CN101957369A

CN101957369A - 用于免疫测定的增强标记缀合物

Info

Publication number: CN101957369A
Application number: CN2010102500776A
Authority: CN
Inventors: I·门德尔-哈特威格; G·伦德斯特伦
Original assignee: Amic AB
Current assignee: Amic AB
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2011-01-26
Also published as: EP2270506A2; EP2270506A3; CA2708640A1; BRPI1002359A2; US20110003313A1; RU2010127055A

Abstract

用于免疫测定的增强标记缀合物。一种用作免疫测定中检测试剂的缀合物，其基于亲水单分散性大分子，即，具有基本一致的大小和形状的大分子，所述大分子形成实际可用和可操作的载体，该载体上连有至少一个连接体和至少一个标记物。

Description

用于免疫测定的增强标记缀合物

技术领域

本发明涉及免疫测定领域，特别是由至少一个载体和至少一个连接体组成的，用于诊断测定的被标记的缀合物。

背景技术

许多测定使用了被标记的试剂，也被称为检测缀合物，提供的每种标记使得可以定性或定量的测定每种特定试剂的存在。标记的重要原理是基于颜色、发光、如化学发光和荧光、放射性、以及磁性。通常优选荧光标记，因为此标记可以并且易于快速测光读数。放射性标记有可以给出定性和定量读数的优势，但最近和当今的趋势通常偏向非放射性标记。

有三个重要因素决定使用检测缀合物的测定的灵敏度。这些因素是连接到试剂，如抗体上的标记物的数量；检测缀合物的亲和力，如每个缀合物的抗体数量；以及检测缀合物在结合点的浓度，即可能发生的连接事件的数量。已经使用掺入或标记了大量标记物的聚合颗粒来增强灵敏度。

已知的增加标记的方法是将更多标记物连接到颗粒上，并将连接体，如抗体连接到这些被标记的颗粒上。

合成的聚合物颗粒，如聚苯乙烯颗粒，有不同的大小可供使用。现在使用的被掺入聚苯乙烯颗粒的荧光基团或发色基团直径最通常是大于100nm。

例如能通过使用适合的、展示出可以标记的氨基的蛋白包被颗粒的方法来改进向颗粒连接标记物。给出以下的例子：甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白、血青蛋白、肌浆球蛋白、脱铁铁蛋白、过氧化氢酶、一系列有不同赖氨酸/氨基酸比率的聚赖氨酸共聚物、α-2-巨球蛋白、亮氨酸氨肽酶、重酶解肌球蛋白和组蛋白。

这种方法在许多情况下是成功的，但也引起了不精确性的问题。后者的另一个问题是由于测定中可以加入的颗粒数量有限，结合点处的连接事件数量少。在实际应用中，在连接到被捕获在固相上的抗原上时，一个颗粒标记被认为等于一个连接体，如抗体。进一步的，流动测定时的强剪应力也可能影响连接和形成的夹心结构的稳定性。

US 5,891,741涉及与右旋糖苷交联的，抗体-藻胆蛋白缀合物，缀合物中每个右旋糖苷分子包含多至12个藻蛋蛋白。公开的内容提及术语“单分散性”，但其仅是与藻胆蛋白家族中的一个成员，藻红蛋白有关。US 5,891,741中使用的载体是右旋糖苷，如前所述是多分散性的。

CA 1330061公开了一种包括与载体颗粒相连的抗生物素蛋白或链霉亲和素的检测缀合物，其中载体颗粒表面包含多于15个能用适合操作的标记物独立标记的氨基。载体颗粒可以与抗生物素蛋白或链霉亲和素相连形成检测缀合物。

US 20050026305A1涉及大小分布窄的多分散性氨基右旋糖苷聚合物分子，以及其作为流式细胞术的细胞标记试剂的用途。

出于实用性原因，当使用已有技术中的，如CA 1330061和US20050026305A1中举出的被标记的颗粒时，颗粒在溶液中的浓度一定会受到限制。

因此，已有技术中的一个问题是怎样提供一种在更高的浓度下可用的缀合物。

Qin等(Anal Chem.2001 Apr 1；73(7)：1521-9)公开了两种用作高灵敏度免疫测定通用检测试剂的，基于链霉亲和素的高荧光检测缀合物。直接缀合物是通过将链霉亲和素共价连接到被大量铕螯合物标记的聚(谷氨酸：赖氨酸)上制备而成；而间接缀合物的制备是首先将牛血清白蛋白(BSA)缀合到被大量铕螯合物标记的聚(谷氨酸：赖氨酸)上，随后进一步将链霉亲和素连接到BSA-聚(谷氨酸：赖氨酸)-铕螯合物缀合物上。直接缀合物和间接缀合物都被用于构建高灵敏度的时间分辨前列腺特异性抗原(PSA)荧光测定。使用直接缀合物的测定灵敏度是使用间接缀合物的测定的1.5倍。当使用45微升样品体积时，使用直接缀合物得到了0.001微克/L的检出限。然而由于聚合物的准确大小难以控制，因此，Qin等的缀合物并不适合实际使用。在实践中，聚(谷氨酸：赖氨酸)聚合物分子量分布在很大的范围内。

现有技术的另一个问题是使用多分散聚合物的效果。进一步的问题还有每个检测缀合物连接体数量少和连接亲和力低。

US 20060008206涉及一种波导板及其生产过程，和包括这样的波导板的微量滴定板。

WO 2008/0733222公开了间接侧向流动夹心测定，其中目标分析物被连接到包含缀合对的第一成员的分析物特异性试剂上，形成复合物，复合物联系并连接包括所述缀合对的另一成员的，一个有色的颗粒状标记物，形成第二复合物。通过固定的被分析物特异性捕获试剂捕获包含被分析物的第二复合物，结果形成了可以被检测到的，被标记的固定夹心复合物。

发明简述

本发明的目的是消除至少一部分现有技术的缺点并提供一种改良的缀合物。

本发明的一个目的是提供具有改良的标记度(DOL)而没有使用背景技术中的颗粒或多分散聚合物的缺点的，增强的检测缀合物。

另一个目的是提供每个检测缀合物上具有更多连接物的缀合物，并由此增强复合物的亲和力。

另一个目的是将改良的缀合物用于侧向流动测定并利用增加的连接在连接体上的标记物，增强的亲和力和在连接点提供高浓度的检测缀合物的可能性。

本发明不同实施方案的进一步目的及其优势将在背景技术的深入研究和本发明的描述中呈现。

本发明涉及一种直接标记的检测缀合物，如独立权利要求中限定的，其中连接体被连接到被标记的载体分子上。依据优选的实施方案，载体和连接体都被标记。

独立权利要求中限定了制备被标记的缀合物的方法，以及进行测定的方法，将其纳入本文作为参考。

在使用了本发明实施方案的实验中，显示出当在检测缀合物中使用多个连接体，如抗体时，标记度显著提高，信号改善和灵敏度提高。

载体分子可以包括亲水性大分子。优选的大分子包括β半乳糖苷酶、尿素酶、匙孔血蓝蛋白、和链霉亲和素复合物。其他可替代的载体包括天然的和合成的聚氨基酸、肽、蛋白、核酸、和碳水化合物，例如但不限于透明质酸。在一个实施方案中亲水单分散性大分子选自由天然单分散亲水性聚氨基酸、合成单分散亲水性聚氨基酸、单分散亲水性肽、单分散亲水性蛋白、单分散亲水性核酸和单分散亲水性碳水化合物组成的组。

本发明的一个优势是提供了在高浓度下可用的，易于处理、放置和干燥的缀合物，

另一个优势是消除了多分散缀合物的效果。

进一步的优势是显著增加每个检测缀合物连接体数量的可能性，其增加了复合物的结合亲和力。

当改良的检测缀合物用在侧向流动测定时，利用增加的连接在抗体上的标记物，增强的亲和力和在连接点提供高浓度的检测缀合物的可能性，得到了协同优势。

进一步的优势是可以针对载体以及简化制备调整结合化学反应。一个或更多个标记物可以在本体反应中被连接到载体分子上，制得被标记的载体。这样的被标记的载体是稳定的并可以保存。随后可以通过每种连接元件的个别化的反应中，将连接物连接到被标记的载体的各部分上。

附图简述

现在通过实施例，参考附图对本发明进行描述，其中

图1示意性地显示了一个侧向流动测定装置，即所谓的测定芯片1，具有样品区2、缀合物区3、反应区4、吸水区5，共同组成了从样品区2到吸水区5的流动途径。反应区4可选择地包括多个反应区(未显示)，在样品区2到吸水区5之间的流动途径中沿流动方向顺序平行排列或以点状形式排列。

图2示意性显示了本发明一种实施方案的被标记的缀合物，包括大分子10，其上连接了连接体，这里示意性的显示为抗体11。大分子携带了多个标记物12，并且可选择的，抗体11上也连接有使用虚线画出的标记物13。和

图3示意性显示了本发明另一种实施方案的被标记的缀合物，包括大分子20，其上连接了连接体，这里显示为抗体21。大分子携带了两种可区别的标记物22和23。

发明详述

在公开和详细描述本发明之前，应当理解本发明不局限于本文公开的特定化合物、结构、方法步骤、基质、和材料，这些化合物、结构、方法步骤、基质、和材料可以略有变化。还应当理解，由于本发明的范围仅由附带的权利要求及其等同形式限定，本文使用的术语的目的仅是用来描述特定的实施方案而不是试图做限制。

必须注意的是，在本发明详述和附带的权利要求中，单数形式a”、“an”、“the”包括了复数的对象除非上下文清楚的另有所指。

如果没有其他的定义，本文使用的术语和科技术语具有本发明技术领域的技术人员通常理解的含义。

在发明描述和权利要求中与数值联用的术语“约”表示本领域技术人员熟知并接受的准确度区间。所述的区间是±10％。

术语“亲水性的”的是指分子体与极性溶剂，特别是与水，或其他极性基团相互作用的能力。亲水性物质易溶于水。

术语“单分散性的”或“单分散的”是用来定义这里被称为“载体”的一些物质，这些物质具有一致的颗粒大小和形状，和一致的聚合物分子量。在本发明文中，一致的大小、形状和/或分子量表示在一个群体中，大小、形状和/或分子量实际相同。具有不一致的大小、形状和分子量分布的物质，如载体的样本被称为多分散性物质。从梯度中取出的一部分中总还要包含这一部分里的梯度。

单分散物质可以通过使用纳米技术中常用的基于模板的合成方法制造。单分散聚合物通常通过自然过程制造。

术语单分散性通常用于由阴离子聚合制备的聚合物链，阴离子聚合是一种能产生相同长度的链的方法。使用的起始链的催化剂是天然阴离子。该技术也被称为活性聚合。其被用于商业上生产嵌段共聚物。

术语“大分子”一般是指大的分子，经常指四种常用的生物大分子：核酸、蛋白、碳水化合物和脂，以及具有大分子量的非聚合物分子。大分子通过聚合过程合成，在聚合过程中单体组装成大的分子-大分子。

术语“连接体”用于定义能够特异性的连接感兴趣的组分的分子或部分，连接的目的在于检测样品中所述组分的存在，以及可选的，样品中所述组分的浓度。连接体的例子包括，但不限于，如下，抗体、抗体片段、半抗原、适体，以及包括DNA、PNA和LNA在内的核酸、蛋白受体、配体受体、凝集素和糖。

术语“载体”是指运载或组成其他组分，如连接体或标记物的基质或平台，但没有明显参加反应的颗粒或物质。

术语“缀合物”表示结合在一起的多种组分，如载体和标记物，以及可选择的，载体、标记物和连接体。

术语“标记物”表示使得能够检测和/或识别携带所述标记物的缀合物的物质、分子、颗粒或属性。

本发明的一个实施方案是用作结合测定中的检测试剂的缀合物，所述缀合物包括至少一个连接体、至少一个标记物和所述的至少一个连接体和至少一个标记物所连接到的载体，其中所述载体是单分散性大分子，如具有基本一致的大小和形状的大分子，并且多个所述的至少一个标记物连接到所述大分子上。

在上述的实施方案中，所述至少一个标记物还被连接到连接体上。所述大分子优选选自由天然的或合成的的氨基酸，包括聚氨基酸、核酸和碳水化合物组成的组。

所述的大分子优选亲水单分散性大分子，更优选分子量位于约50kDa到约10000kDa的区间的亲水单分散性大分子，再优选分子量位于约100kDa到1000kDa的区间。

在上述的实施方案中，所述标记物优选选自由发光化合物、放射性化合物和酶组成的组。所述连接体优选选自由天然的和合成的抗体，抗体片段、半抗原、适体，以及包括DNA、PNA和LNA在内的核酸、蛋白受体、配体受体、凝集素和糖组成的组。

本发明的另一个实施方案是用作结合测定中的检测试剂的缀合物，所述缀合物包括至少一个连接体、至少一个第一标记物以及第二标记物和载体，其中载体是大分子，多个所述第一和第二标记物连接到所述大分子上。

优选的，所述大分子选自由天然单分散性亲水聚氨基酸、合成单分散性亲水聚氨基酸、单分散性亲水肽、单分散性亲水蛋白、单分散性亲水核酸和单分散性亲水碳水化合物组成的组。

在上述缀合物中，所述单分散性亲水大分子分子量优选位于约50kDa到约10000kDa的区间，更优选位于约100kDa到约1000kDa的区间。

根据本发明进一步的实施方案，所述第一和第二标记是不同的，选自由发光化合物、放射性化合物、磁性化合物和酶组成的组的标记物。优选的，所述第一标记物是荧光标记物，而所述第二标记物是不同于所述第一标记物的荧光标记物。

根据具体的实施方案，所述第一和第二标记物能够在两个光学活性中心之间电荷转移。电荷转移荧光探针对溶剂的极性和流动性显示出光谱强度和波长位置的强烈反应。过去已经应用这些性质来追踪聚合物材料的聚合动力学和溶剂引起的效应(如，膨胀)。电荷转移荧光探针的一个重要优势在于其可以在特别低的浓度下被测量，由此限制了聚合物系统的干扰。电荷转移荧光探针的构建本领域技术人员熟知。非限制性的例子可见US 6818453，其公开一种适合制造电荷转移荧光探针的标记物、包括所述标记物的电荷转移荧光探针、包括所述标记物的诊断试剂盒、以及使用所述的电荷转移荧光探针检测材料的方法。

在上述缀合物中，所述连接体优选选自由天然的和合成的抗体，抗体片段、半抗原、适体，以及包括DNA、PNA和LNA在内的核酸、蛋白受体、配体受体、凝集素和糖组成的组。

本发明的另一个实施方案是标记连接体的方法，包括步骤：

-提供载体分子，优选亲水单分散性大分子；

-将多个标记物连接到所述载体上，形成多标记的载体分子；和

-向每个载体上连接至少一个连接体。

在上述方法中，标记载体分子优选在适于连接所述标记物到所述载体的第一条件下进行，而连接所述至少一个连接体则在区别于所述第一条件的，适于连接所述至少一个连接体到被标记的载体分子的第二条件下进行。“适于连接的条件”是指物理和化学条件，例如，但不限于，温度、pH、试剂浓度、缓冲液浓度、反应时间等。

最适条件不同的例子是，例如在标记物连接到单分散性大分子的氨基上的情况，所有缀合物连接条件相同，以及连接体连接到所述大分子的硫醇基上的情况，硫醇基连接步骤的条件可以基于连接体的特征进行调整。另外的例子是当单分散性大分子的三维结构受pH影响时，可以调整pH值以使不同的基团连接。

进一步的，被标记的载体分子在连接多个标记物到所述载体的步骤后能够被储存。

另一个实施方案是在无孔基质上的开放侧向流动性测定中进行免疫测定的方法，使用了包含至少一个连接体、至少一个标记物和所述的至少一个连接体和至少一个标记物所连接到的载体的缀合物，其中所述载体是单分散性大分子，如具有基本一致的大小和形状的亲水单分散性大分子，并且多个所述的至少一个标记物连接到所述大分子上。

上述进行免疫测定的方法进一步特征是将所述缀合物置于侧向流动性测定装置(1)的缀合物区(3)上。

使用单分散的大分子，如具有基本一致的以及优选具有明确大小和形状的大分子，在流动夹心免疫测定中特别有用，其中颗粒的物理行为是反应动力学、速度、灵敏度和测定准确性的限制因素。

亲水单分散性大分子分子量优选位于约50kDa到约10000kDa的区间，更优选位于约100kDa到1000kDa的区间。

直径100nm以上的一般颗粒通常表现不佳。同时，更小的分子有强烈的聚集趋势，因而在反应混合物中不再是单分散的。使用有不同大小和静电荷的多分散聚合物会导致测定发生变化并使得制造和控制变得困难。出乎意料的，使用本发明系统的起始实验产生了增强的信号和更高的灵敏度。

剪应力和检测缀合物低浓度以及其他与流动测试中的颗粒相关的现象的效果现在至少被部分减轻或者甚至完全消除。当基本呈球形、一致并且大小和形状明确时，大分子也是可变的，因此可适应侧向流动测定中的条件。

使用连接了至少一个抗体的被单独标记的载体，使得可以独立优化标记的化学过程。于是被标记的载体被连接上至少一个用于具有多种特异性的检测缀合物的抗体。

在本发明的一个实施方案中，检测中利用所述载体的内在能力，同时使用两种或更多种不同的载体。

依据本发明的一个实施方案，被标记的缀合物用于侧向流动测定，例如在图1所示的装置上进行的测定。这样的侧向流动测定装置，或所谓的测定芯片1，具有至少一个样品区2、至少一个缀合物区3、至少一个反应区4，反应区4可选择包括多个反应区，在样品区2到吸水区5的流动途径中沿流动方向顺序平行排列或以点状形式排列。流动途径包括开放或闭合的通道、沟槽、毛细管。流动途径包括临近突起的侧向流动途径，其具有满足保持毛细流通过所述途径的大小、形状和相互的间隔。在一个实施方案中，流动途径至少是部分开放的。在一个实施方案中，流动途径是完全开放的。

权利要求和说明书中与毛细流联合使用的术语“开放”表示系统是开放的，即系统没有被完全遮盖或盖住，或者如果有遮盖或部分遮盖，所述的遮盖不在与样品液体相接触的毛细管上，即遮盖不参与产生毛细管力。开放的侧向流动途径在相同申请人早先的申请中有详细描述，例如在下列纳入作为参考的公开的申请中：WO2003/103835、WO2005/089082、WO2005/118139、WO2006/137785、和WO2007/149042。

依据本发明实施方案的被标记的缀合物和方法也可以应用于其他测定形式和测定装置，例如在吸水材料上，如基于硝酸纤维素的材料上进行的测定。依据本发明实施方案的被标记的缀合物和方法也可以应用于在反应容器中，或至少部分与反应容器壁，如微量滴定板壁相接的悬液里进行的测定。

对比已知的包括向缀合物中加入更多数量的荧光基团的方法，本发明基于三种成分的联合效应：连接体、标记物和载体。使用真正的单分散性载体分子，载体的变化性可以被最小化。同时，本发明的单分散性载体使得缀合物中可以包含更多的标记物和更多的连接体。在传统的缀合物中，一个连接体通常连接5到10个标记物。在本发明的缀合物中，多个连接体与多个标记物被连接到载体上。这样形成了具有高标记度、以及由此而来的改量的信号、和高亲和力的缀合物。在背景技术中，改进信号经常是标记度、信号淬灭和亲和力间的折中。应用本发明时，使用被独立标记的载体，没有发现亲和力消极效应。

本发明的缀合物的一个例子是每个缀合物具有至少3个抗体(连接体)，和至少10个荧光基团(标记物)的单分散性蛋白载体。由于载体分子是单分散性的，缀合物实际上也显示出单分散性，连接体和标记物数量也较少变化。优选每个缀合物的连接体，例如但不限于抗体的数量从约3到约10个或更多。优选每个缀合物的标记物，例如但不限于荧光基团的数量从约10到约100个。

本发明的缀合物在连接体和被分析物结合时间短的流动性测定中特别有优势。进一步的，在流动性测定中，一致的颗粒大小对于可靠性和可重复性有重要意义。

本发明的其他特点和用途以及其相关的优势在阅读了描述和实施例后，对本领域技术人员来说是显而易见的。

应当理解，本发明不局限于本文中公开的特定实施方案。由于本发明的范围仅由附带的权利要求及其等同形式限定，提供下面的实施例仅是为了展示而不是要限制本发明的范围。

实施例

实施例1

按例如WO2003/103835、WO2005/089082、WO2005/118139、WO2006/137785和WO2007/149042中的描述，本实验在具有微柱阵列限定的开放侧向流动途径的无孔载体上进行。

由

(Zeon Corporation，Japan)制造的塑料基质芯片由

AB，Uppsala，Sweden制造。芯片和测定装置基本依照图1来设计。

芯片表面被覆盖了氧化右旋糖苷以通过结合西佛碱结合共价固定蛋白质。流动通道的反应区被放置(AD3200 Biodot，USA)60nl含1％海藻糖的50mMpH7.5磷酸缓冲液中的1mg/ml的抗-NT-proBNP(cl.13G12Hytest Ltd，Finland)。

芯片在20％的湿度下30℃干燥1小时。使用三种不同的检测缀合物以对比β半乳糖苷酶-抗体复合物的增强能力。复合物通过硫醇化学方法制成。抗-NT-proBNP mAb cl.15C4(Hytest，Finland)与双功能连接剂SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)，(Pierce，Thermo Fisher Scientific，USA)反应以生成易反应的二硫化物。活化的抗体被连接到β-D-半乳糖苷酶的一些天然的硫醇基团上，β-D-半乳糖苷酶由Phadia AB Sweden友情提供。酶上其余的硫醇基被连接到活化的染料Alexa Fluor 647 C2 Maleimide(Molecular Probe，Invitrogen，USA)上。复合物最后在

柱(GE Healthcare Life Science，Uppsala，Sweden)上，含2mM MgCl₂、0.15M NaCl、0.02％NaN₃的50mM pH7.5磷酸钠缓冲液中纯化。

制备两批对照缀合物(cl.15C4)。根据供应商的说明，使用Alexa

蛋白标记试剂盒(Invitrogen，USA)将检测缀合物荧光标记。三种检测缀合物(1.35μl 0.25mg/ml，在含20％海藻糖、2％BSA和0.01％15吐温20的50mM pH8.5的硼酸盐缓冲液中)被放置在(Biodot 3200)缀合物区(见图1，特征3)。芯片在20％相对湿度下30℃干燥1小时。

通过向芯片的样品区加入33μl两种不同NT-proBNP浓度的血浆样品在芯片内测试并运转三种检测缀合物。微柱阵列的毛细管作用推送样品穿过流动通道，溶解干燥的检测缀合物，将样品缀合物的混合物输送到反应区并最终进入吸水区。使用过量的没有缀合物的样品冲洗流动通道中剩余的试剂。通常的测定时间约为10分钟。信号强度使用原型线性发光荧光扫描仪(Amic AB，Uppsala，Sweden)记录。每个测定使用新的芯片，每个浓度重复两次。实验的结果显示在表1中。

表1.改良的检测缀合物的增强效果

表1显示了依照本发明实施方案的抗体与β半乳糖苷酶以荧光标记的复合物和直接标记的抗体的对比(对照1和2)。

如表1中所见，相比直接标记的抗体，使用β-Gal/Ab检测缀合物有约4到5的荧光信号增强系数。如果在使用β-Gal/Ab缀合物时，计算中使用更低的结合本底，灵敏度的增加甚至会更高。

实施例2

使用相同的由

(Zeon Corporation，Japan)制造的塑料基质芯片以及相同的包覆和处理步骤重复实施例1的方法。使用单分散性尿素酶代替β-D-半乳糖苷酶作为载体大分子。与β-D-半乳糖苷酶一样，尿素酶有能够与连接体，如抗体连接的硫醇基。

实施例3

使用相同的由

(Zeon Corporation，Japan)制造的塑料基质芯片以及相同的包覆和处理步骤重复实施例1的方法。与实施例1中一样，使用β-D-半乳糖苷酶作为亲水单分散性载体。

与实施例1不同的是，使用了两种独立的标记物，例如两种可以被分别独立检测出来而没有信号干扰的荧光基团。独立标记物另外的例子是使用不同的物理原理检测的标记物，例如使用荧光基团和放射性标记物、或荧光基团和磁性标记物、或磁性标记物和放射性标记物。

第一标记物被缀合到单分散性载体上，而第二标记物被缀合到连接体上。随后在适合形成检测缀合物的条件下，结合各自携带标记物单分散性载体和连接体形成缀合物。于是缀合物的形成可以被鉴定，而连接体和载体的比率可以通过计算第一标记物和第二标记物的信号的商值测定。

因而，使用两种独立的标记可以被用于质量控制以及成功形成检测缀合物的确认。

实施例4

顺序标记单分散性载体大分子并缀合连接体以形成检测缀合物，可以通过在适于标记物和载体分子的氨基间共价键形成的第一条件(pH、温度、时间)下标记载体分子，并在不同于第一条件的，适于连接体和载体分子上的硫醇基间形成共价键的第二条件(pH、温度、时间)下形成检测缀合物来研究。

pH对载体三维结构的影响以及作为其结果的，对标记度的影响，可以通过改变pH、加入标记物、清洗并测定信号来对单分散性大分子进行研究。

Claims

1.一种用作结合测定中的检测试剂的缀合物，所述缀合物包括至少一个连接体、至少一个标记物和所述的至少一个连接体和至少一个标记物所连接到的载体，其特征在于所述载体是亲水单分散性大分子，分子量位于约50kDa到约10000kDa的区间，并且多个所述的至少一个标记物被连接到所述的大分子上。

2.权利要求1的缀合物，其中所述连接体也携带了至少一个标记物。

3.权利要求1的缀合物，其中所述亲水单分散性大分子选自由天然单分散性亲水聚氨基酸、合成单分散性亲水聚氨基酸、单分散性亲水肽、单分散性亲水蛋白、单分散性亲水核酸和单分散性亲水碳水化合物组成的组。

4.权利要求1的缀合物，其中所述亲水单分散性大分子的分子量位于约100kDa到1000kDa的区间。

5.权利要求1的缀合物，其中所述标记物选自由发光化合物、放射性化合物、磁性化合物和酶组成的组。

6.权利要求1的缀合物，其中所述连接体选自由抗体，抗体片段、抗体、半抗原、适体、核酸、DNA、PNA、LNA、蛋白受体、配体受体、凝集素和糖组成的组。

7.一种用作免疫测定中的检测试剂的缀合物，所述缀合物包括至少一个连接体、至少一个第一标记物以及第二标记物和载体，其特征在于所述载体是亲水单分散性大分子，分子量位于约50kDa到约10000kDa的区间，并且多个所述第一和第二标记物连接到所述大分子上。

8.权利要求7的缀合物，其中所述亲水单分散性大分子选自由天然单分散性亲水聚氨基酸、合成单分散性亲水聚氨基酸、单分散性亲水肽、单分散性亲水蛋白、单分散性亲水核酸和单分散性亲水碳水化合物组成的组。

9.权利要求7的缀合物，其中所述亲水单分散性大分子分子量位于约100kDa到约1000kDa的区间。

10.权利要求7的缀合物，其中所述第一和第二标记是选自由发光化合物、放射性化合物、磁性化合物和酶组成的组的不同的标记物

11.权利要求7的缀合物，其中所述第一标记物是荧光标记物，而所述第二标记物是不同于所述第一标记物的荧光标记物。

12.权利要求11的缀合物，其中所述第一和第二标记物能够在两个光学活性中心之间进行电荷转移。

13.权利要求11的缀合物，其中所述连接体选自由抗体，抗体片段、抗体半抗原、适体、核酸、DNA、PNA、LNA、蛋白受体、配体受体、凝集素和糖组成的组。

14.标记连接体的方法，包括步骤：

-提供选自分子量位于约50kDa到约10000kDa的区间的亲水单分散性大分子的载体分子；

-向每个载体上连接至少一个连接体。

15.权利要求14的方法，其中标记载体分子在适于连接所述标记物到所述载体的第一条件下进行，而连接所述至少一个连接体则在区别于所述第一条件的，适于连接所述至少一个连接体到被标记的载体的分子的第二条件下进行。

16.权利要求14和15中任意一个的方法，其中所述方法包括在连接多个标记物到所述载体的步骤之后，在连接至少一个连接体到每个载体之前储存被标记的载体分子的步骤。

17.一种在无孔基质上的开放侧向流动性测定中进行结合测定的方法，使用了包含至少一个连接体、至少一个标记物和所述的至少一个连接体和至少一个标记物所连接到的载体的缀合物，其特征在于所述载体是亲水单分散性大分子，分子量位于约50kDa到约10000kDa的区间，并且多个所述的至少一个标记物被连接到所述的大分子上。

18.权利要求17的方法，其中所述缀合物被置于侧向流动性测定装置(1)的缀合物区(3)上。