CN110044879A - 一种cyfra21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CYFRA21‑1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：CYFRA21‑1校准品；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的CYFRA21‑1抗体；CYFRA21‑1抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；CYFRA21‑1质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比敏感性高、可测定浓度范围宽、试剂有效期长、操作简单、检测自动化程度高等优点。

Description

一种CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制 备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

CYFRA21-1是细胞质角蛋白片段19的缩写，细胞质角蛋白（Cytokeratin）是构成上皮细胞间丝状体亚基的结构蛋白，在多种正常上皮组织中存在，完整的细胞角蛋白的可溶性较差，但其片段可溶于血液中并被检测，CYFRA21-1（Cytokeratin 19 Fragment）能够被单克隆抗体识别，分子量约为30KD。

CYFRA21-1存在于肺癌、食道癌等上皮起源的肿瘤细胞的细胞质中，是监测非小细胞肺癌的首选肿瘤标记，各类非小细胞肺癌阳性检出率为70%-85%。CYFRA21-1也可用于监测横纹肌浸润性膀胱癌、良性肺部疾病（肺炎，结核，慢性支气管炎，支气管哮喘，肺气肿），CYFRA21-1的血清浓度水平的高低与肿瘤临床分期正相关，可作为肺癌手术和放化疗后追踪早期复发的有效指标。

目前检测CYFRA21-1的方法有时间分辨免疫荧光分析法，采用长效荧光标记物如稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy)标记，通过明间分辨非特异性荧光，但是此方法需要利用稀土金属，成本高，标记难度大，不易得。

另外检测CYFRA21-1的最常用方法是化学发光免疫分析法，磁微粒化学发光免疫分析法，较以前的放射免疫分析法、酶联免疫分析法，在检测灵敏度、检测范围、检测时间及自动化操作上有了大大提高，且没有污染，得到临床工作者的青睐。

现有技术普遍采用荧光素体系，此体系试剂盒有效期短，不稳定，测值上仍然不够精确；另有技术是在磁微粒上直接联抗体，操作难度高，不易得。

发明内容

本发明要解决的问题是提供CYFRA21-1的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，测值不够精确，检测范围窄，成本高，保质期短的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：CYFRA21-1校准品；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的CYFRA21-1抗体；CYFRA21-1抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ ≥ 3.0，活性≥ 250U/mL；CYFRA21-1质控品，质控品包括浓度10ng/mL的低值质控品和200ng/mL的高值质控品；化学发光液A液和B液，A液为5mmol/L， pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.08g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径10-50nm。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）CYFRA21-1校准品的配制：

将CYFRA21-1抗原用山羊血清配制成校准品浓储液，以国家校准品进行定标，将浓储液用山羊血清稀释至工作浓度，分别为1，5，20，100，300ng/mL，即为校准品浓度；

（2）CYFRA21-1质控品的配制：

用山羊血清将上述浓储液分别稀释至3ng/mL和200ng/mL，并以国家校准品进行定标；将3ng/mL作为低值质控品，200ng/mL作为高值质控品；

（3）磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：配制1L，方法如下：

取100mL0.1M 2- 吗啉乙磺酸（MES）缓冲液，加入10mg表面联有羧基的磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mL碳二亚胺（EDC）溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的CYFRA21-1抗体的制备：

取0.5mg CYFRA21-1抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度为5-10%，缓慢振荡，避光反应3h；在上述溶液中加入250uL1M 氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3-5次；

（5）CYFRA21-1抗体酶结合物的制备：

采用改良高碘酸钠氧化法将CYFRA21-1抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:5000-8000，并加入10%酶稳定剂，储存于2~8℃；

改良过碘酸钠氧化法步骤包括：

A：HRP活化

1）配置10mg/mL HRP溶液；

2）配置12.8 mg/mL 过碘酸钠NaIO₄溶液；

3）将上述1）和2）配制溶液按体积比1：1混匀，4℃避光反应30min；

4）配置浓度为20uL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3）以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）；

B、CYFRA21-1单克隆抗体标记

1）将待标记原料装入透析袋中，用0.05 M pH9.6 的碳酸盐缓冲液，透析30min；

2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:3进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析24h（期间换液2-3次）；

3）配置浓度为2mg/mL的 NaBH₄水溶液，按1mgHRP加80uL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

4）将上述步骤3）完成的标记液用0.01M PBS 于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存；

酶稀释液中包括10mL/L 2M NaOH，15g/L NaCl，10g/LBSA，5g/L Dextran T-2000（购自Sigma公司），1.05g/L Triton X-100（购自Sigma公司），2.5mL/L硫酸庆大霉素，1mL/L胭脂红（胭脂红为粉末固体，配制成浓度40mg/mL以后使用），2g/L Tween-20（购自Sigma公司），1mL/L ProClin300（购自Sigma公司）；

（6）20倍浓缩洗液的配制：

20倍浓缩洗液包括58g/L 磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和2% Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制：

A液为0.7g/L鲁米诺，0.08g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：

将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

本发明的原理是，采用双抗体夹心法测定血清或血浆中的CYFRA21-1，在亲和素-磁微粒悬浮液中加入生物素- CYFRA21-1抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-CYFRA21-1抗体复合物，加入样本和酶，通过抗原抗体反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-CYFRA21-1抗体-CYFRA21-1-CYFRA21-1抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值RLU；样本的RLU与样本CYFRA21-1浓度呈正相关；样本中的CYFRA21-1浓度依据由校准品CYFRA21-1浓度和对应的RLU建立的Log（X）-Log（Y）数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的CYFRA21-1含量。

本专利发明的CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优点：

（1）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于0.5ng/mL；

（2）特异性良好，本产品对神经元特异性烯醇化酶（NSE）（300 ng/mL）、癌胚抗原（CEA）（500 ng/mL）未出现交叉反应；

（3）精密性良好，批内不精密度不高于5%，批间不精密度不高于10%；

（4）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值；

（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2~8℃可存放1年。

附图说明

图1是本发明的试剂盒测定CYFRA21-1与罗氏测定CYFRA21-1的测定结果比较图，其中纵坐标为本试剂盒测得的CYFRA21-1值，横坐标为罗氏试剂盒测定CYFRA21-1值，两种方法相关系数（r）=0.9601，直线方程y=1.1034x-0.669。

具体实施方式

实施例1：制备CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒

（1）CYFRA21-1校准品的配制：

将CYFRA21-1抗原用山羊血清配制成校准品浓储液，以国家校准品进行定标，将浓储液用山羊血清稀释至工作浓度，分别为1，5，20，100，300ng/mL，即为校准品浓度；

（2）CYFRA21-1质控品的配制：

用山羊血清将上述浓储液分别稀释至3ng/mL和200ng/mL，并以国家校准品进行定标；将3ng/mL作为低值质控品，200ng/mL作为高值质控品；

（3）磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：配制1L，方法如下：

取100mL0.1M 2- 吗啉乙磺酸（MES）缓冲液，加入10mg表面联有羧基的磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mL碳二亚胺（EDC）溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的CYFRA21-1抗体的制备：

取0.5mg CYFRA21-1抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度为5-10%，缓慢振荡，避光反应3h；在上述溶液中加入250uL1M 氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3-5次；

（5）CYFRA21-1抗体酶结合物的制备：

采用改良高碘酸钠氧化法将CYFRA21-1抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:5000-8000，并加入10%酶稳定剂，储存于2~8℃；

改良过碘酸钠氧化法步骤包括：

A：HRP活化

1）配置10mg/mL HRP溶液；

2）配置12.8 mg/mL 过碘酸钠NaIO₄溶液；

3）将上述1）和2）配制溶液按体积比1：1混匀，4℃避光反应30min；

4）配置浓度为20uL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3）以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）；

B、CYFRA21-1单克隆抗体标记

1）将待标记原料装入透析袋中，用0.05 M pH9.6 的碳酸盐缓冲液，透析30min；

2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:3进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析24h（期间换液2-3次）；

3）配置浓度为2mg/mL的 NaBH₄水溶液，按1mgHRP加80uL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

4）将上述步骤3）完成的标记液用0.01M PBS 于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存；

酶稀释液中包括10mL/L 2M NaOH，15g/L NaCl，10g/LBSA，5g/L Dextran T-2000（购自Sigma公司），1.05g/L Triton X-100（购自Sigma公司），2.5mL/L硫酸庆大霉素，1mL/L胭脂红（胭脂红为粉末固体，配制成浓度40mg/mL以后使用），2g/L Tween-20（购自Sigma公司），1mL/L ProClin300（购自Sigma公司）；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L 磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和2% Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.08g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：

将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

实施例2：本发明试剂盒的检查

（1）物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损；

（2）准确性：试剂盒校准品与国家标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以CYFRA21-1国家标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90~1.10范围内；

（3）剂量-反应曲线的线性：用双读数数学模型拟合，剂量-反应曲线在0.5-300ng/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900；

（4）分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于0.5ng/mL；

（5）精密度：10孔平行测定高值和低值质控品，计算测定结果的平均浓度与标准差（SD），批内不精密度（CV %）= SD／平均浓度×100%；使用3批产品进行3次试验，计算测定结果的平均浓度与标准差（SD），批间不精密度（CV %）= SD／平均浓度×100%，结果应符合批内不精密度（CV%）应不高于5%；批间不精密度（CV%）应不高于10%；

（6）质控品的测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log (Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，低值质控品测值在2.4-3.6ng/mL，高值质控品测值在160-240ng/mL；

（7）特异性：

交叉反应符合下表要求：

交叉反应因子	浓度	测定值
			神经元特异性烯醇化酶（NSE）	300ng/mL	<0.5 ng/mL
癌胚抗原（CEA）	500ng/mL	<0.5ng/mL

（8.）稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。

实施例3：本发明试剂盒的使用方法

（1）将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟；

（2）配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃，待结晶溶解后再进行稀释；

（3）配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合；

（4）将反应管编号，向试管中依次加入25-50uL校准品或血清标本、50uL磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液、50uL生物素-CYFRA21-1抗体结合物、50-100uLCYFRA21-1抗体酶结合物，37℃下振荡反应30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，加入500uL洗液，充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加入化学发光底物液100uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光值（RLU），以校准品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Log为纵坐标，绘制标准曲线，根据血清标本的发光值即可计算出CYFRA21-1的浓度。

实施例4： 本试剂盒的方法学评价结果

检测范围：范围为1~300 ng/mL，对于浓度大于300 ng/mL的标本应先进行稀释后再进行测定；

灵敏度：0.5ng/mL；

精密度：小于5%；

准确性：回收率的平均值在0.90~1.10范围内；

特异性：与NSE、CEA的交叉反应系数小于1%；

质控品测值：低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH）的测值均在允许范围内，低值质控品测值在2.4-3.6ng/mL，高值质控品测值在160-240ng/mL；

稳定性：将试剂盒中各试剂组分于37℃下放置7d，稳定性良好。

实施例5： 本试剂盒的临床对比实验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数120例，先以CYFRA21-1罗氏检测试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，结果表明，直线方程为y = 1.1034x-0.669，相关系数R = 0.9601。可见本方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检验水准α=0.05）， P <0.001，两种方法测定的CYFRA21-1值的相关密切程度是显著性的，可见两种方法测定的CYFRA21-1值密切相关，说明试剂盒的诊断能力较强，可推广临床应用。

Claims (4)

1.一种CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1） CYFRA21-1校准品，浓度为1，5，20，100，300ng/mL；

2） 偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；

3） 生物素标记的CYFRA21-1抗体；

4）CYFRA21-1抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ ≥3.0，活性≥ 250U/mL；

5） CYFRA21-1质控品；质控品包括浓度3ng/mL的低值质控品和200ng/mL的高值质控品；

6） 化学发光液A液和B液；A液为5mmol/L， pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.08g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；

7） 20倍浓缩洗液；

8） 反应管。

2.根据权利要求1所述的CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径10-50nm。

3.根据权利要求1所述的CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

4.一种制备所述权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）CYFRA21-1校准品的配制：

将CYFRA21-1抗原用山羊血清配制成校准品浓储液，以国家校准品进行定标，将浓储液用山羊血清稀释至工作浓度，分别为1，5，20，100，300ng/mL；

（2）CYFRA21-1质控品的配制：

用山羊血清将上述浓储液分别稀释至3ng/mL和200ng/mL ，并以国家校准品进行定标；将3ng/mL作为低值质控品，200ng/mL作为高值质控品；

（3）磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

配制1L，方法如下：

取100mL0.1M MES缓冲液，加入10mg表面联有羧基的磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mLEDC溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的CYFRA21-1抗体的制备

取0.5mg CYFRA21-1抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度为5-10%，缓慢振荡，避光反应3h；在上述溶液中加入250uL1M 氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3-5次；

（5）CYFRA21-1抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将CYFRA21-1抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:5000-8000，并加入15%酶稳定剂，储存于2~8℃；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L 磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和2% Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.08g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。