装和检测
①传统直接上样法：在8cm×30cm带胶塑料底板上依次粘贴硝酸纤维素膜(140s/cm，2.5cm×30cm)、吸水垫(3.0cm×30cm)、含有干燥AuNPs-DP的结合垫(0.65cm×30cm)和样品垫(2.7cm×30cm)，其中，吸水垫和样品垫分别覆盖硝酸纤维素膜0.2cm，样品垫覆盖结合垫0.2cm。用切条机将上述组装好的试纸切割成8cm×0.4cm试纸条。在每张试纸条上滴加探针，具体操作为在硝酸纤维素膜上距离吸水垫0.5cm(质控区)和1.0cm(检测区)处分别滴加0.5μL 100μM质控捕获探针(核酸序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACT GGC CGT CGT TTT AC-3'，序列如SEQ ID NO:3所示)和0.5μL 100μM检测捕获探针(核酸序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAATCAGCCGCTGTCACACGCACAG-3'，序列如SEQ ID NO:6所示)，然后在烘箱内65℃烘30min，暂时不使用的试纸条储存在4℃的干燥器中待用。向上述试纸条的样品垫滴加50μL含有样品的缓冲溶液(pH7.4，含1×PBS(1.47mM KH2PO4，8.10mMNa2HPO4，137.92mM NaCl，2.67mM KCl)和0.49mM MgCl2，4％牛血清白蛋白，1％十二烷基磺酸钠)，利用毛细作用使样品溶液溶解并携带结合垫上的AuNPs-DP迁移经过硝酸纤维素膜进行纸上分离分析，过量液体被吸水垫吸收。5min后试纸条显色完成，即可实现裸眼检测。以上述基于竞争检测机理直接上样法检测miR-210的裸眼检出限(cutoff)为1μM，灰度分析检出限为10nM。
②本发明的方法：在8cm×30cm带胶塑料底板上依次粘贴硝酸纤维素膜(140s/cm，2.5cm×30cm)、吸水垫(3.2cm×30cm)和样品垫(2.7cm×30cm)，其中，吸水垫和样品垫分别覆盖硝酸纤维素膜0.2cm。用切条机将上述组装好的试纸切割成8cm×0.4cm试纸条。在每张试纸条上滴加探针，具体操作为在硝酸纤维素膜上距离吸水垫0.5cm(质控区)和1.0cm(检测区)处分别滴加0.5μL 100μM质控捕获探针(核酸序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACT GGC CGT CGT TTT AC-3'，序列如SEQ ID NO:3所示)和0.5μL 100μM检测捕获探针(核酸序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAATCAGCCGCTGTCACACGCACAG-3'，序列如SEQID NO:6所示)，然后在烘箱内65℃烘30min，暂时不使用的试纸条储存在4℃的干燥器中待用。将上述由吸水垫、硝酸纤维素膜和样品垫(无结合垫)组成的试纸条插入样品溶液(pH7.4，含1×PBS(1.47mM KH2PO4，8.10mM Na2HPO4，137.92mM NaCl，2.67mM KCl)和0.49mMMgCl2，4％牛血清白蛋白，1％十二烷基磺酸钠)的1.5mL塑料离心管中，样品垫浸没在液体中，但液体上沿低于硝酸纤维素膜，样品通过毛细作用吸附迁移流经硝酸纤维素膜被吸水垫吸收进行纸上检测区浓缩和成分分离。为了提高吸水垫的吸水能力，用长尾夹将另一片经折叠的吸水纸固定在试纸条的吸水垫上。15min预富集50μL样品，30min富集100μL样，2h富集400μL样品。然后将一片含有干燥AuNPs-DP的结合垫插入硝酸纤维素膜和样品垫之间(如图1所示)，再将试纸条的样品垫端插入样品中，利用毛细作用使样品溶液溶解并携带AuNPs-DP迁移经过硝酸纤维素膜。5min后试纸条显色完成，即可实现裸眼检测。以上述基于竞争检测机理预富集法检测miR-210，富集50μL样品，裸眼检出限(cutoff)为100nM，灰度分析检出限为1nM，裸眼检出限与灰度分析检出限均比直接上样法降低一个数量级；富集100μL样品，裸眼检出限(cutoff)为10nM，比直接上样法检测限降低两个数量级，灰度分析检出限为1nM，比直接上样法降低一个数量级；富集400μL样品，裸眼检出限为1nM，比直接上样法降低三个数量级，灰度分析检出限为0.1nM，比直接上样法降低两个数量级(如图3所示)。
上述步骤1)、步骤2)和步骤3)①是做胶体金试纸的通用步骤。本实施例关键在于步骤3②，通过采用如下步骤有效地降低了侧流层析试纸检测限：依次线性排列地设置样品垫、层析膜、吸收垫(不含结合垫)，然后在样品垫上载样品溶液使目标检测物在层析膜的检测区(T区)预先富集，再在样品垫和层析膜之间插入结合垫，随后，继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
实施例3
一种降低侧流层析试纸(基于夹心检测机理)检测限的方法，检测目标物为凝血酶，包括以下步骤：
1)金纳米粒子的合成
将98mL超纯水和2mL 50mM氯金酸水溶液在250mL圆底烧瓶中煮沸，然后，快速将圆底烧瓶底部热的电磁搅拌加热套替换成平板电磁搅拌器，在搅拌的状态下趁热尽快将10mL38.8mM柠檬酸三钠水溶液加入上述圆底烧瓶中，烧瓶内溶液由黄色变蓝再变深红色，在搅拌下冷却至室温。即得到金纳米颗粒水溶胶。将上述水溶胶通过0.45μm聚醚砜水系过滤器过滤，并作为金纳米粒子储备溶液保存在4℃冰箱中。
2)制备金纳米粒子-适配体偶联物及结合垫
使用硫醇化适配体I(具有polyT(20)尾的硫醇化核酸序列5'-SH-(CH2)6-TT TTTTTT TTT TTT TTT TTT GGT TGG TGT GGT TGG-3'，序列如SEQ ID NO:7所示)与金纳米粒子偶联。将100μL 1.0OD的硫醇化适配体I与2μL三乙胺和7.7mg二硫苏糖醇在室温下混合反应1小时，然后用400μL乙酸乙酯溶液萃取四次除去过量的DTT，得到激活的适配体I溶液。取5mL步骤一所制备的金纳米粒子储备溶液，18407rcf离心15min，以1mL超纯水复溶沉淀后将其加入到激活的适配体I溶液中，混匀后避光静置24小时。加入1mL pH 7.4的1×PBS缓冲溶液产物老化，在4℃下再放置24小时，随后在18407rcf离心15min以除去过量的试剂。弃上清并用超纯水洗涤沉淀三次，最后沉淀分散在1mL含有20mM Na3PO4·12H2O，5％牛血清白蛋白，0.25％吐温20和10％蔗糖的水溶液中，即得到识别凝血酶的AuNPs-DP。利用三维喷点平台将每250μL上述AuNPs-DP储备液喷布于结合垫(0.65cm×30cm)上并真空干燥得到结合有AuNPs-DP的结合垫，储存在4℃的干燥器中待用。
3)分别制备链霉亲和素与生物素化适配体II和生物素化对照探针DNA偶联物
将42μL 10OD生物素化适配体II(核酸序列为5'-生物素-ATG CCG TGG TAG GGCAGG TTG GGG TGA CT-3'，序列如SEQ ID NO:8所示)与250μL的2mg/mL链霉亲和素混合，室温下反应1小时后，将508μL pH 7.4的1×PBS加入到混合物中。通过离心过滤器(截留分子量30kD)以3381rcf离心30min以移除过量适体，再用500μL pH 7.4的1×PBS洗涤产物两次。收集滤器中剩余的溶液，以1×PBS将溶液稀释定容至500μL，得到链霉亲和素-生物素化适配体II偶联物。按照相同的步骤，使用浓度为10OD的生物素化对照探针DNA(核酸序列为5'-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA-生物素-3'，序列如SEQ ID NO:9所示)与链霉亲和素偶联制备链霉亲和素-生物素化对照探针DNA偶联物。
4)试纸条组装和检测
①传统直接上样法：在8cm×30cm带胶塑料底板上依次粘贴硝酸纤维素膜(140s/cm，2.5cm×30cm)、吸水垫(3.0cm×30cm)、含有干燥AuNPs-DP的结合垫(0.65cm×30cm)和样品垫(2.7cm×30cm)，其中，吸水垫和样品垫分别覆盖硝酸纤维素膜0.2cm，样品垫覆盖结合垫0.2cm。用切条机将上述组装好的试纸切割成8cm×0.4cm试纸条。在每张试纸条上滴加探针，具体操作为在硝酸纤维素膜上距离吸水垫1.0cm(检测区)和0.5cm(质控区)处分别滴加0.5μL链霉亲和素-生物素化适配体II偶联物和链霉亲和素-生物素化对照探针DNA偶联物，室温自然干燥1h，暂时不使用的试纸条储存在4℃的干燥器中待用。向上述试纸条的样品垫滴加50μL含有样品的缓冲溶液(pH 7.0，含2.25M氯化钠，0.23M柠檬酸钠，1％BSA牛血清白蛋白)，利用毛细作用使样品溶液溶解并携带结合垫上的AuNPs-DP迁移经过硝酸纤维素膜进行纸上分离分析，过量液体被吸水垫吸收。5min后试纸条显色完成，即可实现裸眼检测。以上述直接上样法检测凝血酶的裸眼检出限为2.5nM。
②本发明的方法：在8cm×30cm带胶塑料底板上依次粘贴硝酸纤维素膜(140s/cm，2.5cm×30cm)、吸水垫(3.2cm×30cm)和样品垫(2.7cm×30cm)，其中，吸水垫和样品垫分别覆盖硝酸纤维素膜0.2cm。用切条机将上述组装好的试纸切割成8cm×0.4cm试纸条。在每张试纸条上滴加探针，具体操作为在硝酸纤维素膜上距离吸水垫1.0cm(检测区)和0.5cm(质控区)处分别滴加0.5μL链霉亲和素-生物素化适配体II偶联物和链霉亲和素-生物素化对照探针DNA偶联物，室温自然干燥1h，暂时不使用的试纸条储存在4℃的干燥器中待用。将上述试纸条插入装有含样品的缓冲溶液(pH 7.0，含2.25M氯化钠，0.23M柠檬酸钠，1％BSA牛血清白蛋白)的1.5mL塑料离心管中，样品垫浸没在液体中，但液体上沿低于硝酸纤维素膜，样品通过毛细作用吸附迁移流经硝酸纤维素膜被吸水垫吸收进行纸上检测区浓缩和成分分离。为了提高吸水垫的吸水能力，用长尾夹将另一片经折叠的吸水纸固定在试纸条的吸水垫上。15min预富集50μL样品。然后将一片含有干燥AuNPs-DP的结合垫插入硝酸纤维素膜和样品垫之间(如图1所示)，再将试纸条的样品垫端插入样品中，利用毛细作用使样品溶液溶解并携带AuNPs-DP迁移经过硝酸纤维素膜。5min后试纸条显色完成，即可实现裸眼检测。以上述预富集法检测凝血酶，富集50μL样品，裸眼检出限为0.25nM，比直接上样法检测限降低一个数量级。
上述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)①是做胶体金试纸的通用步骤。本实施例关键在于步骤4)②，通过采用如下步骤有效地降低了侧流层析试纸检测限：依次线性排列地设置样品垫、层析膜、吸收垫(不含结合垫)，然后在样品垫上载样品溶液使目标检测物在层析膜的检测区(T区)预先富集，再在样品垫和层析膜之间插入结合垫，随后，继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
实施例4:一种待组装型侧流层析试纸
一种待组装型侧流层析试纸，至少包括样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫；所述侧流层析试纸至少包括3个不接触的独立单元；其中，样品垫和结合垫，分属于不同的独立单元。
第一独立单元中包含样品垫且不含有结合垫、层析膜、吸收垫；第二独立单元中包含结合垫，且不含有样品垫、层析膜、吸收垫。
可选地，所述层析膜和吸收垫组合到一起，成为第三独立单元或其一部分；也可以分别作为不接触的独立单元。
可选地，所述样品垫、结合垫、层析膜、吸收垫，可以是能够用于已有的基于夹心检测机理和基于竞争检测机理(检测区固定化目标物识别分子)的侧流层析试纸中的任意一种形式的样品垫、结合垫、层析膜、吸收垫，比如样品垫为经过处理的纤维膜或玻璃棉，结合垫为纤维膜或玻璃棉，层析膜是硝酸纤维素膜等。
本实施例的待组装型侧流层析试纸，在使用时，使用者可以自由组装，使用更加灵活，克服了现有传统侧流层析试纸所存在的不适合重新组装使用的问题。本实施例的待组装型侧流层析试纸，可以采用以下使用方法：依次线性排列地设置样品垫、层析膜、吸收垫(不含结合垫)，然后在样品垫上载样品溶液使目标检测物在层析膜的检测区(T区)预先富集，再在样品垫和层析膜之间插入结合垫，随后，继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。这样的使用方式，可以有效地降低侧流层析试纸检测限。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种降低侧流层析试纸检测限的方法
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgtgcgtgt gacagcggct ga 22
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaaaaaaaa gtaaaacgac ggccagt 27
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa actggccgtc gttttac 57
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaaaaaaaa aaaaagtaaa acgacggcca tcagccgctg tcacacgcac agactggccg 60
tcgttttac 69
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaaaaaaaa ctgtgcgtgt gacagcggct gagtaaaacg acggccagt 49
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaaaaaaaa aaaaatcagc cgctgtcaca cgcacag 37
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tttttttttt tttttttttt ggttggtgtg gttgg 35
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20

Claims (4)

1.一种待组装型侧流层析试纸或者侧流层析检测试剂盒的使用方法，所述待组装型侧流层析试纸或试剂盒至少包括样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫；所述侧流层析试纸至少包括3个不接触的独立单元；其中，样品垫和结合垫，分属于不同的独立单元；其特征在于，所述使用方法包括：先按照样品垫、层析膜、吸收垫的顺序依次排列得到不含结合垫的预组装试纸，在预组装试纸上载样品，然后在样品垫和层析膜之间插入结合垫，再继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待组装型侧流层析试纸中的层析膜和吸收垫组合到一起，成为第三独立单元或其一部分；或者是，所述层析膜、吸收垫，均为不接触的独立单元。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待组装型侧流层析试纸中的样品垫是用于侧流层析试纸中的任意一种形式的样品垫；所述结合垫是用于侧流层析试纸中的任意一种形式的结合垫；所述层析膜是用于侧流层析试纸中的任意一种形式的层析膜；所述吸收垫可以是能够用于侧流层析试纸中的任意一种形式的吸收垫。
4.一种降低侧流层析试纸检测限的方法，其特征在于，所述方法包括：依次线性排列地设置样品垫、层析膜、吸收垫，然后在样品垫上载样品溶液使目标检测物在层析膜的检测区预先富集，再在样品垫和层析膜之间插入结合垫，随后，继续在样品垫上载样品溶液或者缓冲液。
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