CN104267182A - 同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条及其方法。所述试条的标记垫（3）包被有不同波长量子点对应标记的各肿瘤标志物抗体的混合物，分析膜（7）的T带（4）包被有各肿瘤标志物抗体的混合物，分析膜（7）的C带（5）包被有二抗。各被检物标准曲线采用电子标签进行储存并安装在试条上。所述试条采用具有信号检测功能的检测仪读取电子标签存贮的标准曲线数据并结合检测仪测得的待测样品对应的荧光强度而同步定量检测样品中的各肿瘤标志物浓度。

Description

同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条及其方法

技术领域

本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条及其方法。

背景技术

恶性肿瘤是目前病死率较高的病种之一，它给患者的生命健康造成了严重威胁,早发现、早诊断、早治疗是恶性肿瘤患者获得生存的最主要途径。测定肿瘤标志物的存在或含量，对辅助诊断肿瘤、分析病程、指导治疗、监测复发或转移、判断预后等具有重要意义和实用价值。

目前，肿瘤标志物的血清检测主要采用血清ELISA方法。该方法需要离心机先分离血清，还需要孵育箱、酶标仪等医疗设备，操作过程复杂，每次只能检测一种指标，不能随时随地检测，检测过程至少需要40-60分钟，且价格昂贵，无法满足全面高效的健康体检及临床诊断要求。

样品多种组分同步检测，特别是多种组分同步快速定量检测，对检测领域样品分析具有非常重要意义，其是人们一直追求的目标，是人们长期渴望解决而未能解决的问题。传统上测定混合体系中样品多种组分含量，多采用平行单组分分析法，即每个分析流程只测定其中一种组分含量，多次平行执行该流程，最后得到所有所需组分含量。分析所需时间长，消耗试剂多，分析通量低，劳动量大。

近年发展的纳米量子点（quantum dot, QD）荧光发光效率高，激发谱线范围宽，能“一元激发，多元发射”，发射谱线范围窄且对称，光漂白速度慢，荧光寿命长，粒径与生物分子相近，表面修饰后能多功能化，不同粒径和种类的量子点混合物产生的特征波长荧光光谱不交叠，非常适用于样品多组分分析。

本发明公开一种同步定量多种肿瘤标志物的QD免疫层析试条及其方法，以解决血液样品肿瘤标志物多指标同步快速定量问题。

发明内容

本发明的第一个目的是公开一种同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条。本发明的第二个目的是公开所述试条的制备方法、标准曲线制作方法、以及用所述试条同步定量血液样品肿瘤标志物多指标的方法。

本发明上述目的是通过如下技术方案实现的：

所述的同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条，包括顺次搭接固定在底衬8上的样品垫1、红细胞滤膜2、标记垫3、分析膜7、吸水垫6。

所述标记垫3为玻璃纤维膜。所述分析膜7为硝酸纤维素膜、尼龙膜、或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜，其上具有检测带（即T带）4和质控带（即C带）5。所述底衬8为聚脂或塑料板。

所述标记垫3包被有不同波长量子点对应标记的各肿瘤标志物抗体的混合物。所述分析膜7的T带4包被有各肿瘤标志物抗体的混合物。所述分析膜7的C带5包被有质控物二抗。

本发明所述试条的标记垫3的量子点包括ZnS、CdS、HgS、ZnSe、CdSe、HgSe、CdTe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/PbS、CdS/Cd(0H)₂、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CuSe、CdSe/HgTe、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/InP、InAs/CdSe、InAs/ZnSe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SeTe、BaS、BaSe、BaTe、CdS:Mn、ZnS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb中的任意一种或任意几种纳米粒子的组合，以及由上述任意一种量子点为核、二氧化硅为壳的核-壳型纳米复合粒子。

本发明所述同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条的制备方法包括下述步骤： 

A. 量子点偶联抗体：

a) 取不同波长量子点分别用磷酸缓冲液（PBS）调pH=6-9，加入EDC（l-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐）和NHS（N-羟基硫代琥珀酸亚胺）室温活化10-60min。

b) 分别对应加入各肿瘤标志物的相应抗体旋涡振荡反应0.5-3h。

c) 分别对应加入BSA封闭反应0.5-2h。

d) 离心纯化产物。

e) 取沉淀用PBS缓冲液重悬分散，4℃保存。

B. 试条组件制备：

a) 样品垫1:  选用纤维素膜切成一定规格的膜块，将该膜块放入含有0.1%-10%BSA和0.01%-10%Tween 20的PBS中浸泡，取出，干燥备用。

b) 红细胞滤膜2：选红细胞滤膜切成一定规格膜块，干燥备用。

c) 标记垫3：选用玻璃纤维膜切成一定规格膜块，加入用不同波长量子点对应标记的各肿瘤标志物抗体的混合物溶液于该膜块上，干燥膜块备用。

d) 分析膜7： 选用纤维素膜切成一定规格的膜块，自膜块底边起由下自上相隔一定距离分别喷点0.5-10mg/ml各肿瘤标志物抗体的混合物作T带4，喷点0.5-10mg/ml二抗作C带5，干燥膜块备用。

e) 吸水垫6： 选用具有吸水作用的纤维素膜切成一定规格的膜块，干燥备用。

C. 试条组件组装：

上述制备好的试条组件按样品垫1、红细胞滤膜2、标记垫3、分析膜7、吸水垫6顺次搭接粘贴于底衬8上，切成一定规格的试条，装入塑料盒中，与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。

本发明所述量子点免疫层析试条同步定量多种肿瘤标志物用的标准曲线的制备方法包括如下步骤：

（a）配制各肿瘤标志物标准品系列浓度，并滴加到所述的量子点免疫层析试条上。

（b）用检测仪分别读取T带的荧光强度（OD_t）和C带的荧光强度（OD_c），计算获得OD_t/OD_c比值或OD_t/（OD_t+OD_c）比值。

（c）以标准品系列浓度作X轴，OD_t/OD_c比值作Y轴，或以标准品系列浓度作X轴，OD_t/（OD_t+OD_c）比值作Y轴，得到荧光强度与浓度对应标准曲线。

本发明所述试条用于同步定量多种肿瘤标志物的方法包括如下步骤：

（a）用电子标签存贮标准曲线数据。所述电子标签包括具有信息存贮功能的RFID（射频识别标签）、二维码、条码、或IC卡芯片。

（b）存贮有标准曲线数据的电子标签安装在量子点免疫层析试条上，或安装在装载试条的试条盒上。

（c）用具有信号检测功能的检测仪读取电子标签存贮的标准曲线数据并结合检测仪测得的待测样品对应的荧光强度而得到样品中的各肿瘤标志物浓度。

本发明具有如下有益效果：

（1）一次加样即可实现样品肿瘤标志物多指标同步快速定量检测。

（2）所述试条的样品垫1与标记垫3之间设有红细胞滤膜2，该红细胞滤膜（2）可能阻止血液中的红细胞通过而只能让其血清滤过，血液样品毋需用离心设备等分离血清，用全血就能直接进行检测。

附图说明

图1：本发明所述同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条的结构侧视图

图2：本发明所述量子点免疫层析试条用于同步定量检测肿瘤标志物AFP（甲胎蛋白）和CEA（癌胚抗原）而得到的标准曲线

图3：本发明所述量子点免疫层析试条用于同步定量检测AFP和CEA而得到的荧光光谱图

上述图1-2中，T表示检测带（Test），C表示质控带（Control）

序号表示如下：

1.样品垫，2.红细胞滤膜，3.标记垫，4.检测带，5.质控带，6.吸水垫，7.分析膜，8.底衬。

具体实施方式

实施例：同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条用于同步定量检测血液肿瘤标志物AFP、CEA

1.试条结构

结合图1予以说明。图1中，所述的同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条，其包括顺次搭接固定在底衬8上的样品垫1、红细胞滤膜2、标记垫3、分析膜7、吸水垫6。

所述试条的标记垫3为玻璃纤维膜。所述分析膜7为硝酸纤维素膜、尼龙膜、或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜，其上具有检测带（即T带）4和质控带（即C带）5。所述底衬8为聚脂或塑料板。

所述标记垫3包被有CdSe/ZnS QD₅₄₆标记的AFP单抗（即anti-AFP McAb-QD₅₄₆）和CdSe/ZnS QD₆₂₂标记的CEA单抗（即anti-CEA McAb-QD₆₂₂）的混合物。所述分析膜7的T带4包被有AFP抗体（anti-AFP）和CEA抗体（anti-CEA）的混合物。所述分析膜7的C带5包被有二抗质控物羊抗鼠抗体。

试条制备方法

所述试条的制备方法包括如下步骤：

A. 量子点偶联抗体：

a) 取发射波长为546nm和622nm的水溶性CdSe/ZnS QD₅₄₆、CdSe/ZnS QD₆₂₂分别用PBS缓冲液调pH=6-9，分别加入EDC（l-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐）和NHS（N-羟基硫代琥珀酸亚胺）室温活化10-60min；

b) 分别加入AFP 单抗（即anti-AFP McAb）、CEA 单抗（anti-CEA McAb）旋涡振荡反应0.5-3h；

c) 分别加入牛血清白蛋白（BSA），避光封闭反应0.5-2h;

d) 离心纯化各产物;

e) 取各产物沉淀分别用PBS缓冲液重悬分散，得到anti-AFP McAb-QD₅₄₆、anti-CEA McAb-QD₆₂₂各量子点偶联物溶液。4℃保存各量子点偶联物溶液。

B. 试条组件制备：

a) 样品垫1:  选用纤维素膜作材料，将其切成具有一定规格的膜块，将该膜块放入含有0.1%-10%BSA和0.01%-10%Tween 20的磷酸缓冲液（PBS）中浸泡，取出，干燥备用。

b) 红细胞滤膜2：选红细胞滤膜切成一定规格膜块，干燥备用。

c) 标记垫3：选用玻璃纤维膜作材料，将其切成具有一定规格的膜块，加CdSe/ZnS QD₅₄₆标记的AFP 单抗（即anti-AFP McAb-QD₅₄₆）和CdSe/ZnS QD₆₂₂标记的CEA单抗（即anti-CEA McAb-QD₆₂₂）的混合物溶液于该膜块上，干燥膜块备用。

d) 分析膜7： 选用硝酸纤维素膜（NC膜）作材料，将其切成具有一定规格的膜块，自膜块底边起由下自上相隔一定距离分别喷点0.5-10mg/ml AFP抗体（anti-AFP）和0.5-10mg/ml CEA抗体（anti-CEA）的混合物作T带4，喷点0.5-10mg/ml二抗质控物羊抗鼠抗体作C带5，干燥膜块备用。

e) 吸水垫6： 选用具有吸水作用的纤维素膜切成一定规格的膜块，干燥备用。

C. 试条组件组装

上述制备好的试条组件按样品垫1、红细胞滤膜2、标记垫3、分析膜7、吸水垫6顺次相互搭接粘贴于塑料底衬8上，切成一定规格的试条，装入塑料盒中，与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。

试条标准曲线建立

（a）取AFP、CEA标准品分别用磷酸缓冲液（PBS）以倍比稀释方式配成标准品系列浓度若干份。

（b）将每一标准品浓度分别滴加在10条量子点免疫层析试条上在相同条件下用检测仪进行检测（即：每一标准品浓度分别用10条量子点免疫层析试条在相同条件下用检测仪检测10次），分别读得其T带荧光强度（OD_t）与C带荧光强度（OD_c），得到平均值和OD_t/OD_c比值。

（c）以标准品系列浓度作X轴，以OD_t/OD_c比值作Y轴，得到荧光强度与浓度对应标准曲线见图2。

也可以标准品系列浓度作X轴，以OD_t/（OD_t+OD_c）比值作Y轴，得到荧光强度与浓度对应标准曲线，本实施例未显示。

用量子点免疫层析试条同步定量检测AFP、CEA

方法如下：

（a）用RFID电子标签（射频识别标签）存贮标准曲线数据（该标准曲线数据也可采用二维码、条码、或IC卡芯片等存贮介质进行储存，本实施例未显示）。

（b）存贮有标准曲线数据的RFID电子标签贴附于试条上，或直接贴附在装载试条的试条盒上。

（c）用具有信号检测功能的检测仪读取RFID电子标签存贮的标准曲线数据并结合检测仪测得的待测样品对应的荧光强度而得到样品中的AFP、CEA浓度。

图3所示本发明所述量子点免疫层析试条同步定量检测血液肿瘤标志物AFP、CEA时T带所测得的荧光光谱图。其中Ⅰ为AFP的量子点（CdSe/ZnS QD₅₄₆）荧光峰、Ⅱ为CEA的量子点（CdSe/ZnS QD₆₂₂）荧光峰。

特别需要指出的是：（1）本发明实施例及其附图仅是为了说明本发明，本领域人员不应以此限制本发明的保护范围；（2）本发明所述同步定量肿瘤多指标的量子点免疫层析试条及其方法理所当然包括由相同试条结构、原理和方法所实现的肿瘤标志物单项指标检测；（3）本发明还可以有其它改进方法。因此，凡是对本发明所述试条及其方法采用任何等同替换或等效变换形成的其它技术方案，均落在本发明权利要求的保护范围中。

Claims (7)

1.一种同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条，包括顺次搭接固定在底衬（8）上的样品垫（1）、红细胞滤膜（2）、标记垫（3）、分析膜（7）、吸水垫（6），分析膜（7）具有T带（4）和C带（5），其特征在于：标记垫（3）包被有不同波长量子点对应标记的各肿瘤标志物抗体的混合物，分析膜（7）的T带（4）包被有各肿瘤标志物抗体的混合物，分析膜（7）的C带（5）包被有二抗。

2.根据权利要求1所述的同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条，其特征在于：所述标记垫（3）的量子点包括ZnS、CdS、HgS、ZnSe、CdSe、HgSe、CdTe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/PbS、CdS/Cd(0H)₂、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CuSe、CdSe/HgTe、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/InP、InAs/CdSe、InAs/ZnSe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SeTe、BaS、BaSe、BaTe、CdS:Mn、ZnS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb中的任意一种或任意几种纳米粒子的组合，以及由上述任意一种量子点为核、二氧化硅为壳的核-壳型纳米复合粒子。

3.根据权利要求1所述的同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条，其特征在于：所述标记垫（3）为玻璃纤维膜，所述分析膜（7）为硝酸纤维素膜、尼龙膜、或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜，底衬（8）为聚脂或塑料板。

4.一种如权利要求1所述的同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

A. 量子点偶联抗体：

a) 取不同波长量子点分别用PBS缓冲液调pH=6-9，加入EDC（l-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐）和NHS（N-羟基硫代琥珀酸亚胺）室温活化10-60min；

b) 分别对应加入各肿瘤标志物的相应抗体旋涡振荡反应0.5-3h；

c) 分别对应加入BSA封闭反应0.5-2h;

d) 离心纯化产物;

e) 取沉淀用PBS缓冲液重悬分散，4℃保存;

B. 试条组件制备：

a) 样品垫（1）:  选用纤维素膜切成一定规格的膜块，将该膜块放入含有0.1%-10%BSA和0.01%-10%Tween 20的PBS中浸泡，取出，干燥备用；

b) 红细胞滤膜（2）：选红细胞滤膜切成一定规格膜块，干燥备用；

c) 标记垫（3）：选用玻璃纤维膜切成一定规格膜块，加入用不同波长量子点对应标记的各肿瘤标志物抗体的混合物溶液于该膜块上，干燥膜块备用；

d) 分析膜（7）： 选用纤维素膜切成一定规格的膜块，自膜块底边起由下自上相隔一定距离分别喷点0.5-10mg/ml各肿瘤标志物抗体的混合物作T带（4），喷点0.5-10mg/ml二抗作C带（5），干燥膜块备用；

e) 吸水垫（6）： 选用具有吸水作用的纤维素膜切成一定规格的膜块，干燥备用；

C. 试条组件组装：

上述制备好的试条组件按样品垫（1）、红细胞滤膜（2）、标记垫（3）、分析膜（7）、吸水垫（6）顺次搭接粘贴于底衬（8）上，切成一定规格的试条，装入塑料盒中，与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。

5.一种如权利要求1所述的同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条用于同步定量多种肿瘤标志物的标准曲线的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

（a）配制各肿瘤标志物标准品系列浓度，并滴加到所述的同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条上;

（b）用检测仪分别读取T带的荧光强度（OD_t）和C带的荧光强度（OD_c），计算获得OD_t/OD_c比值或OD_t/（OD_t+OD_c）比值;

（c）以标准品系列浓度作X轴，OD_t/OD_c比值作Y轴，或以标准品系列浓度作X轴，OD_t/（OD_t+OD_c）比值作Y轴，得到荧光强度与浓度对应标准曲线。

6.一种如权利要求1所述的同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条用于同步定量多种肿瘤标志物的方法，其特征在于，该定量方法包括下述步骤：

（a）用电子标签存贮标准曲线数据；

（b）存贮有标准曲线数据的电子标签安装在所述量子点免疫层析试条上，或安装在装载试条的试条盒上；

（c）用具有信号检测功能的检测仪读取电子标签存贮的标准曲线数据并结合检测仪测得的待测样品对应的荧光强度而得到样品中的各肿瘤标志物浓度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述的电子标签包括具有信息存贮功能的RFID、二维码、条码、或IC卡芯片。