CN107505463B - 与吊白块特异结合的核酸适配体Sf-B09及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与吊白块特异结合的核酸适配体Sf‑B09及其应用，所述核酸适配体是单链DNA，由82个核苷酸组成，其SEQ ID NO：2所示；其二级结构含有突出的环和茎，且存在G‑四链体结构，其中Sf‑B09吉布斯自由能DG=‑11.42；该核酸适配体通过酶联寡核苷酸吸附试验验证都能特异性检测到吊白块；具有简单、快速、灵敏等特点，10‑15分钟内即可出结果，无需使用抗体和仪器设备、操作简单、特异性好、结果容易判读、制作方便。

Description

与吊白块特异结合的核酸适配体Sf-B09及其应用
技术领域
本发明涉及一种与吊白块特异结合的核酸适配体Sf-B09及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
吊白块，系以福尔马林结合亚硫酸氢钠再还原制得，化学名甲醛合次硫酸氢钠(Sodium FormSf-B09ldehyde SulfoxylSf-B09te，SFS)，分子式NSf-B09hSO2·Ch2O·2h2O，分子量154.12，结晶性粉粒有机化合物。它易溶于水，在常温下较为稳定，其水溶液在60℃以上开始分解出有害物质，120℃高温下可分解产生甲醛、二氧化硫和硫化氢等有毒气体，有强还原性，有漂白作用。
甲醛次硫酸氢钠对人体有害，属于非食品用原料。其毒性与其中的甲醛和二氧化硫有关，食用掺有甲醛次硫酸氢钠的食品，会损伤人的肝脏、肺脏、肾脏，严重的导致癌症和畸形病变。甲醛是细胞原浆毒，能使蛋白质凝固，口服甲醛溶液(10-20)mL，可致人死亡。长期接触低浓度的甲醛蒸汽可出现头晕、头痛、乏力、嗜睡、食欲减退、视力下降等。中毒以呼吸系统和消化道损伤为主要特征；并有弱的麻醉作用。甲醛急性中毒表现为喷嚏、咳嗽、视物模糊、头晕、头痛、乏力、口腔黏膜糜烂、上腹痛、呕吐等症状，随病情加重，出现声音嘶哑、胸痛、呼吸困难等，严重者出现咽喉与肺部水肿、昏迷、休克。长期皮肤接触，可引起接触性皮炎。口服中毒者表现为胃肠道黏膜损伤、出血、穿孔，可出现脑水肿，代谢性酸中毒，昏迷及休克等症状。研究表明，甲醛易与细胞内亲核物质反应形成加合物，并引起DNSF-B09-蛋白质交联。造成DNSF-B09复制过程中某些重要基因丢失，导致DNSF-B09损伤。长期接触甲醛者鼻腔与鼻咽部发生肿瘤增多。国际癌症研究组织(ISF-B09RC)1995年将甲醛列为对人体(鼻咽部)可能的致癌物(Group2SF-B09)。甲醛次硫酸氢钠的毒性为，大鼠经口LD50(半数致死量)>2g/kg体重。人经口摄入纯甲醛次硫酸氢钠10g就会中毒致死，甲醛次硫酸氢钠也是一种致癌的物质，所以甲醛次硫酸氢钠早已被我国明令禁止在食品中使用，属非食品用原料。
由于甲醛次硫酸氢钠对食品有防腐及保色等作用，一些不法生产商仍然在食品生产、加工等环节中使用甲醛次硫酸氢钠，主要添加腐竹、豆皮、豆腐、面粉、米粉、银耳、牛筋、蜜枣、白糖、冰糖、饵丝干等。为保证广大人民群众的身体健康，打击不法生产者，食品中甲醛次硫酸氢钠的检测非常重要，建立一种准确可靠、灵敏快速、广泛适用的检测方法在食品安全工作中尤为重要。
核酸适配体是经过指数富集配体系统进化技术(SyStemSf-B09tic evolution ofligSf-B09ndS by exponentiSf-B09l enrichment，SELEX)筛选得到的能与金属离子、小分子、生物大分子，甚至整个细胞高专一性和亲和性结合的SSDNSF-B09或ＲNSF-B09分子。核酸适配体不仅具备抗体分子的识别特性，凡是涉及抗体的诊断领域，几乎都可以用核酸适配体来代替，而且还具备自己独特的优异性能，其具有靶分子范围广、分子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点。核酸适配体及其相关筛选技术(SELEX)，核酸适配体近年来在治疗新药、药物运输、癌细胞检测、生物成像、生物标志物的发现、毒品检测、抗病毒等生物医学领域中的应用。
发明人将本发明的吊白块特异性核酸适配体的核苷酸序列和基因数据库进行了比对搜索，未发现有任何相同序列信息。
普通的免疫检测法是将特意的标记抗体先固定于固相支持物，与待测物特异结合后，再与另一抗体结合，这样通过肉眼或特定的检测仪器，就可以定性检测待测物，从而实现特异性的免疫诊断。
常用的免疫层析法所用的特意识别检测的生物大分子都是抗体，通过抗原抗体特异识别反应，标记在抗原或者抗体上的免疫胶体颗粒使检测线和质控线显示一定颜色，从而实现特异性的免疫诊断。但是该方法检测不够快速和灵敏，而且用抗体检测还需要用到相应的仪器设备，操作不简便。
发明内容
本发明的目的是提供一种与吊白块特异性结合的核酸适配体Sf-B09，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；该核酸适配体均为单链DNA，由82个核苷酸组成，拓扑学结构为直链状；预测的二级结构具有突出的环和茎，且存在G-四链体结构，吉布斯自由能： Sf-B09 DG=-11.42。
本发明另一目的是将与吊白块特异性结合的核酸适配体Sf-B09应用在制备识别吊白块的试剂或在制备检测吊白块的试剂盒中，使用时，其与核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的核酸适配体Sf-A09或与核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的核酸适配体Sf-E07搭配使用。
即提供一种基于核酸适配体的层析法检测试剂盒及其制备方法和检测方法；通过提供一种能通过核酸适配体特异识别检测物，在常规简体金免疫层析试剂盒的基础上，制作胶体金免疫层析检测试剂盒，通过在检测线和控制线上显色，来实现检测，将与吊白块特异性结合的核酸适配体应用在识别吊白块或在制备检测吊白块的试剂盒中。
本发明通过如下方案实现发明目的：
1、吊白块特异性核酸适配体的筛选、克隆、分离和测序
采用SELEX技术筛选出能够与吊白块特异性结合的核酸适配体群体，设计引物进行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（ELONA）进行验证，得到适配体，它能够高亲和力高特异性的结合吊白块。配体接头引物序列为：Aptamer Fw:GACATATTCAGTCTGACAGC；反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC；Aptamer Rv:GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进行核苷酸序列测定，测序结果表明与吊白块特异性结合的核酸适配体由82个核苷酸组成，其序列（5’端至3’端）为：
。
2、核酸适配体单链DNA二级结构表征
使用MFOLD软件（http://mfold.rna.albany.edu/q=mfold/DNA-Folding-Form）对与吊白块特异性结合的核酸适配体单链DNA分子进行二级结构预测。结果表明，其二级结构具有突出的环和茎，且存在G-四链体结构，Sf-A09吉布斯自由能DG=-14.75；Sf-B09吉布斯自由能DG=-11.42；Sf-E07吉布斯自由能DG=-10.78显示该结构具有较高的稳定性。
3、核酸适配体的特异性和对吊白块的敏感性
根据核酸适配体的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立了一种新型的酶联寡核苷酸检测方法，通过此方法对核酸适配体的特异性和其对吊白块的敏感性进行检测；结果显示，三种核酸适配体具有很高的特异性。Sf-A09能检测到吊白块的最低浓度别为10ng/mL；Sf-B09能检测到吊白块的最低浓度别为10ng/mL；Sf-E07能检测到吊白块的最低浓度别为10ng/mL。
本发明的意义在于:
利用SELEX技术筛选出的配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07能够高亲和力高特异性的识别并结合吊白块；核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07的鉴别对于食品中残留的吊白块的检测，进而降低吊白块对人体的侵害具有重要意义。
进步一的，本发明提供了一种基于核酸适配体的层析法检测试剂盒，其包括检测试纸；所述检测试纸包括底板，粘合在底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上靠近结合垫的一侧设有检测线，硝酸纤维素膜靠近吸水垫的一侧设有质控线；结合垫上涂有胶体金标记的核酸适配体Sf-B09；检测线上涂有核酸适配体A与链霉亲和素的复合物；质控线上涂有链霉亲和素溶液；核酸适配体A为核酸适配体Sf-A09或核酸适配体Sf-E07。
其中核酸适配体SF-B09的核苷酸序列5’端被生物素标记，3’端被巯基标记；核酸适配体A的核苷酸序列5’端被生物素标记。
所述底板为PVC板；样品垫的材料为玻璃纤维；结合垫的材料为玻璃纤维；吸水垫为吸水纸；检测试纸由硬质塑料卡包装。
本发明还提供一种制备上述试剂盒的方法，方法中百分比为质量百分比，包括如下步骤：
（1）用直径20-40nm的胶体金标记核酸适配体Sf-B09；
（2）将样品垫放入含有3%牛血清蛋白(BSA)、0.05%吐温-20 0.01M 磷酸缓冲盐溶液(PBS) (pH 7.4)的样品垫处理液中浸泡1小时以上，37℃烘干备用；
（3）将结合垫放入含有5%牛血清蛋白、1%聚乙二醇-20000、0.05%吐温-20、5%蔗糖的0.01M pH 7.4磷酸缓冲盐溶液中浸泡1 小时以上，37℃烘干备用；
（4）将步骤（1）被胶体金标记的核酸适配体SF-B09重悬于含有5%牛血清蛋白(BSA)、1%聚乙二醇-20000(PEG20000)、0.05%吐温-20、5%蔗糖的0.01M 磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH7.4)中，并喷于结合垫上，37℃烘干备用；
（5）在硝酸纤维素膜上检测线位置以0.5-1.5μL/cm的流量喷点核酸适配体A与链霉亲和素的复合物，在质控线位置以0.5-1.5μL/cm的流量喷点链霉亲和素溶液，烘干备用；
（6）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成检测4毫米试纸条，组装于硬质塑料卡包装。
其中，所述步骤（1）是用直径20-40nm的胶体金标记核酸适配体SF-B09；步骤（5）中喷点于检测线位置的核酸适配体A与链霉亲和素的复合物是将浓度为25-35μM的核酸适配体A溶液与浓度为0.5-1.5mg/mL的链霉亲和素溶液按体积比5-3:1混合制备而成；喷点于质控线位置的链霉亲和素溶液是将链霉亲和素溶于0.01M pH7.4磷酸缓冲盐溶液中制得，浓度为0.5-1.5mg/mL。
本发明还提供了一种基于核酸适配体的检测方法：
所述方法采用识别同一检测物的两个核酸适配体，通过核酸适配体SF-B09和核酸适配体A与待测物特异性结合后在检测线和质控线显色来实现无抗体的层析检测。若质控线不显色，则测试结果均无效；若质控线显色，而检测线不显色，则表示检测样品中不含待测物；若质控线和检测线均显色，则表示检测样品中含有待测物。
下面结合试剂盒的详细制作过程及原理对本发明作进一步说明：
本发明试剂盒具体制作过程如下：
(1)用直径为20-40nm的金纳米粒子标记核酸适配体Sf-B09，按每毫升胶体金溶液标记0.4nmol核酸适配体Sf-B09进行标记，避光反应16 小时以上，加入1M NaCl，使NaCl终浓度为0.1M，避光反应24 小时；4℃，12000g离心20 分钟，去上清，沉淀复溶于含有5%牛血清蛋白(BSA)、1%聚乙二醇-20000(PEG20000)、0.05%吐温-20、5%蔗糖的0.01M 磷酸缓冲盐溶液(PBS) (pH7.4)中；
(2)选用玻璃纤维作为样品垫材料，将其放入含有3%牛血清蛋白(BSA)、0.05%吐温-20 的0.01M 磷酸缓冲盐溶液(PBS) (pH 7.4)中浸泡1小时以上，37℃烘干1 小时以上，4℃保存备用；
(3)选用玻璃纤维作为结合垫材料，将结合垫放入含有5%牛血清蛋白、1%聚乙二醇-20000、0.05%吐温-20、5%蔗糖的0.01M pH 7.4磷酸缓冲盐溶液中浸泡1 小时以上，37℃烘干备用；
(4)将步骤（1）制备的胶体金标记的核酸适配体SF-B09喷于步骤（3）处理过的结合垫，37℃烘干，4℃保存备用；
(5)硝酸纤维素膜上的点样：将合成的用生物素标记的核酸适配体A稀释成浓度25-35μM的溶液，与浓度为0.5-1.5mg/mL的链霉亲和素溶液按5-3:1的体积比混合，室温反应1 小时；用浓度为0.5-1.5mg/mL的链霉亲和素溶液包被质控线；用划膜仪将核酸适配体A与链霉亲和素复合物和链霉亲和素稀释液分别以0.5-1.5μL/cm的流量画在硝酸纤维素膜上检测线和质控线的位置，两线相隔3 毫米，然后将此硝酸纤维素膜干燥半小时备用；
(6)将处理好的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸分别按顺序粘贴在PVC底板上，再用切条机切成4 毫米宽度的检测条装入塑料卡中，组成层析法检测试剂盒。
使用时，将待测样本加入到样品垫上，待测样本在毛细作用下沿着样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜向吸水纸端方向层析，在层析过程中，待测样本中的检测物先与玻璃纤维结合垫上的金纳米粒子-核酸适配体Sf-B09复合物特异性结合并使之复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，与硝酸纤维素膜检测线区域包被的核酸适配体A发生免疫反应，在一定浓度的检测物的作用下，显示出相应的颜色线条；多余的金纳米粒子-核酸适配体Sf-B09复合物继续向前，核酸适配体Sf-B09上标记的生物素到达质控区域时，与包被的链霉亲和素发生结合，金纳米粒子发生富集，显现出金纳米粒子的颜色线条。如果样品中不含有检测物时，金纳米粒子-核酸适配体Sf-B09复合物与核酸适配体A不会在检测线区域作用，而继续向前层析通过生物素-链霉亲和素反应。因此检测线不会出现条带，而质控线出现条带。质控线用于判断试剂盒的质量情况：当样品中检测物浓度过高或者有高盐，会造成胶体金-核酸适配体Sf-B09全部富集在检测线，没有多余的金纳米粒子继续向前，质控线就不会有金纳米粒子富集，没有条带显示，说明检测的微环境超出了本检测试剂盒的使用范围，结果是无效的。当核酸适配体Sf-B09从胶体金表面脱离或者被降解，或其他原因导致试剂盒质量发生变化，都会导致检测线和质控线上都不会出现金纳米粒子，检测线和质控线均不会出现条带，标明检测结果无效。因此，在检测中，控制线出现条带才表明检测结果的可信。
本发明免疫层析法显示的质控线和检测线均为金纳米粒子的颜色，核酸适配体也能特异性识别检测物，两条能特异性识别同一检测物的分别包被在胶体金免疫层析中的玻璃纤维结合垫及硝酸纤维膜上的核酸适配体。与现有技术相比，本发明实现无抗体层析：标记的核酸适配体SF-B09与检测物结合后，在毛细管作用下，样品将沿着硝酸纤维素膜向前移动，当移动至固定有另一个也能特异识别检测物的硝酸纤维素膜上检测线（包被有核酸适配体A区域）时，样品垫中结合了核酸适配体SF-B09的检测物再与核酸适配体A发生特异性结合，形成胶体金、核酸适配体SF-B09、检测物、核酸适配体A的复合物，为可见胶体金的颜色，这样就是实现了特异性的免疫层析法检测。本发明制备试纸条时，无需使用抗体，检测时也不需要其他试剂，只需直接将待测样品稀释后，取0.08mL滴在样品垫上，10-15 分钟后即可出结果，具有简单、快速、灵敏等特点。
附图说明
图1为核酸适配体Sf-A09的二级结构示意图；
图2为核酸适配体Sf-B09的二级结构示意图；
图3为核酸适配体Sf-E07的二级结构示意图；
图4为本发明中CD圆二色谱法对K+浓度与核酸适配体Sf-A09的关系的分析结果；
图5为本发明中CD圆二色谱法对K+浓度与核酸适配体Sf-B09的关系的分析结果；
图6为本发明中CD圆二色谱法对K+浓度与核酸适配体Sf-E07的关系的分析结果；
图7为本发明中ELONA法对核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07的特异性分析，图中：空白对照1:吊白块+脱脂奶；空白对照2：吊白块+不含配体的生物素；阴性对照1-6为：非靶标蛋白（甲胺磷，苏丹红，三聚氰胺，草甘膦，乙酰甲胺磷，呋喃丹）+标记有生物素的配体；阳性组：吊白块100μg/mL +标记有生物素的配体；
图8为本发明中ELONA法对核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07的最佳浓度的分析，图中：空白对照1：吊白块+脱脂奶；空白对照2：吊白块+不含配体的生物素；阳性组1：吊白块+标记有生物素的配体Sf-A09；阳性组2：吊白块+标记有生物素的配体Sf-B09；阳性组3：吊白块+标记有生物素的配体Sf-E07；
图9为本发明中ELONA法对吊白块灵敏度的分析，图中：空白对照1：吊白块+脱脂奶；空白对照2：吊白块+不含配体的生物素；阳性组1：吊白块+标记有生物素的配体Sf-A09；阳性组2：吊白块+标记有生物素的配体Sf-B09；阳性组3：吊白块+标记有生物素的配体Sf-E07；
图10为本发明试剂盒中检测试纸结构示意图；
图11为本发明免疫层析法检测结果判定图；其中，T表示检测线，C表示质控线；
图12为Sf-B09与Sf-E07搭配使用的结果图；
图13为不同浓度吊白块溶液检测结果(从左往右浓度依次降低)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来进一步说明本发明的实质性内容，实施例仅为了更好理解本发明但不局限与本发明范围，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：吊白块核酸适配体的筛选
一、配基（吊白块）与基质（琼脂糖凝胶6B）的偶联
1、在烧结玻璃滤器中（多空度G3）用3mL蒸馏水中悬浮1g的冻干粉末琼脂糖凝胶6B；
2、立即在烧结玻璃滤器中用200 mL的蒸馏水洗涤基质1 小时；
3、用6 mL的偶联缓冲溶液（0.05 M，pH9.6的碳酸盐缓冲液）溶解6 g的配基，使其最终浓度为1 mg/mL，
4、将步骤2基质与步骤3中的浓度为1 mg/mL溶解好配基的缓冲溶液按体积比1:2比例混合，在35℃-40℃的水浴条件下，处理16 小时，并且37℃摇床过夜；
5、在40℃-50℃的条件下，用1M的氨基乙醇封闭过剩的基团，至少4 小时或者过夜；
6、用偶联缓冲液洗过剩的配基，4000 rpm离心2 分钟，吸取上清；用超纯水（每次7-8 mL）清洗3次；紧接着用含有0.1 M NaHCO3、0.5 M NaCl的pH8.0的溶液清洗3-4次；然后用含有0.1 M NaCl、0.1 M醋酸盐的pH 4.0的溶液清洗3-4次；最后用质量百分比浓度为20%乙醇6 mL保存，放置于4℃冰箱，封口膜封口，竖直放置。
二、核酸适配体文库（SSDNA）的PCR
采用TaKaRa公司合成的SSDNA适配体文库；
1、94℃预热PCR仪；
2、将3 μLSSDNA、30.6 μL去离子水、5 μL10×Buffer、3 μLMgCl2、4 μL dNTP混合物（各2.5μM）、2μL正向扩增引物、2μL反向扩增引物以及0.4 μLTaq酶离心管进行反应；正向扩增引物序列为5’–GACATATTCAGTCTGACAGC-3’，反向扩增引物序列为5’-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3’。
3、在PCR仪中按以下程序扩增
(1) 预变性
94℃ 5 分钟；
(2) 40个循环
94℃ 45 秒
58℃ 45 秒
72℃ 30 秒；
(3) 后扩增
72℃ 7 分钟。
三、配体库的纯化、上样及洗脱
1、配体库的纯化
(1)核酸适配体文库PCR产物直接与胶回收试剂盒里的溶液按体积比1:1比例混合，进行DNA片段回收；
(2)DNA片段回收后，95℃水浴10分钟，冰浴10分钟；经过此变性处理，使双链DNA变成单链DNA。
2、亲和层析
(1)用偶联缓冲液洗脱偶联过的基质：吸取上层溶液，加偶联缓冲液至6 mL，混匀，离心，弃去上清液，此步骤重复3次；
(2)将步骤1中的单链DNA加入到偶联过的基质中，于37℃温育并40rpm轻柔转动2小时；
(3)加入前述样品到层析柱中，用2-3柱体积的超纯水冲洗柱子；
(4)然后用3-4柱体积的洗脱缓冲液（0.1 M NaCl，0.1 M醋酸盐，pH4.0）进行线性梯度洗脱，收集洗脱组分；
(5)洗脱组分与胶溶液等体积混合，回收后用TE溶液溶解，得到Selex溶液。
四、PCR优化和大量扩增核酸适配体
以上述Selex溶液作为模板，按如下步骤操作：
1、94℃预热PCR仪；
2、将5 μL模板、28.6 μL去离子水、5 μL10×Buffer、3 μLMgCl2、4 μL dNTP混合物（各2.5μM）、2μL正向扩增引物、2μL反向扩增引物、0.4 μLTaq酶，于PCR离心管中进行反应。正向扩增引物序列为5’–GACATATTCAGTCTGACAGC-3’，反向扩增引物序列为5’-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3’。
3、在PCR仪中按以下程序扩增：
(1) 预变性
94℃ 5 分钟；
(2) 37个循环：
94℃ 45 秒
58℃ 45 秒
72℃ 30 秒；
(3) 后扩增
72℃ 7 分钟；
4、循环结束后，将PCR 产物用TIANGEN 公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
(1) 将PCR产物与等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5 分钟，使DNA充分与硅胶膜结合，12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
(2) 加入700 µL的漂洗液（含乙醇）于离心纯化柱中，12000 rpm 离心1 分钟，倒掉收集管中的废液；
(3) 重复步骤（2）；
(4) 12000 rpm 离心3 分钟；
(5) 将离心纯化柱置于新的离心管中；
(6) 加入30µL超纯水，在室温下静置5 分钟；
(7) 12000 rpm离心1 分钟，管底溶液即为纯化过的核酸适配体的PCR产物。
实施例2：核酸适配体的克隆，分离和测序以及单链DNA二级结构的预测
一、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
1、挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mL液体LB培养基中，37℃振荡2 分钟；当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；
2、将细菌培养物转移到一个50mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10分钟，使培养物冷却；
3、于4℃下4000 rpm离心10分钟，弃去培养液，并将管倒置l 分钟以使残留的培养液流尽；
4、各加150 μL冰预冷的0.1 mM CaCl2溶液，合并两管，冰浴10 分钟；
5、于4℃下4000 rpm离心10分钟，弃去上清液，并将管倒置l 分钟以使残留的液体流尽；
6、先加入800 μL冰预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细胞，再加入25 μL预冷的75%的甘油，之后于-80℃贮存备用。
二、连接及连接产物的转化
1、在微量离心管中加入0.5 μL Takara pMD19-T Simple载体、4.5 μL核酸适配体PCR产物及5 μL的连接酶缓冲混合物；
2、16℃反应3 分钟；
3、全量（10 μL）加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30 分钟；
4、42℃加热90 秒后，再在冰中放置1 分钟；
5、加入37℃温浴过的LB培养基890μL，37℃缓慢振荡培养60 分钟；
6、取200μL涂布于含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16 分钟以形成单菌落。
三、核酸适配体的克隆筛选，分离和测序以及单链DNA二级结构预测
挑取上述白色的单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4 分钟，进行PCR扩增；扩增引物及扩增条件同前述核酸适配体的扩增条件。将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后，以美国Applied BioSyStemS3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷酸序列的测定；结构表明，与吊白块特异性结合的核酸适配体其序列自5’端至3’端为:
与吊白块特异性结合的核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07的序列长度：82个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：SS DNA。
通过MFOLD软件设置温度为26℃、Na+浓度为150 mM，Mg2+浓度为1 mM （http://mfold.rna.albany.edu/q=mfold/DNA-Folding-Form）和QGRS映射（http://bioinformaticS.ramapo.edu/QGRS/analyze.php）对与吊白块特异性结合的核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07单链DNA分子进行二级结构预测。结果表明，适配体含有突出的环和茎，Sf-A09吉布斯自由能DG=-14.75；Sf-B09吉布斯自由能DG=-11.42；Sf-E07吉布斯自由能DG=-10.78，三种结构具有较高的稳定性（见图1-3）。
实施例3：圆二色谱法对K+浓度与核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07的关系的探究
1、将适配体用灭菌水稀释至 20 μM后，于 94 °C变性 0.5 分钟 以 0.5 °C/分钟的速度冷却至 25 °C。
2、用含有不同浓度 (0, 10, 20, 40,60,80, 100mM) KCl溶液将核酸适配体SF-B0909、B09、E07稀释至2.5μM。
3、于25℃，220–340 nm波长处用圆二色谱仪进行检测（结果见图4-6）。
实施例4：核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07的特异性和对吊白块的敏感性
一、核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07特异性检测
1、ELONA方法
在传统的ELISA方法的基础上加以改进，用筛选出来的适配体来代替抗体，采用生物素-亲和素放大系统用以检测待测样品。
(1)适配体-生物素的包被
筛选出来的特异性识别吊白块的核酸适配体送到TaKaRa公司合成，得到用生物素标记的适配体。使用时先短暂离心，使生物素标记的适配体聚集在试管底部。根据说明书，用灭菌水或TE buffer(pH7.5-8.0)充分溶解成存储溶液，一般浓度为10-4或10-5M，置于-20℃保存。为避免反复冻融，可分装成小份。将生物素标记的适配体用1×PBS稀释到工作浓度，每个孔加100 μL，用不干胶或封口膜密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 小时，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 分钟，每次都要在干净的吸水纸上拍干。
(2)加吊白块孵育
按核酸适配体结合缓冲液与吊白块体积比1:1的比例加入到包被有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100μL，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 小时，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 分钟，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干（对照组（阴性组）则将吊白块换成甲胺磷，苏丹红，三聚氰胺，草甘膦，乙酰甲胺磷，呋喃丹等非靶标蛋白，方法同上）。
(3)加酶结合物孵育
往每孔中加入100 μL辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1 小时，洗涤3次，每次2 分钟。
(4)显色
每孔加入TMB100 μL，于37℃避光显色l0 分钟，拍照保存。
(5)终止
加25μL终止液（2 M硫酸），并在反应终止10 分钟以内用酶标仪测各孔450 nm处吸光度值OD450。
结果显示，适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07能够与吊白块特异性的结合（结果见图7）。
二、核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07最佳使用浓度的检测
1、将生物素标记的适配体用1×PBS稀释到不同的工作浓度，每个孔加100 μL，用不干胶或封口膜密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 小时，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 分钟，每次都要在干净的吸水纸上拍干；
2、按适配体结合缓冲液与100μg/mL的吊白块溶液体积比1:1比例加入到包被有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100μL，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 小时，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 分钟，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干；
3、往每孔中加入100 μL辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1 小时，洗涤3次，每次2 分钟；
4、每孔加入TMB100 μL，于37℃避光显色l0 分钟；
5、加25μL终止液（2 M硫酸），并在反应终止10 分钟以内用酶标仪测各孔450 nm处吸光度值OD450；
6、结果表明，适配体Sf-A09、 Sf-B09、Sf-E07的最佳使用浓度均为100 nM（图8）。
三、核酸适配体Sf-A09、Sf-B09、Sf-E07对吊白块的灵敏度的检测
1、将生物素标记的适配体用1×PBS稀释到工作浓度，每个孔加100 μL，用不干胶或封口膜密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 小时，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 分钟，每次都要在干净的吸水纸上拍干；
2、按适配体结合缓冲液与不同浓度的吊白块溶液体积比1:1比例加入到包被有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100μL，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 小时，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 分钟，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干；
3、往每孔中加入100 μL辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1 小时，洗涤3次，每次2 分钟；
4、每孔加入TMB100 μL，于37℃避光显色l0 分钟；
5、加25μL终止液（2 M硫酸），并在反应终止10 分钟以内用酶标仪测各孔450 nm处吸光度值OD450；
6、结果表明，适配体Sf-A09能检测到吊白块的最低浓度为10ng/mL；适配体Sf-B09能检测到吊白块的最低浓度为10ng/mL；适配体E07能检测到吊白块的最低浓度为10ng/mL（结果见图9）。
实施例5：如图10所示，本基于核酸适配体的层析法检测试剂盒包括检测试纸，所述检测试纸包括底板1，粘在底板1上且依次搭接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫7；所述硝酸纤维素膜4上靠近结合垫3的一侧设有检测线5，硝酸纤维素膜4上靠近吸水垫7的一侧设有质控线6；结合垫3上涂有胶体金标记的核酸适配体Sf-B09；检测线5上涂有核酸适配体A与链霉亲和素的复合物；质控线6上涂有链霉亲和素溶液，其中核酸适配体Sf-B09的DNA序列5’端被生物素标记，3’端被巯基标记；所述核酸适配体A的DNA序列5’端被生物素标记。
所述底板为PVC板；所述样品垫的材料为玻璃纤维；所述结合垫的材料为玻璃纤维；所述吸水垫为吸水纸；所述检测试纸由硬质塑料卡包装。
实施例6：制备实施例5所述试剂盒的方法
（1）核酸适配体SF-B09标记胶体金颗粒：用直径为40nm的金纳米粒子标记核酸适配体Sf-B09，按每毫升胶体金溶液标记0.4nmol适配体进行标记，避光反应16 小时以上，加入1M NaCl，使NaCl终浓度为0.1M，避光反应24 小时；4℃，12000g离心20 分钟，去上清，沉淀复溶于含含有5%牛血清蛋白(BSA)、1%聚乙二醇-20000(PEG20000)、0.05%吐温-20、5%蔗糖的0.01M 磷酸缓冲盐溶液(PBS) (pH 7.4)中；
（2）样品垫的处理：选用玻璃纤维作为样品垫材料，将其放入含有3%牛血清蛋白(BSA)、0.05%吐温-20 0.01M 磷酸缓冲盐溶液(PBS) (pH 7.4)中浸泡1 小时以上，37℃烘干2 小时，4℃保存备用；
（3）结合垫的处理：选用玻璃纤维作为结合垫材料，将其放入含有步骤（1）中的重悬液浸泡1 小时以上，37℃烘干2小时，4℃保存备用；
（4）结合垫的制备：将步骤（1）制备的胶体金标记的核酸适配体Sf-B09喷点于步骤（3）处理过的结合垫，37℃烘干2小时，4℃保存备用；
（5）硝酸纤维素膜上的点样：将合成的用生物素标记的核酸适配体A（核酸适配体Sf-A09或核酸适配体Sf-E07）稀释成30μM，与浓度为1mg/mL的链霉亲和素按5:1的体积比混合，室温反应1 小时；用浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液包被质控线。用划膜仪将核酸适配体A链霉亲和素复合物和链霉亲和素稀释液分别以1μL/cm的流量画在硝酸纤维素膜上检测线和质控线的位置，两线相隔3 毫米，然后将此硝酸纤维素膜干燥半小时备用；
（6）将处理好的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸分别按顺序粘贴在PVC底板上，再用切条机切成4毫米宽度的检测条装入塑料卡中，组成层析法检测试剂盒；
（7）检测：吸取待测样本加水稀释后取0.08mL滴入加样孔。若质控线不显色，测试结果均无效；若检测线显红色而质控线不显色也视为无效；若质控线和检测线均出现红色，表示在检测样品中含有高于最低检测浓度的吊白块（图11）；
其中Sf-B09与Sf-E07搭配效果：吸取0.08mL待测样本溶液（图中从左至右第1、2条检测条均为10μg/mL 的吊白块溶液，第3条为超纯水）滴在样品垫上，反应时间12 分钟后观察，结果表明该组合能检出吊白块（图12）。
Sf-B09与Sf-A07搭配使用的最低检出量：分别配制浓度为10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.8μg/mL的吊白块溶液，各浓度吸取0.08mL滴加到样品垫上，进行10次平行实验，反应时间15分钟后观察，结果表明能检出高于最低检测浓度(1μg/mL)的吊白块（图13）。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 与吊白块特异性结合的核酸适配体Sf-B09及其应用
<160> 3
<170> PatentIn verSion 3.5
<210> 1
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gacatattca gtctgacagc ggaagcgggt cagtccaact cacggtctcg catgcacggg 60
agatggacga atatcgtcta gc 82
<210> 2
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gctagacgat attcgtccat ctcccgtgca tgcgagaccg tgagttggac tgacccgctt 60
ccgctgtcag actgaatatg tc 82
<210> 3
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gctagacgat attcgtccat ctcccgtgcc tccgagaccg tgagttggac tgacccgctt 60
ccgctgtcag actgaatatg tc 82

Claims (7)

1.一种与吊白块特异性结合的核酸适配体Sf-B09，其特征在于：核酸适配体Sf-B09的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的与吊白块特异性结合的核酸适配体Sf-B09，其特征在于：二级结构均具有突出的环和茎，且存在G-四链体结构，吉布斯自由能分别为DG=-11.42。
3.权利要求1所述的与吊白块特异性结合的核酸适配体Sf-B09在制备识别吊白块的试剂或在制备检测吊白块的试剂盒中的应用，其特征在于：其与核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的核酸适配体Sf-A09或与核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的核酸适配体Sf-E07搭配使用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述试剂盒为基于核酸适配体的层析法检测试剂盒，其包括检测试纸，所述检测试纸包括底板（1），粘在底板（1）上且依次搭接的样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）、吸水垫（7）；所述硝酸纤维素膜（4）上靠近结合垫（3）的一侧设有检测线（5），硝酸纤维素膜（4）上靠近吸水垫（7）的一侧设有质控线（6）；其特征在于：结合垫（3）上涂有胶体金标记的核酸适配体SF-B09；检测线（5）上涂有核酸适配体A与链霉亲和素的复合物；质控线（6）上涂有链霉亲和素溶液，其中核酸适配体A为核酸适配体Sf-A09或核酸适配体Sf-E07。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：核酸适配体SF-B09的核苷酸序列5’端被生物素标记，3’端被巯基标记；核酸适配体A的核苷酸序列5’端被生物素标记。
6.制备权利要求4或5中所述试剂盒的方法，包括如下步骤：
（1）用胶体金标记核酸适配体SF-B09；
（2）将样品垫放入含有3%牛血清蛋白、0.05%吐温-20的0.01M pH 7.4磷酸缓冲液溶液中浸泡1 小时以上，37℃烘干备用；
（3）将结合垫放入含有5%牛血清蛋白、1%聚乙二醇-20000、0.05%吐温-20、5%蔗糖的0.01M pH 7.4磷酸缓冲液溶液中浸泡1 小时以上，37℃烘干备用；
（4）将步骤（1）被胶体金标记的核酸适配体SF-B09悬浮于含有5%牛血清蛋白、1%聚乙二醇-20000、0.05%吐温-20、5%蔗糖的0.01M pH 7.4磷酸缓冲液溶液中，并喷于步骤（3）活化过的结合垫上，37℃烘干备用；
（5）在硝酸纤维素膜上检测线位置以0.5-1.5μL/cm的流量喷点核酸适配体A与链霉亲和素的复合物，在质控线位置以0.5-1.5μL/cm的流量喷点链霉亲和素溶液，烘干备用；
（6）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成检测试纸条，组装于硬质塑料卡包装。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）是用直径20-40nm的胶体金标记核酸适配体Sf-B09；步骤（5）中喷点于检测线位置的核酸适配体A与链霉亲和素的复合物是将浓度为25-35μM的核酸适配体B溶液与浓度为0.5-1.5mg/mL的链霉亲和素溶液按体积比5-3:1混合制备而成；喷点于质控线位置的链霉亲和素溶液是将链霉亲和素溶于0.01MpH7.4磷酸缓冲液溶液中制得，浓度为0.5-1.5mg/mL。
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