WO2010137532A1 - 検出対象の検出方法及び定量方法 - Google Patents

検出対象の検出方法及び定量方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010137532A1
WO2010137532A1 PCT/JP2010/058651 JP2010058651W WO2010137532A1 WO 2010137532 A1 WO2010137532 A1 WO 2010137532A1 JP 2010058651 W JP2010058651 W JP 2010058651W WO 2010137532 A1 WO2010137532 A1 WO 2010137532A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substance
detection target
binding
responsive polymer
affinity
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/058651
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
克彦 木次
悟 杉田
大西　徳幸
Original Assignee
チッソ株式会社
オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by チッソ株式会社, オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 filed Critical チッソ株式会社
Priority to CA2763856A priority Critical patent/CA2763856C/en
Priority to JP2011516004A priority patent/JP5329658B2/ja
Priority to US13/322,809 priority patent/US9063144B2/en
Priority to CN201080023788.8A priority patent/CN102483409B/zh
Priority to EP10780487A priority patent/EP2437059A4/en
Publication of WO2010137532A1 publication Critical patent/WO2010137532A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a detection method and a quantification method of a detection target.
  • a latex agglutination method has been used as a method for detecting a detection target in a specimen.
  • the latex agglutination method is a method for detecting the antigen in a fluid such as a biological sample by mixing a latex carrying an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the antigen with the fluid to determine the degree of latex aggregation.
  • This is a method for detecting or quantifying an antigen by measuring (for example, see Patent Document 1).
  • an antigen added as a specimen crosslinks a plurality of latex-bound antibodies to promote latex agglutination. Since the procedure is simple as described above, the antigen can be detected easily and rapidly. However, when the antigen is in a trace amount, the crosslinking is difficult to occur, so that the latex does not sufficiently aggregate. For this reason, it was difficult to detect a trace amount of antigen.
  • ELISA and CLEIA enzyme substrate reactions
  • a primary antibody that specifically binds to an antigen is bound to the antigen
  • a secondary antibody having an enzyme is bound to the primary antibody.
  • the antigen is detected or quantified by adding the enzyme substrate and measuring the degree of reaction catalyzed by the enzyme.
  • the detection sensitivity of luminescence after the addition of the substrate is high, so that a trace amount of antigen can be detected.
  • this method consists of multiple steps such as a step of incubating the sample and each reagent, a step of washing the system, and a step of measuring luminescence, and the operation is complicated. Moreover, the time required for each stage is extremely long, and is not suitable for large-scale processing.
  • the present inventors use a bound substance in which a substance containing a stimulus-responsive polymer and an affinity substance for a detection target are bound, and a bound substance in which a charged substance and an affinity substance for the detection target are bound.
  • a detection and quantification technique for the detection target International Publication WO2008 / 001868 pamphlet.
  • this technique it was determined that the degree of aggregation of the stimuli-responsive polymer was reduced by measuring the turbidity after placing the mixture of the above-mentioned two kinds of conjugates and the specimen under conditions where the stimuli-responsive polymer aggregated. If it is detected, it is determined that the detection target exists in the sample.
  • this technique it is achieved using only a substance containing a stimuli-responsive polymer, an affinity substance, and a substance having a charge, and is performed without using any special reagent, so that it is inexpensive and simple.
  • it is only a measure of the degree of aggregation inhibition, and since it is not a system that utilizes a reaction catalyzed by an enzyme, it can be carried out rapidly.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a detection method and a quantification method of a detection target capable of detecting and quantifying a detection target quickly, inexpensively, simply and with high accuracy in various environments. Let it be an issue.
  • the present inventors have found that when a mixture of two kinds of conjugates and a specimen is developed on a development carrier, the signal resulting from the presence of the conjugate on the development carrier varies greatly depending on the presence or absence of the detection target.
  • the present invention has been completed. Specifically, the present invention has the following configuration.
  • a method for detecting a detection target in a sample A first binding material in which a first substance containing a stimulus-responsive polymer and a first affinity substance for the detection target are bound; a second substance having hydrophilicity; and a second affinity for the detection target A second binding substance bound with a sex substance and the specimen are mixed, The obtained mixture is subjected to a condition where the stimulus-responsive polymer aggregates, and the mixture is developed on a developing carrier, or the obtained mixture is developed on a developing carrier, and the stimulus-responsive polymer aggregates the mixture.
  • the signal resulting from the presence of the first binding substance or the second binding substance in the development carrier is confirmed, and when the signal is different from that in the absence of the detection target, the detection target is present in the sample. Then, it is a method including a step of determining, A method in which a first affinity substance and a second affinity substance can bind to different sites to be detected. [2] The method according to [1], wherein when the intensity of a signal due to the presence of the first binding substance is weaker than that in the absence of the detection target, it is determined that the detection target exists in the specimen.
  • a method for quantifying a detection target in a sample A first binding material in which a first substance containing a stimulus-responsive polymer and a first affinity substance for the detection target are bound; a second substance having hydrophilicity; and a second affinity for the detection target A second binding substance bound with a sex substance and the specimen are mixed, The obtained mixture is subjected to a condition where the stimulus-responsive polymer aggregates, and the mixture is developed on a developing carrier, or the obtained mixture is developed on a developing carrier, and the stimulus-responsive polymer aggregates the mixture.
  • the method includes a step of calculating the amount of the detection target in A method in which a first affinity substance and a second affinity substance can bind to different sites to be detected. [5] The method according to [4], wherein a signal due to the presence of aggregates of the first conjugate is measured. [6] The mixture is developed on the development carrier after removing aggregates of the first binding substance, The method according to [4], wherein the intensity of the signal resulting from the presence of the first conjugate is measured.
  • the first conjugate has colored particles; The method according to any one of [1] to [6], wherein the signal depends on a color based on the presence of the colored particles.
  • the first binding substance or the second binding substance has a substance that develops color or emits light on the development carrier, The method according to any one of [1] to [7], wherein the signal depends on a color or light based on the presence of the substance that develops or emits light.
  • a kit for detecting and / or quantifying a detection target A first binding substance in which a first substance containing a stimulus-responsive polymer and a first affinity substance for the detection target are bound; a second substance having hydrophilicity; and a second affinity for the detection target A second binding substance bound with a sex substance;
  • a kit comprising: a development carrier for developing the conjugate.
  • the kit according to [9] wherein the first combined product has colored particles.
  • the first binding substance or the second binding substance has a substance that develops color or emits light on the development carrier.
  • the first affinity substance and the second affinity substance are bound to the binding target. Therefore, the stimulus-responsive polymer bound to the first affinity substance;
  • the second substance bound to the second affinity substance approaches.
  • a charge part or a hydrophilic part is arrange
  • the signal when the mixture is spread on the development carrier changes according to the amount of the detection target, the detection target can be easily detected or quantified based on the presence or absence and degree of this change. .
  • FIG. 7 is a cross-sectional view taken along the line VII-VII of the deployment device of FIG. It is a figure which shows the change of the expansion
  • the first binding substance is a combination of the first substance containing the stimulus-responsive polymer and the first affinity substance for the detection target.
  • the first substance used in the present invention is a substance containing a stimulus-responsive polymer, and this stimulus-responsive polymer undergoes a structural change in response to an external stimulus and is a polymer capable of adjusting aggregation and dispersion.
  • the stimulus include, but are not limited to, temperature change, light irradiation, acid or base addition (pH change), electric field change, and the like.
  • a temperature-responsive polymer that can be aggregated and dispersed by temperature change can be used.
  • the temperature-responsive polymer include a polymer having a lower critical solution temperature (hereinafter also referred to as LCST) and a polymer having an upper critical solution temperature (hereinafter also referred to as UCST).
  • LCST lower critical solution temperature
  • UCST upper critical solution temperature
  • a polymer having a lower critical solution temperature with an LCST of 37 ° C. is completely dispersed in an aqueous solution having a temperature lower than the LCST, and can be agglomerated immediately when the water temperature is raised above the LCST.
  • a polymer having an upper critical solution temperature with a UCST of 5 ° C. is completely dispersed in an aqueous solution having a temperature exceeding the UCST, and can be immediately aggregated when the water temperature is lowered below the UCST.
  • Examples of the polymer having a lower critical solution temperature used in the present invention include Nn-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-ethylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-acryloylpyrrolidine, N-acryloylpiperidine, N -N substitution such as acryloylmorpholine, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-ethylmethacrylamide, N, N-dimethylmethacrylamide, N-methacryloylpyrrolidine, N-methacryloylpiperidine, N-methacryloylmorpholine Polymer composed of (meth) acrylamide derivative; hydroxypropyl cellulose, polyvinyl alcohol partially acetylated product, polyvinyl methyl ether, (polyoxyethylene-polyoxypro Len) block copolymers, polyoxyethylene alkylamine derivatives such as polyoxyethylene laurylamine
  • copolymers comprising these polymers and at least two of these monomers can also be used.
  • a copolymer of N-isopropylacrylamide and Nt-butylacrylamide can also be used.
  • another copolymerizable monomer may be copolymerized with the polymer within a range having a lower critical solution temperature.
  • an elastin-derived polypeptide having a repeating sequence of a pentapolypeptide represented by Val-Pro-Gly-X-Gly (X is an amino acid other than proline) can be preferably used.
  • a polymer having the upper critical solution temperature used in the present invention a polymer comprising at least one monomer selected from the group consisting of acryloylglycinamide, acryloylnipecotamide, acryloylasparagineamide, acryloylglutamineamide, and the like can be used. Moreover, the copolymer which consists of these at least 2 types of monomers may be sufficient.
  • These polymers include other copolymerizable monomers such as acrylamide, acetylacrylamide, biotinol acrylate, N-biotinyl-N′-methacryloyl trimethylene amide, acryloyl sarcosine amide, methacryl sarcosine amide, acryloylmethyl uracil, etc. May be copolymerized within the range having the upper critical solution temperature.
  • a pH-responsive polymer that can be aggregated and dispersed by changing pH can be used as the stimulus-responsive polymer.
  • the pH at which the pH-responsive polymer undergoes a structural change is not particularly limited, but it can suppress a decrease in detection and quantification accuracy due to denaturation of the first bound substance, the second bound substance described later, and the specimen at the time of applying the stimulus.
  • pH 4 to 10 is preferable, and pH 5 to 9 is more preferable.
  • Examples of such a pH-responsive polymer include polymers containing groups such as carboxyl, phosphoric acid, sulfonyl and amino as functional groups. More specifically, (meth) acrylic acid, maleic acid, styrene sulfonic acid, 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid, phosphorylethyl (meth) acrylate, aminoethyl methacrylate, aminopropyl (meth) acrylamide, dimethylamino
  • a monomer having a dissociating group such as propyl (meth) acrylamide may be polymerized, and the monomer having such a dissociating group and other vinyl monomers such as methyl (meta ) (Meth) acrylates such as acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate, vinyl compounds such as styrene, vinyl chloride and N-viny
  • the first substance may contain fine particles carrying a stimulus-responsive polymer and an affinity substance described below.
  • the microparticles used here are smaller than the pore diameter of the development carrier described later alone, and larger than the pore diameter of the development carrier when aggregated, so that the signal on the development carrier changes depending on the degree of aggregation.
  • the specific composition thereof is not particularly limited as long as it can support the stimulus-responsive polymer and the affinity substance.
  • the fine particles In the conventional latex agglutination method, latex agglomerates in accordance with the presence of a detection target, and it is necessary to detect the agglomeration. In order to improve detection sensitivity, it is preferable that the fine particles have a large particle diameter. In contrast, in the method of the present invention, the smaller the particle size, the larger the specific surface area per unit volume, and the more effective inhibition of aggregation of the stimuli-responsive polymer due to increased binding of the detection target. It is preferable that the particle diameter of this is small. However, the average particle diameter of the fine particles needs to be set so as to be smaller than the pore diameter of the developing carrier when not aggregated and larger than the pore diameter of the developing carrier when aggregated.
  • the average particle size of the fine particles may be appropriately set in consideration of the efficiency of aggregation inhibition, the aggregation method (particularly the change in diameter), the pore size of the developing carrier, and the like.
  • the lower limit of the average particle diameter is preferably 0.001 ⁇ m, more preferably 0.010 ⁇ m, most preferably 0.1 ⁇ m
  • the upper limit is preferably 0.5 ⁇ m, more preferably. Is 0.3 ⁇ m, most preferably 0.2 ⁇ m.
  • the fine particles are preferably colored particles in that they form a color-dependent signal when developed on a development carrier, and the signal can be easily confirmed or measured.
  • the colored particles are not particularly limited, and may be metal colloid particles (for example, gold colloid particles), synthetic polymers such as polystyrene latex, homogeneous spherical particles made of natural polymers such as gelatin, and the like.
  • the first bound product can be used not only for the method of the present invention but also for the detection method described in International Publication WO2008 / 001868 pamphlet. In this case, by separating the aggregates by applying magnetic force, The detection accuracy can be improved (for details, see WO2008 / 001868). Therefore, in order to improve versatility, the fine particles preferably include a magnetic substance, and the magnetic substance may be composed of a polyhydric alcohol and magnetite.
  • the polyhydric alcohol is not particularly limited as long as it is an alcohol structure having at least two hydroxyl groups as a structural unit and capable of binding to iron ions, and examples thereof include dextran, polyvinyl alcohol, mannitol, sorbitol, and cyclodextrin. .
  • dextran polyvinyl alcohol
  • mannitol mannitol
  • sorbitol sorbitol
  • cyclodextrin cyclodextrin.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-82538 discloses a method for producing a particulate magnetic material using dextran.
  • the compound which has an epoxy like a glycidyl methacrylate polymer and forms a polyhydric alcohol structure after ring-opening can also be used.
  • the first affinity substance may be, for example, a monoclonal antibody that recognizes different antigenic determinants to be detected.
  • the antibody used herein may be any type of immunoglobulin molecule, and may be an immunoglobulin molecule fragment having an antigen binding site such as Fab.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the first binding substance is prepared by binding the first substance and the first affinity substance.
  • the binding method is not particularly limited.
  • substances having affinity for each other on both the first substance side for example, stimulus-responsive polymer portion
  • the first affinity substance for example, first antibody
  • avidin and biotin, glutathione and glutathione S-transferase are bound, and the first substance and the first affinity substance are bound via these substances.
  • biotin is bonded to the stimulus-responsive polymer by adding biotin or the like to a polymerizable functional group such as methacryl or acryl to form an addition polymerizable monomer. It can be carried out by copolymerizing with other monomers.
  • the binding of avidin or the like to the first affinity substance can be performed according to a conventional method.
  • the biotin-binding stimulus-responsive polymer and the avidin-bonded first affinity substance are mixed, the first affinity substance and the stimulus-responsive polymer are bonded through the bond between avidin and biotin.
  • a monomer having a functional group such as carboxyl, amino or epoxy is copolymerized with another monomer during the production of the polymer, and through this functional group, an antibody affinity substance (for example, according to methods well known in the art)
  • an antibody affinity substance for example, according to methods well known in the art
  • a method of binding melon gel, protein A, protein G to a polymer can be used.
  • a first bound product of the stimulus-responsive polymer and the first antibody against the antigen to be detected is produced.
  • a monomer having a functional group such as carboxyl, amino, or epoxy may be copolymerized with another monomer during the production of the polymer, and the first antibody against the antigen to be detected may be directly bonded to these functional groups according to a conventional method. Good.
  • the first affinity substance and the stimulus-responsive polymer may be bound to the fine-particle magnetic substance.
  • the first bound substance may be purified by subjecting the first substance to conditions where the stimulus-responsive polymer aggregates and then separating by centrifugation.
  • a magnetic substance in the form of fine particles is bound to the stimulus-responsive polymer, and after the first affinity substance is further bound, the magnetic force is applied under the condition that the stimulus-responsive polymer aggregates. Then, the magnetic material may be recovered by a method.
  • the fine magnetic substance can be bonded to the stimulus-responsive polymer via a reactive functional group, or a polymerizable unsaturated bond is introduced into the active hydrogen or polyhydric alcohol on the polyhydric alcohol in the magnetic substance.
  • the graft polymerization may be carried out by a method known in the art such as graft polymerization (for example, ADV.Polym.Sci., Vol.4, p111, 1965, J. Polymer Sci., Part-A, 3, p1031). 1965).
  • the second substance having hydrophilicity is, for example, a polymer compound having a charge, and is preferably a polyanion or a polycation.
  • the polyanion means a substance having a plurality of anion groups
  • the polycation means a substance having a plurality of cation groups.
  • Examples of polyanions include nucleic acids such as DNA and RNA. These nucleic acids have the properties of polyanions due to the presence of a plurality of phosphodiester groups along the nucleic acid urn.
  • the polyanion includes a polymer containing a large number of carboxyl-containing polypeptides (polypeptides consisting of amino acids such as glutamic acid and aspartic acid), polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polysulfonic acid, and acrylic acid or methacrylic acid as polymerization components. Also included are polysaccharides such as carboxymethylcellulose, hyaluronic acid, and heparin.
  • examples of the polycation include polylysine, polyarginine, polyornithine, polyalkylamine, polyethyleneimine, and polypropylethyleneimine.
  • the number of functional groups of the polyanion (carboxyl) or polycation (amino) is preferably 25 or more.
  • latex particles having a carboxyl group are also exemplified.
  • the second substance having hydrophilicity is, for example, a water-soluble polymer compound, a polymer containing an ether bond such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyethylene oxide, or polypropylene oxide, or an alcoholic hydroxyl group such as polyvinyl alcohol.
  • water-soluble polysaccharides such as dextran, cyclodextrin, agarose and hydroxypropylcellulose, polypeptides containing neutral amino acids, and the like.
  • hydrophilic substances may have a functional group or the like for binding the second affinity substance in or at the end of the polymer chain.
  • the 2nd substance which has hydrophilicity may be utilized individually by 1 type, or multiple may be mixed and utilized.
  • the second affinity substance is capable of binding to the same detection target as the first affinity substance at a site different from the first affinity substance.
  • the first affinity substance and the second affinity substance may be, for example, monoclonal antibodies that recognize different antigenic determinants to be detected.
  • the second binding substance is created by directly or indirectly binding the second substance and the second affinity substance.
  • substances that are compatible with each other for example, avidin and biotin, glutathione, and glutathione S-transferase
  • the second substance side and the second affinity substance eg, second antibody
  • the second substance and the second affinity substance are indirectly bound via these substances.
  • the second substance and the second affinity substance may be bound via a functional group.
  • a functional group the method of Gosh et al .: Bioconjugate Chem., 1, 71-76, 1990). Specifically, there are the following two methods.
  • a mercapto group also known as a sulfhydryl group
  • EMCS 6-maleimidohexanoic acid succinimide ester
  • a mercapto group is introduced at the 5 ′ end of the nucleic acid in the same manner as in the first method, and N, N-1,2-phenylenedioxide, which is a homobifunctional reagent, is further introduced into this mercapto group.
  • N, N-1,2-phenylenedioxide which is a homobifunctional reagent
  • maleimide By reacting with maleimide, a maleimide group is introduced at the 5 ′ end of the nucleic acid, while a mercapto group is introduced into the antibody.
  • these two substances are bonded through a mercapto group and a maleimide group.
  • nucleic Acids Research Vol. 15 5275 (1987) and Nucleic Acids Research Vol. 16 3671 (1988) are known. Yes. These techniques can be applied to the binding of nucleic acids and antibodies.
  • a mercapto group is first introduced into the 5'-terminal hydroxyl group of an oligonucleotide by reacting the oligonucleotide with cystamine, carbodiimide and 1-methylimidazole. After purifying the oligonucleotide with a mercapto group introduced, it is reduced with dithiothreitol, followed by the addition of 2,2'-dipyridyl disulfide to introduce a pyridyl group via a disulfide bond at the 5 'end of the oligonucleotide. To do.
  • a mercapto group is introduced by reacting iminothalylene.
  • the oligonucleotide into which the pyridyl disulfide is introduced and the protein into which the mercapto group is introduced are mixed, and the protein and the oligonucleotide are bound by specifically reacting the pyridyl group and the mercapto group.
  • dithio-bis-propionic acid-N- Hydroxysuccinimide ester (abbreviation: dithio-bis-propionyl-NHS) is reacted.
  • dithiothreitol is added to reduce the disulfide bond in the dithio-bis-propionyl-NHS molecule and introduce a mercapto group at the 3 'end of the oligonucleotide.
  • a heterobifunctional cross-linking agent as shown in JP-A-5-48100 is used.
  • a heterobicycle having a first reactive group (succinimide) that can react with a functional group (for example, an amino group) in a protein and a second reactive group (for example, maleimide) that can react with a mercapto group By reacting the protein with a functional cross-linking agent, a second reactive group is introduced into the protein to obtain a protein reagent activated in advance. The protein reagent thus obtained is covalently bound to the mercapto group of the thiolated polynucleotide.
  • a second conjugate can be produced by the same operation as described above by introducing a mercapto group at the terminal or the like.
  • the stimulus-responsive polymer is the charge part or hydrophilic part of the detection target.
  • the dispersion is inhibited by aggregation.
  • the stimulus-responsive polymer aggregates without being inhibited from aggregation.
  • the first bound substance, the second bound substance, and the specimen may be mixed at the same time or may be mixed separately one by one.
  • the first conjugate 10 contains a stimulus-responsive polymer 11, and this stimulus-responsive polymer 11 binds to the first antibody 13 against the detection target 50 via avidin 15 and biotin 17.
  • the first bonded material 10 includes a particulate magnetic material 19, and the stimulus-responsive polymer 11 as the first material is bonded to the surface of the magnetic material 19.
  • the second conjugate 20 the second antibody 23 against the detection target 50 and the second substance 21 are bound. Since the first antibody 13 and the second antibody 23 can bind to different parts of the detection target 50, they can bind to the same detection target 50.
  • the second combined substance 20 can approach the magnetic substance 19 via the detection target 50 and the stimulus-responsive polymer 11, and at this time, the second substance 21 is located in the vicinity of the magnetic substance 19.
  • the charge of the second combined product 20 Although the configuration is such that the portion or the hydrophilic portion is positioned in the vicinity of the magnetic substance 19, the configuration is not limited to this, and a configuration in which the charge portion or the hydrophilic portion to be detected is positioned in the vicinity of the magnetic substance 19 may be used.
  • the container containing the mixed solution may be transferred to a constant temperature bath at a temperature at which the temperature-responsive polymer aggregates.
  • temperature-responsive polymers There are two types of temperature-responsive polymers: a polymer having an upper critical solution temperature (hereinafter sometimes abbreviated as “UCST”) and a polymer having a lower critical solution temperature (hereinafter sometimes abbreviated as “LCST”).
  • UCST upper critical solution temperature
  • LCST lower critical solution temperature
  • the temperature-responsive polymer can be agglomerated by transferring the container containing the mixed solution to a constant temperature bath of 37 ° C. or higher. .
  • the temperature-responsive polymer can be agglomerated by moving the container containing the mixed solution to a thermostatic bath of less than 5 ° C. .
  • LCST decreases with increasing salt concentration around the temperature-responsive polymer. For this reason, it is also possible to agglomerate the temperature-responsive polymer at a constant temperature by adding a salt (for example, NaCl) having a predetermined concentration to a solution in which the temperature-responsive polymer is dispersed at a certain temperature.
  • a salt for example, NaCl
  • Examples of the salt used in the present invention include lithium sulfate, sodium sulfate, potassium sulfate, magnesium sulfate, ammonium sulfate and the like; halides such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, barium chloride; magnesium nitrate, Nitrates such as calcium nitrate; thiocyanates such as potassium thiocyanate; carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate; borate salts; phosphates and the like. These salts can be used alone or in combination of two or more.
  • sodium salt of monocarboxylic acid such as sodium acetate, sodium aspartate, sodium glutamate, sodium iminodiacetate, sodium maleate, sodium malonate, sodium oxalate, disodium succinate, or dicarboxylic acid such as sodium tartrate
  • Organic salts such as sodium salt of tricarboxylic acid such as disodium citrate, sodium salt of tetracarboxylic acid such as disodium ethylenediaminetetraacetate, etc. Available. These salts can be used alone or in combination of two or more.
  • an aqueous salt solution may be added so as to obtain a desired salt concentration.
  • the required amount of salt to aggregate the temperature-responsive polymer varies depending on the type of salt, the temperature of the aqueous solution, the type of temperature-responsive polymer, and the concentration of the temperature-responsive polymer, but it is generally 50 mM to 5 M at a final concentration in the aqueous solution. Preferably, it is in the range of 100 to 1000 mM.
  • an acid solution or an alkali solution may be added to a container containing a mixed solution.
  • an acid solution or an alkali solution is added to a container containing a dispersion mixture outside the pH range where the pH-responsive polymer causes a structural change, and the pH-responsive polymer causes a structural change inside the container. Change to the range.
  • an acid solution may be added to a container containing a mixed solution that is dispersed at pH 5 or higher so that the pH is 5 or lower. .
  • an alkaline solution may be added to a container containing a mixed solution that is dispersed at a pH lower than 10 so that the pH becomes 10 or higher.
  • the pH at which the pH-responsive polymer undergoes a structural change is not particularly limited, but is preferably pH 4 to 10, and more preferably pH 5 to 9.
  • polypeptide containing a large number of carboxyls polypeptide consisting of amino acids such as glutamic acid and aspartic acid
  • polyacrylic acid polymethacrylic acid
  • polymer containing acrylic acid or methacrylic acid as a polymerization component
  • carboxymethylcellulose And polysaccharides such as hyaluronic acid and heparin, polylysine, polyarginine, polyornithine, polyalkylamine, polyethyleneimine and polypropylethyleneimine.
  • a photoresponsive polymer when a photoresponsive polymer is used, light having a wavelength capable of aggregating the polymer may be irradiated to a container containing the mixed solution.
  • the preferred light for aggregation varies depending on the type and structure of the photoresponsive functional group contained in the photoresponsive polymer, but in general, ultraviolet light or visible light having a wavelength of 190 to 800 nm can be suitably used.
  • the strength is preferably 0.1 to 1000 mW / cm 2 .
  • a photoresponsive polymer is a thing which is hard to produce dispersion
  • the measurement accuracy can be improved by shortening the irradiation time.
  • Specific examples include polymers containing photoresponsive functional groups such as azobenzene, spirobenzopyran, and spirobenzothiopyran.
  • the stimulus-responsive polymer 11 When the mixture of the first binding substance 10, the second binding substance 20, and the specimen is placed under such conditions, the stimulus-responsive polymer 11 is charged in the second binding substance 20 when the detection target 50 exists. Aggregation is inhibited by the part or the hydrophilic part and dispersed (FIG. 2 (A)). On the other hand, when the detection target 50 does not exist, the stimulus-responsive polymer 11 aggregates without being inhibited from aggregation ((B) in FIG. 2).
  • the aggregation of the temperature-responsive polymer may be performed after the first bound substance and the second bound substance are bound to the detection target, or may be performed in parallel, but the processing time can be shortened. And the latter is preferred.
  • the lower critical solution temperature is determined as follows. First, a sample is put into a cell of an absorptiometer and the sample is heated at a rate of 1 ° C./min. During this time, the change in transmittance at 550 nm is recorded. Here, when the transmittance when the polymer is transparently dissolved is 100% and when the transmittance when the polymer is completely aggregated is 0%, the temperature at which the transmittance is 50% is obtained as LCST.
  • the upper critical solution temperature is determined as follows. The sample is cooled at a rate of 1 ° C./min and the change in transmittance at 550 nm is recorded as in the case of the lower critical solution temperature.
  • the transmittance when the polymer is transparently dissolved is 100% and the transmittance when the polymer is completely aggregated is 0%
  • the temperature at which the transmittance is 50% is obtained as UCST.
  • the timing of placing the mixture under conditions in which the stimuli-responsive polymer aggregates may be before the development (the mixture is developed after being subjected to the aggregation conditions), and simultaneously with the development. It may be present (subject to aggregation conditions during deployment).
  • the development carrier used in the method of the present invention is not particularly limited as long as the fine particles can be developed in an aqueous solution, and may be a conventionally known chromatography carrier. Specifically, a porous three-dimensional structure film such as a nylon film or a nitrocellulose film may be used, and either a synthetic or natural polymer film may be used. However, the developing carrier needs to have a pore diameter larger than the average particle diameter of the fine particles and smaller than the aggregate diameter of the above-mentioned fine particles. It is preferable to have a pore diameter of about 0.5 ⁇ m.
  • FIG. 3 is a diagram showing a procedure of a method according to an embodiment of the present invention.
  • the specimen and the first binding substance are mixed and incubated under the above-mentioned conditions, and the second binding substance is further mixed and incubated under the above-mentioned conditions.
  • the condition that the stimulus-responsive polymer aggregates has already been established at this point.
  • the developing carrier is immersed in the mixture from the lower end to a predetermined height, and the mixture is developed in this state. Then, when there is no detection target in the sample, a large amount of aggregates are formed in the mixture. However, since the aggregate diameter is larger than the pore diameter, the aggregate is concentrated on the meniscus and the bound substance in the aggregate A colored band (an example of a signal) due to the presence of (usually fine particles) is confirmed. On the other hand, when the detection target is present in the specimen, the amount of the aggregate is significantly reduced according to the amount of the detection target, and the non-aggregate smaller than the pore size moves on the development carrier. Therefore, the colored band due to the presence of aggregates is not confirmed or thinned, and the colored area (an example of signal) due to the presence of bound substances (usually fine particles) in non-aggregates is confirmed over a wide range. Is done.
  • the intensity due to the presence of the aggregate (the intensity of the signal color gamut) is weaker than in the absence of the detection target, it can be determined that the detection target exists in the sample. Further, in the present embodiment, it can be determined that the detection target exists in the specimen even when the position of the signal color gamut is different from that in the absence of the detection target.
  • FIG. 4 is a diagram showing a procedure of a method according to another embodiment of the present invention.
  • a stimulus-responsive polymer at room temperature at a position away from the lower end of the development carrier (shown for convenience, but may actually be invisible).
  • An effective amount of salt e.g., NaCl
  • Development is then started without subjecting the mixture to agglomeration conditions (eg, at a lower temperature than the LCST of the stimulus-responsive polymer).
  • the mixture moves to the position where the salt is arranged, but concentrates at this position because it aggregates and cannot move.
  • the detection target is present in the specimen, the mixture is inhibited from aggregation even if it moves to the position where the salt is arranged, so that it moves further through this position. For this reason, colored bands due to the presence of aggregates are not confirmed or become thin, and a colored region (an example of a signal) due to the presence of binding substances (usually fine particles) in non-aggregates is confirmed over a wide range. Is done.
  • the intensity due to the presence of the aggregate is weaker than in the absence of the detection target, it can be determined that the detection target exists in the sample.
  • the colored band since the colored band is confirmed in the meniscus, the colored band may be unclear in an environment where it is difficult to keep the liquid level constant, but in this embodiment, salt is disposed. Since the colored band is confirmed at the position, the colored band can be sharpened regardless of the liquid level. This effect is particularly important when detection is performed in an environment such as outside the laboratory.
  • positions salt is not specifically limited,
  • the arbitrary places of the upper end side may be sufficient as the lower end of a expansion
  • a salt can be placed near the center of the development carrier in that the same signal can be obtained. preferable. This effect is also particularly important when detection is performed in an environment such as outside the laboratory.
  • a mark or the like indicating the direction of the spreading carrier may be provided on the spreading carrier, thereby increasing the degree of freedom of the location where the salt is placed.
  • the salt is arranged on the development carrier, but it is not particularly limited as long as the stimulus-responsive polymer can be aggregated. Specifically, it may be set to a temperature at which only a predetermined portion of the development carrier can be aggregated, an acid or a base having an aggregation pH may be disposed, or light may be irradiated.
  • FIG. 5 is a diagram showing a procedure of a method according to another embodiment of the present invention.
  • the joint is present at a position away from the lower end of the development carrier (shown for convenience, it may not be actually visible)
  • a substance that develops or emits light on the carrier is arranged.
  • FIG. 5 (b) when development is performed in the same procedure as in FIG. 3 using such a development carrier, as shown in FIG. 5 (b), when a detection target is present in the specimen, a non-aggregate smaller than the pore diameter is developed. Since it moves to the position of the substance that develops or emits light on the carrier, color development or emission (an example of a signal) is confirmed at this position.
  • the sensitivity and accuracy of detection can be further improved by appropriately selecting the intensity of color development or light emission.
  • color development or light emission corresponds to a signal.
  • the substance that develops or emits light may be appropriately selected from conventionally known substances.
  • the coloring substance include those having an absorption band in the visible region, such as triazine and 1,10-phenanthroline.
  • the luminescent substance include fluorescent and chemiluminescent substances such as luminol and luciferase.
  • a coloring material is preferable in that it can be confirmed with the naked eye and does not require a light irradiation device, but is not limited thereto.
  • the amount of magnetism may be measured. In this case, the amount of magnetism corresponds to a signal.
  • the binding substance is configured to be colored, the colored area due to the presence of the aggregate can be confirmed at a position corresponding to the meniscus when there is no detection target in the specimen.
  • the signal may be one type or a plurality of types, and may be appropriately selected.
  • FIG. 6 is a plan view of a deployment device 40 including a deployment carrier 30 used in the method according to another embodiment of the present invention
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of the deployment device 40 of FIG. 6 taken along the line VII-VII.
  • the filter 47 is disposed on one end (the lower end in FIG. 6, the left end in FIG. 7) of the deployment carrier 30 that is disposed horizontally, and the position away from the one end.
  • a substance that develops color or emits light on the developing carrier 30 when it is present together with the bound substance is arranged.
  • the liquid absorption 49 is in contact with the other end of the development carrier 30.
  • the filter 47 may be made of the same or different material as the developing carrier 30, but does not transmit the aggregates and transmits the non-aggregates. That is, the filter 47 is larger than the above-described average particle diameter of the fine particles and the aggregate diameter of the aggregates. Need to have a smaller pore size. Moreover, the liquid absorption 49 will not be specifically limited if it can absorb the solvent in a mixture.
  • the development carrier 30, the filter 47 and the liquid absorption 49 in this state are held by the upper holder 41 and the lower holder 42, the filter 47 is exposed through the supply port portion 43, and the position 31 is visible from the outside through the window portion 44. is there.
  • the holding method is not particularly limited, it is preferable that the upper holder 41 and the lower holder 42 are detachable in that the upper holder 41 and the lower holder 42 can be reused.
  • the developing device 40 Using the developing device 40, the mixture prepared in the same procedure as in FIG. As a result, the mixture is developed on the development carrier after the aggregates are removed by the filter 47. For this reason, when a detection target is present in the specimen, a large amount of non-aggregated substance passes through the filter 47 and moves to the position 31 on the development carrier 30, and color development or light emission is confirmed at the position 31. On the other hand, when there is no detection target in the specimen, a large amount of aggregate formed in the mixture remains on the filter 47, while there is very little or no non-aggregate that can pass through the filter 47. Therefore, it is difficult to confirm color development or light emission at the position 31.
  • the detection target is present in the specimen when the intensity of the signal (here, color development or luminescence) due to the presence of the aggregate is stronger than in the absence of the detection target.
  • This embodiment is different from the above-described embodiments because there is little restriction that the development carrier must be supported in the same posture during the development, so there is no support stand outside the laboratory or wind It is preferable at the point which can respond also to the environment where external air flows.
  • the quantification method of the present invention first, the first binding substance, the second binding substance, and the specimen are mixed, and this mixture is subjected to a predetermined condition in which the stimulus-responsive polymer aggregates. Next, the mixture is developed on a development carrier, the intensity of the signal due to the presence of the binding substance in the development carrier is measured, and based on the correlation equation under a predetermined condition between the amount of the detection target and the signal intensity, The amount of the detection target is calculated. Since the procedure up to the deployment is the same as the detection method described above, the description is omitted.
  • the measurement may be performed according to a conventionally known procedure according to the type of signal to be measured, and may be performed with the naked eye or using a measuring instrument. Further, the signal intensity used in the correlation equation described below may be a measured value itself or a score value of a group classified according to the range of signal intensity. The score value is, for example, as follows. Score 0: No signal was confirmed. Score 1: The signal is weak. Score 2: The signal is clearly confirmed.
  • Correlation formula A correlation equation between the amount of detection target and the signal intensity under the same condition as the predetermined condition is created.
  • the data may be related to the amount of the detection target of two or more points, and is preferably related to the amount of the detection target of three or more points.
  • the correlation equation between the detection target amount and the signal intensity is not only an equation indicating a direct correlation between the detection target amount and the signal strength, but also the parameter reflecting the detection target amount and the signal strength, or the above-described parameter. It may be a correlation formula with the score value.
  • Targets that can be detected by the above detection methods include environmental pollutants, food and drink contaminants, and substances used for clinical diagnosis. Specifically, dioxins, environmental hormones, agricultural chemicals, PCB, organic mercury, prions, etc.
  • Fibrinogen Fibrin and their degradation products
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • CRP C-reactive protein
  • myoglobin carcinoembryonic antigen
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • HPL human placental lactogen
  • HIV virus antigens allergens
  • bacterial toxins bacterial antigens
  • enzymes formo (E.g., human thyroid stimulating hormone (TSH), insulin, etc.), drugs, and the like.
  • the present invention also includes a kit for detecting and / or quantifying a detection target.
  • the kit includes a first bound substance in which a first substance having an aggregating substance containing a stimulus-responsive polymer and a first affinity substance for a detection target are bound, and a second substance having hydrophilicity.
  • the first substance or the second substance preferably has colored particles.
  • bonding material has a substance which carries out color development or light emission on the said expansion
  • PBS buffer 10-fold concentrated PBS (81 mM Na 2 HPO 4 , 14.7 mM KH 2 PO 4 , 26.8 mM KCl, 1370 mM NaCl, pH 7.4, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) 1/10 with purified water Diluted to (V / V).
  • Purified water Water purified with “Direct-Q” (trade name) manufactured by MILLIPORE.
  • Example 1 In this example, anti-TSH ⁇ antibody binding-temperature responsive polymer surface-modified magnetic particles are used as the first conjugate, and anti-TSH ⁇ antibody-conjugated sodium polyacrylate is used as the second conjugate. ) Is detected.
  • Streptavidin bond-temperature-responsive polymer surface-modified magnetic particles 250 ⁇ L of Thermo-Max (registered trademark) LSA Streptavidin (0.4 mass%) manufactured by Magnabeat Co., Ltd. are taken in a 1.5 mL microtube, and further PBS 50 ⁇ L (0.75 mg / mL) of a biotinylated anti-human TSH ⁇ antibody dissolved in a buffer was added and mixed by inversion at 4 ° C. for 15 minutes. After the microtube was heated to 37 ° C., the magnetic particles were collected with a magnet and the supernatant was removed. To this, 250 ⁇ L of PBS buffer was added and cooled to disperse the magnetic particles.
  • This labeled antibody (this antibody is also referred to as sodium polyacrylate-anti-human TSH ⁇ antibody conjugate), 0.5% (w / v) BSA (manufactured by Sigma), 0.5% (w / v) A second conjugate was prepared by diluting to a protein concentration of 4 ⁇ g / mL with PBS buffer (pH 7.4) containing Tween® 20, 10 mM EDTA.
  • the maleimidated sodium polyacrylate was prepared as follows. First, 2 g of acrylic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2-aminoethanethiol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0. 021 g and 0.023 g of azobisisobutyronitrile (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were dissolved in 50 mL of N, N-dimethylformamide, and purged with nitrogen for 1 hour. Thereafter, a polymerization reaction was carried out at 70 ° C. for 7 hours.
  • reaction liquid was concentrated to 10 mL under reduced pressure, and reprecipitation was performed with diethyl ether until the viscous product became powdery.
  • the white precipitate was filtered off and further dried overnight in a vacuum dryer to obtain amino group-terminated polyacrylic acid (yield 1.5 g).
  • 0.5 g of this amino group-terminated polyacrylic acid and 10 mL of N, N-dimethylformamide were placed in a 50 mL eggplant flask equipped with a nitrogen gas inlet tube and a stirrer and dissolved. Thereto was added 3 mg of EMCS (N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide) (manufactured by Dojindo Laboratories) and reacted overnight.
  • EMCS N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide
  • the obtained reaction liquid was concentrated to 1 mL under reduced pressure, and reprecipitation was performed with diethyl ether until a viscous product became powdery.
  • the white precipitate was filtered off and further dried overnight in a vacuum dryer to obtain maleimide group-terminated polyacrylic acid.
  • the number-average molecular weight of this maleimide group-terminated polyacrylic acid is about 130,000 (GPC system: manufactured by Shimadzu Corporation, column: manufactured by Tosoh Corporation, TSKgel Super AW3000, 6 mm ID. ⁇ 150 mm, mobile phase: 0.1 M sodium nitrate), The yield was 0.4g.
  • sample preparation TSH; Aspen Bio Pharma, Inc. A solution (concentration 30 ⁇ g / mL) of human thyroid stimulating hormone (activity 8.5 IU / mg, WHO 80/558) manufactured by Ortho Clinical Diagnostics, Inc. with “Vitros® TSH calibrator 1” Samples 2 and 3 were diluted to be 06 mIU / L and 0.0012 mIU / L, respectively. Sample 1 was prepared by the same procedure except that it did not contain human thyroid stimulating hormone activity.
  • a membrane filter “Hi-Flow Membrane # SNHF0400” (trade name) manufactured by MILLIPORE as a developing carrier having a pore size of 5 mm ⁇ 50 mm and a size of 0.1 ⁇ m or less is placed about 10 mm from the lower end of the reaction solution in the reaction tube. And soaked for 1 minute. Thereafter, the membrane filter was gently lifted and the state on the membrane filter was observed. The result is shown in FIG.
  • Example 2 In this example, an example of detecting HBs antigen using anti-HBs antibody binding-temperature-responsive polymer surface-modified magnetic particles as the first conjugate and anti-HBs antibody-conjugated polyethylene glycol as the second conjugate is shown. .
  • Anti-HBs monoclonal antibody (antigenic determinant: a, clone number Hyb-824) manufactured by Special Immunology Research Institute Co., Ltd. was used using EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Kit, Product # 21420 (trade name) manufactured by PIERCE. Biotinylated according to the biotinylation method attached to the kit to prepare a biotinylated anti-HBs monoclonal antibody.
  • Thermo-Max (registered trademark) LSA Streptavidin (30) (0.2 mass%) manufactured by Magnabeat, which is a temperature-responsive polymer surface-modified magnetic particle, in a 1.5 mL microtube, and further with PBS buffer 50 ⁇ l (0.75 mg / mL) of the biotinylated anti-HBs monoclonal antibody dissolved in was added and mixed by inversion at 4 ° C. for 15 minutes. After the microtube was heated to 37 ° C., the magnetic particles were collected with a magnet, and the supernatant was removed to prepare anti-HBs monoclonal antibody temperature-responsive polymer surface-modified magnetic particles.
  • Example preparation Purified HBs antigen manufactured by Special Immunity Research Institute Co., Ltd. was diluted to a concentration of 1000 ng / mL with 0.5% BSA (manufactured by Sigma) and PBS buffer (pH 7.4). This dilution was diluted to a concentration of 10 ng / mL with human serum determined to be negative by “Vitros (registered trademark) HBs antigen (Lot No. 2330) kit manufactured by Ortho Clinical Diagnostics. The sample was a positive sample (Sample 2), and this human serum was a negative sample (Sample 1).
  • the membrane filter is developed on the membrane filter in the same procedure as in Example 1 except that 100 ⁇ L of the first conjugate dispersion, 100 ⁇ L of the second conjugate dispersion, and 5 ⁇ L of the sample are used. Was observed. The result is shown in FIG.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

　種々の環境において、検出対象を迅速、安価、簡便且つ高精度に検出、定量できる検出対象の検出方法及び定量方法を提供すること。　検体中の検出対象を検出する方法は、刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、検体とを混合し、得られた混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号を確認し、信号が、検出対象の非存在下と異なる場合には、検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む。第１の親和性物質と第２の親和性物質とは、検出対象の異なる部位に結合できる。

Description

検出対象の検出方法及び定量方法
　本発明は、検出対象の検出方法及び定量方法に関する。
　従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が利用されてきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテックスと、流体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である（例えば、特許文献１参照）。
　このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。
　そこで、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法といった酵素基質反応を利用する方法も広く利用されている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する。
　これらの方法によれば、例えば基質として発光試薬を用いると、基質添加後の発光の検出感度が高いため、微量の抗原も検出できる。
　しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体や発光試薬等の特殊な試薬が多数必須であり、作業コストが高い。また、発光試薬の退色（ブリーチング現象）を抑制する必要から、測定工程を極めて短時間に終了せざるを得ないため、測定精度が不充分になることが懸念される。
　一方、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションする工程、系を洗浄する工程、発光を測定する工程等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極めて長く、大規模処理には適さない。
特公昭５８－１１５７５号公報
　そこで、本発明者らは、刺激応答性ポリマーを含有する物質と検出対象に対する親和性物質とが結合した結合物、並びに電荷を有する物質と検出対象に対する親和性物質とが結合した結合物を用いた、検出対象の検出及び定量技術を開発した（国際公開ＷＯ２００８／００１８６８号パンフレット）。この技術は、上記２種類の結合物と検体とを混合した混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下においた後、濁度測定等によって刺激応答性ポリマーの凝集の程度が低下したと判定された場合には、検体中に検出対象が存在すると判別するものである。
　この技術によれば、刺激応答性ポリマーを含有する物質、親和性物質及び電荷を有する物質のみを用いて達成され、特殊な試薬を特に使用することなく行われるので、安価且つ簡便である。また、凝集阻害の程度を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。
　しかし、上記技術では、検出対象の存在の判別のために、濁度測定等を行う精密機器が必要になる場合が多く、検出や定量を設備が整った実験室等の環境で行うことが望まれる。しかし、環境汚染検査、食品検査等の場合には、実験室外等の設備が整っていない場所で検出及び定量を行うことが一般的であるため、検出対象の存在の判別が困難である。
　本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、種々の環境において、検出対象を迅速、安価、簡便且つ高精度に検出、定量できる検出対象の検出方法及び定量方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、２種類の結合物と検体との混合物を展開担体に展開させると、検出対象の存在の有無によって、展開担体における前記結合物の存在に起因する信号が大きく異なることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下の構成を有する。
　［１］　検体中の検出対象を検出する方法であって、
　刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、
　得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
　前記展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号を確認し、前記信号が、前記検出対象の非存在下と異なる場合には、前記検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む方法であり、
　第１の親和性物質と第２の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
　［２］　第１の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも弱い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する［１］記載の方法。
　［３］　前記混合物は、第１の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
　第１の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも強い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する［１］記載の方法。
　［４］　検体中の検出対象を定量する方法であって、
　刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、
　得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
　前記展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、前記検出対象の量と信号強度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出する工程を含む方法であり、
　第１の親和性物質と第２の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
　［５］　第１の結合物の凝集体の存在に起因する信号を測定する［４］記載の方法。
　［６］　前記混合物は、第１の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
　第１の結合物の存在に起因する信号の強度を測定する［４］記載の方法。
　［７］　第１の結合物は有色粒子を有し、
　前記信号は、前記有色粒子の存在に基づく色に依存したものである［１］から［６］いずれか記載の方法。
　［８］　第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有し、
　前記信号は、前記発色もしくは発光する物質の存在に基づく色又は光に依存したものである［１］から［７］いずれか記載の方法。
　［９］　検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
　刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、
　前記結合物を展開するための展開担体と、を備えるキット。
　［１０］　第１の結合物は有色粒子を有する［９］記載のキット。
　［１１］　第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有する［９］又は［１０］記載のキット。
　本発明によれば、検出対象が存在する場合、この結合対象に第１の親和性物質及び第２の親和性物質が結合するため、第１の親和性物質に結合した刺激応答性ポリマーと、第２の親和性物質に結合した第２の物質が接近する。これにより、電荷部分又は親水性部分が刺激応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答した刺激応答性ポリマーの凝集が阻害される。このため、混合物を展開担体に展開させたときの信号が、検出対象の存在量に応じて変化するので、この変化の有無や程度に基づいて、検出対象を簡便に検出又は定量することができる。
　以上の手順は、いずれも特殊な試薬、機器を特に使用することなく行われるので、種々の環境において、安価且つ簡便に実施できる。また、展開後の信号を確認するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。
本発明の一実施形態に係る方法において使用される結合物の概略構成図である。 前記実施形態に係る結合物の使用状態を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る方法の手順を示す図である。 本発明の別の実施形態に係る方法の手順を示す図である。 本発明の別の実施形態に係る方法の手順を示す図である。 本発明の別の実施形態に係る方法で用いる展開担体を備える展開器具の平面図である。 図６の展開器具のＶＩＩ－ＶＩＩ線断面図である。 図６の展開担体の変化を示す図である。 本発明の一実施例に係る方法を実施した結果を示す写真である。 本発明の別の実施例に係る方法を実施した結果を示す写真である。
　以下、本発明の一実施形態について、図面を参照しながら説明する。
　＜検出方法＞
　〔混合・凝集〕
　本発明の検出方法では、まず、結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。ここで用いる結合物は少なくとも２種であり、そのうち必須の構成要素である第１の結合物、及び第２の結合物について詳細に説明する。
　［第１の結合物］
　第１の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と、検出対象に対する第１の親和性物質とが結合したものである。
　（第１の物質）
　本発明で用いられる第１の物質は刺激応答性ポリマーを含有する物質であり、この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）、電場変化等が挙げられる。
　特に、本発明では、刺激応答性ポリマーとしては、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーが利用できる。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度を有するポリマー（以下、ＵＣＳＴとも称する）が挙げられる。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＬＣＳＴ未満の温度の水溶液中では完全に分散し、ＬＣＳＴ以上に水温を上昇させると直ちに凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＵＣＳＴを超える温度の水溶液中では完全に分散し、ＵＣＳＴ以下に水温を下降させると直ちに凝集させることができる。
　本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－アクリロイルピロリジン、Ｎ－アクリロイルピペリジン、Ｎ－アクリロイルモルホリン、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルメタクリルアミド、Ｎ－メタクリロイルピロリジン、Ｎ－メタクリロイルピペリジン、Ｎ－メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとＮ－ｔ－ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－アクリロイルピロリジン、Ｎ－アクリロイルピペリジン、Ｎ－アクリロイルモルホリン、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルメタクリルアミド、Ｎ－メタクリロイルピロリジン、Ｎ－メタクリロイルピペリジン、Ｎ－メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ－イソプロピルアクリルアミドとＮ－ｔ－ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。また、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸）に代表されるようなペンタポリペプチドの繰返し配列を持つエラスチン由来ポリペプチド等も利用できる。
　本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ－ビオチニル－Ｎ’－メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。
　また、本発明では、刺激応答性ポリマーとして、ｐＨの変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマーが利用できる。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における第１の結合物、後述の第２の結合物、及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４～１０が好ましく、ｐＨ５～９であることが更に好ましい。
　このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ－ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。
　（微粒子）
　第１の物質は、刺激応答性ポリマー及び後述の親和性物質を担持する微粒子を含有してもよい。ここで用いる微粒子は、凝集の程度に応じて展開担体上の信号が変化するように、単独では後述の展開担体の孔径よりも小さく、且つ、凝集した際には展開担体の孔径よりも大きくなるような平均粒子径を有する必要があるが、その具体的組成は刺激応答性ポリマー及び親和性物質を担持できる限りにおいて特に限定されない。
　従来のラテックス凝集法では、検出対象の存在に応じてラテックスが凝集し、その凝集を検出する必要があるところ、検出感度を向上するために微粒子が大きい粒子径を有することが好ましい。対照的に、本発明の方法では、微粒子が小さい粒子径になる程、単位体積あたりの比表面積が増し、検出対象の結合の増加による刺激応答性ポリマーの凝集阻害が効率的になるので、微粒子の粒子径が小さいことが好ましい。ただし、微粒子の平均粒子径は、非凝集時には展開担体の孔径よりも小さく、凝集した際には展開担体の孔径よりも大きくなるよう設定される必要がある。このように、微粒子を用いる場合には、微粒子の平均粒子径は、凝集阻害の効率、凝集の仕方（特に径の変化）、及び展開担体の孔径等を考慮して適宜設定されてよい。一般的に、その平均粒子径の下限は、０．００１μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０１０μｍ、最も好ましくは０．１μｍであり、上限は０．５μｍであることが好ましく、より好ましくは０．３μｍ、最も好ましくは０．２μｍである。
　微粒子は、展開担体への展開時に色に依存した信号を形成し、その信号が容易に確認又は測定できる点で、有色粒子であることが好ましい。有色粒子は、特に限定されず、金属コロイド粒子（例えば金コロイド粒子）、ポリスチレンラテックス等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子からなる均質な球状粒子等であってよい。ただし、第１の結合物は、本発明の方法のみならず、国際公開ＷＯ２００８／００１８６８号パンフレットに記載される検出方法にも使用でき、この場合には磁力付加により凝集体を分離することで、検出精度を向上できる（詳細は国際公開ＷＯ２００８／００１８６８号パンフレット）。そこで、汎用性を向上するべく、微粒子は磁性物質を含むことが好ましく、かかる磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。
　多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５－８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。
　（第１の親和性物質）
　第１の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
　［第１の結合物の作製］
　第１の結合物は、第１の物質と第１の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第１の物質側（例えば刺激応答性ポリマー部分）及び第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第１の物質及び第１の親和性物質を結合させる。
　具体的には、刺激応答性ポリマーへのビオチンの結合は、国際公開ＷＯ０１／００９１４１に記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性ポリマー及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーが結合する。
　別法として、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、刺激応答性ポリマーと、検出対象の抗原に対する第１の抗体との第１の結合物が作製される。
　あるいは、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する第１の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。
　あるいは、微粒子状の磁性物質に第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーを結合させてもよい。
　第１の物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、刺激応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第１の親和性物質を結合させた後、刺激応答性ポリマーが凝集する条件におき、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。
　微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ－Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。
　［第２の結合物］
　本発明の方法では、第１の結合物に加えて、親水性を有する第２の物質と、検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物を用いる。これにより、検出感度を向上することができる。
　（第２の物質）
　親水性を有する第２の物質は、例えば電荷を有する高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン（カルボキシル）やポリカチオン（アミノ）の官能基数は、２５個以上が好ましい。また、カルボキシル基を持つラテックス粒子等も挙げられる。
　また、親水性を有する第２の物質は、例えば水溶性の高分子化合物であり、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等のエーテル結合を含有する高分子、ポリビニルアルコール等のアルコール性水酸基を含有する高分子、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性多糖類、中性アミノ酸を含むポリペプチド等が挙げられる。
　これら親水性を有する物質は、高分子鎖の中又は末端に、第２の親和性物質を結合させるための官能基等を有していてもよい。また、親水性を有する第２の物質は、一種単独で利用しても、複数を混合して利用してもよい。
　（第２の親和性物質）
　第２の親和性物質は、第１の親和性物質とは異なる部位において、第１の親和性物質と同じ検出対象に結合できるものである。第１の親和性物質及び第２の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。
　［作製方法］
　第２の結合物は、第２の物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第２の物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第２の物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。
　第２の物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ　ｅｔ　ａｌ．：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．、　１、　７１－７６、１９９０）のマレイミド－チオールカップリングに従って結合できる。具体的には、以下の２つの方法が挙げられる。
　第１の方法では、まず、核酸の５’末端にメルカプト基（別名、スルフヒドリル基）を導入する一方、抗体に６－マレイミドヘキサノイックアシッドスクシンイミドエステル（例えば、「ＥＭＣＳ（商品名）」（（株）同仁化学研究所製））を反応させてマレイミド基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
　第２の方法では、まず、第１の方法と同様にして核酸の５’末端にメルカプト基を導入し、このメルカプト基に更にホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ－１，２－フェニレンジマレイミドと反応させることによって核酸の５’末端にマレイミド基を導入する一方、抗体にメルカプト基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
　この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　第１５巻５２７５頁（１９８７年）及びＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結合に応用できる。
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　第１６巻３６７１頁（１９８８年）によると、まず、オリゴヌクレオチドを、シスタミン、カルボジイミド及び１－メチルイミダゾールと反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にメルカプト基を導入する。メルカプト基を導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２、２’－ジピリジルジスルフィドを加えることによってオリゴヌクレオチドの５’末端にジスルフィド結合を介してピリジル基を導入する。一方、タンパク質に対しては、イミノチアレンを反応させてメルカプト基を導入しておく。これらピリジルジスルフィドを導入したオリゴヌクレオチドとメルカプト基を導入したタンパク質を混合し、ピリジル基とメルカプト基を特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。
　Ｎｕｌｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｃｈ　第１５巻５２７５頁（１９８７年）によると、まず、オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノ基を導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオ－ビス－プロピオニックアシッド－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチオ－ビス－プロピオニル－ＮＨＳ）を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することによりジチオ－ビス－プロピオニル－ＮＨＳ分子中のジスルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３’末端にメルカプト基を導入する。タンパク質の処理については、特開平５－４８１００号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基）と反応しうる第１の反応性基（スクシンイミド）、及びメルカプト基と反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入し、予め活性化されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタンパク試薬をチオール化ポリヌクレオチドのメルカプト基へ共有結合させる。
　核酸以外のポリアニオンやポリカチオンを使用する場合にも、これらの末端等にメルカプト基を導入することで、上記と同様の操作で第２の結合物を作製できる。
　再び、検出方法の手順の説明に戻る。以上のような２種類の結合物及び検体の混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におくと、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが検出対象の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する。一方、検出対象が存在しない場合には、刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。なお、第１の結合物、第２の結合物、及び検体は、すべてを同時に混合してもよく、１種ずつを別々に混合してもよい。
　この現象を、図１～図２を参照しながら説明する。
　図１に示されるように、第１の結合物１０は刺激応答性ポリマー１１を含有し、この刺激応答性ポリマー１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して検出対象５０に対する第１の抗体１３に結合されている。また、第１の結合物１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この磁性物質１９の表面に第１の物質としての刺激応答性ポリマー１１が結合されている。一方、第２の結合物２０では、検出対象５０に対する第２の抗体２３と、第２の物質２１とが結合されている。そして、第１の抗体１３及び第２の抗体２３は、検出対象５０の異なる部位に結合できることから、同じ検出対象５０に結合できる。第２の結合物２０は検出対象５０と刺激応答性ポリマー１１とを介して磁性物質１９に接近でき、このとき第２の物質２１が磁性物質１９の近傍に位置することになる。
　図２に示されるように、第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物を所定条件下におくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する。（図２（Ａ））。一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（（図２（Ｂ））。なお、本実施形態では、第２の結合物２０の電荷部分又は親水性部分が磁性物質１９の近傍に位置する構成としたが、これに限られず、検出対象の電荷部分又は親水性部分が磁性物質１９の近傍に位置する構成であってもよい。
　刺激応答性ポリマー１１を凝集させるためには、例えば温度応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。温度応答性ポリマーには、上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーと、下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーの２種類がある。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。
　また、ＬＣＳＴは、温度応答性ポリマーの周囲の塩濃度の増加に伴って低下することが知られている。このため、ある温度で温度応答性ポリマーが分散している溶液に、所定濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ）を添加することにより、一定温度下で温度応答性ポリマーを凝集させることも可能である。
　本発明で用いられる塩としては、硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム等の硫酸塩；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム、等のハロゲン化物；硝酸マグネシウム、硝酸カルシウム等の硝酸塩；チオシアン化カリウム等のチオシアン酸塩；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩；ホウ酸塩；リン酸塩等が挙げられる。これらの塩は、単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、酢酸ナトリウム等のモノカルボン酸のナトリウム塩、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、イミノ二酢酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、又は、酒石酸ナトリウム等のジカルボン酸のナトリウム塩、クエン酸二ナトリウム等のトリカルボン酸のナトリウム塩、エチレンジアミン４酢酸二ナトリウム等のテトラカルボン酸のナトリウム塩等の有機酸塩等が挙げられ、これらのカリウム塩等の有機酸塩等も利用できる。これらの塩は、単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　温度応答性ポリマーを凝集させるためには、例えば、所望の塩濃度となるように塩の水溶液を添加すればよい。温度応答性ポリマーを凝集させるための塩の必要添加量は、塩の種類、水溶液の温度、温度応答性ポリマーの種類、温度応答性ポリマーの濃度によって異なるが、水溶液中終濃度で概ね５０ｍＭ～５Ｍ、好ましくは１００～１０００ｍＭの範囲である。
　また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散混合液の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４～１０が好ましく、ｐＨ５～９であることが更に好ましい。具体的には、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ヘパリン等の多糖類、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミン及びポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。
　また、光応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０～８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１～１０００ｍＷ／ｃｍ２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、濁度の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、濁度の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。具体的には、アゾベンゼン、スピロベンゾピラン及びスピロベンゾチオピラン等の光応答性の官能基を含有するポリマー等が挙げられる。
　かかる条件下に第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物をおくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する（図２（Ａ））。一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（（図２（Ｂ））。
　なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び第２の結合物と検出対象との結合後に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。
　ここで、下限臨界溶液温度は、次のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。
　また、上限臨界溶液温度は、次のように決定する。１℃／分の速度で試料を冷却し、下限臨界溶液温度の場合と同様に５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＵＣＳＴとして求める。
　〔判別〕
　検体と結合物との混合物を展開担体に展開させ、この展開担体における結合物の存在に起因する信号を確認し、この信号が、検出対象の非存在下と異なる場合には、検体中に検出対象が存在すると判別する。つまり、図２に示したように、検出対象の有無に応じて、各混合物中の凝集の状態が異なるため、各混合物の展開態様も異なることになる。そこで、検出対象の非存在下と異なる信号が確認された場合には、検体中に検出対象が存在したと判別できるのである。このように、判別が、展開担体上の信号を確認するだけで、特殊な試薬、機器を特に使用することなく行われるので、種々の環境において、安価且つ簡便に検出を実施できる。
　なお、後述するように、混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におくタイミングは、展開よりも前であってもよい（混合物を凝集条件においた後に展開させる）し、展開と同時並行であってもよい（展開中に凝集条件におく）。
　（展開担体）
　本発明の方法で用いられる展開担体は、水溶液中で微粒子を展開できるものであれば特に限定されず、従来公知のクロマトグラフィー用担体であってよい。具体的には、有孔の三次元構造膜、例えばナイロン膜、ニトロセルロース膜等が挙げられ、合成又は天然高分子膜のいずれであってもよい。ただし、展開担体は、前述した微粒子の平均粒子径よりも大きく且つ凝集体の凝集径よりも小さい孔径を有する必要があるところ、種々の微粒子に対応でき汎用性に優れる点で、０．０１μｍ～０．５μｍ程度の孔径を有することが好ましい。
　展開及び判別の具体的手順は、特に限定されず、任意であってよい。好ましい手順を以下に説明する。
　図３は、本発明の一実施形態に係る方法の手順を示す図である。この実施形態では、検体及び第１の結合物を前述の条件で混合してインキュベートし、更に第２の結合物を前述の条件で混合してインキュベートする。本実施形態では、この時点で既に、刺激応答性ポリマーが凝集する条件が成立している。
　その後、展開担体を、その下端から所定高さの位置まで混合物に浸し、この状態で混合物を展開させる。すると、検体中に検出対象が存在しない場合には、多量の凝集体が混合物中に形成されているところ、凝集体径が孔径よりも大きいため、メニスカスに集中して、凝集体中の結合物（通常は微粒子）の存在に起因する有色のバンド（信号の一例）が確認される。これに対して、検体中に検出対象が存在する場合には、検出対象の存在量に応じて凝集体の量が顕著に低下し、孔径よりも小さい非凝集体が展開担体上を移動していくため、凝集体の存在に起因する有色のバンドは確認されず又は薄くなるとともに、広範囲に非凝集体中の結合物（通常は微粒子）の存在に起因する有色域（信号の一例）が確認される。
　従って、凝集体の存在に起因する強度（信号有色域の濃さ）が、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。また、本実施形態では、信号有色域の位置が検出対象の非存在下の場合と異なることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。
　図４は、本発明の別の実施形態に係る方法の手順を示す図である。本実施形態では、図４（ａ）に示されるように、展開担体の下端から離れた位置（便宜上図示しているが、実際には視認不能であってよい）に、室温で刺激応答性ポリマー（特にＬＣＳＴを有するポリマー）を凝集させる有効量の塩（例えばＮａＣｌ）が配置されている。そして、混合物を凝集条件下にはおかず（例えば、刺激応答性ポリマーのＬＣＳＴよりも低い温度におく）に展開を開始する。
　すると、検体中に検出対象が存在しない場合、混合物は、塩が配置された位置まで移動するものの、この位置で凝集して移動不能になるために集中する。これに対して、検体中に検出対象が存在する場合、混合物は、塩が配置された位置まで移動しても凝集阻害されるので、この位置を通過して更に移動していく。このため、凝集体の存在に起因する有色のバンドは確認されず又は薄くなるとともに、広範囲に非凝集体中の結合物（通常は微粒子）の存在に起因する有色域（信号の一例）が確認される。
　従って、凝集体の存在に起因する強度（信号有色域の濃さ）が、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。また、本実施形態においては、非凝集体中の結合物（通常は微粒子）の存在に起因する有色域の範囲が非存在下の場合と異なることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。
　前記実施形態では、有色バンドがメニスカスに確認されるため、液面を一定に保つのが困難な環境下では、有色バンドが不鮮明になるおそれがあるが、本実施形態では、塩が配置された位置に有色バンドが確認されるため、液面にかかわらず、有色バンドを鮮明化することができる。この効果は、実験室外等の環境下で検出を行う場合にとりわけ重要である。
　なお、塩を配置する箇所は、特に限定されず、展開担体の下端より上端側の任意の箇所であってよい。ただし、展開担体をいずれの方向で用いても（つまり、両端部が上下いずれの方向に向いていても）、同様の信号が得られる点で、展開担体の中央近傍に塩を配置することが好ましい。この効果も、実験室外等の環境下で検出を行う場合にとりわけ重要である。また、展開担体の方向を示す目印等を展開担体に設けてもよく、これにより塩を配置する箇所の自由度を増すことができる。
　本実施形態では、展開担体に塩を配置したが、刺激応答性ポリマーの凝集可能な条件であれば、特に限定されない。具体的には、展開担体の所定箇所のみを凝集可能な温度に設定してもよく、凝集ｐＨにする酸又は塩基を配置してもよく、あるいは光を照射してもよい。
　図５は、本発明の別の実施形態に係る方法の手順を示す図である。本実施形態では、図５（ａ）に示されるように、展開担体の下端から離れた位置（便宜上図示しているが、実際には視認不能であってよい）に、結合物と併存すると展開担体上で発色もしくは発光する物質が配置されている。かかる展開担体を用いて図３と同様の手順で展開を行うと、図５（ｂ）に示されるように、検体中に検出対象が存在する場合には、孔径よりも小さい非凝集体が展開担体上を、発色もしくは発光する物質の位置へと移動するため、この位置で発色又は発光（信号の一例）が確認される。これに対して、検体中に検出対象が存在しない場合には、多量の凝集体が混合物中に形成されているため、発色又は発光は確認され難い。この態様によれば、発色又は発光の強度を適宜選択することで、検出の感度及び精度をより向上することができる。本態様では、発色又は発光が信号に相当する。
　発色又は発光する物質は、従来周知のものから適宜選択されてよい。発色物質としては、トリアジン、１，１０－フェナンスロリン等の可視領域に吸収帯を有するものが挙げられる。発光物質としては、ルミノール、ルシフェラーゼ等の蛍光、化学発光する物質が挙げられる。肉眼で確認できて光照射機器等が不要である点では、発色物質が好ましいが、これに限られない。また、磁性物質を用いる場合には、磁気量を測定してもよく、この場合には磁気量が信号に相当する。
　なお、図５の態様において、結合物を有色に構成すれば、検体中に検出対象が存在しない場合に、凝集体の存在に起因する有色域がメニスカスに対応する位置に確認することもできる。このように、信号は１種でも複数種でもよく、適宜選択されてよい。
　図６は本発明の別の実施形態に係る方法で用いる展開担体３０を備える展開器具４０の平面図であり、図７は図６の展開器具４０のＶＩＩ－ＶＩＩ線断面図である。
　図７に示されるように、展開器具４０において、水平に配置される展開担体３０の一端（図６では下端、図７では左端）上にフィルタ４７が配置されるとともに、この一端から離れた位置３１に、結合物と併存すると展開担体３０上で発色もしくは発光する物質が配置されている。また、展開担体３０の他端には吸液体４９が当接している。
　フィルタ４７は、展開担体３０と同じ又は異なる素材で構成されてよいが、凝集体を透過させず且つ非凝集体を透過させる、つまり前述した微粒子の平均粒子径よりも大きく且つ凝集体の凝集径よりも小さい孔径を有する必要がある。また、吸液体４９は、混合物中の溶媒を吸収できるものであれば、特に限定されない。
　この状態の展開担体３０、フィルタ４７及び吸液体４９が上保持具４１及び下保持具４２によって保持され、フィルタ４７は供給口部４３を通して露出し、位置３１は窓部４４を通して外部から視認可能である。なお、保持の方式は特に限定されないが、上保持具４１及び下保持具４２を再利用可能な点では、上保持具４１及び下保持具４２が着脱自在であることが好ましい。
　かかる展開器具４０を用い、図３と同様の手順で調製した混合物をフィルタ４７にロードする。これにより、混合物は、凝集体がフィルタ４７で除去された後に展開担体に展開されることになる。このため、検体中に検出対象が存在する場合には、多量の非凝集体がフィルタ４７を透過し、展開担体３０上を位置３１へと移動し、位置３１において発色又は発光が確認される。これに対して、検体中に検出対象が存在しない場合には、混合物中に形成された多量の凝集体がフィルタ４７上に残留する一方、フィルタ４７を透過できる非凝集体が極めて少ない又は存在しないため、位置３１に発色又は発光が確認され難い。
　従って、凝集体の存在に起因する信号（ここでは発色又は発光）の強度が、検出対象の非存在下よりも強い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。この実施形態は、前述した実施形態とは異なり、展開の間、混合物に展開担体を同じ姿勢で支持し続けなければならないという制約が小さいため、実験室外等の支持台が存在しなかったり、風等で外気が流動したりする環境にも対応できる点で好ましい。
　＜定量方法＞
　本発明の定量方法によれば、まず、第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく。次に、混合物を展開担体に展開させ、この展開担体における結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、検出対象の量と信号強度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。展開までの手順は前述した検出方法と共通するので、説明を省略する。
　（測定）
　測定は、測定すべき信号の種類に応じ、従来公知の手順に従って行えばよく、肉眼で又は測定機器を用いて行ってよい。また、次に説明する相関式で用いる信号強度は、測定値そのものであってもよいし、信号強度の範囲に応じて分類された群のスコア値であってもよい。スコア値とは、例えば、以下のようなものである。
　　スコア０：信号が確認されず。
　　スコア１：信号が微弱である。
　　スコア２：信号が明確に確認される。
　（相関式）
　上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と信号強度との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と信号強度との測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２点以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
　ここで、検出対象の量と信号強度との相関式は、検出対象の量と信号強度との直接的な相関を示す式のみならず、検出対象の量と、信号強度を反映するパラメータ又は前述のスコア値との相関式であってもよい。
　（算出）
　混合物を展開したときの信号強度値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。
　（検出対象）
　以上の検出方法で検出できる対象としては、環境汚染物質、飲食品汚染物質、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、ダイオキシン、環境ホルモン、農薬、ＰＣＢ、有機水銀等、プリオン、カビ毒、フグ毒、抗生物質、防カビ剤等、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、薬剤等が挙げられる。
　＜キット＞
　本発明は、検出対象を検出及び／又は定量するためのキットも包含する。このキットは、刺激応答性ポリマーを含有する凝集性物質を持つ第１の物質と検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、この結合物を展開するための展開担体と、を備える。第１の物質又は第２の物質は有色粒子を有することが好ましい。また、第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有することが好ましい。各構成要素の詳細は前述の通りであるので、省略する。
　本発明の実施例で用いた代表的な試薬は次の通りである。
　　ＰＢＳバッファー：１０倍濃度の市販のＰＢＳ（８１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１４．７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、２６．８ｍＭ　ＫＣｌ、１３７０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ニッポンジーン（株）製）を精製水で１／１０（Ｖ／Ｖ）に希釈して用いた。
　　精製水：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製「Ｄｉｒｅｃｔ－Ｑ」（商品名）で精製した水。
　＜実施例１＞
　本実施例では、第１の結合物として抗ＴＳＨβ抗体結合－温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第２の結合物として抗ＴＳＨα抗体結合ポリアクリル酸ナトリウムを用いて、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を検出する例を示す。
　（第１の結合物の調製）
　Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製の抗ヒトＴＳＨβ抗体（Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｂｅｔａ、クローン：１９５マウス、クラス：マウスＩｇＧ）をｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎを用いて旭テクノグラス社がビオチン化し、ビオチン化抗ヒトＴＳＨβ抗体を調製した。
　ストレプトアビジン結合－温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子として、マグナビート（株）製のＴｈｅｒｍａ－Ｍａｘ（登録商標）　ＬＳＡ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（０．４質量％）２５０μＬを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、更にＰＢＳバッファーに溶解したビオチン化抗ヒトＴＳＨβ抗体５０μＬ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、４℃で１５分間転倒混和した。前記マイクロチューブを３７℃に加熱した後、前記磁性粒子を磁石で回収し、上清部分を除去した。ここにＰＢＳバッファー２５０μＬを加え、冷却して、前記磁性粒子を分散させた。更に、過剰量のビオチンをチューブ内に添加してストレプトアビジンのビオチン結合部位をマスクした。再度マイクロチューブを３７℃に加熱した後、前記磁性粒子を磁石で回収し、上清部分を除去することで、抗ヒトＴＳＨβ抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を調製した。
　この抗ヒトＴＳＨβ抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を含むチューブに、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）５００μＬを加え、冷却することで分散させ、第１の結合物の分散溶液を調製した。
　（第２の結合物の調製）
　まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第２の親和性物質としての抗ヒトＴＳＨα抗体（Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ａｌｐｈａ、クローン：１７６マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製、１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに２－メルカプトエタノール６ｍｇを加え、３７℃で１２０分間反応させた。反応後、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商品名）　透析カセット、１０Ｋ　ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、ＰＢＳバッファー５００ｍＬに対して透析を行って、過剰の２－メルカプトエタノールを除き、限界排除分子量１００００の限外濾過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製［Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４　Ｕｌｔｒａｃｅｌ　１０ｋ］）を用いて０．５ｍＬに濃縮し、マウス抗ヒトＴＳＨα抗体の還元抗体を得た。この還元抗体０．５ｍＬと、１００μＬマレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムとを４℃で１晩反応させ、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００　１０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてゲル濾過することで、標識抗体を調製した。この標識抗体（この抗体は、ポリアクリル酸ナトリウム－抗ヒトＴＳＨα抗体結合物ともいう。）を、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）でタンパク質濃度４μｇ／ｍＬになるように希釈することで、第２の結合物を調製した。
　なお、上記マレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムは、次のように調製した。まず、窒素ガス導入管、温度計、及び撹拌装置を付した１００ｍＬの三口フラスコ内で、アクリル酸（和光純薬工業社製）２ｇ、２－アミノエタンチオール（和光純薬工業社製）０．０２１ｇ、及びアゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．０２３ｇをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５０ｍＬに溶解し、１時間に亘り窒素置換を行った。その後、７０℃で７時間に亘り重合反応を行った。得られた反応液を１０ｍＬまで減圧濃縮し、粘稠状の物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ別し、更に真空乾燥機で１晩乾燥することで、アミノ基末端ポリアクリル酸を得た（収量１．５ｇ）。このアミノ基末端ポリアクリル酸０．５ｇ及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１０ｍＬを、窒素ガス導入管、及び撹拌装置を付した５０ｍＬのナスフラスコに入れ、溶解した。そこにＥＭＣＳ（Ｎ－（６－マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド）（同仁化学研究所社製）３ｍｇを加え、一晩反応した。得られた反応液を１ｍＬまで減圧濃縮し、粘稠な物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ別し、更に真空乾燥機で、１晩乾燥しマレイミド基末端ポリアクリル酸を得た。このマレイミド基末端ポリアクリル酸の数平均分子量は約１３００００（ＧＰＣシステム：島津製作所製、カラム：東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ　Ｓｕｐｅｒ　ＡＷ３０００、６ｍｍ　ＩＤ．×１５０ｍｍ、移動相：０．１Ｍ　硝酸ナトリウム）であり、収量は０．４ｇであった。
　（検体の調製）
　ＴＳＨ；Ａｓｐｅｎ　Ｂｉｏ　Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．製ヒト甲状腺刺激ホルモン（活性８．５ＩＵ／ｍｇ、ＷＨＯ８０／５５８）の溶液（濃度３０μｇ／ｍＬ）を、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティクス社製「ビトロス（登録商標）　ＴＳＨ　キャリブレータ１」で、０．０６ｍＩＵ／Ｌ、０．００１２ｍＩＵ／Ｌとなるよう希釈したものを、それぞれ検体２、３とした。なお、ヒト甲状腺刺激ホルモン活性を含有しないことを除き、同様の手順で調製したものを検体１とした。
　（展開）
　第１の結合物の分散溶液１５０μＬ及び第２の結合物の分散溶液２００μＬをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサーで１秒間撹拌した後、検体１～３各々を５０μＬ注ぎ、ボルテックスミキサーで撹拌した後、室温（２１℃）で５分間インキュベートした。チューブから反応液全量を採り、予め３７℃に保温してある反応管（図３参照）に注ぎ、３７℃で５分間に亘り保温した。
　その後、反応管内の反応液に、寸法５ｍｍ×５０ｍｍ、０．１μｍ以下の孔径を有する展開担体としてのＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製メンブレンフィルタ「Ｈｉ－Ｆｌｏｗ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　＃ＳＮＨＦ０４００」（商品名）を、その下端から約１０ｍｍの位置まで浸し、１分間に亘り静置した。その後、メンブレンフィルタを静かに引き上げ、メンブレンフィルタ上の様子を観察した。この結果を図９に示す。
　（判別）
　図９に示されるように、検出対象を含有しない検体１では、メニスカスに対応する位置（下端から約１０ｍｍ）に、凝集体中の結合物（磁性粒子）の存在に起因する茶色のバンドが確認された。これに対して、検出対象を含有する検体２、３では、メニスカスに対応する位置での茶色のバンドは確認されず、広範囲に茶色域が確認された。従って、メニスカスに対応する位置の茶色バンドの濃さが、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。また、茶色域の位置がメニスカス位置に集中せず、広範囲に亘ることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。
　＜実施例２＞
　本実施例では、第１の結合物として抗ＨＢｓ抗体結合－温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第２の結合物として抗ＨＢｓ抗体結合ポリエチレングリコールを用いて、ＨＢｓ抗原を検出する例を示す。
　（第１の結合物の調製）
　（株）特殊免疫研究所製の抗ＨＢｓモノクローナル抗体（抗原決定基：ａ、クローン番号Ｈｙｂ－８２４）を、ＰＩＥＲＣＥ社製ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ　Ｋｉｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔ＃２１４２０（商品名）を用い、キットに添付のビオチン化方法に従ってビオチン化し、ビオチン化抗ＨＢｓモノクローナル抗体を調製した。
　温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子であるマグナビート（株）製のＴｈｅｒｍａ－Ｍａｘ（登録商標）　ＬＳＡ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（３０）（０．２質量％）５００μｌを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、更にＰＢＳバッファーに溶解したビオチン化抗ＨＢｓモノクローナル抗体５０μｌ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、４℃で１５分間に亘り転倒混和した。前記マイクロチューブを３７℃に加熱した後、前記磁性粒子を磁石で回収し、上清部分を除去し、抗ＨＢｓモノクローナル抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を調製した。
　この抗ＨＢｓモノクローナル抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を含むチューブに、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）５００μＬを加え、冷却することで、前記磁性粒子を分散させ、第１の結合物の分散溶液を調製した。
　（第２の結合物の調製）
　抗ヒトＴＳＨα抗体の代わりに、（株）特殊免疫研究所製の抗ＨＢｓモノクローナル抗体（抗原決定基：ｄ、クローン番号Ｈｙｂ－３４２３）及び抗ＨＢｓモノクローナル抗体（抗原決定基：ｙ、クローン番号Ｈｙｂ－３４５７）を用いた点、及び２－メルカプトエタノールの代わりに２－メルカプトエチルアミン塩酸塩を用いた点を除き、実施例１と同様の手順で、２種類の抗ＨＢｓモノクローナル抗体の還元抗体を得た。これらの還元抗体から、マレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムの代わりにマレイミド化ポリエチレングリコールを用いた点を除き、実施例１と同様の手順で２種類の標識抗体を得て、第２の結合物を調製した。なお、用いたマレイミド化ポリエチレングリコールは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＭＥ－４００ＭＡ（商品名）日油（株）製　重量平均分子量４０，０００である。
　（検体の調製）
　（株）特殊免疫研究所製の精製ＨＢｓ抗原を、０．５％ＢＳＡ（シグマ社製）及びＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度へと希釈した。この希釈物を、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製「ビトロス（登録商標）　ＨＢｓ抗原（ロット番号２３３０）キットで陰性と判断されたヒト血清で、１０ｎｇ／ｍＬの濃度へと希釈したものを陽性検体（検体２）とした。また、このヒト血清を陰性検体（検体１）とした。
　（展開）
　第１の結合物の分散溶液１００μＬ、第２の結合物の分散溶液１００μＬ及び検体５μＬを用いた点を除き、実施例１と同様の手順でメンブレンフィルタへの展開を行い、メンブレンフィルタ上の様子を観察した。この結果を図１０に示す。
　（判別）
　図１０に示されるように、検出対象を含有しない検体１では、メニスカスに対応する位置（図中の矢印で示す位置）に、凝集体中の結合物（磁性粒子）の存在に起因する茶色のバンドが確認された。これに対して、検出対象を含有する検体２では、メニスカスに対応する位置での茶色のバンドは確認されず、広範囲に茶色域が確認された。従って、メニスカスに対応する位置の茶色バンドの濃さが、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。また、茶色域の位置がメニスカス位置に集中せず、広範囲に亘ることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。
　１０　第１の結合物
　１１　刺激応答性ポリマー
　１３　第１の抗体（第１の親和性物質）
　１５　アビジン
　１７　ビオチン
　１９　磁性物質
　２０　第２の結合物
　２１　第２の物質
　２３　第２の抗体（第２の親和性物質）
　３０　展開担体
　４０　展開器具
　４１　上保持具
　４２　下保持具
　４３　供給口部
　４４　窓部
　４７　フィルタ
　５０　検出対象

Claims (11)

  1. 　検体中の検出対象を検出する方法であって、
    　刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、
    　得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
    　前記展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号を確認し、前記信号が、前記検出対象の非存在下と異なる場合には、前記検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む方法であり、
    　第１の親和性物質と第２の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
  2. 　第１の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも弱い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する請求項１記載の方法。
  3. 　前記混合物は、第１の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
    　第１の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも強い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する請求項１記載の方法。
  4. 　検体中の検出対象を定量する方法であって、
    　刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、
    　得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
    　前記展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、前記検出対象の量と信号強度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出する工程を含む方法であり、
    　第１の親和性物質と第２の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
  5. 　第１の結合物の凝集体の存在に起因する信号を測定する請求項４記載の方法。
  6. 　前記混合物は、第１の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
    　第１の結合物の存在に起因する信号の強度を測定する請求項４記載の方法。
  7. 　第１の結合物は有色粒子を有し、
    　前記信号は、前記有色粒子の存在に基づく色に依存したものである請求項１から６いずれか記載の方法。
  8. 　第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有し、
    　前記信号は、前記発色もしくは発光する物質の存在に基づく色又は光に依存したものである請求項１から７いずれか記載の方法。
  9. 　検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
    　刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、
    　前記結合物を展開するための展開担体と、を備えるキット。
  10. 　第１の結合物は有色粒子を有する請求項９記載のキット。
  11. 　第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有する請求項９又は１０記載のキット。
PCT/JP2010/058651 2009-05-29 2010-05-21 検出対象の検出方法及び定量方法 WO2010137532A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2763856A CA2763856C (en) 2009-05-29 2010-05-21 Signal transduction by aggregation inhibition developed on a solid carrier
JP2011516004A JP5329658B2 (ja) 2009-05-29 2010-05-21 検出対象の検出方法及び定量方法
US13/322,809 US9063144B2 (en) 2009-05-29 2010-05-21 Detection method and quantification method for target substance
CN201080023788.8A CN102483409B (zh) 2009-05-29 2010-05-21 检出对象的检出方法和定量方法
EP10780487A EP2437059A4 (en) 2009-05-29 2010-05-21 DETECTION METHOD AND QUANTIFICATION METHOD OF A DETECTION TARGET

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009130958 2009-05-29
JP2009-130958 2009-05-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010137532A1 true WO2010137532A1 (ja) 2010-12-02

Family

ID=43222642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/058651 WO2010137532A1 (ja) 2009-05-29 2010-05-21 検出対象の検出方法及び定量方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9063144B2 (ja)
EP (1) EP2437059A4 (ja)
JP (1) JP5329658B2 (ja)
CN (1) CN102483409B (ja)
CA (1) CA2763856C (ja)
WO (1) WO2010137532A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102680510A (zh) * 2012-05-30 2012-09-19 渤海大学 一种味精中掺入硫酸镁的定性鉴别方法
WO2014038585A1 (ja) * 2012-09-04 2014-03-13 Jnc株式会社 物質測定センサー
JP2016006405A (ja) * 2014-05-28 2016-01-14 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法
WO2017090721A1 (ja) * 2015-11-26 2017-06-01 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検体中の検出対象を定量する方法
WO2017115440A1 (ja) * 2015-12-28 2017-07-06 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法
JP2018128366A (ja) * 2017-02-09 2018-08-16 積水メディカル株式会社 イムノクロマトグラフ法
WO2020027234A1 (ja) * 2018-08-02 2020-02-06 キヤノンメディカルシステムズ株式会社 分析方法、試薬キット及び分析装置
JP7486978B2 (ja) 2020-02-28 2024-05-20 キヤノン株式会社 検査薬、検査キットおよび検査方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108700580B (zh) * 2016-02-12 2021-12-14 Jsr株式会社 添加剂、表面处理剂、表面改性乳胶粒子、表面改性乳胶粒子的制造方法、乳胶凝聚反应用试剂、试剂盒、以及靶物质的检测方法
NL2019775B1 (en) * 2017-10-20 2019-04-29 Univ Delft Tech Coacervate-based detection of a compound of interest
US20200132681A1 (en) * 2018-10-30 2020-04-30 University Of New Hampshire 2-dimensional surfaces capable of monitoring stimuli-responsive behavior and methods of use thereof
CN109613257B (zh) * 2018-12-01 2021-02-26 山东博科生物产业有限公司 一种转铁蛋白(trf)检测试剂盒
CN111381034A (zh) * 2020-03-03 2020-07-07 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种gpc-3抗体包被磁珠及其制备方法、试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5811575A (ja) 1981-07-13 1983-01-22 Hohnen Oil Co Ltd 耐水性接着剤
JPH0548100A (ja) 1991-08-20 1993-02-26 Fujitsu Ltd 半導体装置の製造方法
WO2001009141A1 (fr) 1999-07-29 2001-02-08 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Derives de biotine polymerisables, polymere de la biotine et polymere reagissant a la stimulation de l'avidine
JP2005082538A (ja) 2003-09-09 2005-03-31 Chisso Corp 刺激応答性ポリマー固定化磁性微粒子及びこれを用いた吸着材
JP2006145256A (ja) * 2004-11-16 2006-06-08 Sekisui Chem Co Ltd 磁性体内包粒子、免疫測定用粒子及びイムノクロマトグラフィ法
WO2008001868A1 (en) 2006-06-30 2008-01-03 Chisso Corporation Kit for detection/quantification of analyte, and method for detection/quantification of analyte

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5811575B2 (ja) 1976-08-16 1983-03-03 帝国臓器製薬株式会社 抗原−抗体反応の測定法
US5091206A (en) * 1987-10-26 1992-02-25 Baxter Diagnostics Inc. Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof
US5314804A (en) * 1992-03-24 1994-05-24 Serim Research Corporation Test for Helicobacter pylori
JP2000500733A (ja) * 1995-09-01 2000-01-25 ユニバーシティ オブ ワシントン 相互作用分子結合体
US7981688B2 (en) * 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
US9372187B2 (en) * 2007-12-28 2016-06-21 Ortho-Clinical Diagnostics Kabushiki Kaisha Detection method and determination method for detection target
CN101952724B (zh) * 2007-12-28 2014-08-13 奥索临床诊断股份有限公司 检测对象的检测方法和定量方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5811575A (ja) 1981-07-13 1983-01-22 Hohnen Oil Co Ltd 耐水性接着剤
JPH0548100A (ja) 1991-08-20 1993-02-26 Fujitsu Ltd 半導体装置の製造方法
WO2001009141A1 (fr) 1999-07-29 2001-02-08 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Derives de biotine polymerisables, polymere de la biotine et polymere reagissant a la stimulation de l'avidine
JP2005082538A (ja) 2003-09-09 2005-03-31 Chisso Corp 刺激応答性ポリマー固定化磁性微粒子及びこれを用いた吸着材
JP2006145256A (ja) * 2004-11-16 2006-06-08 Sekisui Chem Co Ltd 磁性体内包粒子、免疫測定用粒子及びイムノクロマトグラフィ法
WO2008001868A1 (en) 2006-06-30 2008-01-03 Chisso Corporation Kit for detection/quantification of analyte, and method for detection/quantification of analyte

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADV. POLYM. SCI., vol. 4, 1965, pages 111
AKIHIKO KONDO ET AL.: "Nanotechnology to Biosensor I. Nano-Ryushi Kanren 4. Netsu Otosei Jisei Ryushi ni yoru Kosoku Jiki Bunri", JOURNAL OF MEDICAL TECHNOLOGY, vol. 50, no. 12, 30 November 2006 (2006-11-30), pages 1375 - 1384, XP008164719 *
AKIHIKO KONDO ET AL.: "Powder Nanotechnology (2) Powder Technology for Future Nanotechnology 2.3 Powder Technology for Future Bio-Nanotechnology and Biosensing 2.3.3 Development of Magnetic Nanocomposite Particles and their Application to Biotechnology", JOURNAL OF THE SOCIETY OF POWDER TECHNOLOGY, vol. 43, no. 12, 10 December 2006 (2006-12-10), JAPAN, pages 906 - 911, XP008164716 *
GHOSH ET AL., BIOCONJUGATE CHEM., vol. 1, 1990, pages 71 - 76
J. POLYMER SCI., vol. 3, 1965, pages 1031
NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 16, 1988, pages 3671
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 15, 1987, pages 5275
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 16, 1988, pages 3671
See also references of EP2437059A4 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102680510A (zh) * 2012-05-30 2012-09-19 渤海大学 一种味精中掺入硫酸镁的定性鉴别方法
WO2014038585A1 (ja) * 2012-09-04 2014-03-13 Jnc株式会社 物質測定センサー
CN104755932A (zh) * 2012-09-04 2015-07-01 捷恩智株式会社 物质测定传感器
JPWO2014038585A1 (ja) * 2012-09-04 2016-08-12 Jnc株式会社 物質測定センサー
US10401356B2 (en) 2012-09-04 2019-09-03 Jnc Corporation Analyte-measuring sensor
JP2016006405A (ja) * 2014-05-28 2016-01-14 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法
WO2017090721A1 (ja) * 2015-11-26 2017-06-01 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検体中の検出対象を定量する方法
JPWO2017090721A1 (ja) * 2015-11-26 2018-11-15 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検体中の検出対象を定量する方法
WO2017115440A1 (ja) * 2015-12-28 2017-07-06 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法
JP2018128366A (ja) * 2017-02-09 2018-08-16 積水メディカル株式会社 イムノクロマトグラフ法
WO2020027234A1 (ja) * 2018-08-02 2020-02-06 キヤノンメディカルシステムズ株式会社 分析方法、試薬キット及び分析装置
JP7486978B2 (ja) 2020-02-28 2024-05-20 キヤノン株式会社 検査薬、検査キットおよび検査方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2763856A1 (en) 2010-12-02
JP5329658B2 (ja) 2013-10-30
JPWO2010137532A1 (ja) 2012-11-15
US9063144B2 (en) 2015-06-23
CN102483409B (zh) 2016-05-18
US20120070912A1 (en) 2012-03-22
CA2763856C (en) 2014-07-08
EP2437059A1 (en) 2012-04-04
CN102483409A (zh) 2012-05-30
EP2437059A4 (en) 2013-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5329658B2 (ja) 検出対象の検出方法及び定量方法
EP2037272B1 (en) Kit for detection/quantification of analyte, and method for detection/quantification of analyte
JP5193228B2 (ja) 検出対象の検出方法及び定量方法
JP5184554B2 (ja) 検出対象の検出方法及び定量方法
US20190170758A1 (en) Method of detection with a fluorescent labeling particle
US10203326B2 (en) Method of detecting target substance
JP5026251B2 (ja) 検出対象の検出方法及び定量方法
JP2016121940A (ja) アプタマーを用いた検査診断方法
JP2009162534A (ja) 検出対象の検出方法及び定量方法
JP5184072B2 (ja) 検出対象の検出方法及び定量方法
JP6282819B2 (ja) 検出対象を検出又は定量するためのキット、及び方法
US20180348228A1 (en) Method of Determining Quantity of Objects to be Detected in Specimen
US20190011442A1 (en) Method for detecting substance of interest, method for quantifying substance of interest, kit, and method for preparing reagent
JP2016006405A (ja) 検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080023788.8

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10780487

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011516004

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13322809

Country of ref document: US

Ref document number: 2763856

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 4881/KOLNP/2011

Country of ref document: IN

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010780487

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010780487

Country of ref document: EP