WO2017090721A1 - 検体中の検出対象を定量する方法 - Google Patents

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WO2017090721A1
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detection target
stimulus
responsive
mixture
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PCT/JP2016/084946
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悟 杉田
將行 福嶋
昌貴 西田
大久保　典雄
三好　一富
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オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社
古河電気工業株式会社
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    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying a detection target in a specimen.
  • a trace component in a specimen is detected using an antigen-antibody reaction or the like.
  • the specimen include specimens obtained from a living body such as various body fluids such as serum, plasma, urine, and lymph.
  • Patent Document 1 discloses a first binding substance in which a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target are combined, and a second substance having a charge.
  • the specimen are mixed and placed under the aggregation condition of the stimulus-responsive substance, and the stimulus-responsive substance is dispersed in the mixture
  • a method for detecting the presence or absence of a detection target based on the turbidity of a mixture.
  • the stimulus-responsive substance when the detection target is present, the stimulus-responsive substance is inhibited and dispersed while being agglutinated, whereas when the detection target is not present, the stimulus-responsive substance is aggregated.
  • the presence or absence of such aggregation inhibition is reflected in the turbidity of the mixture.
  • the greater the amount of the detection target the more the stimulus-responsive substance is agglomerated and dispersed to lower the turbidity, and then the relationship between the detection target amount and the turbidity is reversed.
  • the turbidity decreases from the initial value over time. This is because the agglomerated magnetic substance is solid-liquid separated by magnetic force, but higher detection sensitivity can be obtained by utilizing the difference between the maximum measured value and the measured value after that point. It has been.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a method capable of detecting and quantifying a detection target quickly and with high sensitivity.
  • the present inventors have found that the degree of dispersion of the stimulus-responsive substance can be detected and quantified rapidly and with high sensitivity by determining the particle size of the suspension in the mixture,
  • the present invention has been completed. Specifically, the present invention provides the following.
  • a method for quantifying a detection target in a sample A mixing step of mixing a carrier particle carrying a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target, and the specimen to prepare a mixture; A measurement step of placing the mixture under agglomeration conditions of the stimulus-responsive substance and measuring a particle size of a suspension in the mixture; Determining the amount of the detection target based on the particle diameter.
  • the detection target can be quantified quickly and with high sensitivity.
  • the method for quantifying a detection target in a sample of the present invention comprises a carrier particle carrying a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target (hereinafter sometimes referred to as a first bound substance), a sample Mixing step for preparing a mixture, placing the mixture under agglutination conditions of the stimulus-responsive substance, measuring step for measuring the particle size of the suspension in the mixture, and the amount to be detected based on the particle size Determining step.
  • sample> examples of the sample include various body fluids such as human or animal serum, plasma, urine, and lymph, biological materials such as feces, food and drinks, tap water, and samples collected from environments such as rivers.
  • detection target> examples of targets that can be detected by the above detection methods include environmental pollutants, food pollutants, and substances used for clinical diagnosis.
  • Such substances include dioxins, environmental hormones, pesticides, PCB (polychlorbiphenyl), organic mercury, prion fungus poison, puffer poison, antibiotics, fungicides, body fluids, urine, sputum, feces, etc.
  • Human immunoglobulin G Human immunoglobulin M, human immunoglobulin A, human immunoglobulin E, human albumin, human fibrinogen (fibrin and their degradation products), ⁇ -fetoprotein (AFP), C-reactive protein (CRP) ), Myoglobin, carcinoembryonic antigen, hepatitis virus antigen, human chorionic gonadotropin (hCG), human placental lactogen (HPL), HIV virus antigen, allergen, bacterial toxin, bacterial antigen, enzyme, hormone (eg, human thyroid stimulation Hormone (TSH), a Surin, etc.), and agents, and the like.
  • TSH human thyroid stimulation Hormone
  • the carrier particle is not particularly limited as long as it is a substance that can be directly or indirectly bound to the stimulus-responsive substance and / or the first affinity substance and can be suspended.
  • the carrier particles include organic fine particles such as silica and acrylic resin, particles made of metal, and the like, and particles made of silica are preferable.
  • Silica should just be a particle
  • Silica particles have a silanol group (Si—OH) on the surface of the particles, and are therefore highly hydrophilic, so that they are preferable in that they are easily reacted in water. Silica particles are also preferred because they are not toxic and are easy to handle and easy to manufacture.
  • the carrier particles do not need to be a magnetic material attracted by magnetic force and affect the magnetic field. It may be a non-magnetic substance that does not affect
  • the average refractive index of the carrier particles is preferably 1.3 or more, more preferably 1.3 or more and 4.0 or less, and more preferably 1.4 or more and 3.0 or less.
  • the average refractive index of carrier particles is preferably in the above range.
  • the average refractive index is a value measured at a wavelength of 589 nm and a temperature of 37 ° C. using an Abbe refractometer (DR-A1 manufactured by Atago Co., Ltd.) and a spectral light source.
  • the average particle size of the carrier particles may be appropriately selected, and may be, for example, 0.05 to 1.0 ⁇ m, or 0.3 to 0.7 ⁇ m.
  • the average particle diameter is a value measured by a scanning electron microscope (SEM).
  • a stimulus-responsive substance is a substance that undergoes a structural change in response to an external stimulus and can adjust aggregation and dispersion.
  • Examples of the stimulus include, but are not limited to, temperature change, light irradiation, acid or base addition (pH change), electric field change, and the like.
  • a temperature-responsive polymer that can be aggregated and dispersed by temperature change can be used as the stimulus-responsive substance.
  • the temperature-responsive polymer include a polymer having a lower critical solution temperature (hereinafter also referred to as LCST) and a polymer having an upper critical solution temperature (hereinafter also referred to as UCST).
  • LCST lower critical solution temperature
  • UCST upper critical solution temperature
  • a polymer having a lower critical solution temperature with an LCST of 37 ° C. is completely dispersed in an aqueous solution having a temperature lower than the LCST, and can be agglomerated immediately when the water temperature is raised above the LCST.
  • a polymer having an upper critical solution temperature with a UCST of 5 ° C. is completely dispersed in an aqueous solution having a temperature exceeding the UCST, and can be immediately aggregated when the water temperature is lowered below the UCST.
  • Examples of the polymer having a lower critical solution temperature used in the present invention include Nn-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-ethylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-acryloylpyrrolidine, N-acryloylpiperidine, N N substitution such as acryloylmorpholine, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-ethylmethacrylamide, N, N-dimethylmethacrylamide, N-methacryloylpyrrolidine, N-methacryloylpiperidine, N-methacryloylmorpholine Polymer composed of (meth) acrylamide derivative; hydroxypropyl cellulose, polyvinyl alcohol partially acetylated product, polyvinyl methyl ether, (polyoxyethylene-polyoxypro Len) block copolymers, polyoxyethylene alkylamine derivatives such as polyoxyethylene laurylamine; poly
  • copolymers of these polymers and at least two of these monomers can also be used.
  • a copolymer of N-isopropylacrylamide and Nt-butylacrylamide can also be used.
  • another copolymerizable monomer may be copolymerized with the polymer within a range having a lower critical solution temperature.
  • an elastin-derived polypeptide having a repeating sequence of a pentapolypeptide represented by Val-Pro-Gly-X-Gly (X is an amino acid other than proline) can be preferably used.
  • a polymer having the upper critical solution temperature used in the present invention a polymer comprising at least one monomer selected from the group consisting of acryloylglycinamide, acryloylnipecotamide, acryloylasparagineamide, acryloylglutamineamide, and the like can be used. Moreover, the copolymer which consists of these at least 2 types of monomers may be sufficient.
  • These polymers include other copolymerizable monomers such as acrylamide, acetylacrylamide, biotinol acrylate, N-biotinyl-N′-methacryloyl trimethylene amide, acryloyl sarcosine amide, methacryl sarcosine amide, acryloylmethyl uracil, etc. May be copolymerized within the range having the upper critical solution temperature.
  • a substance such as a pH-responsive polymer that can be aggregated and dispersed by changing pH can be used as the stimulus-responsive substance.
  • the pH at which the pH-responsive substance undergoes a structural change is not particularly limited, but is preferably pH 4 to 10, and preferably pH 5 to 9 from the viewpoint of suppressing a decrease in detection / quantification accuracy due to denaturation of carrier particles and specimens at the time of stimulation. More preferably.
  • Examples of such a pH-responsive polymer include polymers containing groups such as carboxyl, phosphoric acid, sulfonyl and amino as functional groups. More specifically, (meth) acrylic acid, maleic acid, styrene sulfonic acid, 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid, phosphorylethyl (meth) acrylate, aminoethyl methacrylate, aminopropyl (meth) acrylamide, dimethylamino
  • a monomer having a dissociating group such as propyl (meth) acrylamide may be polymerized, and the monomer having such a dissociating group and other vinyl monomers such as methyl (meta ) (Meth) acrylates such as acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate, vinyl compounds such as styrene, vinyl chloride and N-viny
  • the stimulus-responsive substance is not limited to the above-mentioned stimulus-responsive polymer.
  • Japanese Patent No. 3693979, Japanese Patent No. 3916330, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-85957, Japanese Patent No. 4071738, Japanese Patent No. 2869684 are disclosed.
  • Hydrogels disclosed in Japanese Patent No. 2927601, Japanese Patent No. 3845249, and the like may be used.
  • the first affinity substance is not particularly limited as long as it has affinity for the detection target.
  • affinity refers to the property that a certain substance specifically binds to another substance.
  • the first affinity substance include an antibody against the antigen when the detection target is an antigen, and an antigen against the antibody when the detection target is an antibody.
  • glutathione when the detection target is a protein with a GST tag
  • chelating agent coordinated with a metal ion when the detection target is a protein with a histidine tag
  • a nucleic acid having a complementary sequence when the detection target is a nucleic acid Can be mentioned.
  • the antibody may be any type of immunoglobulin molecule, and may be an immunoglobulin molecule fragment having an antigen binding site such as Fab.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the second bound substance is added in addition to the first bound substance in the mixing step described later.
  • This second binding substance is a combination of a hydrophilic substance and a second affinity substance for the detection target.
  • hydrophilic substance A hydrophilic substance will not be specifically limited if it is a substance which has hydrophilicity with respect to the aqueous dispersion medium mentioned later.
  • hydrophilic refers to the property that a substance has an affinity for an aqueous dispersion medium.
  • the hydrophilic high molecular compound which has an electric charge is mentioned, for example, It is preferable that it is a polyanion or a polycation.
  • the polyanion means a substance having a plurality of anion groups
  • the polycation means a substance having a plurality of cation groups.
  • polyanions include nucleic acids such as DNA and RNA.
  • nucleic acids have the properties of polyanions due to the presence of a plurality of phosphodiester groups along the nucleic acid urn.
  • the polyanion contains, as a polymerization component, a polypeptide having a large number of carboxylic acid functional groups (polypeptide consisting of amino acids such as glutamic acid and aspartic acid), polyacrylic acid, polymethacrylic acid, and acrylic acid or methacrylic acid.
  • Polysaccharides such as polymers, carboxymethylcellulose, hyaluronic acid, and heparin are also included.
  • examples of the polycation include polylysine, polyarginine, polyornithine, polyalkylamine, polyethyleneimine, and polypropylethyleneimine.
  • the number of functional groups of the polyanion (carboxyl group) or polycation (amino group) is preferably 25 or more.
  • the second affinity substance a substance that can bind non-competitively to the detection target at a site different from that of the first affinity substance is used.
  • the detection target is an antigen
  • the second affinity substance is a monoclonal antibody or a polyclonal that recognizes an antigen determinant to be detected that recognizes an antigenic determinant different from the first affinity substance in the antigen. It is an antibody.
  • the first binding substance is prepared by binding the stimulus-responsive substance and the first affinity substance directly or indirectly to the carrier particles.
  • This bonding method is not particularly limited.
  • a method of binding via a reactive functional group is exemplified, and a method well known in the art. You can go.
  • the binding between the stimulus-responsive substance and the first affinity substance is performed by binding both the stimulus-responsive substance and the first affinity substance to substances that are compatible with each other (for example, , Avidin and biotin, glutathione and glutathione S transferase), and the stimulus-responsive substance and the first affinity substance are bound via these substances.
  • substances that are compatible with each other for example, , Avidin and biotin, glutathione and glutathione S transferase
  • biotin is bound to a stimulus-responsive substance by adding biotin or the like to a polymerizable functional group such as methacryl or acryl to form an addition polymerizable monomer. It can be carried out by copolymerizing with other monomers.
  • the binding of avidin or the like to the first affinity substance can be performed according to a conventional method.
  • the biotin-binding stimulus-responsive substance and the avidin-bonded first affinity substance are mixed, the stimulus-responsive substance and the first affinity substance are bonded through the binding between avidin and biotin.
  • a monomer having a functional group such as carboxyl, amino, or epoxy is copolymerized with another monomer during the production of the polymer or the like, and the antibody affinity substance is passed through this functional group according to a method well known in the art.
  • a method of binding melon gel, protein A, protein G to a polymer can be used.
  • a monomer having a functional group such as carboxyl, amino, or epoxy may be copolymerized with another monomer during the production of the polymer, and the first antibody against the antigen to be detected may be directly bonded to these functional groups according to a conventional method. Good.
  • the first affinity substance and the stimulus-responsive polymer may be bound to the fine-particle magnetic substance.
  • the first binding substance may be purified by subjecting the first affinity substance to conditions where the stimulus-responsive polymer aggregates and then separating by centrifugation.
  • the first bound substance is purified by a method in which a particulate magnetic substance is bound to the stimulus-responsive polymer, and further the first affinity substance is bound, and then the magnetic substance is recovered by applying a magnetic force. Also good.
  • the fine magnetic substance can be bonded to the stimulus-responsive polymer via a reactive functional group, or a polymerizable unsaturated bond is introduced into the active hydrogen or polyhydric alcohol on the polyhydric alcohol in the magnetic substance.
  • the graft polymerization may be carried out by a method known in the art such as graft polymerization (for example, ADV.Polym.Sci., Vol.4, p111, 1965, J. Polymer Sci., Part-A, 3, p1031). 1965).
  • the second binding substance is prepared by directly or indirectly binding the hydrophilic substance and the second affinity substance.
  • substances having affinity for each other for example, avidin and biotin, glutathione and glutathione S transferase
  • the hydrophilic substance and the second affinity substance are indirectly bonded through these substances.
  • hydrophilic substance and the second affinity substance When the hydrophilic substance and the second affinity substance are directly bonded, they may be bonded through a functional group.
  • a functional group the method of Gosh et al. (Ghosh et al: Bioconjugate Chem. , 1, 71-76, 1990). Specifically, there are the following two methods.
  • a mercapto group also called a sulfhydryl group
  • a 6-maleimidohexanoic acid succinimide ester for example, “EMCS (trade name)” (Dojin) is introduced into an antibody.
  • the maleimide group is introduced by reacting Chemical). Next, these two substances are bonded through a mercapto group and a maleimide group.
  • a mercapto group is introduced at the 5 ′ end of the nucleic acid in the same manner as in the first method, and N, N-1,2-phenylene diene which is a homobifunctional reagent is further introduced into this mercapto group.
  • N, N-1,2-phenylene diene which is a homobifunctional reagent is further introduced into this mercapto group.
  • maleimide By reacting with maleimide, a maleimide group is introduced at the 5 ′ end of the nucleic acid, while a mercapto group is introduced into the antibody.
  • these two substances are bonded through a mercapto group and a maleimide group.
  • nucleic Acids Research Vol. 15 5275 (1987) and Nucleic Acids Research Vol. 16 3671 (1988) are known. Yes. These techniques can be applied to the binding of nucleic acids and antibodies.
  • a mercapto group is first introduced into the 5'-terminal hydroxyl group of an oligonucleotide by reacting the oligonucleotide with cystamine, carbodiimide and 1-methylimidazole. After purifying the oligonucleotide with a mercapto group introduced, it is reduced with dithiothreitol, followed by the addition of 2,2'-dipyridyl disulfide to introduce a pyridyl group via a disulfide bond at the 5 'end of the oligonucleotide. To do.
  • a mercapto group is introduced by reacting iminothalylene.
  • the oligonucleotide introduced with the pyridyl disulfide group and the protein introduced with the mercapto group are mixed, and the pyridyl group and the mercapto group are specifically reacted to bind the protein and the oligonucleotide.
  • dithio-bis-propionic acid-N- Hydroxysuccinimide ester (abbreviation: dithio-bis-propionyl-NHS) is reacted.
  • dithiothreitol is added to reduce the disulfide bond in the dithio-bis-propionyl-NHS molecule and introduce a mercapto group at the 3 'end of the oligonucleotide.
  • a heterobifunctional cross-linking agent As shown in JP-A-5-48100 is used. First, it has a first reactive group (succinimide group) that can react with a functional group (for example, an amino group) in a protein, and a second reactive group (for example, a maleimide group) that can react with a mercapto group.
  • a first reactive group succinimide group
  • a second reactive group for example, a maleimide group
  • a second reactive group is introduced into the protein to obtain a preactivated protein reagent.
  • the protein reagent thus obtained is covalently bound to the mercapto group of the thiolated polynucleotide.
  • the method for quantifying the detection target of the present invention comprises mixing a carrier particle (first bound substance) carrying a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target, and a specimen to prepare a mixture.
  • the first combined substance and the specimen are mixed in a container to prepare a mixture.
  • it is preferable to mix the second binding substance together.
  • it may be dispersed in an aqueous dispersion medium as necessary.
  • the aqueous dispersion medium no absorption is observed with respect to the wavelength of a laser used in an apparatus using a dynamic light scattering method, which will be described later, and there is no influence of dissolution, swelling, etc. on the first bonded substance.
  • Any material having a refractive index different from that of the first combination and the second combination may be used.
  • examples of the dispersion medium include Tris-HCl buffer, phosphate buffer, and borate buffer.
  • the mixture is placed under agglomeration conditions where the stimulus responsive substance agglomerates.
  • the stimulus-responsive substance is dispersed and inhibited by aggregation by the charge portion or the hydrophilic portion of the detection target.
  • the stimulus-responsive substance aggregates without being inhibited from aggregation.
  • the container containing the mixture may be transferred to a thermostatic bath at a temperature at which the temperature responsive polymer aggregates.
  • a temperature-responsive polymer having an upper critical solution temperature (hereinafter sometimes abbreviated as “UCST”) and a polymer having a lower critical solution temperature (hereinafter sometimes abbreviated as “LCST”).
  • UCST upper critical solution temperature
  • LCST lower critical solution temperature
  • the temperature-responsive polymer can be agglomerated by transferring the container containing the mixed solution to a constant temperature bath of 37 ° C. or higher. .
  • the temperature-responsive polymer can be agglomerated by moving the container containing the mixed solution to a thermostatic bath of less than 5 ° C. .
  • the aggregation of the temperature-responsive polymer may be performed before the first bound substance and the target to be detected, or may be performed in parallel, but the latter is preferable because the processing time can be shortened.
  • the lower critical solution temperature and the upper critical solution temperature can be determined as follows, for example. First, a sample is put into a cell of an absorptiometer and the sample is heated at a rate of 1 ° C./min. During this time, the change in transmittance at 550 nm is recorded. Here, when the transmittance when the polymer is transparently dissolved is 100% and when the transmittance when the polymer is completely aggregated is 0%, the temperature at which the transmittance is 50% is obtained as LCST.
  • an acid solution or an alkali solution may be added to a container containing the mixture.
  • an acid solution or an alkaline solution is added to a container containing a mixture outside the pH range where the pH-responsive polymer undergoes a structural change, and the pH-responsive polymer is brought into a pH range where the pH-responsive polymer undergoes a structural change. Change it.
  • an acid solution may be added to a container containing a mixture dispersed at a pH of more than 5 so that the pH is 5 or less.
  • an alkaline solution may be added to a container containing a mixture dispersed at a pH lower than 10 so that the pH becomes 10 or higher.
  • the pH at which the pH-responsive polymer undergoes a structural change is not particularly limited, but is preferably pH 4 to 10, and more preferably pH 5 to 9.
  • the photoresponsive polymer when a photoresponsive polymer is used, light having a wavelength capable of aggregating the photoresponsive polymer may be irradiated onto a container containing a mixed solution.
  • the preferred light for aggregation varies depending on the type and structure of the photoresponsive functional group contained in the photoresponsive polymer, but in general, ultraviolet light or visible light having a wavelength of 190 to 800 nm can be suitably used.
  • the strength is preferably 0.1 to 1000 mW / cm 2 .
  • the photoresponsive polymer is one that hardly causes dispersion when irradiated with light used for measuring the particle diameter, in other words, aggregates, in that the measurement accuracy can be improved.
  • the measurement accuracy can be improved by shortening the irradiation time.
  • the particle size of the suspension in the mixture can be measured with a commercially available particle size distribution measuring device or the like.
  • Particle size distribution measurement methods include dynamic light scattering, optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, centrifugal sedimentation, and electrical pulse measurement. Methods, chromatographic methods, ultrasonic attenuation methods and the like are known.
  • the dynamic light scattering particle size distribution measuring device may be a discrete method, but is preferably not a discrete measuring device from the viewpoint of continuously and smoothly measuring the particle diameter.
  • the “particle diameter by dynamic light scattering method” is a concept that includes not only primary particles but also secondary particles formed by aggregation of primary particles, as measured by the dynamic light scattering method. This is an index for evaluating the degree of dispersion of the complex in which the stimulus-responsive substance of the combined substance is aggregated. Examples of a commercially available measuring device using dynamic light scattering include a dynamic light scattering type particle size distribution measuring device [device name: ZETA SIZER Nano-ZS; manufactured by Malvern].
  • the measurement time (aggregation time) of the particle size of the suspension may be set as appropriate from the viewpoint of required speed and sensitivity. When quickness is required, it may be performed before the time required for the turbidity (absorbance) of the solution in which the detection target is not present to reach the maximum value after being placed under the aggregation condition. In the method of quantifying the detection target by measuring the particle size, the change in the particle size appears greatly from the very early stage under the aggregation conditions. Therefore, for example, as shown in FIG. 3, the present invention detects a detection target with high detection sensitivity before 600 seconds when the turbidity (absorbance) of a solution in which no detection target exists (zero) is maximum. Is possible.
  • the measurement should be performed beyond the above time (the time required for the turbidity (absorbance) of the solution in which the detection target is not present to reach the maximum value after being placed under the aggregation condition). Good.
  • a sample (blood, etc.) suspected of containing a detection target contains many types and a large amount of contaminants, but the measured particle size is greatly influenced by the contaminants in the detection target. It is not a thing. For this reason, it is not always necessary to perform a preliminary procedure of removing impurities before measurement.
  • the data may be related to the amount of two or more detection targets, and is preferably related to the amount of three or more detection targets.
  • the amount of the detection target in the sample can be calculated. For example, when a polymer having a lower critical solution temperature with an LCST of 37 ° C. is used as the stimulus responsive substance, the container containing the mixed solution is transferred to a constant temperature bath at 37 ° C. or higher to detect the antigen to be detected. Depending on the concentration, changes in the particle size as shown in FIG. 1 are observed.
  • the result shown in FIG. 1 is the measurement performed on the same conditions as the measurement process demonstrated in Example 1 mentioned later except the density
  • the first binding substance and the detection target are mixed, if the detection target exists, the first affinity substance binds to the detection target, and the charge part or the hydrophilic part of the detection target has the first affinity.
  • the charge portion or the hydrophilic portion is arranged in the vicinity of the stimulus responsive substance, and aggregation of the stimulus responsive substance in response to the stimulus is inhibited.
  • the stimulus-responsive substance aggregates without being inhibited from aggregation. Therefore, the smaller the amount of the detection target, the more the aggregation of the stimulus-responsive substance in the mixture proceeds with time, and the particle diameter of the suspension increases with time.
  • the method of quantifying the detection target based on the particle size of the suspension has a change in the particle size compared to the case of quantifying the detection target based on the turbidity of the suspension. Since it appears from a fast stage, high detection sensitivity can be obtained even when the concentration of the detection target is small.
  • a step of solid-liquid separation of the aggregates of the carrier particles (first bound material) is not necessarily required before the determination step. Therefore, the measurement time can be greatly shortened.
  • the first binding substance, the second binding substance, and the detection target are mixed, when the detection target exists, the first affinity substance and the second affinity substance are bound to the detection target, and the carrier
  • the charged portion or hydrophilic portion to be detected approaches the stimulus-responsive substance bound to the particle or the first affinity substance.
  • the charged or hydrophilic portion bound to the second affinity substance approaches the stimulus-responsive substance bound to the carrier particles or the first affinity substance.
  • the charge portion or the hydrophilic portion is disposed in the vicinity of the stimulus responsive substance, and aggregation of the stimulus responsive substance in response to the stimulus is inhibited.
  • the stimulus-responsive substance aggregates without being inhibited from aggregation.
  • the second binding substance may be further mixed in addition to the first binding substance.
  • the method of quantifying the detection target based on the particle diameter of the suspension can be quantified more rapidly and with higher sensitivity than when the detection target is detected based on the turbidity of the suspension.
  • an antibody (clone: 195 mouse, mouse IgG, manufactured by Leinco Technology, Inc.) as a first affinity substance for human thyroid-stimulating hormone (TSH) as a detection target is obtained by using a well-known sulfo-NHS-Biotin method. Biotinylated by (Asahi Techno Glass Co., Ltd.) to prepare a biotin-labeled anti-TSH beta antibody.
  • Thermo-Max LSA Streptavidin (0.4% by mass) manufactured by Magnabeat Co., Ltd., which is a finely divided magnetic substance to which streptavidin is bound, is placed in a 1.5 mL microtube, and this microtube is heated to 42 ° C.
  • the Thermo-Max LSA Streptavidin was aggregated and recovered with a magnet, and then the supernatant was removed.
  • 250 ⁇ L of TBS buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5) was added, and the aggregate was dispersed by cooling.
  • an antibody (clone: 176 mouse, mouse IgG, manufactured by Leinco Technology, Inc., 1 mg / mL) as a second affinity substance for human thyroid stimulating hormone (TSH) as a detection target, 6 mg of 2-mercaptoethanol And reacted at 37 ° C. for 120 minutes.
  • TSH human thyroid stimulating hormone
  • the labeled antibody was prepared by gel filtration using This labeled antibody (this antibody is also called a polyacrylic acid anti-TSH ⁇ antibody conjugate) is 0.5% (w / v) BSA (manufactured by Sigma), 0.5% (w / v) Tween (registered trademark). ) A second conjugate was prepared by diluting with 20 / PBS (pH 7.4), 10 mM EDTA in water to a protein concentration of 4 ⁇ g / mL.
  • the maleimidated sodium polyacrylate was prepared as follows. First, 2 g of acrylic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2-aminoethanethiol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0. 021 g and 0.023 g of azobisisobutyronitrile (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were dissolved in 50 mL of N, N-dimethylformamide, followed by nitrogen substitution for 1 hour. Thereafter, a polymerization reaction was carried out at 70 ° C. for 7 hours.
  • reaction solution was concentrated under reduced pressure to 10 mL, and re-precipitated with diethyl ether until the viscous product became powdery.
  • the white precipitate was filtered, and further dried overnight in a vacuum dryer to obtain amino group-terminated polyacrylic acid (yield 1.5 g).
  • amino group-terminated polyacrylic acid was maleimidized.
  • a 50 mL eggplant flask equipped with a nitrogen gas inlet tube and a stirrer was charged with 0.5 g of amino group-terminated polyacrylic acid and 10 mL of N, N-dimethylformamide.
  • Example preparation Human thyroid stimulating hormone (TSH; manufactured by Aspen Bio Pharma, Inc., activity 8.5 IU / mg, WHO 80/558) was dissolved in PBS buffer (pH 7.4) to a concentration of 30 ⁇ g / mL. A sample obtained by diluting this solution with Vitros TSH calibrator 1 (TSH: 0 mIU / L, manufactured by Ortho Clinical Diagnostics) to 1 ng / mL was used as a sample.
  • TSH Human thyroid stimulating hormone
  • an antibody (clone: 195 mouse, mouse IgG, manufactured by Leinco Technology, Inc.) as a first affinity substance for human thyroid-stimulating hormone (TSH) as a detection target is obtained by using a well-known sulfo-NHS-Biotin method. Biotinylated by (Asahi Techno Glass Co., Ltd.) to prepare a biotin-labeled anti-TSH beta antibody.
  • Thermo-Max LSA Streptavidin (0.4% by mass) manufactured by Magnabeat Co., which is a particulate magnetic material to which streptavidin is bound, is placed in a 1.5 mL microtube, and this microtube is heated to 42 ° C.
  • Thermo-Max LSA Streptavidin was aggregated and recovered with a magnet, and then the supernatant was removed.
  • 250 ⁇ L of TBS buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5) was added, and the aggregate was dispersed by cooling.
  • Example preparation Human thyroid stimulating hormone (TSH; manufactured by Aspen Bio Pharma, Inc., activity 8.5 IU / mg, WHO 80/558) was dissolved in PBS buffer (pH 7.4) to a concentration of 30 ⁇ g / mL. A sample obtained by diluting this solution with Vitros TSH calibrator 1 (TSH: 0 mIU / L, manufactured by Ortho Clinical Diagnostics) to 1 ng / mL was used as a sample.
  • TSH Human thyroid stimulating hormone
  • a neodymium permanent magnet (manufactured by Seiko Sangyo Co., Ltd.) having a size of 5 mm ⁇ 9 mm ⁇ 2 mm was attached outside the optical path of a widely used semi-micro cell for a spectrophotometer. This cell was placed in a visible ultraviolet spectrophotometer “UV-3101PC” (manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a cell temperature controller, and kept at 37 ° C. for 10 minutes or more.
  • UV-3101PC visible ultraviolet spectrophotometer
  • the above mixture is dispensed into the cell, zero-corrected according to the instruction manual attached to the spectrophotometer, and continuously with turbidity (absorbance Abs) at a slit width of 10 mm for 35 minutes using light with a wavelength of 420 nm. ) was measured. Similarly, the turbidity (absorbance Abs) was also measured for the mixed solution serving as a negative control. The result is shown in FIG. 2 together with the result of the example.

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Abstract

検出対象を迅速にかつ高感度で定量することができる方法を提供すること。　検体中の検出対象を定量する方法は、刺激応答性物質及び検出対象に対する第１の親和性物質を担持する担体粒子と、検体とを混合し、混合物を調製する混合工程と、混合物を刺激応答性物質が凝集する条件下におき、混合物中の懸濁物の粒子径を測定する測定工程と、粒子径に基づき、検出対象の量を決定する決定工程と、を有する。

Description

検体中の検出対象を定量する方法
　本発明は、検体中の検出対象を定量する方法に関する。
　臨床検査等の分野で、抗原抗体反応等を利用して、検体中の微量成分を検出することが行われている。検体としては、例えば血清、血漿、尿、リンパ液等の各種体液といった生体から得られる検体が挙げられる。
　検体中の検出対象を検出する方法として、例えば、特許文献１には、刺激応答性物質及び検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、（電荷を有する第２の物質と検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、）検体とを混合し、刺激応答性物質の凝集条件下におき、混合物中の刺激応答性物質の分散の有無を、混合物の濁度によって判定し、検出対象の存否する検出する方法が提案されている。また、検出感度を上げるために、装置に磁石を設置することにより磁力で凝集した第１の結合物（磁性物質）を固液分離することが提案されている。
　上記検出方法において、検出対象が存在する場合には、刺激応答性物質が凝集阻害されて分散する一方、検出対象が存在しない場合には刺激応答性物質が凝集することになる。このような凝集阻害の有無が混合物の濁度に反映される。例えば、図３に示すように、通常、検出対象の量が多いほど、刺激応答性物質が凝集阻害されて分散し濁度が低くなり、その後、検出対象の量と濁度との関係が反転し始め、時間の経過とともに濁度が初期値よりも低下する。これは、凝集した磁性物質が磁力により固液分離されるからであるが、最大値となる測定値とそれ以降の時点での測定値との差を利用することにより、より高い検出感度が得られている。
ＷＯ２００８／００１８６８号パンフレット
　上述したように、混合物の濁度によって検出対象の存否を検出し定量する方法では、高い検出感度を得ようとすると、磁力による固液分離の工程が必要となり、検出時間が長くなる。
　本発明は、以上の事情に鑑みなされたものであり、検出対象を迅速にかつ高感度で検出し定量することができる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、刺激応答性物質の分散の程度を、混合物中の懸濁物の粒子径によって判定することにより、検出対象を迅速にかつ高感度で検出し定量することができることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は、以下のものを提供する。
　（１）検体中の検出対象を定量する方法であって、
　刺激応答性物質及び前記検出対象に対する第１の親和性物質を担持する担体粒子と、前記検体とを混合し、混合物を調製する混合工程と、
　前記混合物を前記刺激応答性物質の凝集条件下におき、前記混合物中の懸濁物の粒子径を測定する測定工程と、
　前記粒子径に基づき、前記検出対象の量を決定する決定工程と、を有する方法。
　（２）懸濁物に含まれる担体粒子の凝集物を固液分離する工程を、前記決定工程の前に含まない（１）記載の方法。
　（３）前記担体粒子は非磁性物質からなる（１）又は（２）記載の方法。
　（４）前記測定は、動的光散乱法を用いて行われる（１）から（３）いずれか記載の方法。
　（５）前記担体粒子は、平均屈折率１．３以上を有する（４）記載の方法。
　（６）前記測定は、陰性対照の濁度が前記凝集条件下においた後に最大値になるのに要する時間より前に行う（１）から（５）いずれか記載の方法。
　（７）前記混合工程において、前記担体粒子に加え、親水性物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質との結合物をさらに混合する（１）から（６）いずれか記載の方法。
　本発明によれば、検出対象を迅速かつ高感度で検出対象を定量することができる。
本発明の一実施形態に係る定量方法における、測定時間（凝集時間）と平均粒子径との相関性を示すグラフである。 本発明の実施例及び比較例に係る定量方法における、測定時間（凝集時間）と平均粒子径との相関性を示すグラフである。 従来の、濁度により検出対象の定量を行う定量方法における、測定時間（凝集時間）と吸光度との相関性を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について説明するが、これらに本発明が限定されるものではない。
　本発明の検体中の検出対象を定量する方法は、刺激応答性物質及び検出対象に対する第１の親和性物質を担持する担体粒子（以下、第１の結合物と称する場合がある）と、検体とを混合し、混合物を調製する混合工程と、混合物を刺激応答性物質の凝集条件下におき、混合物中の懸濁物の粒子径を測定する測定工程と、粒子径に基づき検出対象の量を決定する決定工程とを有する。
　まず、検体、検出対象、第１の結合物の各構成について説明する。また、より高い検出感度を得るために、好ましく用いられる第２の結合物について説明する。
＜検体＞
　検体としては、人又は動物の血清、血漿、尿、リンパ液等の各種体液及び糞便等の生物学的物質、飲食品、水道水、並びに河川等の環境から採取した試料等が挙げられる。
＜検出対象＞
　以上の検出方法で検出できる対象としては、例えば環境汚染物質、食品汚染物質及び臨床診断に利用される物質が挙げられる。このような物質としては、具体的には、ダイオキシン、環境ホルモン、農薬、ＰＣＢ（ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｂｉｐｈｅｎｙｌ）、有機水銀等、プリオンカビ毒、フグ毒、抗生物質、防カビ剤、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、及び薬剤等が挙げられる。
＜第１の結合物＞
［担体粒子］
　担体粒子は、刺激応答性物質及び／又は第１の親和性物質が直接又は間接に結合可能な物質で、懸濁可能な物質であれば特に限定されない。担体粒子としては、シリカ、アクリル樹脂等の有機微粒子、金属からなる粒子等が挙げられ、シリカからなる粒子が好ましい。シリカは、二酸化ケイ素を主成分とする粒子であればよく、石英又は水晶からなる粒子を含み、シリカと通称されるものからなる粒子であってよい。シリカ粒子は、粒子表面にシラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）を有していることから、親水性が高いので、水中で反応させやすい点で好ましい。シリカ粒子は、また、毒性がないので、取扱いが容易であり、製造も容易である点でも好ましい。
　なお、本発明は、後述するように、磁力により懸濁物に含まれる凝集物質を固液分離する必要がないことから、担体粒子は磁力により引き付けられる磁性物質である必要はなく、磁場に影響を及ぼさない非磁性物質であってよい。
　担体粒子の平均屈折率は、１．３以上であることが好ましく、１．３以上４．０以下がより好ましく、１．４以上３．０以下であることがより好ましい。本発明では、測定光を散乱させる（光の回折、屈折、反射、吸収を含む）測定方法により粒子径を求めることが好ましいことから、担体粒子の平均屈折率は上記範囲が好ましい。なお、平均屈折率は、アッベ屈折率計（装置名アタゴ社製のＤＲ－Ａ１）と分光光源を用いて、波長５８９ｎｍ、温度３７℃において測定した値である。
　また、担体粒子の粒径は、大きすぎると、懸濁性を下げる傾向を有する一方、小さすぎると、粒子径等のパラメータに与える影響（つまり検出及び定量の感度）を下げる傾向を有する。この観点で担体粒子の平均粒子径は適宜選択されてよく、例えば、０．０５～１．０μｍであってよく、０．３～０．７μｍであってよい。平均粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により測定した値である。
［刺激応答性物質］
　刺激応答性物質は、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できる物質である。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）、電場変化等が挙げられる。
　特に、本発明では、刺激応答性物質として、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーが利用できる。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度（以下、ＵＣＳＴとも称する）を有するポリマーが挙げられる。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＬＣＳＴ未満の温度の水溶液中では完全に分散し、ＬＣＳＴ以上に水温を上昇させると直ちに凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＵＣＳＴを超える温度の水溶液中では完全に分散し、ＵＣＳＴ以下に水温を下降させると直ちに凝集させることができる。
　本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－アクリロイルピロリジン、Ｎ－アクリロイルピペリジン、Ｎ－アクリロイルモルホリン、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルメタクリルアミド、Ｎ－メタクリロイルピロリジン、Ｎ－メタクリロイルピペリジン、Ｎ－メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。さらに、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとＮ－ｔ－ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－アクリロイルピロリジン、Ｎ－アクリロイルピペリジン、Ｎ－アクリロイルモルホリン、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルメタクリルアミド、Ｎ－メタクリロイルピロリジン、Ｎ－メタクリロイルピペリジン、Ｎ－メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ－イソプロピルアクリルアミドとＮ－ｔ－ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。また、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸）に代表されるようなペンタポリペプチドの繰返し配列を持つエラスチン由来ポリペプチド等も利用できる。
　本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ－ビオチニル－Ｎ’－メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。
　また、本発明では、刺激応答性物質として、ｐＨの変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマー等の物質が利用できる。ｐＨ応答性物質が構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における担体粒子及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４～１０が好ましく、ｐＨ５～９であることがさらに好ましい。
　このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ－ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。
　また、刺激応答性物質は、上記の刺激応答性ポリマーに限らず、例えば、特許第３６９３９７９号、特許第３９１６３３０号公報、特開２００２－８５９５７号公報、特許第４０７１７３８号公報、特許第２８６９６８４号公報、特許第２９２７６０１号公報、特許第３８４５２４９号公報等に開示されるヒドロゲルであってもよい。
　［第１の親和性物質］
　第１の親和性物質は、検出対象に対して親和性を有する物質であれば、特に限定されない。ここで、「親和性」とは、ある物質が他の物質と特異的に結合する性質をいう。第１の親和性物質としては、例えば検出対象が抗原である場合は該抗原に対する抗体、検出対象が抗体である場合は該抗体に対する抗原である。例えば、検出対象がＧＳＴタグ付きのタンパク質である場合はグルタチオン、検出対象がヒスチジンタグ付のタンパク質の場合は金属イオン配位したキレート剤、検出対象が核酸の場合は相補的な配列をもつ核酸が挙げられる。
　前記抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。
　＜第２の結合物＞
　第２の結合物は、より高い検出感度を得るために、後述する混合工程において、上記第１の結合物に加えて添加されるものである。この第２の結合物は、親水性物質と検出対象に対する第２の親和性物質とを結合したものである。
［親水性物質］
　親水性物質は、後述する水性分散媒に対して親水性を有する物質であれば特に限定されない。ここで、「親水性」とはある物質が水性分散媒に対して親和力をもつ性質をいう。親水性物質としては、例えば、電荷を有する親水性の高分子化合物が挙げられ、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボン酸官能基を含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン（カルボキシル基）やポリカチオン（アミノ基）の官能基数は、２５個以上が好ましい。
［第２の親和性物質］
　第２の親和性物質は、検出対象に対して、第１の親和性物質とは異なる部位にて非競合的に結合できる物質を用いる。例えば、検出対象が抗原である場合、第２の親和性物質は、該抗原において第１の親和性物質とは異なる抗原決定基を認識する検出対象の抗原決定機を認識するモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である。
　以下、第１の結合物の作製方法について説明する。
［第１の結合物の作製方法］
　第１の結合物は、担体粒子に刺激応答性物質と第１の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、担体粒子と刺激応答性物質とを直接的に結合する場合は、反応性官能基を介して結合する方法が挙げられ当技術分野で周知の方法で行ってよい。
　また、例えば、刺激応答性物質と第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）との結合は、刺激応答性物質と第１の親和性物質の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して刺激応答性物質と第１の親和性物質を結合させる。
　具体的には、刺激応答性物質へのビオチンの結合は、国際公開ＷＯ０１／００９１４１に記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性物質及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、刺激応答性物質と第１の親和性物質とが結合する。
　別法として、ポリマー等の物質の製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、刺激応答性物質と、検出対象の抗原に対する第１の抗体との結合物が作製される。
　あるいは、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する第１の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。
　あるいは、微粒子状の磁性物質に第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーを結合させてもよい。
　第１の親和性物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、刺激応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、さらに第１の親和性物質を結合させた後、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。
　微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ－Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。
　［第２の結合物の作製］
　第２の結合物は、親水性物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、親水性物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して親水性物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。
　親水性物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ　ｅｔ　ａｌ：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．、　１、　７１－７６、１９９０）のマレイミド－チオールカップリングに従って結合できる。具体的には、以下の２つの方法が挙げられる。
　第１の方法では、まず、核酸の５’末端にメルカプト基（別名、スルフヒドリル基）を導入する一方、抗体に６－マレイミドヘキサノイックアシッドスクシンイミドエステル（例えば、「ＥＭＣＳ（商品名）」（同仁化学社製））を反応させてマレイミド基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
　第２の方法では、まず、第１の方法と同様にして核酸の５’末端にメルカプト基を導入し、このメルカプト基にさらにホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ－１，２－フェニレンジマレイミドと反応させることによって核酸の５’末端にマレイミド基を導入する一方、抗体にメルカプト基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
　この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　第１５巻５２７５頁（１９８７年）及びＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結合に応用できる。
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　第１６巻３６７１頁（１９８８年）によると、まず、オリゴヌクレオチドを、シスタミン、カルボジイミド及び１－メチルイミダゾールと反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にメルカプト基を導入する。メルカプト基を導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２、２’－ジピリジルジスルフィドを加えることによってオリゴヌクレオチドの５’末端にジスルフィド結合を介してピリジル基を導入する。一方、タンパク質に対しては、イミノチアレンを反応させてメルカプト基を導入しておく。これらピリジルジスルフィド基を導入したオリゴヌクレオチドとメルカプト基を導入したタンパク質を混合し、ピリジル基とメルカプト基を特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。
　Ｎｕｌｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｃｈ　第１５巻５２７５頁（１９８７年）によると、まず、オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノ基を導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオ－ビス－プロピオニックアシッド－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチオ－ビス－プロピオニル－ＮＨＳ）を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することによりジチオ－ビス－プロピオニル－ＮＨＳ分子中のジスルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３’末端にメルカプト基を導入する。タンパク質の処理については、特開平５－４８１００号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基）と反応しうる第１の反応性基（スクシンイミド基）、及びメルカプト基と反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド基等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入し、予め活性化されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタンパク試薬をチオール化ポリヌクレオチドのメルカプト基へ共有結合させる。
　以下、上述した第１の結合物を用いて、検体中の検出対象を定量する方法について説明する。
　＜定量方法＞
　本発明の検出対象を定量する方法は、刺激応答性物質及び検出対象に対する第１の親和性物質を担持する担体粒子（第１の結合物）と、検体とを混合し、混合物を調製する混合工程と、混合物を刺激応答性物質の凝集条件下におき、混合物中の懸濁物の粒子径を測定する測定工程と、粒子径に基づき、検出対象の量を決定する決定工程とを有する。
［混合工程］
　まず、第１の結合物と検体とを容器内で混合し、混合物を調製する。また、より高い検出感度が必要な場合には、第２の結合物も併せて混合することが好ましい。混合物を調製する際には必要に応じて水性分散媒に分散させるとよい。水性分散媒には、後述する動的光散乱法を用いた装置で使用するレーザーの波長に対して吸収を認めず、第１の結合物に対して溶解、膨潤等の影響を与えず、第１の結合物及び第２の結合物と異なった屈折率を有しているものであればよい。例えば、分散媒としては、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファー、ホウ酸バッファー等が挙げられる。
［測定工程］
　上記混合物を刺激応答性物質が凝集する凝集条件下におく。検出対象が存在する場合には、刺激応答性物質が検出対象の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する。一方、検出対象が存在しない場合には刺激応答性物質が凝集阻害されず凝集することになる。
　例えば、刺激応答性物質として温度応答性ポリマーを用いた場合には、混合物の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。温度応答性ポリマーには、上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーと、下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーの２種類がある。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。
　なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び検出対象の結合前に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。
　ここで、下限臨界溶液温度及び上限臨界溶液温度は例えば以下のように決定することができる。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。
　また、刺激応答性物質としてｐＨ応答性ポリマーを用いた場合には、混合物の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある混合物の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合物の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合物の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４～１０が好ましく、ｐＨ５～９であることがさらに好ましい。
　また、光応答性ポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器に光応答性ポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０～８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１～１０００ｍＷ／ｃｍ２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、粒子径の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、粒子径の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。
　混合物中の懸濁物の粒子径を測定は、市販の粒度分布測定装置等で計測することができる。粒度分布測定法としては、動的光散乱法、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られている。
　本発明においては、粒子径範囲及び測定の容易さから、動的光散乱方式粒度分布測定装置（ＤＬＳ）を用いることが好ましい。また、動的光散乱方式粒度分布測定装置（ＤＬＳ）としては、ディスクリート方式であってもよいが、連続的かつ円滑に粒子径を測定する点からはディスクリート式測定装置でないことが好ましい。なお、「動的光散乱法による粒子径」とは、動的光散乱法により測定され、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、第１の結合物の刺激応答性物質が凝集した複合体の分散度を評価する指標である。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、動的光散乱方式粒度分布測定装置［装置名：ＺＥＴＡ　ＳＩＺＥＲ　Ｎａｎｏ－ＺＳ；Ｍａｌｖａｒｎ社製］等が挙げられる。
　懸濁物の粒子径の測定時間（凝集時間）は、要求される迅速さ、感度の点から、適宜設定されればよい。迅速さが要求される場合には、検出対象物が存在しない溶液の濁度（吸光度）が凝集条件下においた後に最大値になるのに要する時間より前に行うとよい。粒子径の測定による検出対象の定量方法は、凝集条件下において、粒子径の変化が極めて早い段階から大きく現れる。そのため、本発明は、例えば、図３に示すように、検出対象物が存在しない（ゼロ）溶液の濁度（吸光度）が最大値となる６００秒以前に高い検出感度で検出対象を検出することが可能である。一方、より高い感度が要求される場合には、上記時間（検出対象物が存在しない溶液の濁度（吸光度）が凝集条件下においた後に最大値になるのに要する時間）を超えて測定するとよい。
　なお、検出対象が含まれると疑われる検体（血液等）には、多種類かつ多量の夾雑物が混在する場合が多いが、測定される粒子径は検出対象中の夾雑物に大きく影響されるものではない。このため、測定前に夾雑物を除去するといった予備手順を必ずしも行わなくてもよい。
［決定工程］
（相関式）
　上記測定工程と同一の条件における、検出対象の量と懸濁物の粒子径との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と懸濁物の粒子径との測定には、データが多いほどに信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
（算出）
　上述した測定工程で得られた懸濁物の粒子径の測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。例えば、刺激応答性物質として、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、検出対象の抗原濃度に応じて、図１に示すような粒子径の変化がみられる。なお、図１に示す結果は、ビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体の濃度が異なる以外は、後述する実施例１で説明する測定工程と同一の条件下で行われた測定である。
〔作用効果〕
　第１の結合物と検出対象とを混合すると、検出対象が存在する場合、この検出対象に第１の親和性物質が結合し、検出対象の電荷部分又は親水性部分が、第１の親和性物質に結合した刺激応答性物質に接近する。これにより電荷部分又は親水性部分が刺激応答性物質の近傍に配置され、刺激に応答した刺激応答性物質の凝集が阻害される。一方、検出対象が存在しない場合、刺激応答性物質が凝集阻害されず凝集することになる。そのため、検出対象の量が少ないほど、混合物中の刺激応答性物質の凝集が経時で進み、懸濁物の粒子径が経時で大きくなる。図１及び図３の比較からわかるように、懸濁物の粒子径に基づき検出対象を定量する方法は、懸濁物の濁度に基づき検出対象を定量する場合に比べ、粒子径の変化が速い段階から現れるため、検出対象の濃度が小さい場合においても高い検出感度を得ることができる。また、懸濁物の濁度に基づき検出対象を定量する場合のように、決定工程の前に、担体粒子（第１の結合物）の凝集物を固液分離する工程が必ずしも必要ない。よって、測定時間の大幅な短縮が可能となる。
　また、第１の結合物と第２の結合物と検出対象とを混合すると、検出対象が存在する場合、検出対象に第１の親和性物質と第２の親和性物質とが結合し、担体粒子又は第１の親和性物質に結合した刺激応答性物質に対して、検出対象の電荷部分又は親水性部分が接近する。若しくは、担体粒子又は第１の親和性物質に結合した刺激応答性物質に対して、第２の親和性物質に結合した電荷部分又は親水性部分が接近する。これにより、電荷部分又は親水性部分が刺激応答性物質の近傍に配置され、刺激に応答した刺激応答性物質の凝集が阻害される。一方、検出対象が存在しない場合、刺激応答性物質が凝集阻害されず凝集することになる。そのため、検出対象の量が少ないほど、混合物中の刺激応答性物質の凝集が経時で進み、懸濁物の粒子径が経時で大きくなる。このように、第２の結合物を併用した場合には、検出対象の量による変化の度合いは、第１の結合物と検出対象とを混合した場合に比べて大きくなる。よって、検出対象の量が極めて少なく、高い検出感度を得ることが要求される場合には、混合工程において、第１の結合物に加えて第２の結合物をさらに混合するとよい。
　このように、懸濁物の粒子径に基づき検出対象を定量する方法は、懸濁物の濁度に基づき検出対象を検出する場合に比べ、迅速かつ高感度に定量することができる。
＜実施例＞
［第１の結合物の調製］
　まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第１の親和性物質としての抗体（クローン：１９５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製）を、従来周知のｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ法（旭テクノグラス社）によりビオチン化し、ビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体を調製した。
　一方、ストレプトアビジンが結合された微粒子状の磁性物質であるマグナビート株式会社製のＴｈｅｒｍａ－Ｍａｘ　ＬＳＡ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（０．４質量％）２５０μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、このマイクロチューブを４２℃に加熱することで、Ｔｈｅｒｍａ－Ｍａｘ　ＬＳＡ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。ここにＴＢＳバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。この分散液に、ＰＢＳバッファー（０．０１Ｍ　リン酸バッファー、０．００２７Ｍ　塩化カリウム、０．１３７Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン標識抗ＴＳＨβ抗体５０μＬ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、室温で１５分間転倒混和した。マイクロチューブを４２℃に加熱してＴｈｅｒｍａ－Ｍａｘ　ＬＳＡ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清部分を除去し、余分なビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体を分離した（Ｂ／Ｆ分離）。ここにＴＢＳバッファー２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。続いて、過剰量のビオチンを添加して、ストレプトアビジンのビオチン結合部位を被覆した後、余分なビオチンを分離した（Ｂ／Ｆ分離）。さらに０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有させたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）溶液に分散させることで、第１の結合物を調製した。
［第２の結合物の調製］
　まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第２の親和性物質としての抗体（クローン：１７６マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製、１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに２－メルカプトエタノール６ｍｇを加え、３７℃で１２０分反応させた。反応後、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商品名）　透析カセット、１０Ｋ　ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、ＰＢＳバッファー５００ｍＬに対して透析し、過剰の２－メルカプトエタノールを除き、限界排除分子量１００００の限外濾過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製［Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４　Ｕｌｔｒａｃｅｌ　１００ｋ］）を用いて０．５ｍＬに濃縮し、マウス抗ＴＳＨα抗体の還元抗体を得た。この還元抗体０．５ｍＬと１００μＬマレイミド化ポリアクリル酸ナトリウム（３３ｍｇをＰＢＳバッファー１ｍＬに溶解したもの）とを４℃で１晩反応させ、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００　１０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてゲル濾過することで、標識抗体を作成した。この標識抗体（この抗体は、ポリアクリル酸抗ＴＳＨα抗体結合物ともいう。）を０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡの水溶液でタンパク質濃度４μｇ／ｍＬに希釈することで、第２の結合物を調製した。
　なお、上記マレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムは、次のように調製した。
　まず、窒素ガス導入管、温度計、及び撹拌装置を付した１００ｍＬの三口フラスコ内で、アクリル酸（和光純薬工業社製）２ｇ、２－アミノエタンチオール（和光純薬工業社製）０．０２１ｇ、及びアゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．０２３ｇをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５０ｍＬに溶解し、１時間窒素置換を行った。その後、７０℃で７時間重合反応を行った。得られた反応液を、１０ｍＬまで減圧濃縮し、粘稠状の物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ過し、さらに真空乾燥機で１晩乾燥することで、アミノ基末端ポリアクリル酸を得た（収量１．５ｇ）。次にアミノ基末端ポリアクリル酸をマレイミド化した。窒素ガス導入管、及び撹拌装置を付した５０ｍＬのナスフラスコに、アミノ基末端ポリアクリル酸０．５ｇ及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１０ｍＬを入れ、溶解した。そこにＥＭＣＳ（Ｎ－（６－マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド）（同仁化学研究所社製）３ｍｇを加え、一晩反応した。得られた反応液を、１ｍＬまで減圧濃縮し、粘稠な物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ過し、さらに真空乾燥機で、１晩乾燥しマレイミド基末端ポリアクリル酸を得た。分子量は約１３００００（東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ　Ｓｕｐｅｒ　ＡＷ３０００、６ｍｍ　ＩＤ．×１５０ｍｍ、移動相０．１Ｍ　硝酸ナトリウム）であり、収量は０．４ｇであった。
［試料の調製］
　ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；Ａｓｐｅｎ　Ｂｉｏ　Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．製、活性８．５ＩＵ／ｍｇ、ＷＨＯ８０／５５８）をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に３０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。この溶液をビトロスＴＳＨキャリブレータ１（ＴＳＨ：０ｍＩＵ／Ｌ、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製）で１ｎｇ／ｍＬ、となるよう希釈したものを試料とした。
［混合］
　第１の結合物１５０μＬ及び第２の結合物１２０μＬをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサで１秒間撹拌した。このマイクロチューブ内に上記試料７５０μＬを添加し、再びボルテックスミキサで６０秒間撹拌し、混合液を得た。同様に、陰性対照として、ヒト甲状腺刺激ホルモンが存在しない混合液も用意した。
［測定］
　上記混合液を動的光散乱方式粒度分布測定装置（ＤＬＳ）［Ｍａｌｖａｒｎ社製のＺＥＴＡ　ＳＩＺＥＲ　Ｎａｎｏ－ＺＳ］内に設置し、３７度の凝集条件下で３５分間に亘って粒子径の測定を行った。同様に、陰性対照となる混合液についても粒子径の測定を行った。その結果を図２に示す。装置の条件は下記の通りである。
装置の条件：Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘ＝１．４５、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ＝０．０１０
＜比較例＞
［第１の結合物の調製］
　まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第１の親和性物質としての抗体（クローン：１９５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製）を、従来周知のｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ法（旭テクノグラス社）によりビオチン化し、ビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体を調製した。
　一方、ストレプトアビジンが結合された微粒子状の磁性物質であるマグナビート株式会社製のＴｈｅｒｍａ－Ｍａｘ　ＬＳＡ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（０．４質量％）２５０μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、このマイクロチューブを４２℃に加熱することで、Ｔｈｅｒｍａ－Ｍａｘ　ＬＳＡ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。ここにＴＢＳバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。この分散液に、ＰＢＳバッファー（０．０１Ｍ　リン酸バッファー、０．００２７Ｍ　塩化カリウム、０．１３７Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン標識抗ＴＳＨβ抗体５０μＬ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、室温で１５分間転倒混和した。マイクロチューブを４２℃に加熱してＴｈｅｒｍａ－Ｍａｘ　ＬＳＡ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清部分を除去し、余分なビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体を分離した（Ｂ／Ｆ分離）。ここにＴＢＳバッファー２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。続いて、過剰量のビオチンを添加して、ストレプトアビジンのビオチン結合部位を被覆した後、余分なビオチンを分離した（Ｂ／Ｆ分離）。さらに０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有させたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）溶液に分散させることで、第１の結合物を調製した。
［第２の結合物の調製］
　第２の結合物の調製は、実施例１における第２の結合物の調製方法と同様である。
［試料の調製］
　ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；Ａｓｐｅｎ　Ｂｉｏ　Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．製、活性８．５ＩＵ／ｍｇ、ＷＨＯ８０／５５８）をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に３０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。この溶液をビトロスＴＳＨキャリブレータ１（ＴＳＨ：０ｍＩＵ／Ｌ、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製）で１ｎｇ／ｍＬ、となるよう希釈したものを試料とした。
［混合］
　第１の結合物１５０μＬ及び第２の結合物１２０μＬをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサで１秒間撹拌した。このマイクロチューブ内に上記試料７５０μＬを添加し、再びボルテックスミキサで６０秒間撹拌し、混合液を得た。同様に、陰性対照として、ヒト甲状腺刺激ホルモンが存在しない混合液も用意した。
［測定］
　汎用されている分光光度計用セミミクロセルの光路外に、寸法５ｍｍ×９ｍｍ×２ｍｍのネオジム永久磁石（西興産業社製）を取り付けた。このセルを、セル温度制御機が設けられた可視紫外分光光度計「ＵＶ－３１０１ＰＣ」（島津製作所製）内に設置し、３７℃のもと１０分間以上保持した。
　上記混合液をセル内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ補正し、波長４２０ｎｍの光を用いて、直にスリット幅１０ｍｍで３５分間にわたって連続して濁度（吸光度Ａｂｓ）を測定した。同様に、陰性対照となる混合液についても濁度（吸光度Ａｂｓ）の測定を行った。その結果を実施例の結果と共に図２に示す。
［結果］
　図２の結果から、粒子径に基づき定量を行う実施例では、初期段階（例えば、測定時間１０分以内）においても、濁度（吸光度）に基づき定量を行う比較例に比べ、高い検出感度で定量が可能であることが確認された。また、粒子径に基づき定量を行う実施例では、比較例のように、磁石を設置する（固液分離をする）必要もなく、検出対象を高感度で検出できることが確認された。
 

Claims (7)

  1. 　検体中の検出対象を定量する方法であって、
    　刺激応答性物質及び前記検出対象に対する第１の親和性物質を担持する担体粒子と、前記検体とを混合し、混合物を調製する混合工程と、
    　前記混合物を前記刺激応答性物質の凝集条件下におき、前記混合物中の懸濁物の粒子径を測定する測定工程と、
    　前記粒子径に基づき、前記検出対象の量を決定する決定工程と、を有する方法。
  2. 　懸濁物に含まれる担体粒子の凝集物を固液分離する工程を、前記決定工程の前に含まない請求項１記載の方法。
  3. 　前記担体粒子は非磁性物質からなる請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記測定は、動的光散乱法を用いて行われる請求項１から３いずれか記載の方法。
  5. 　前記担体粒子は、平均屈折率１．３以上を有する請求項４記載の方法。
  6. 　前記測定は、陰性対照の濁度が前記凝集条件下においた後に最大値になるのに要する時間より前に行う請求項１から５いずれか記載の方法。
  7. 　前記混合工程において、前記担体粒子に加え、親水性物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質との結合物をさらに混合する請求項１から６いずれか記載の方法。
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