CN111089968A - 一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法 - Google Patents

一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111089968A
CN111089968A CN201911388078.4A CN201911388078A CN111089968A CN 111089968 A CN111089968 A CN 111089968A CN 201911388078 A CN201911388078 A CN 201911388078A CN 111089968 A CN111089968 A CN 111089968A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
probe
solution
quality control
line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911388078.4A
Other languages
English (en)
Inventor
吴英松
陈振华
刘天才
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Publication of CN111089968A publication Critical patent/CN111089968A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明公开了一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法。该方法应用单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，包括单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条和多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针。该检测试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和粘性底衬，所述硝酸纤维素膜上依次涂有检测线T和质控线C。检测线T由三种不同的单克隆IgG涂层组成，质控线C由羊抗兔IgG组成。本发明应用双抗体夹心免疫法和多色镧系元素的荧光特性，实现在单检测线的时间分辨荧光免疫分析检测试纸条上同时定量检测三种不同目标抗原浓度。本发明具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高稳定性的优点。

Description

一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法。
背景技术
侧向流免疫层析技术(Lateral flow immunoassay，LFIA)是20世纪80年代初发展起来的一种基于抗原抗体特异性免疫反应的即时检测(Point-of-care testing，POCT)技术，是一种可以依据医疗和患者个人需要，不受场所、时间、检测环境及检测设施限制，可在现场或附近进行的检测技术，在各类生化指标的检测中有广阔的应用前景，且特别适用于社会防疫、家庭生活、生物武器以及现场检测等领域。
常用的LFIA检测是以胶体金颗粒或荧光染料为标记物，通过条带显色或荧光信号对待测分析物作分析。胶体金LFIA有明显的不足：首先，胶体金LFIA通常以肉眼判读检测结果，仅能作定性或半定量检测，检测准确度较低；其次，尽管胶体金颗粒的制备工艺较为成熟，但是想要获得大小形状均一且单分散性的胶体颗粒，不仅依赖于高质量的试剂，而且要求操作人员具有丰富的经验。而不均一的金颗粒难以均匀地包被蛋白分子，在检测过程中易发生非特异性聚集，产生假阳性的结果；最后，检测过程中，胶体金颗粒本身的散射光干扰带来较高的本底信号，因此胶体金法定量范围较窄，灵敏度较低。另一方面，以荧光染料为标记物的LFIA检测亦有诸多缺点：比如传统的荧光染料荧光寿命短、容易受光漂白、Stokes位移小导致检测信号受背景荧光干扰等。针对上述标记方法的不足，科学家发明了时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)技术，它是一种以镧系稀土元素为标记物的新型分析技术，利用镧系元素的发光特性，该方法具有检测本底低、灵敏度高、检测范围宽、稳定性高的优点。
LFIA是比较容易实现多标志物同步检测的分析技术之一。目前LFIA主要通过两种策略实现多标志物同步检测。第一种是将多条单检测指标的试纸条联用，使检测试剂同时向不同方向流动，以“检测盘”的方式实现多标志物同步检测。该策略的主要缺点在于需要成倍地提高样本、检测试剂用量，检测成本较高；而且不同试纸条的检测条件可能不一致。另一种策略则是通过增加检测线条数的方式，实现在一个试纸条上对多个分析物作检测。但这样的方式亦有着明显的弊端：首先，检测线上的蛋白分子通过静电作用包被固定在层析膜的孔隙中，微观上形成一道“栅栏”用于拦截、捕获待测分析物。为了避免组分非特异性聚集堆积在检测线上，多条检测线之间需要保持足够的距离。因此增加检测线需要增加层析膜的有效长度，从而导致分析样本、试剂用量提高，检测成本上升；更重要的是，层析膜上毛细作用流动速率是非恒定的，越靠近终点的检测线流动速率越低，越容易发生化学组分的堆积。由于流动速率不一致，导致检测线之间反应动力学不一致，检测的均一性、准确性得不到保障。
虽然时间分辨荧光免疫分析技术具有检测本底低、灵敏度高、检测范围宽、稳定性高的优点，但仍然不能解决上述实现多标志物同步检测的两种策略的不足。因此，针对现有技术不足，本发明提供一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条及其制备方法和应用，以克服现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法。该检测方法具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高稳定性等优点，实现了在只有单检测线的时间分辨荧光免疫分析检测试纸条上同时定量检测三种不同目标抗原浓度的目的。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现：
提供一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，包括单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条和多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针。
具体的，上述检测试纸条由粘性底衬、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；硝酸纤维素膜上依次涂有检测线T和质控线C；检测线T由抗BTA单克隆IgG、抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG的混合物涂层组成；质控线C由羊抗兔IgG涂层组成。
具体的，上述多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针包括检测探针和质控探针，多色镧系元素包括铽元素、铕元素和钐元素。
具体的，上述检测探针包括抗BTA探针、抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针，抗BTA探针由抗BTA单克隆IgG和铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成，抗NMP-22探针由抗NMP-22单克隆IgG和铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成，抗CYFRA 21-1探针由抗CYFRA21-1单克隆IgG和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成。
具体的，上述质控探针由兔IgG和等量的铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成。
进一步的，上述检测探针与检测线T的单克隆IgG捕获目标抗原形成双抗体夹心免疫复合物，并固定在上述检测线T；上述质控探针的兔IgG与上述质控线C的羊抗兔IgG形成免疫复合物，并固定在上述质控线C。
进一步的，利用荧光读数仪读取检测线T和质控线C处的铽元素、铕元素和钐元素对应的荧光信号，计算不同浓度抗原工作液的同种元素荧光信号的T/C值，并以同种镧系元素的 T/C值为Y轴，对应目标抗原浓度为X轴，拟合目标抗原浓度的标准工作曲线，用于检测分析待测样品中的目标抗原浓度。
具体的，上述检测试纸条的制备方法按以下步骤进行：
将未经裁切的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接于粘性底衬上，上述硝酸纤维素膜的两个搭接端分别位于样品垫搭接端和吸水纸搭接端的下方；按上述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸的分布方向裁切，获得检测试纸条。
上述样品垫是预先制备的，样品垫的制备具体为：
将样品垫浸泡在含有1wt％聚乙烯吡咯烷酮，0.2wt％干酪素钠，1wt％Triton X-100和0.1 wt％叠氮钠的0.1mol/L硼酸盐缓冲液中，静置1h后取出，放置于35～38℃的鼓风干燥箱内烘干过夜，干燥封存备用。
上述硝酸纤维素膜是预先制备的，硝酸纤维素膜的制备具体为：
将抗BTA单克隆IgG、抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA21-1单克隆IgG分别用10mM 磷酸盐缓冲液稀释至1.5～2mg/mL，等体积混合三种不同单克隆捕获IgG溶液并装入划膜仪，以0.8～1.0μL/cm的溶液划线浓度，将单克隆捕获IgG混合溶液均匀地喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线T；将羊抗兔IgG用10mM磷酸盐缓冲液稀释至1.5～2mg/mL后，装入划膜仪，以0.6～0.8μL/cm的溶液划线浓度，将羊抗兔IgG均匀地喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线C；喷涂完毕后将硝酸纤维素膜放置于36～38℃的鼓风干燥箱内烘干过夜，干燥封存备用。
具体的，上述检测线T接近样品垫，上述质控线C接近吸水纸；上述检测线T和质控线 C平行设置，两者相距3～4mm；上述检测线T和质控线C均为实直线。
具体的，上述检测试纸条总长度为5.5～6.0cm，宽度为3～4mm；上述样品垫与硝酸纤维素膜搭接端的长度为4mm，上述吸水纸与硝酸纤维素膜搭接端的长度为2mm；上述样品垫和吸水纸分别与粘性底衬相接触部分的长度为1～1.5cm。
具体的，上述10mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.3～7.4，含0.9wt％氯化钠、0.3wt％海藻糖和0.1wt％叠氮钠。
具体的，上述多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针的制备方法，按以下步骤进行：
S101，制备多色镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球。
将20mmol苯乙烯单体，0.2～0.3mmol铽元素螯合物和0.15mmol偶氮二异丁腈混合均匀，获得反应液A。
将0.15～0.2mmol十六烷基三甲基溴化铵与1.0～1.5mmol丙烯酸，加入15mL去离子水溶解，获得反应液B。
在三口烧瓶中混合反应液A和反应液B，获得混合液；往混合液中通入纯度大于90％的氮气2h，排尽空气；将混合液超声乳化30min后，继续通入纯度大于90％的氮气10～15min，密封三口烧瓶；将混合液加热至70℃，在避光条件下，搅拌反应18～20h后降至室温备用；用截留分子量7000～14000Da的透析袋及去离子水透析上述混合液3～5天，获得透析液；以上述透析液的40000～50000×质量的去离子水离心洗涤上述透析液30min，重复洗涤3～5 次，收集离心沉淀，以10wt％浓度的乙醇溶液重悬上述沉淀后，获得铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球，于4℃避光保存备用；同理制备铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球。
S102，制备功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球检测探针和质控探针。
上述检测探针按以下步骤制备：
取50～100μg的抗BTA单克隆IgG，用50mM磷酸盐缓冲液补充至体积为500μL后，加入到超滤管中，离心超滤3～5次，获得纯化后的抗BTA单克隆IgG，于4℃保存备用；同理制备抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG备用。
取铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球1mg，加入到50mM MES缓冲液离心洗涤3～5次，沉淀用0.4mL MES缓冲液重悬，然后加入10μL 10mg/mL的碳二亚胺溶液和90μL 10mg/mL 的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，混合液在室温下缓慢震荡孵育30min后，用50mM磷酸盐缓冲液离心洗涤3～5次；所得沉淀用50mM磷酸盐缓冲液重悬分散，得到纯化后的铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液，备用；同理制备纯化后的铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液备用。
将上述抗BTA单克隆IgG与铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液混合均匀，室温震荡孵育18～24h后，加入10μL乙醇胺，进一步室温震荡孵育30min；离心洗涤除去未反应的化合物，离心沉淀为抗BTA探针，重悬于探针储存液中，于4℃避光保存备用；同理制备抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针。
上述质控探针按以下步骤制备：
取100～150μg的兔IgG用50mM磷酸盐缓冲液补充至体积为500μL后，加入到超滤管中，离心超滤3～5次，得到纯化后的兔IgG，于4℃保存备用。
分别取铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球各0.5mg，加入到50mMMES 缓冲液离心洗涤3～5次，沉淀用0.4mL MES缓冲液重悬，然后加入10μL 15mg/mL的碳二亚胺溶液和90μL 15mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，混合液在室温下缓慢震荡孵育30min后，用50mM磷酸盐缓冲液离心洗涤3～5次；所得沉淀用50mM磷酸盐缓冲液重悬分散，得到纯化后的铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球混合悬浮液，备用。
将上述兔IgG与铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球混合悬浮液混合均匀，室温震荡孵育18～24h后，加入10μL乙醇胺，进一步室温震荡孵育30min；离心洗涤除去未反应的化合物，离心沉淀为功能性时间分辨荧光免疫分析纳米质控探针，重悬于探针储存液中，于4℃避光保存备用。
具体的，上述聚苯乙烯纳米微球由苯乙烯和丙烯酸共聚合所得，并且在聚合的过程中将多色镧系元素螯合物封装在微球内部；上述聚苯乙烯纳米微球的直径为150～200nm。
具体的，上述50mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.6；上述50mM MES缓冲液的pH 值为5.0～6.0，上述碳二亚胺溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液均以上述50mM MES缓冲液配制。
具体的，上述探针储存液为含有10mg/mL的牛血清白蛋白、0.5wt％吐温-20及0.05wt％叠氮钠的50mM磷酸盐缓冲液。
进一步的，应用该单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统进行的检测分析方法，按如下步骤进行：
(1)配制含有BTA抗原、NMP-22抗原和CYFRA 21-1抗原的标准曲线工作液，至少配制五个不同浓度的工作液。
(2)将一个浓度的上述标准曲线工作液与上述检测探针和质控探针溶液混合后，添加到上述检测试纸条的样品垫区域；将上述检测试纸条水平静置孵育10～20min后，插入荧光读数仪中，分别读取检测线T和质控线C处的铽元素、铕元素和钐元素对应的荧光信号，求得同种镧系元素荧光信号的T/C值。
(3)重复步骤(2)，获得不同浓度下，铽元素、铕元素和钐元素对应的多个T/C值，分别建立铽元素、铕元素和钐元素对应的标准工作曲线。
(4)以待测样品替代标准曲线工作液，按步骤(2)的操作，求得待测样品中铽元素、铕元素和钐元素对应的T/C值，利用步骤(3)建立的标准工作曲线，计算出待测样品中BTA抗原、抗 NMP-22抗原和抗CYFRA 21-1抗原的浓度。
本发明的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法的检测原理是双抗夹心法。首先，将苯乙烯单体与丙烯酸以乳化的方式共聚合，并且在聚合的过程中分别将铽元素、铕元素和钐元素螯合物封装包裹在微球的内部，制得铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球；其次，分别将抗BTA单克隆IgG、抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG与上述三种镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球共价偶联并作表面处理后，制得功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球检测探针。与此同时，将兔IgG同时与等量的上述三种镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球连接，并作表面处理制得功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球质控探针。将检测探针和质控探针与待测样品混合后，加入到检测试纸条的样品垫区域，样品混合物因毛细作用向吸水纸一端迁移。当样品混合物流经检测线T区域时，样品中的目标抗原被检测线T上的捕获抗体和检测探针捕获，形成双抗体夹心免疫复合物，过量的检测探针与质控探针继续向吸水纸方向流动。样品混合物继续流经质控线C区域时，质控探针则被羊抗兔IgG捕获，过量的检测探针和质控探针则继续迁移至吸水纸处。利用荧光读数仪读取检测线T和质控线C区域中不同波长的镧系元素荧光信号，依据检测线T和质控线C两处相同波长的镧系元素荧光信号的T/C值，参照标准浓度曲线即可分析出待测样本中的目标抗原的浓度。
本发明以喷涂目标单克隆捕获抗体为检测线的同时，引入独立的单克隆抗体作质控线，该独立的质控处理可以有效地校正不同试纸条之间人为的操作误差及样品垫释放效果差异造成的系统误差。
本发明将对应不同待测分析物的单克隆捕获抗体混合后喷涂于同一条检测线上，可以有效提高反应的一致性及检测灵敏度，减少反应误差。众所周知，免疫层析检测的灵敏度与硝酸纤维素膜的毛细流动速度有关，而其毛细流动速度则与其已浸润的体积有关，换言之，对于具体的某一条免疫层析试纸条而言，其硝酸纤维素膜上各点的毛细流动速度是不同的，越接近流动终点其液体毛细流动速率越低，而反应的灵敏度越高。本发明将三种不同单克隆捕获抗体混合后喷涂于同一条检测线上，则可以保证各待测分析物在流经检测线时反应一致，提高检测的准确度。
本发明使用三种镧系元素螯合物纳米微球作标记物，该处理一方面充分利用纳米微球较大的比表面积的特性，另一方面纳米微球表面的羧酸基团可以便捷地与生物分子的氨基以共价键相连接，提高连接稳定性。而且，本发明在纳米微球聚合的过程中将镧系元素螯合物封装包裹在微球内部，为镧系元素螯合物提供了稳定的疏水性环境，防止其淬灭，更重要的是，纳米微球内部可以封装包裹大量的镧系元素螯合物分子，提高单个纳米微球的荧光强度，从而提高了检测的灵敏度和准确度。
本发明使用镧系元素螯合物纳米微球，其具有的时间分辨荧光可以有效地与生物样品中的自发背景荧光信号区分，大幅提高检测的灵敏度。而且该纳米微球直径为150～200nm，可以有效保证其在硝酸纤维素膜上的流动性和避免发生聚集，提高了检测的精确度减小误差。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明实例1和实施例2的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条的结构示意图；
图2是本发明实施例4的镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球粒径测试结果；
图3是本发明实施例4的镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球荧光特性；
图4是本发明实施例7检测尿液样本中BTA抗原、NMP-22抗原及CYFRA 21-1抗原的标准浓度曲线图；
在图1中，包括：
样品垫1、硝酸纤维素膜2、吸水纸3、粘性底衬4、检测线T 5、质控线C 6。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1。
一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，包括单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条和多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针。
如图1所示，该检测试纸条由粘性底衬1、样品垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4组成；硝酸纤维素膜3上依次涂有检测线T 5和质控线C 6；检测线T 5由抗BTA单克隆IgG、抗 NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG的混合物涂层组成；质控线C 6由羊抗兔 IgG涂层组成。
多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针包括检测探针和质控探针，多色镧系元素包括铽元素、铕元素和钐元素。
检测探针包括抗BTA探针、抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针，抗BTA探针由抗BTA单克隆IgG和铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成，抗NMP-22探针由抗NMP-22单克隆IgG和铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成，抗CYFRA 21-1探针由抗CYFRA 21-1单克隆IgG和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成。
质控探针由兔IgG和等量的铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成。
检测探针与检测线T 5的单克隆IgG捕获目标抗原形成双抗体夹心免疫复合物，并固定在上述检测线T 5；上述质控探针的兔IgG与上述质控线C 6的羊抗兔IgG形成免疫复合物，并固定在上述质控线C 6。
利用荧光读数仪读取检测线T 5和质控线C 6处的铽元素、铕元素和钐元素对应的荧光信号，计算不同浓度抗原工作液的同种元素荧光信号的T/C值，并以所述同种镧系元素的T/C 值为Y轴，对应目标抗原浓度为X轴，拟合目标抗原浓度的标准工作曲线，用于检测分析待测样品中的目标抗原浓度。
需要说明的是，本实施例中的三种目标抗原BAT为膀胱肿瘤相关抗原(Bladdertumor-associated antigen)、NMP-22为核基质蛋白22(Nuclear matrix protein 22)和CYFRA 21-1 为细胞角蛋白19可溶性片段(Cytokeratin 19fragment)。检测尿液中的上述三种抗原对分析膀胱肿瘤具有指导作用。
需要说明的是，本实施例中的多色镧系元素分别为铽元素(Terbium，Tb)、铕元素(Europium，Eu)和钐元素(Samarium，Sm)。镧系元素具有的时间分辨荧光可以有效地与生物样品中的自发背景荧光信号区分，大幅提高检测的灵敏度。
本实施例的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试系统能够准确定量检测目标抗原的浓度，利用镧系元素编码的纳米微球标记单克隆抗体，结合时间分辨荧光免疫分析技术，可避免样本本身的荧光干扰。本发明具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高稳定性等优点，实现在单检测线的时间分辨荧光免疫分析检测试纸条上同时定量检测三种不同目标抗原浓度的目的。
实施例2。
如图1所示，实施例1中的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条的制备方法，按以下步骤进行：
将未经裁切的样品垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4依次搭接于粘性底衬1上，硝酸纤维素膜3的两个搭接端分别位于样品垫2搭接端和吸水纸4搭接端的下方；按样品垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4的分布方向裁切，获得检测试纸条；
样品垫2是预先制备的，样品垫2的制备具体为：
将样品垫2浸泡在含有1wt％聚乙烯吡咯烷酮，0.2wt％干酪素钠，1wt％Triton X-100和 0.1wt％叠氮钠的0.1mol/L硼酸盐缓冲液中，静置1h后取出，放置于35～38℃的鼓风干燥箱内烘干过夜，干燥封存备用；
硝酸纤维素膜3是预先制备的，硝酸纤维素膜3的制备具体为：
将抗BTA单克隆IgG、抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG分别用10mM磷酸盐缓冲液稀释至1.5～2mg/mL，等体积混合三种单克隆捕获IgG溶液并装入划膜仪，以0.8～1.0μL/cm的溶液划线浓度，将单克隆捕获IgG混合溶液均匀地喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线T；将羊抗兔IgG用10mM磷酸盐缓冲液稀释至1.5～2mg/mL后，装入划膜仪，以0.6～0.8μL/cm的溶液划线浓度，将羊抗兔IgG均匀地喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线 C；喷涂完毕后将硝酸纤维素膜放置于36～38℃的鼓风干燥箱内烘干过夜，干燥封存备用。
需要说明的是，检测线T 5接近样品垫2，质控线C 6接近吸水纸4；检测线T 5和质控线C 6平行设置，两者相距3～4mm；检测线T 5和质控线C 6均为实直线。
检测试纸条总长度为5.5～6.0cm，宽度为3～4mm；样品垫2与硝酸纤维素膜3搭接端的长度为4mm，吸水纸4与硝酸纤维素膜3搭接端的长度为2mm；样品垫2和吸水纸4分别与粘性底衬1相接触部分的长度为1～1.5cm。
本实施例提供的检测试纸条制备方法简单，将对应不同待测分析物的单克隆捕获抗体混合后喷涂于同一条检测线上，可以有效提高反应的一致性及检测灵敏度，减少反应误差。众所周知，免疫层析检测的灵敏度与硝酸纤维素膜的毛细流动速度有关，而其毛细流动速度则与其已浸润的体积有关，换言之，对于具体的某一条免疫层析试纸条而言，其硝酸纤维素膜上各点的毛细流动速度是不同的，越接近流动终点其液体毛细流动速率越低，而反应的灵敏度越高。本发明将三种不同单克隆捕获抗体混合后喷涂于同一条检测线上，可以保证各待测分析物在流经检测线时反应一致，提高检测的准确度。
实施例3。
如实施例1中的多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球的制备方法，按以下步骤进行：
将20mmol苯乙烯单体，0.2～0.3mmol铽元素螯合物和0.15mmol偶氮二异丁腈混合均匀，获得反应液A。
将0.15～0.2mmol十六烷基三甲基溴化铵与1.0～1.5mmol丙烯酸，加入15mL去离子水溶解，获得反应液B。
在三口烧瓶中混合反应液A和反应液B，获得混合液；往混合液中通入纯度大于90％的氮气2h，排尽空气；将混合液超声乳化30min后，继续通入纯度大于90％的氮气10～15min，密封三口烧瓶；将混合液加热至70℃，在避光条件下，搅拌反应18～20h后降至室温备用；用截留分子量7000～14000Da的透析袋及去离子水透析上述混合液3～5天，获得透析液；以上述透析液的40000～50000×质量的去离子水离心洗涤上述透析液30min，重复洗涤3～5 次，收集离心沉淀，以10wt％浓度的乙醇溶液重悬上述沉淀后，获得铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球，于4℃避光保存备用；同理制备铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球。
需要说明的是，制备过程中使用的纯度大于90％的氮气可以选用中国广东佛山市智程气体有限公司的工业级超高纯氮气，含量为99.999％，苯乙烯单体购自麦克林公司，偶氮二异丁腈购自阿拉丁公司，丙烯酸购自麦克林公司，透析袋购自美仑生物公司。
本实施例的聚苯乙烯纳米微球的直径为150～200nm，可以有效保证其在硝酸纤维素膜上的流动性和避免发生聚集，提高了检测的精确度减小误差。本实施例使用三种镧系元素螯合物纳米微球作标记物，该处理一方面充分利用纳米微球较大的比表面积的特性，另一方面纳米微球表面的羧酸基团可以便捷地与生物分子的氨基以共价键相连接，提高连接稳定性。而且，本实施例在纳米微球聚合的过程中将镧系元素螯合物封装包裹在微球内部，为镧系元素螯合物提供了稳定的疏水性环境，防止其淬灭，更重要的是，纳米微球内部可以封装包裹大量的镧系元素螯合物分子，提高单个纳米微球的荧光强度，从而提高了检测的灵敏度和准确度。
实施例4。
本实施例的多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球的制备方法，其步骤和实施例3相同，不同之处在于：
将20mmol苯乙烯单体，0.2mmol铽元素螯合物和0.15mmol偶氮二异丁腈混合均匀，获得反应液A。
将0.15mmol十六烷基三甲基溴化铵与1.0mmol丙烯酸，加入15mL去离子水溶解，获得反应液B。
经测定，本实施例所得镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球直径为174.9±1.015nm，表面 zeta电位为-67.4±2.17mV，表面羧基含量约为0.15～0.18meq/g。其中，铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球最大荧光发射峰为547.5±5nm，半峰全宽为15～17nm；铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球最大荧光发射峰为615.5±2nm，半峰全宽为10～13nm；钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球最大荧光发射峰为644.5 6nm，半峰全宽为12～14nm。
本实施例使用三种镧系元素螯合物纳米微球作标记物，该处理一方面充分利用纳米微球较大的比表面积的特性，另一方面纳米微球表面的羧酸基团可以便捷地与生物分子的氨基以共价键相连接，提高连接稳定性。而且，本实施例在纳米微球聚合的过程中将镧系元素螯合物封装包裹在微球内部，为镧系元素螯合物提供了稳定的疏水性环境，防止其淬灭，更重要的是，纳米微球内部可以封装包裹大量的镧系元素螯合物分子，提高单个纳米微球的荧光强度，从而提高了检测的灵敏度和准确度。
实施例5。
如实施例1中的多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球检测探针的制备方法，按以下步骤进行：
取50～100μg的抗BTA单克隆IgG，用50mM磷酸盐缓冲液补充至体积为500μL后，加入到超滤管中，离心超滤3～5次，获得纯化后的抗BTA单克隆IgG，于4℃保存备用；同理制备抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG备用。
取铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球1mg，加入到50mM MES缓冲液离心洗涤3～5次，沉淀用0.4mL MES缓冲液重悬，然后加入10μL 10mg/mL的碳二亚胺溶液和90μL 10mg/mL 的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，混合液在室温下缓慢震荡孵育30min后，用50mM磷酸盐缓冲液离心洗涤3～5次；所得沉淀用50mM磷酸盐缓冲液重悬分散，得到纯化后的铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液，备用；同理制备纯化后的铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液备用。
将上述抗BTA单克隆IgG与铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液混合均匀，室温震荡孵育18～24h后，加入10μL乙醇胺，进一步室温震荡孵育30min；离心洗涤除去未反应的化合物，离心沉淀为抗BTA探针，重悬于探针储存液中，于4℃避光保存备用；同理制备抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针。
需要说明的是，上述抗BTA单克隆IgG购自中国台湾Abnova公司，上述抗NMP-22单克隆 IgG购自美国LifeSpan BioSciences公司，上述抗CYFRA 21-1单克隆IgG购自芬兰Medix Biochemica公司。
需要说明的是，上述50mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.6，上述50mM MES缓冲液的pH值为5.0～6.0，上述碳二亚胺溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液均以上述50mM MES缓冲液配制。上述探针储存液为含有10mg/mL的牛血清白蛋白、0.5wt％吐温-20及0.05wt％叠氮钠的50mM磷酸盐缓冲液。
本实施例中，抗BTA单克隆IgG除了与铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球配对组合检测探针，还可以与铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球或钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球配对。配对组合原则是一种镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球唯一表征一种单克隆IgG。综上所述，抗 BTA探针、抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针的构成情况共有如下6种组合：
Figure BDA0002344137700000111
Figure BDA0002344137700000121
Figure BDA0002344137700000122
Figure BDA0002344137700000123
Figure BDA0002344137700000124
Figure BDA0002344137700000125
本实施例中，按一种镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球唯一表征一种单克隆IgG的原则组装检测探针的有益效果是提高了检测方法的特异性，故此可以在只有单检测线的检测试纸条上同时测定三种不同目标抗原的浓度，从而提高检测效率，并保证检测结果的可靠度。
实施例6。
如实施例1中的多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球质控探针的制备方法，按以下步骤进行：
取100～150μg的兔IgG用50mM磷酸盐缓冲液补充至体积为500μL后，加入到超滤管中，离心超滤3～5次，得到纯化后的兔IgG，于4℃保存备用。
分别取铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球各0.5mg，加入到50mMMES 缓冲液离心洗涤3～5次，沉淀用0.4mL MES缓冲液重悬，然后加入10μL 15mg/mL的碳二亚胺溶液和90μL 15mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，混合液在室温下缓慢震荡孵育30min后，用50mM磷酸盐缓冲液离心洗涤3～5次；所得沉淀用50mM磷酸盐缓冲液重悬分散，得到纯化后的铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球混合悬浮液，备用。
将上述兔IgG与铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球混合悬浮液混合均匀，室温震荡孵育18～24h后，加入10μL乙醇胺，进一步室温震荡孵育30min；离心洗涤除去未反应的化合物，离心沉淀为功能性时间分辨荧光免疫分析纳米质控探针，重悬于探针储存液中，于4℃避光保存备用。
需要说明的是，上述50mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.6，上述50mM MES缓冲液的pH值为5.0～6.0，上述碳二亚胺溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液均以上述50mM MES缓冲液配制。上述探针储存液为含有10mg/mL的牛血清白蛋白、0.5wt％吐温-20及0.05wt％叠氮钠的50mM磷酸盐缓冲液。
本实施例使用独立的兔IgG作质控探针，被检测试纸条的质控线C处的羊抗兔IgG捕获形成免疫复合物，该独立的质控处理可以有效地校正不同试纸条之间人为的操作误差及样品垫释放效果差异造成的系统误差。
实施例7。
应用实施例1的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统对尿液样本中BTA抗原、NMP-22抗原和CYFRA 21-1抗原进行的检测分析方法，按如下步骤进行：
(1)配制含有BTA抗原、NMP-22抗原和CYFRA 21-1抗原的标准曲线工作液，按表1的浓度配制工作液；
表1 BTA抗原/NMP-22抗原/CYFRA 21-1抗原工作液浓度
Figure BDA0002344137700000141
(2)将浓度A工作液70μL与1.3μL探针工作液混合后，添加到检测试纸条的样品垫1区域；将检测试纸条水平静置孵育15min后，插入便携式荧光读数仪(广州蓝勃生物科技有限公司生产)中，分别读取如图1所示的检测线T 5和质控线C 6处的铽元素、铕元素和钐元素对应的荧光信号，分别求得浓度A工作液的铽元素、铕元素和钐元素荧光信号的T/C值。
需要说明的是，将实施例4和实施例5中制备的时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针用分析缓冲液(pH值为7.35～7.45的10mM磷酸盐缓冲液，含0.9wt％氯化钠、1wt％牛血清白蛋白、0.3wt％TritonX-100及0.1wt％表面活性剂S9)分别稀释至1mg/mL后，按铽-BTA 探针：铕-NMP-22探针：钐-CYFRA 21-1探针：多色镧系元素-兔IgG探针＝5:5:7:0.7的比例混合得到探针工作液。
(3)重复步骤(2)，获得浓度B至浓度F工作液中，铽元素、铕元素和钐元素对应的T/C值，分别建立铽元素、铕元素和钐元素对应的标准工作曲线，如图4所示；
(4)取待测尿液样品70μL，按步骤(2)的操作，求得待测尿液样品中铽元素、铕元素和钐元素对应的T/C值，利用步骤(3)建立的标准工作曲线，即可求得待尿液测样品中BTA抗原、抗NMP-22抗原和抗CYFRA 21-1抗原的浓度。
本实施例应用单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统对尿液样本中BTA抗原、NMP-22抗原和CYFRA 21-1抗原进行的检测分析方法，具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高稳定性等优点，实现在单检测线的时间分辨荧光免疫分析检测试纸条上同时定量检测三种不同目标抗原浓度的目的。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，包括单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条和多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针；
所述检测试纸条由粘性底衬、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述硝酸纤维素膜上依次涂有检测线T和质控线C；所述检测线T由抗BTA单克隆IgG、抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG的混合物涂层组成；质控线C由羊抗兔IgG涂层组成；
所述多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针包括检测探针和质控探针，所述多色镧系元素包括铽元素、铕元素和钐元素；
所述检测探针包括抗BTA探针、抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针，所述抗BTA探针由抗BTA单克隆IgG和铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成，所述抗NMP-22探针由抗NMP-22单克隆IgG和铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成，所述抗CYFRA 21-1探针由抗CYFRA 21-1单克隆IgG和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成；
所述质控探针由兔IgG和等量的铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成；
所述检测探针与所述检测线T的单克隆IgG捕获目标抗原形成双抗体夹心免疫复合物，并固定在所述检测线T；所述质控探针的兔IgG与所述质控线C的羊抗兔IgG形成免疫复合物，并固定在所述质控线C；
利用荧光读数仪读取检测线T和质控线C处的铽元素、铕元素和钐元素对应的荧光信号，计算不同浓度抗原工作液的同种元素荧光信号的T/C值，并以所述同种镧系元素的T/C值为Y轴，对应目标抗原浓度为X轴，拟合目标抗原浓度的标准工作曲线，用于检测分析待测样品中的目标抗原浓度。
2.根据权利要求1所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述检测试纸条的制备方法按以下步骤进行：
将未经裁切的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接于粘性底衬上，所述硝酸纤维素膜的两个搭接端分别位于样品垫搭接端和吸水纸搭接端的下方；按所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸的分布方向裁切，获得检测试纸条；
所述样品垫是预先制备的，样品垫的制备具体为：
将样品垫浸泡在含有1wt％聚乙烯吡咯烷酮，0.2wt％干酪素钠，1wt％Triton X-100和0.1wt％叠氮钠的0.1mol/L硼酸盐缓冲液中，静置1h后取出，放置于35～38℃的鼓风干燥箱内烘干过夜，干燥封存备用；
所述硝酸纤维素膜是预先制备的，硝酸纤维素膜的制备具体为：
将抗BTA单克隆IgG、抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG分别用10mM磷酸盐缓冲液稀释至1.5～2mg/mL，等体积混合三种单克隆捕获IgG溶液并装入划膜仪，以0.8～1.0μL/cm的溶液划线浓度，将单克隆捕获IgG混合溶液均匀地喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线T；将羊抗兔IgG用10mM磷酸盐缓冲液稀释至1.5～2mg/mL后，装入划膜仪，以0.6～0.8μL/cm的溶液划线浓度，将羊抗兔IgG均匀地喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线C；喷涂完毕后将硝酸纤维素膜放置于36～38℃的鼓风干燥箱内烘干过夜，干燥封存备用。
3.根据权利要求2所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述检测线T接近样品垫，所述质控线C接近吸水纸；所述检测线T和质控线C平行设置，两者相距3～4mm；所述检测线T和质控线C均为实直线。
4.根据权利要求2所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述检测试纸条总长度为5.5～6.0cm，宽度为3～4mm；所述样品垫与硝酸纤维素膜搭接端的长度为4mm，所述吸水纸与硝酸纤维素膜搭接端的长度为2mm；所述样品垫和吸水纸分别与粘性底衬相接触部分的长度为1～1.5cm。
5.根据权利要求2所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述10mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.3～7.4，含0.9wt％氯化钠、0.3wt％海藻糖和0.1wt％叠氮钠。
6.根据权利要求1所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针的制备方法，按以下步骤进行：
S101，制备多色镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球；
将20mmol苯乙烯单体，0.2～0.3mmol铽元素螯合物和0.15mmol偶氮二异丁腈混合均匀，获得反应液A；
将0.15～0.2mmol十六烷基三甲基溴化铵与1.0～1.5mmol丙烯酸，加入15mL去离子水溶解，获得反应液B；
在三口烧瓶中混合反应液A和反应液B，获得混合液；往混合液中通入纯度大于90％的氮气2h，排尽空气；将混合液超声乳化30min后，继续通入纯度大于90％的氮气10～15min，密封三口烧瓶；将混合液加热至70℃，在避光条件下，搅拌反应18～20h后降至室温备用；用截留分子量7000～14000Da的透析袋及去离子水透析上述混合液3～5天，获得透析液；以上述透析液的40000～50000×质量的去离子水离心洗涤上述透析液30min，重复洗涤3～5次，收集离心沉淀，以10wt％浓度的乙醇溶液重悬上述沉淀后，获得铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球，于4℃避光保存备用；同理制备铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球；
S102，制备功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球检测探针和质控探针；
所述检测探针按以下步骤制备：
取50～100μg的抗BTA单克隆IgG，用50mM磷酸盐缓冲液补充至体积为500μL后，加入到超滤管中，离心超滤3～5次，获得纯化后的抗BTA单克隆IgG，于4℃保存备用；同理制备抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG备用；
取铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球1mg，加入到50mM MES缓冲液离心洗涤3～5次，沉淀用0.4mL MES缓冲液重悬，然后加入10μL 10mg/mL的碳二亚胺溶液和90μL 10mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，混合液在室温下缓慢震荡孵育30min后，用50mM磷酸盐缓冲液离心洗涤3～5次；所得沉淀用50mM磷酸盐缓冲液重悬分散，得到纯化后的铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液，备用；同理制备纯化后的铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液备用；
将所述抗BTA单克隆IgG与铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液混合均匀，室温震荡孵育18～24h后，加入10μL乙醇胺，进一步室温震荡孵育30min；离心洗涤除去未反应的化合物，离心沉淀为抗BTA探针，重悬于探针储存液中，于4℃避光保存备用；同理制备抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针；
所述质控探针按以下步骤制备：
取100～150μg的兔IgG用50mM磷酸盐缓冲液补充至体积为500μL后，加入到超滤管中，离心超滤3～5次，得到纯化后的兔IgG，于4℃保存备用；
分别取铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球各0.5mg，加入到50mM MES缓冲液离心洗涤3～5次，沉淀用0.4mL MES缓冲液重悬，然后加入10μL 15mg/mL的碳二亚胺溶液和90μL 15mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，混合液在室温下缓慢震荡孵育30min后，用50mM磷酸盐缓冲液离心洗涤3～5次；所得沉淀用50mM磷酸盐缓冲液重悬分散，得到纯化后的铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球混合悬浮液，备用；
将所述兔IgG与铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球混合悬浮液混合均匀，室温震荡孵育18～24h后，加入10μL乙醇胺，进一步室温震荡孵育30min；离心洗涤除去未反应的化合物，离心沉淀为功能性时间分辨荧光免疫分析纳米质控探针，重悬于探针储存液中，于4℃避光保存备用。
7.根据权利要求6所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述聚苯乙烯纳米微球由苯乙烯和丙烯酸共聚合所得，并且在聚合的过程中将多色镧系元素螯合物封装在微球内部；所述聚苯乙烯纳米微球的直径为150～200nm。
8.根据权利要求6所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述50mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.6；所述50mM MES缓冲液的pH值为5.0～6.0，所述碳二亚胺溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液均以所述50mM MES缓冲液配制。
9.根据权利要求6所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述探针储存液为含有10mg/mL的牛血清白蛋白、0.5wt％吐温-20及0.05wt％叠氮钠的50mM磷酸盐缓冲液。
10.一种通过如权利要求1～9任意一项的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统进行的检测分析方法，其特征在于，按如下步骤进行：
(1)配制含有BTA抗原、NMP-22抗原和CYFRA 21-1抗原的标准曲线工作液，至少配制五个不同浓度的工作液；
(2)将一个浓度的所述标准曲线工作液与所述检测探针和质控探针溶液混合后，添加到所述检测试纸条的样品垫区域；将所述检测试纸条水平静置孵育10～20min后，插入荧光读数仪中，分别读取检测线T和质控线C处的铽元素、铕元素和钐元素对应的荧光信号，求得同种镧系元素荧光信号的T/C值；
(3)重复步骤(2)，获得不同浓度下，铽元素、铕元素和钐元素对应的多个T/C值，分别建立铽元素、铕元素和钐元素对应的标准工作曲线；
(4)以待测样品替代标准曲线工作液，按步骤(2)的操作，求得待测样品中铽元素、铕元素和钐元素对应的T/C值，利用步骤(3)建立的标准工作曲线，计算出待测样品中BTA抗原、抗NMP-22抗原和抗CYFRA 21-1抗原的浓度。
CN201911388078.4A 2019-07-16 2019-12-30 一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法 Pending CN111089968A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910640439 2019-07-16
CN2019106404393 2019-07-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111089968A true CN111089968A (zh) 2020-05-01

Family

ID=70398492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911388078.4A Pending CN111089968A (zh) 2019-07-16 2019-12-30 一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111089968A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111781346A (zh) * 2020-07-17 2020-10-16 成都赛普克生物科技股份有限公司 一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法
CN112730839A (zh) * 2021-01-20 2021-04-30 宁波海壹生物科技有限公司 一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒
CN113484525A (zh) * 2021-07-05 2021-10-08 海南医学院 一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条
CN113702643A (zh) * 2021-07-12 2021-11-26 杭州奥泰生物技术股份有限公司 一种联合检测新型冠状病毒中和抗体及核衣壳蛋白抗体的装置

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514987A (zh) * 2008-07-14 2009-08-26 马义才 量子点标记试条定量检测系统及其检测方法
CN101592659A (zh) * 2009-02-09 2009-12-02 马义才 一种基于持续荧光物标记的试条定量检测系统及其方法
CN103105384A (zh) * 2012-09-20 2013-05-15 河南生生医疗器械有限公司 一种时间分辨荧光法综合检测乳腺癌试剂盒及其应用
CN104198731A (zh) * 2014-08-28 2014-12-10 宁波瑞源生物科技有限公司 一种c反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸
CN104267182A (zh) * 2014-09-27 2015-01-07 成都领御生物技术有限公司 同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条及其方法
CN104749149A (zh) * 2015-03-27 2015-07-01 基蛋生物科技股份有限公司 一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条
CN107880877A (zh) * 2017-12-18 2018-04-06 上海艾瑞德生物科技有限公司 一种单分散聚合物荧光微球的制备方法及其应用
CN108535495A (zh) * 2018-07-05 2018-09-14 深圳市迈科龙生物技术有限公司 一种定量检测血液中cyfra21-1的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法
CN108593922A (zh) * 2018-05-03 2018-09-28 常州领航量子生物医疗科技有限公司 一种测定膀胱癌的联合检测试剂盒及其制备方法
CN109387640A (zh) * 2018-12-17 2019-02-26 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514987A (zh) * 2008-07-14 2009-08-26 马义才 量子点标记试条定量检测系统及其检测方法
CN101592659A (zh) * 2009-02-09 2009-12-02 马义才 一种基于持续荧光物标记的试条定量检测系统及其方法
CN103105384A (zh) * 2012-09-20 2013-05-15 河南生生医疗器械有限公司 一种时间分辨荧光法综合检测乳腺癌试剂盒及其应用
CN104198731A (zh) * 2014-08-28 2014-12-10 宁波瑞源生物科技有限公司 一种c反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸
CN104267182A (zh) * 2014-09-27 2015-01-07 成都领御生物技术有限公司 同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条及其方法
CN104749149A (zh) * 2015-03-27 2015-07-01 基蛋生物科技股份有限公司 一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条
CN107880877A (zh) * 2017-12-18 2018-04-06 上海艾瑞德生物科技有限公司 一种单分散聚合物荧光微球的制备方法及其应用
CN108593922A (zh) * 2018-05-03 2018-09-28 常州领航量子生物医疗科技有限公司 一种测定膀胱癌的联合检测试剂盒及其制备方法
CN108535495A (zh) * 2018-07-05 2018-09-14 深圳市迈科龙生物技术有限公司 一种定量检测血液中cyfra21-1的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法
CN109387640A (zh) * 2018-12-17 2019-02-26 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTA SANCHEZ-CARBAYO, ET AL.: "COMPARATIVE SENSITIVITY OF URINARY CYFRA 21-1, URINARY BLADDER CANCER ANTIGEN, TISSUE POLYPEPTIDE ANTIGEN AND NMP22* TO DETECT BLADDER CANCER.", 《THE JOURNAL OF UROLOGY》 *
张春燕，等: "单分散键合型含铕聚苯乙烯微球的制备与荧光传感性能。", 《高等学校化学学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111781346A (zh) * 2020-07-17 2020-10-16 成都赛普克生物科技股份有限公司 一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法
CN111781346B (zh) * 2020-07-17 2023-02-03 成都赛普克生物科技股份有限公司 一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法
CN112730839A (zh) * 2021-01-20 2021-04-30 宁波海壹生物科技有限公司 一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒
CN112730839B (zh) * 2021-01-20 2024-01-30 宁波海尔施智造有限公司 一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒
CN113484525A (zh) * 2021-07-05 2021-10-08 海南医学院 一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条
CN113702643A (zh) * 2021-07-12 2021-11-26 杭州奥泰生物技术股份有限公司 一种联合检测新型冠状病毒中和抗体及核衣壳蛋白抗体的装置

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111089968A (zh) 一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法
CN100367034C (zh) 免疫胶体金粒子荧光淬灭的测量方法
CN107607498B (zh) 一种荧光纳米分子印记仿生传感器及其制备方法和应用
WO2007011936A2 (en) Lateral flow assay and device using magnetic particles
WO2010137532A1 (ja) 検出対象の検出方法及び定量方法
CA1140045A (en) Carcinoembryonic antigen determination
CN108226122B (zh) 基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法
WO2014146215A1 (en) Method and apparatus for time-resolved fluorescence immunoassay testing
US10203326B2 (en) Method of detecting target substance
US20160216273A1 (en) Fluorescent labeling particle
Li et al. Dual protecting encapsulation synthesis of ultrastable quantum-dot nanobeads for sensitive and accurate detection of cardiac biomarkers
CN101957369A (zh) 用于免疫测定的增强标记缀合物
CN110044879A (zh) 一种cyfra21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN110988368A (zh) 一种游离甲状腺素发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN113933521A (zh) 磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法和应用
JPS61128168A (ja) 免疫分析方法
IE883460L (en) A method of determining in a test sample one or more components of the reaction between a specifically-binding protein and the corresponding bindable substance, using at least one labelled component, a method of preparing the labelled component, and a test kit for the determination of immuno components
CN111693721A (zh) 基于普鲁士蓝纳米酶标记物的酶联免疫吸附实验的制备方法及应用
Zhan et al. Magnetic bead-based sandwich immunoassay for viral pathogen detection by employing gold nanoparticle as carrier
CN113109558A (zh) 一种定量检测cyfra21-1的磁微粒化学发光试剂盒及其制作方法
Zhu et al. Fluorescence immunoassay of α-1-fetoprotein with hemin as a mimetic enzyme labelling reagent
KR20130090174A (ko) 퀀칭 시스템을 이용한 바이오 센서 및 이를 이용한 측정방법
CN111474355A (zh) 用于肺癌诊断的液相芯片及其使用方法
CN113125703B (zh) 一种肌红蛋白的均相检测试剂盒及其应用
CN113125705B (zh) 一种肌红蛋白的均相检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200501