CN107202895A - 一种基于适配体识别的凝血酶快速检测试纸条 - Google Patents

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吴世嘉
刘丽红
王周平
段诺
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Abstract

本发明公开了一种基于适配体识别的凝血酶快速检测试纸条的制备与应用，属于胶体金检测领域。该技术是将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫固定于塑料地板，通过虹吸现象达到检测目的。所述结合垫上固定的是通过巯基连接的适配体1(Aptamer1)金标探针，所述层析膜检测线是通过链霉亲和素固定的适配体2(Aptamer 2)序列，所述质控线是通过链霉亲和素固定的金标探针非识别序列的互补序列DNA1。本发明应用夹心原理，可在5min内得到检测结果，达到凝血酶快速、灵敏检测的目的。本发明具有成本低廉、使用简单、特异性好，操作简单等优点。

Description

一种基于适配体识别的凝血酶快速检测试纸条
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种基于适配体识别的试纸条检测技术。
背景技术
临床上对恶性肿瘤进行快速灵敏筛查常以肿瘤标志物作为检测的目标分子。例如凝血酶是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶，具有催化纤维蛋白元变成纤维蛋白，促进血液凝固和调控凝血等作用，在解释肿瘤的发生机制及作为早期诊断、疗效及预后判断等方面均具有重要意义。发展可以高灵敏检测这些肿瘤标志物蛋白质的生物传感器是恶性肿瘤早期诊断的一个非常有效的方法。
传统的检测方法需要昂贵的设备支持，同时样品处理时间长，过程复杂，耗时耗力。而适配体试纸条技术可在5min内观察到检测结果，价格低廉、反应快速、灵敏度高。
发明内容
本发明利用适配体高特异性、高亲和力等优点，将其替代抗体用于试纸条技术，解决了试纸条技术中常见的假阴性假阳性等问题。同时利用核苷酸序列碱基互补配对原理制备质控线，结果准确、稳定。
本发明的技术方案如下：
纳米金适配体探针的制备：取新制备粒径为10nm左右的纳米金溶液，浓缩后加入100μM巯基化适配体溶液，4℃内反应过夜。加入SDS溶液，混匀后分批加入NaCl溶液至终浓度为80mM，放于4℃避光环境下孵育过夜。于10000rpm下离心20min，用PBS重悬洗涤后用重悬液(0.01M PBS，5％蔗糖、0.5％ PEG，0.1％ Tween-20，0.05％ MgSO4，0.05％(NH4)2SO4)重悬。
结合垫的制备：将纳米金探针制备完成后，用点晶喷膜仪将金标溶液喷于聚酯膜上，37℃烘干，于避光霞密闭保存备用。
核酸序列与链霉亲和素复合物的制备：取链霉亲和素20μL，分别加入100μMAptamer 2及DNA 1序列，混匀后37℃孵育30min备用。
硝酸纤维素膜的处理：用点晶喷膜仪将制备好的核酸序列与链霉亲和素复合物喷涂于140孔径硝酸纤维素膜上，喷样量为0.6μL/cm，检测线与质控线之间距离为6mm。处理后将其放于37℃烘箱烘干并于密闭环境下保存备用。
试纸条的组装：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次固定于聚乙烯底板上，相邻两部分重叠2mm，并用板条切割机将其切割成4mm宽，避光密闭环境下保存备用。
本发明制备的试纸条使用方法：将试纸条至于水平面上，取待测液20μL，滴加于试纸条样品垫上，5min 后观察结果。若硝酸纤维素膜上有两条线，则检验结果呈阳性，若只有一条线，则检验结果呈阴性。
本发明制备的试纸条是利用适配体识别底物，纳米金显色原理制备。当有凝血酶存在时，样品中的凝血酶首先与结合垫上的纳米金适配体探针结合形成凝血酶-Aptamer1-纳米金复合物结构。当其通过层析作用流过检测线时，凝血酶再次被线上固定的另一种适配体捕获形成Aptamer 2-凝血酶-Aptamer 1-纳米金的复合结构，因此T线显色。当液体流过质控线时，线上固定的DNA1序列会通过碱基互补非对原理捕获金标探针。无论有无底物存在，质控线均可显色。
本发明的优点在于：
本发明利用适配体代替传统免疫层析试纸条中的抗体，保证了与待测物的高亲和力、高特异性的通知，大大降低了试纸条的制备成本。同时适配体制备周期短，性能稳定，对有无免疫原性的靶标均可筛选得到相应的适配体，因此大大拓宽了试纸条的适用范围。
本发明采用两条不同适配体分别识别底物形成夹心结构，大大降低了假阴性的出现。
本发明的质控线没有采用金标探针适配体识别序列的互补序列，而是在通过polyA识别探针适配体尾端添加的poly T序列，解决了适配体识别底物后无法与质控线上DNA1序列碱基互补配对的问题，使质控线更稳定，检测结果更准确。
附图说明
图1本发明试纸条的检测原理示意图；
图2本发明检测结果示意图；
图3本发明实际检测结果图。
具体实施方案
1.试纸要求
(1)阴性参考品符合率
用磷酸盐缓冲溶液(0.01M PBS溶液，pH 7.4)配制浓度为10mM的血红蛋白标准品溶液进行10次平行检测，一正常或矫正目力观察结果，反应在5min时观察结果，应为阴性。
用磷酸盐缓冲溶液(0.01M PBS溶液，pH 7.4)配制浓度为10mM的牛血清蛋白标准品溶液进行10次平行检测，一正常或矫正目力观察结果，反应在5min时观察结果，应为阴性。
(2)阳性参考品符合率
用磷酸盐缓冲溶液(0.01M PBS溶液，pH 7.4)配制浓度为1000、700、400、100nM的凝血酶标准品溶液进行10次平行检测，一正常或矫正目力观察结果，反应在5min时观察结果，不得出现阴性。
(3)最低检出量
用磷酸盐缓冲溶液(0.01M PBS溶液，pH 7.4)配制浓度为1000、700、400、100、50、10、0nM的凝血酶标准品溶液进行10次平行检测，一正常或矫正目力观察结果，反应在5min时观察结果，最低检出量不高于10nM。
(4)再现性
用磷酸盐缓冲溶液(0.01M PBS溶液，pH 7.4)配制浓度为400nM的凝血酶标准品溶液进行10次平行检测，一正常或矫正目力观察结果，结果一致，显色度均一。
(5)稳定性检测
37℃放置10天后，各项指标复合以上要求。
2.复杂样品中凝血酶的检测
为了考察所建立的方法能否用于实际样品检测，选择稀释的人血液作为检测样品。正常人血浆中凝血酶主要由外源性凝血途径产生，每毫升血浆可产生210-360U的凝血酶。将血液盛于离心管中，置37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心(3000rpm，离心10min)，取上清，分装备用。
将人血清稀释倍20(5％ serum)，配制得到一定浓度的凝血酶样品(5μL样品分析对应的凝血酶浓度为0， 10，20，50，100nM，将试纸条平放于水平桌面上，取20μL待测液滴加于试纸条样品垫上，5min后观察结果。检测线颜色随着凝血酶浓度的增大逐渐加深，且与相同浓度的标准样品得到的条带基本无差异。
序列表
〈110〉 江南大学
〈120〉 一种基于适配体识别的凝血酶快速检测试纸条
〈130〉
〈160〉 1
〈170〉 PatentIn version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 1
ttttttttttttttttttttttttttttttggttggtgtggttgg 45
〈210〉 2
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 2
agtccgtggtagggcaggttggggtgact 29
〈210〉 3
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 3
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 30

Claims (4)

1.一种基于适配体识别的凝血酶快速检测试纸条，其特征在于聚乙烯底板上分别固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫。其特征在于结合垫固定纳米金标记的适配体1(Aptamer 1)，硝酸纤维素膜检测线固定链霉亲和素与适配体2(Aptamer 2)的复合物，质控线上固定链霉亲和素与纳米金探针非识别序列的互补序列DNA1的复合物。
2.根据权利要求1所述核苷酸序列为：
Aptamer1：5-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG
Aptamer2：5-biotin-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT
DNA1：5-biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
3.根据权利要求1所述的一种基于适配体识别的凝血酶快速检测试纸条，其特征在于其制备过程如下：
将100μM Aptamer1加入至10nm纳米金溶液中，制备纳米金适配体探针，10000rpm下离心、洗涤、重悬备用；
将步骤(1)制备的探针固定于结合垫，烘干备用；
将100μM Aptamer 2与DNA 1分别加入到0.125mg/mL链霉亲和素溶液中，制备Aptamer2、DNA1序列与链霉亲和素的复合物；
通过点晶喷膜仪将步骤(3)制备的复合物分别固定于硝酸纤维素膜的检测线与质控线，烘干备用；
将试纸条各部分组装，相邻两部分重叠2mm，切割成4mm宽度，放于密闭环境下保存备用。
4.根据权利要求1所述，其特征在于检测结果为：
阳性：硝酸纤维素膜上出现两条条带，且可通过T线颜色深浅反映出样品中凝血酶含量；
阴性：硝酸纤维素膜上只有一条条带，出现在靠近吸水垫一端。
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