JP2018128366A - イムノクロマトグラフ法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、測定試薬が測定装置に記憶させてある基準検量線と適合する温度になるまで測定を開始できない機構を測定装置に搭載させる方式も知られているが、測定装置の小型化という要請に応えるため、冷却機能を有さずに、一定温度までの昇温機能のみを有する温度制御装置が搭載されている場合には対応できない。
以上のように、イムノクロマトグラフ法での測定装置を用いた定量測定において、反応温度の管理が重要であるが、測定試薬においてこれを解決しようという試みはなされていなかった。
しかし、イムノクロマトグラフ法における温度応答性ポリマーの利用例はこれまでにない。
[1]イムノクロマトグラフ法であって、
曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子の存在下、免疫反応を行う前記イムノクロマトグラフ法。
[2]イムノクロマトグラフ法であって、
(1)サンプルパッドと(2)対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より(1)、(2)の順で配置されたテストストリップを使用し、
(a)生物試料及び曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
(b)前記メンブレン上に曇点が20〜40℃の重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
(c)免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
を含む、前記イムノクロマトグラフ法。
[3]生物試料が、全血、血清又は血漿である、[1]または[2]に記載の検出方法。
[4]イムノクロマトグラフ法おける温度依存性の均一化方法であって、曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子の存在下、免疫反応を行う前記温度依存性の均一化方法。
[5]イムノクロマトグラフ法における温度依存性の均一化方法であって、
(1)サンプルパッドと(2)対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より(1)、(2)の順で配置されたテストストリップを使用し、
(a)生物試料を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
(b)前記メンブレン上に曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
(c)免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
を含む、前記メンブレン上での免疫反応の温度依存性の均一化方法。
[6]イムノクロマトグラフ法であって、
(1)サンプルパッドと(2)対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より(1)、(2)の順で配置されたテストストリップを使用し、
(a)生物試料を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
(b)前記メンブレン上に曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
(c)免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
(d)検出したデータをあらかじめ求めた検量線データをもとに対象物質の量を算出する工程、
を含む前記イムノクロマトグラフ法。
[7]あらかじめ求めた検量線データが、対象物質の免疫反応温度と2℃以上異なる温度で検出されたものである、[6]に記載のイムノクロマトグラフ法。
[8]曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含有するイムノクロマトグラフ用の検体希釈液。
[9]曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含有するイムノクロマトグラフィー用の検体希釈液と、イムノクロマトグラフ用テストデバイスとを含むイムノクロマトグラフ用試薬キット。
[10]重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含有する高分子溶液であって、曇点が20℃〜40℃である高分子溶液を使用するイムノクロマトグラフ法。
本発明の高分子の曇点は、20℃〜40℃であり、好ましくは、22℃〜35℃であり、更に好ましくは、24℃〜33℃である。
曇点とは、透明または半透明な液体で温度変化によって相分離が起き、その結果不透明になる温度のことであり、下限臨界溶解(溶液,共溶)温度とも呼ばれる。
本発明に用いられる曇点が20℃〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子としては、例えば、曇点が20〜40℃の温度応答性高分子、曇点が20〜40℃の界面活性剤、曇点が20〜40℃の親水性高分子等が挙げられる。
上記温度応答性高分子としては、例えば、アルキル(メタ)アクリルアミドの単独重合体、又はアルキル(メタ)アクリルアミド−(メタ)アクリル酸の共重合体であり、ポリ−N−n−プロピルアクリルアミド(単独重合体の曇点21℃)、ポリ−N−n−プロピルメタクリルアミド(同27℃)、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(以下、NIPAMということがある)(同32℃)、ポリ−N−エトキシエチルアクリルアミド(同約35℃)、ポリ−N−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(同約28℃)、ポリ−N−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド(同約35℃)、ポリ−N,N−ジエチルアクリルアミド(同32℃)等の単独重合体、又は共重合体が挙げられ、好ましくは、N−イソプロピルアクリルアミドの単独重合体、N−イソプロピルアクリルアミドと(メタ)アクリル酸を重合性単量体の単位とし、両者が共重合したものであり、更に好ましくは、N−イソプロピルアクリルアミドの単独重合体、N−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸を重合性単量体の単位とし、両者が共重合したものである(以下、NIPAM−MAという。
当該単独重合体、共重合体は、例えば、Sigma−Aldrich社より種々の重量平均分子量の単独重合体、又は(メタ)アクリル酸含有量の共重合体を購入することができる。
本発明において単独重合体の重量平均分子量は、5,000〜50,000が好ましく、10,000〜40,000が更に好ましく、更により好ましくは12,000〜40,000である。
共重合体の重量平均分子量は、5,000〜60,000が好ましく、25,000〜60,000が更に好ましく、共重合体中の(メタ)アクリル酸含有量は、0.1〜10mol%が好ましく、NIPAMと5mol%のメタクリル酸との共重合体(製品名:NIPAM−5MA)が好適に用いられる。
本発明のイムノクロマトグラフ用デバイスは、(1)サンプルパッド、(2)検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より(1)、(2)の順で配置されている。
以下、検出対象物質を抗原、検出対象物質と特異的に結合可能な成分を抗抗原特異抗体(以下、特異抗体ということがある)とし、2以上の特異抗体で抗原−特異抗体複合体を形成させて検出を行うサンドイッチ法を例に、図1を参照しながら説明する。なお、本明細書において「上流」、「下流」とは、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のイムノクロマト用デバイスで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
(サンプルパッド)
本発明において、「サンプルパッド」とは、サンプルを受け入れるサンプル供給部を担う部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物の成分とが通り抜けることができる物質及び形態であればいずれのものをも含む。
その場合、曇点20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子は、サンプルパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全部に含ませておくこともできる。
また、サンプルパッドには、緩衝液を含ませておくこともできる。その場合、サンプルパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全部に含ませることもできる。
サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維(グラスファイバー)、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、本発明の目的を逸脱せず、反応系に影響のない範囲において、必要に応じ通常使用されるブロッキング試薬を含ませることもできる。
本発明の、曇点20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子は、サンプルパッドにあらかじめ添加して乾燥することで保持させておいてもよい。
検出対象物質と特異的に結合可能な成分(抗抗原特異抗体)が固定化されたメンブレンは、特異抗体を含有する溶液を線状に塗布することによって得ることができる。当該線状に塗布された特異抗体は、抗原をメンブラン上に捕捉、濃縮する役割を担う。
使用するメンブレンの材質は、任意の材質のものが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類あるいはセラミックス等が挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、メルク社、東洋濾紙社、ワットマン社などより販売されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などなどが好適に用いられる。
なお、特異抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、F(ab’)2のような断片であってもよい。更に抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。また遺伝子組み換え技術の利用やDNA免疫法の採用など、取得方法のよる制限を受けない。
抗原−特異抗体複合体を検出するためには、標識物質で標識された特異抗体が必要でありこれをコンジュゲートと呼ぶ。標識物質としては、酵素(パーオキシダーゼなど)、発色あるいは発光性の色素(フルオレセインなど)、金属コロイド(金コロイド)、着色された微粒子(カラーラテックスなど)などが好適に用いられる。
このコンジュゲートを溶液状態で使用する場合には、予め試料と混合して使用したり、試料をサンプルパッドに添加後にサンプルパッドに添加したりすることができる(上記した(A)の態様に含まれる)。イムノクロマト用デバイスが、コンジュゲートパッドを有する場合には、これに含浸させておき、イムノクロマト用デバイスを構成することができる。
その場合、曇点20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子は、コンジュゲートパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全部に含ませておくこともできる。
コンジュゲートパッドの材質としては、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス繊維またはレーヨンのような不織繊維が挙げられるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが好適に用いられる。
なお、サンプルパッドがコンジュゲートパッドの機能を兼ね備えている場合には、一の部材でサンプルパッド及びコンジュゲートパッドを有するものとみなす。
本発明のイムノクロマト用デバイスには、検体(サンプル)中の非特異抑制物質を補足する目的、全血中の血球を捕捉する目的で3rdパッド(血球分離用パッド)を有していてもよい。3rdパッド(血球分離パッド)を有する場合には、上流からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、の順で配置されるのが好ましいが、これに限定されない。3rdパッド(血球分離パッド)の材質はガラス繊維(グラスファイバー)、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が好適である。
イムノクロマトグラフ用デバイスの製造方法は、抗原や抗体等の安定性、感度等、イムノクロマトグラフ法の性能に悪影響を与えないことを限度としてイムノクロマトグラフ法に使用される技術(例えばブロッキング)であればいずれも使用することができる。また、イムノクロマトグラフ法において使用される添加剤(非特異的反応の抑制物質、増感剤、保湿剤、安定化剤、防腐剤)も同様である。
本発明のイムノクロマトグラフ用デバイスによる検出対象物質の検出方法は、特に制限を受けないが、吸光度や反射光強度を検知する機器を用いた定量法においてその効果を最大に享受することができる。
本発明における検出対象物質は、抗原抗体反応に利用できるものであれば制限を受けないが、臨床検査において、全血での測定要望が高い、C反応性タンパク(CRP)、ヘモグロビン、ヒトフィブリノーゲン、DDダイマー、BNP、hFABP等が好適に挙げられる。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(1)金コロイド標識抗CRP抗体(コンジュゲート)の作製
抗CRPモノクローナル抗体(Clone:08207)を2mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)で抗体濃度20μg/mLの抗体液に調製し、1 OD/mLの金コロイド粒子(粒径30nm)溶液20mLに対し、1mLの抗体液を添加し、室温で10分間撹拌した。金コロイド粒子−抗体混合液に対し、5重量%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を2mL添加し、さらに5分間撹拌後、10℃にて、10,000rpmで45分間遠心し、沈渣(コンジュゲート)を得た。得られたコンジュゲートに対し、Conjugate Dilution Buffer(Scripps社製)を1.2mL添加し、コンジュゲートを懸濁させた。各コンジュゲートの最大吸収波長における吸光度を測定した。
なお、抗体は、便宜上、それぞれを産生するハイブリドーマのクローン名で表している(以下同じ)。
上記(1)で調製したコンジュゲートを、15 OD/mL、3重量%BSA、4重量%スクロースを含む20mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.2)で希釈し、コンジュゲート溶液を作製した。これを、一定体積のグラスファイバー製パッド(日本ポール社、No.8964)に、該パッド体積の1.2倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で70℃、30分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。また、必要に応じ、増感剤などの添加剤を添加する場合には、前記コンジュゲート溶液に必要量を添加した後、同様の操作を行えばよい。
抗CRPモノクローナル抗体(Clone:08210)を1mg/mLになるように、2.5重量%スクロースを含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)として調製し、ニトロセルロースメンブレン(ミリポア社、HF240またはHF180)の短辺の一端の内側の位置に抗CRPモノクローナル抗体(テストライン)を、約5mmの間隔をあけて抗免疫グロブリン抗体(コントロールライン)を、イムノクロマト用ディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社)を用いて、0.75μL/cmとなるようにライン状に塗布した。ドライオーブン内で70℃、45分乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
24mmol/L塩化ナトリウム、0.5重量%スクロース及び30mmol/Lエチレンジアミンテトラ酢酸を含む20mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.2)を、一定体積に切断したグラスファイバー製パッド(Lydall社)に、該パッド体積の1.15倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で70℃、45分乾燥し、サンプルパッドとした。
プラスチックス製粘着シート(a)に上記抗体固定化メンブレン(b)を貼り、展開上流部側に抗CRPモノクローナル抗体(テストライン)(c)、次いで抗免疫グロブリン抗体(コントロールライン)(d1)の順に塗布部を配置し、さらにグラスファイバー製パッドからなる3rdパッド(i)を装着した。次いで、上記2)で作製したコンジュゲートパッド(e)を配置装着し、さらにこのコンジュゲートパッドに重なるように上記4)で作製したサンプルパッド(f)を配置装着し、反対側の端には吸収パッド(g)を配置装着した。また、最後に抗体固定化メンブレンおよび吸収パッドを被覆するように、上面にポリエステルフィルム(h)を配置装着し、ラミネート加工した。このように各構成要素を重ね合わせた構造物に切断してテストストリップを作製した。該テストストリップは、アッセイの際、プラスチックス製の専用のハウジング(サンプル添加窓部、サンプル検出窓部及びテストライン検出窓部を有する、図1中図示せず)に格納・搭載し、テストデバイスの形態にした。図1にテストストリップの模式構成図を示した。
Tween20を終濃度で0.01重量%含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)に防腐剤を添加し、0.45μmフィルターで濾過した液体を本試薬の検体希釈液とした。
以下の操作を20℃、27℃、30℃の恒温槽内で行った。前記「試験例」で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。全血試料又は血漿試料を検体希釈液でそれぞれ151倍希釈し、テストストリップのサンプル滴下窓に滴下して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア(登録商標、積水メディカル社製)でCRP濃度測定を行った。各試料の測定はn=3で行い平均値を算出した。算出した平均測定値は27℃での平均測定値を100として%で表示した。
以下の操作を15℃、27℃、30℃の恒温槽内で行った。試験例で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。各血漿試料をそれぞれ0.1%、0.3%、0.5%のNIPAM(重量分子量20,000〜40,000)(Sigma−ALDrich社製)(曇点32℃)を含有する検体希釈液でそれぞれ151倍希釈し、テストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア(登録商標、積水メディカル社製)でCRP濃度測定を行った。
また、比較のために、NIPAMを含まない検体希釈液についても同様に測定を行った。
NIPAMを含有しない検体希釈液(従来希釈液)を用いた場合は、低値(0.30mg/dL)、中値(2.90mg/dL)、高値(6.97mg/dL)の測定値において温度の影響が見られた。
これに対して、0.1%、0.3%、0.5%NIPAMを含有した検体希釈液を用いた場合は、低値、中値、高値の測定値ともに温度の影響が小さくなり、特に、0.3%、0.5%NIPAMの含有で温度の影響がほとんどなくなった。
1.測定方法
以下の操作を15℃、27℃、30℃の恒温槽内で行った。試験例で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。各血漿試料をそれぞれ0.3%、0.5%NIPAM(重量分子量20,000〜40,000)を含有する検体希釈液でそれぞれ151倍希釈し、テストテストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア(積水メディカル社製)でCRP濃度測定を行った。
測定結果を図3に示した。0.3%、0.5%NIPAM含有希釈液を用いることにより、低値、高値の測定値ともに温度の影響を受けなかった。
1.測定方法
以下の操作を20℃、27℃、30℃の恒温槽内で行った。試験例で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。血漿試料を0.02%NIPAM−5MA(重量平均分子量50,000、MA含量5mol%)(Sigma−ALDrich社製)を含有する検体希釈液でそれぞれ151倍希釈し、テストテストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア(積水メディカル社製)でCRP濃度測定を行った。
測定結果を図4に示した。0.02%のNIPAM−5MA含有希釈液を用いることにより、測定値が温度の影響を受けなかった。
1.測定方法
以下の操作を20℃、27℃、30℃の恒温槽内で行った。試験例で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。血漿試料を0.02%NIPAM−5MA(重量平均分子量50,000、MA含量5mol%)を含有する検体希釈液でそれぞれ151倍希釈し、テストテストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア(積水メディカル社製)でCRP濃度測定を行った。
測定結果を図5に示した。0.02%NIPAM−5MAの含有希釈液を用いることにより、測定値が温度の影響を受けなかった。
1.測定方法
以下の操作を25℃、30℃の恒温槽内で行った。前記試験例の抗CRPモノクローナル抗体を抗ヘモグロビンモノクローナル抗体に置き換えた以外は同様の方法により作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。
全血試料を0.08%NIPAM−5MA(重量平均分子量50,000、MA含量5mol%)を含有する検体希釈液でそれぞれ151倍希釈し、テストテストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア(積水メディカル社製)でヘモグロビン濃度測定を行った。ヘモグロビン濃度は、ブロゾーン以上の減衰領域で測定した
測定結果を図6に示した。0.08%NIPAM−5MAの含有希釈液を用いることにより、測定値が温度の影響を受けなかった。
(b)抗体固定化メンブレン
(c)抗CRPモノクローナル抗体(テストライン)
(d1)抗免疫グロブリン抗体(コントロールライン)
(e)コンジュゲートパッド
(f)サンプルパッド
(g)吸収パッド
(h)ポリエステルフィルム
(i)3rdパッド
Claims (10)
- イムノクロマトグラフ法であって、
曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子の存在下、免疫反応を行う前記イムノクロマトグラフ法。 - イムノクロマトグラフ法であって、
(1)サンプルパッドと(2)対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より(1)、(2)の順で配置されたテストストリップを使用し、
(a)生物試料及び曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
(b)前記メンブレン上に曇点が20〜40℃の重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
(c)免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
を含む、前記イムノクロマトグラフ法。 - 生物試料が、全血、血清又は血漿である、請求項1または2に記載の検出方法。
- イムノクロマトグラフ法おける温度依存性の均一化方法であって、曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子の存在下、免疫反応を行う前記温度依存性の均一化方法。
- イムノクロマトグラフ法における温度依存性の均一化方法であって、
(1)サンプルパッドと(2)対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より(1)、(2)の順で配置されたテストストリップを使用し、
(a)生物試料を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
(b)前記メンブレン上に曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
(c)免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
を含む、前記メンブレン上での免疫反応の温度依存性の均一化方法。 - イムノクロマトグラフ法であって、
(1)サンプルパッドと(2)対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より(1)、(2)の順で配置されたテストストリップを使用し、
(a)生物試料を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
(b)前記メンブレン上に曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
(c)免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
(d)検出したデータをあらかじめ求めた検量線データをもとに対象物質の量を算出する工程、
を含む前記イムノクロマトグラフ法。 - あらかじめ求めた検量線データが、対象物質の免疫反応温度と2℃以上異なる温度で検出されたものである、請求項6に記載のイムノクロマトグラフ法。
- 曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含有するイムノクロマトグラフ用の検体希釈液。
- 曇点が20〜40℃、重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含有するイムノクロマトグラフィー用の検体希釈液と、イムノクロマトグラフ用テストデバイスとを含むイムノクロマトグラフ用試薬キット。
- 重量平均分子量1,000〜100,000の高分子を含有する高分子溶液であって、曇点が20℃〜40℃である高分子溶液を使用するイムノクロマトグラフ法。
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