CN104755932A - 物质测定传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种新颖的物质测定传感器，其能以更高的感度来进行对象物质的定量测定。本发明的物质测定传感器含有：与测定对象物质特异地反应的标识粒子、热响应性高分子、在溶液中显示出正或负的动电位的带电物质、及金属粒子，并且金属粒子是由标识粒子与带电物质与热响应性高分子的共聚物所被覆。

Description

物质测定传感器
技术领域
本发明涉及一种物质测定传感器，更详细来说，本发明涉及一种利用免疫反应来对测定对象物质进行定量时所用的物质测定传感器。
背景技术
以前，作为环境中的微量物质等的检测方法或定量方法，已提出了利用免疫反应的免疫学测定法(免疫测定(immunoassay))。作为该免疫测定的通常的测定方法，例如已知酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)或免疫色谱法(immunochromatography)等。
这些方法需要进行利用荧光物质等对生物物质进行标识的操作，因此正在研究能更简易地制造的物质测定传感器。例如已提出了如下的生物传感器，该生物传感器含有：与测定对象物质特异地反应的分子识别成分、因测定对象物质与分子识别成分的反应而体积变化的刺激响应性高分子、及因刺激响应性高分子的体积变化而局部表面等离子体共振的强度变化的平均粒径为0.2nm～200nm的金属粒子，并且金属粒子及分子识别成分是固定在刺激响应性高分子上(例如参照专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开2010-197046号公报
发明内容
[发明所欲解决的问题]
在利用免疫反应的对象物质的定量测定中，从实用化的方面来看，期望检测感度充分、操作容易的新颖的物质测定传感器。
因此，本发明的目的在于提供一种新颖的物质测定传感器，其为使用热响应性高分子的物质测定传感器，并且能以更高的感度来进行对象物质的定量测定。
[解决问题的技术手段]
为了解决所述问题，本发明人进行了努力研究，结果发现，通过由金属粒子、热响应性高分子、显示出正或负的动电位的带电物质、及与测定对象物质特异地反应的标识粒子来构成复合体，可制成高感度的传感器。
即，本发明是通过下述(1)～(11)来达成。
(1)一种物质测定传感器，含有：与测定对象物质特异地反应的标识粒子、热响应性高分子、在溶液中显示出正或负的动电位的带电物质、及金属粒子，并且
所述金属粒子是由所述标识粒子与所述带电物质与所述热响应性高分子的共聚物所被覆。
(2)根据所述(1)所记载的物质测定传感器，其中所述金属粒子的平均粒径为10nm～50nm。
(3)根据所述(1)或(2)所记载的物质测定传感器，其中所述金属粒子为金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)及钯(Pd)中的任一种。
(4)根据所述(1)至(3)中任一项所记载的物质测定传感器，其中所述热响应性高分子为聚(N-异丙基丙烯酰胺)及聚(乙烯基甲基醚)中的至少一种。
(5)根据所述(1)至(3)中任一项所记载的物质测定传感器，其中所述标识粒子为抗体、抗原、肽、单链脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)、单链核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)及这些物质的衍生物中的任一种。
(6)根据所述(1)至(5)中任一项所记载的物质测定传感器，其中所述带电物质在溶液中显示出正的动电位。
(7)根据所述(6)所记载的物质测定传感器，其中所述热响应性高分子具有氨基，所述带电物质为胺系化合物。
(8)根据所述(1)至(7)中任一项所记载的物质测定传感器，含有0.1质量％～0.4质量％的所述标识粒子。
(9)一种物质测定传感器的制造方法，制造根据所述(1)至(8)中任一项所记载的物质测定传感器，并且
在含有用来形成热响应性高分子的单体的溶液中，添加与测定对象物质特异地反应的标识粒子、及在溶液中显示出正或负的动电位的带电物质，进行聚合而形成三元共聚物，
在含有所得的三元共聚物的溶液中添加含有金属粒子的溶液后，进行加热冷却，由所述三元共聚物来被覆所述金属粒子。
(10)一种物质测定传感器的制造方法，制造根据所述(1)至(8)中任一项所记载的物质测定传感器，并且
在含有用来形成热响应性高分子的单体的溶液中，添加在溶液中显示出正或负的动电位的带电物质，进行聚合而形成共聚物，
在所得的共聚物中添加金属粒子，由所述共聚物来被覆所述金属粒子，
在被覆所述金属粒子的共聚物中添加与测定对象物质进行特异反应的标识粒子而进行复合化。
(11)一种测定对象物质的测定方法，在根据所述(1)至(8)中任一项所记载的物质测定传感器中，在所述物质测定传感器的带电物质显示出正的动电位的情况下，添加在溶液中显示出负的动电位并且与含有测定对象物质特异地反应的标识粒子的复合化化合物，或者，在所述物质测定传感器的带电物质显示出负的动电位的情况下，添加在溶液中显示出正的动电位并且含有与测定对象物质特异地反应的标识粒子的复合化化合物，
在所述物质测定传感器的热响应性高分子为在下限临界溶液温度以上不溶解而引起相分离的热响应性高分子的情况下，对所述物质测定传感器的热响应性高分子的相转变温度以上的温度下的透射率进行测定，或者，在所述物质测定传感器的热响应性高分子为在上限临界溶液温度以下不溶解而引起相分离的热响应性高分子的情况下，对所述物质测定传感器的热响应性高分子的相转变温度以下的温度下的透射率进行测定。
[发明的效果]
根据本发明，能以高感度对促甲状腺素(Thyroid Stimulating Hormone，TSH)、凝血酶(thrombin)、外源凝集素(lectin)、伴刀豆球蛋白A(concanavalinA)、血小板源生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)等测定对象物质简单地进行计量。因此，特别可以有效地用于利用免疫反应的测定对象物质的检测。
附图说明
图1的(a)为对本发明的物质测定传感器与测定对象物质结合的状态加以说明的图，图1的(b)为对不存在测定对象物质的情形的物质测定传感器的结合状态进行说明的图。
图2的(a)为表示物质测定传感器1的抗生物素蛋白(avidin)浓度变化时的温度与透射率的关系的图表，图2的(b)为表示物质测定传感器2的抗生物素蛋白浓度变化时的温度与透射率的关系的图表。
图3的(a)为表示物质测定传感器3的抗生物素蛋白浓度变化时的温度与透射率的关系的图表，图3的(b)为表示物质测定传感器4的抗生物素蛋白浓度变化时的温度与透射率的关系的图表，图3的(c)为表示物质测定传感器5的抗生物素蛋白浓度变化时的温度与透射率的关系的图表。
图4的(a)为表示物质测定传感器6的抗生物素蛋白浓度变化时的温度与透射率的关系的图表，图4的(b)为表示物质测定传感器7的抗生物素蛋白浓度变化时的温度与透射率的关系的图表，图4的(c)为表示物质测定传感器8的抗生物素蛋白浓度变化时的温度与透射率的关系的图表。
图5为表示35℃下的抗生物素蛋白浓度与透射率的关系的图，图5的(a)为表示物质测定传感器3～物质测定传感器5的结果的图表，图5的(b)为表示物质测定传感器6～物质测定传感器8的结果的图表。
图6为表示由抗生物素蛋白及热响应性高分子的有无所致的物质测定传感器的温度与透射率的关系的图表。
图7为表示牛血清基质共存条件下的物质测定传感器4的抗生物素蛋白浓度变化时的温度与透射率的关系的图表。
图8为表示牛血清基质共存下与非共存下的物质测定传感器4的35℃下的抗生物素蛋白浓度与透射率的关系的图表。
具体实施方式
(物质测定传感器)
本发明的物质测定传感器含有：与测定对象物质特异地反应的标识粒子、热响应性高分子、在溶液中显示出正或负的动电位的带电物质、及金属粒子。
(热响应性高分子)
热响应性高分子为因热刺激而物性变化的聚合物，在水溶液中的溶解性因温度变化而变化。热响应性高分子中，有在低温下溶解于水中但在下限临界溶液温度(Lower Critical Solution Temperature，简称LCST)以上不溶解而引起相分离的热响应性高分子、及若温度上升而超过上限临界溶液温度(Upper Critical Solution Temperature，简称UCST)则显示出水溶性的热响应性高分子。
LCST型的热响应性高分子例如可以举出：甲基纤维素、聚环氧乙烷、聚乙酸乙烯酯皂化物、聚(乙烯基甲基醚)(简称PMVE)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(简称PNIPAM)、羟丙基纤维素等。UCST型的温度响应性高分子例如可以举出：聚(丙烯酰基甘氨酰胺)、聚(丙烯酰基天冬氨酰胺)、聚(丙烯酰基谷氨酰胺)、丙烯酰基甘氨酰胺与丙烯酰基天冬氨酰胺的共聚物等。
聚(N-异丙基丙烯酰胺)在32℃附近具有LCST，且相转变的变化极为敏锐。由于该LCST为较接近体温的温度，并且所述聚(N-异丙基丙烯酰胺)显示出在LCST以上收缩的物性，因此在制作缓释性药剂的方面有用，是以可内含药剂的纳米尺寸(nanosize)至微米尺寸(microsize)的水凝胶(hydrogel)或胶束(micell)等形态而利用。聚(N-异丙基丙烯酰胺)具有氢键部位，在低于LCST的温度下吸持疏水性水合水而膨润。另一方面，若温度变为LCST以上则脱水合，通过疏水部分的疏水性相互作用而收缩成小球(globule)状，不溶解。由于该相转变行为可逆，因此通过设定为低于LCST的温度而再次溶解于水中。
本发明中，热响应性高分子优选的是使用聚(N-异丙基丙烯酰胺)及聚(乙烯基甲基醚)中的至少一种。聚(N-异丙基丙烯酰胺)及聚(乙烯基甲基醚)可以合成通过自由基共聚合而导入有具有各种官能基的单体的共聚物。由此，可以容易地控制LCST或附加热响应以外的功能。
热响应性高分子在物质测定传感器中的浓度优选的是设定为0.01质量％～0.02质量％的范围，更优选0.015质量％～0.02质量％的范围，特别优选0.016质量％～0.017质量％的范围。若浓度为0.01质量％以上，则透射率的变化变明显，因此优选，若浓度为0.02质量％以下，则维持明显的透射率变化，因此优选。
(金属粒子)
本发明的金属粒子显示出由表面等离子体共振(Surface PlasmonResonance，简称SPR)所致的吸收。所谓表面等离子体，是指在金属表面上传播的等离子体(附加了量子力学含义的等离子体波(plasma wave))。通常，金属中的自由电子不会因光而成为激发状态，因此必须使用衰减波(evanescent wave，随着远离金属表面而衰减的电磁波)来激发。若该衰减波与表面等离子体波的波数一致，则引起共振，产生反射光衰减的现象。
具有由表面等离子体共振所致的吸收的金属粒子视金属的种类而不同，大致是通过将金属粒子的粒径设定为纳米(nm)级而获得。本发明中，金属粒子的平均粒径优选10nm～50nm，更优选10nm～30nm，特别优选10nm～20nm。若金属粒子的平均粒径为10nm以上，则透射率的变化变明显，因此优选，若金属粒子的平均粒径为50nm以下，则维持明显的透射率的变化，因此优选。
金属的种类并无特别限定，可以优选地使用金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)、钯(Pd)等。其中，金容易通过表面修饰来赋予功能性，因此特别优选。
本发明的金属粒子优选的是平均纵横比为1～5。所谓纵横比，是指粒子的长度(长轴径)与直径(短轴径)之比(长轴径/短轴径)，所谓平均纵横比，是指对200个粒子求出各自的纵横比所得的算术平均的值。若平均纵横比为所述范围，则透射率的变化变明显，因此优选。
金属粒子在物质测定传感器中的浓度优选的是设定为0.01g/L～0.02g/L的范围，更优选0.015g/L～0.02g/L的范围，特别优选0.016g/L～0.017g/L的范围。若浓度为0.01g/L以上，则透射率的变化变明显，因此优选，若浓度为0.02g/L以下，则维持明显的透射率的变化，因此优选。
(带电物质)
本发明的带电物质在溶液中显示出正或负的动(ζ)电位。所谓动电位是定义为如下电位：在溶液中的粒子周围所形成的被称为离子固定层与离子扩散层的双电层中，开始引起液体流动的“滑动面”的电位。根据粒子的表面特性，该动电位的绝对值显示出正(正性)或负(负性)的值。
带电物质并无特别限定，可以举出带正电或负电的有机物质等，其中从有效的静电相互作用的观点来看，优选的是使用带正电的有机物质。
带正电的有机物质可以例示：乙二胺、二乙三胺、三乙四胺、四乙五胺、五乙六胺等胺系化合物及其衍生物，特别优选三乙四胺及其衍生物。在带电物质为胺系化合物及其衍生物的情况下，热响应性高分子含有具有正电荷的氨基。
另外，带负电的有机物质可以例示：丙烯酸或甲基丙烯酸等羧酸系化合物及其衍生物。在带电物质为羧酸系化合物及其衍生物的情况下，热响应性高分子含有具有负电荷的羧基。
(标识粒子)
本发明的标识粒子与测定对象物质特异地反应。标识粒子例如可以举出：抗体、抗原、肽、单链DNA、单链RNA及这些物质的衍生物。关于标识粒子(分子识别成分)与测定对象物质的特异反应，已知免疫反应，本发明的物质测定传感器在使用免疫反应的情况下，可检测测定对象物质。
所谓免疫反应，是指抗原与和其相对应的抗体特异地结合的反应，也被称为抗原抗体反应。所谓抗体，是指与作为抗原的粒子状蛋白质特异地结合的血浆蛋白。相对于此，抗原这一单词是以更广义地指适应性免疫(adaptiveimmunity)系统中可识别的物质的单词而使用，与抗体反应的分子被称为抗原，将引起抗体生产的抗原称为免疫原。抗体的总体结构在多数抗体中共同，被称为免疫球蛋白(Immunoglobulin，简称lg)。lg抗体中，最多地存在的抗体为免疫球蛋白G(lgG)抗体。蛋白抗原的情况下，在抗原·抗体间发挥作用的静电相互作用、氢键、范德华(Van Der Waals)力等参与结合，抗体分子遍及广范围而与其抗原所识别的抗体分子表面的互补区域相互作用。
免疫反应的例子可以举出抗生物素蛋白-生物素相互作用。抗生物素蛋白与生物素之间具有极强的亲和性(Affinity)或差异性。
在本发明的物质测定传感器中，抗生物素蛋白(分子量约68kDa)发挥将生物素间结合的接着剂的作用。作为具有与抗生物素蛋白非常相似的结构的物质，有来源于被称为链霉菌(Streptomyces)的放射菌的链霉抗生物素蛋白(分子量约60kDa)。链霉抗生物素蛋白的等电点在6附近，且不具有糖链，但抗生物素蛋白的等电点在10附近，且其上具有糖链。据此，链霉抗生物素蛋白在生理条件下较抗生物素蛋白更难以引起非特异性吸附，改性也强，因此可以合适地使用。
生物素为分类至维生素B群中的水溶性维生素的一种，也被称为维生素B7。另外，因在生体内发挥的作用而有时也被称为辅酶R，为人所必需的营养素，因此视摄取量不同而可能引起缺乏症。在物质测定传感器中，将生物素用于作为检测对象的蛋白质的标识。由此可以在不损及蛋白质的生理活性情况下标识抗体。另外，因使多个生物素共价键合于蛋白质，因此经生物素标识的蛋白质可与多个抗生物素蛋白相互作用。
标识粒子在物质测定传感器中的浓度优选的是设定为0.1mol％～0.4mol％的范围，更优选0.2mol％～0.4mol％的范围，特别优选0.3mol％～0.4mol％的范围。若浓度为0.1mol％以上，则响应低浓度的抗生物素蛋白，因此优选，若浓度为0.4mol％以下，则保持对抗生物素蛋白的响应感度，因此优选。
(物质测定传感器的制造方法)
本发明的物质测定传感器若可由与测定对象物质特异地反应的标识粒子、带电物质与热响应性高分子的共聚物来被覆金属粒子的表面，则其制造方法并无特别限定。例如可以举出以下的1)～3)的方法，但不限定于这些方法。
1)使标识粒子、带电物质、及用来形成热响应性高分子的单体进行共聚合而合成三元共聚物(terpolymer，三聚物)，将该三元共聚物被覆在金属粒子上的方法
2)使用来形成热响应性高分子的单体与带电物质进行共聚合而合成共聚物(copolymer)，将该共聚物被覆在金属粒子上后，使标识粒子进行复合化的方法
3)使用来形成热响应性高分子的单体与带电物质进行共聚合而合成共聚物(copolymer)，使标识粒子与该共聚物进行复合化后，被覆金属粒子的方法
(复合化化合物)
本发明的物质测定传感器通过溶液中的复合化化合物的存在而与测定对象物质一起形成三元系复合体。本发明中所用的复合化化合物包含在溶液中显示出正或负的动电位的物质(带电物质)、及与测定对象物质特异地反应的标识粒子。在测定对象物质的测定方法中，在物质测定传感器的带电物质显示出正的动电位的情况下，使用在溶液中显示出负的动电位的复合化化合物，在物质测定传感器的带电物质显示出负的动电位的情况下，使用在溶液中显示出正的动电位的复合化化合物。用于复合化化合物的在溶液中显示出正或负的动电位的物质并无特别限定，例如可以举出聚丙烯酸盐等。另外，用于复合化化合物的标识粒子只要可与测定对象物质结合，则并无特别限定，可与用于物质测定传感器的标识粒子相同，也可不同。
像这样，通过使用具有与本发明的物质测定传感器的带电物质的动电位不同的动电位的复合化化合物，溶液中的三元系复合体不会引起电荷的抵消，而保持亲水性。因此，不会因加热而引起相转变。因此，可以通过测定溶液的透射率来对测定对象物质进行定量。
(测定对象物质的测定)
其次，对使用所述获得的物质测定传感器的测定对象物质的测定方法加以说明。图1为对物质测定传感器的结合状态加以说明的图，图1的(a)为对本发明的物质测定传感器与测定对象物质结合的状态加以说明的图，图1的(b)为对不存在测定对象物质的情况下的物质测定传感器的结合状态进行说明的图。
关于本发明的物质测定传感器1，在溶液中存在测定对象物质2、及含有与该物质测定传感器1的标识粒子14相同的标识粒子15的复合化化合物3的情况下，像图1的(a)所示那样，物质测定传感器1的标识粒子14及复合化化合物3的标识粒子15分别与测定对象物质2相互作用而形成三元系复合体。通过测定对象物质2与标识粒子14、标识粒子15的相互作用，在构成物质测定传感器1的带电物质与构成复合化化合物3的带电物质之间产生立体限制，因此完全不会引起复合体内的电荷抵消。所以亲水性得以保持。因此，即便进行加热也不会引起明确的相转变，溶液的透射率不会降低。
相对于此，在不存在测定对象物质2的情况下，像图1的(b)所示那样，通过静电相互作用而形成二元系复合体。若形成二元系复合体，则引起有效的电荷抵消。由此亲水性降低。若在该状态下将溶液加热到相转变温度以上，则发生明确的相转变，溶液的透射率降低。
根据以上机制，在相转变温度以上的条件下，溶液的透射率根据测定对象物质的浓度而变化。像这样，通过将溶液加温到相转变温度以上并测定该溶液的透射率，可以对测定对象物质进行定量。
关于利用本发明的物质测定传感器的测定对象物质的测定方法，可以通过以下方式来进行检测：在物质测定传感器中添加测定对象物质及复合化化合物，将溶液的温度调整为所使用的热响应性高分子的上限临界溶液温度以下或下限临界溶液温度以上，测定特定波长下的吸光度。
例如在测定透射光的情况下，在石英制池(cell)中放入物质测定传感器，然后添加成为测定对象的溶液及复合化化合物，观察750nm～900nm的波长下的吸收波峰的强度变化，由此可以进行测定。
实施例
接着，通过实施例对本发明加以更详细说明，但本发明不受这些例子的任何限定。此外，纯水是使用利用密理博(Millipore)制造的纯水制造装置(型号：F9MN25332C)将自来水纯化后，利用密理博(Millipore)制造的密理-Q(Milli-Q)超纯水制造系统进行纯化所得的水。
<装置>
本发明中所用的装置如下。
·吸收光谱及透射率的测定：日本分光股份有限公司制造的“V-650型紫外可见分光光度计”
·动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测定(粒径的测定：测定值为散射光强度基准的调和平均粒径(直径))及动电位测定：马尔文(Malvern)公司制造的“纳米粒度仪(Zetasizer Nano)ZS”
·冷冻干燥：东京理化器械股份有限公司制造的“FD-5N型冷冻干燥机”
·超滤：爱多邦得科(ADVANTEC)公司制造的“UHP-76K型定容量连续过滤装置”
·透析：仕必纯(Spectrum Laboratories)公司制造的“纤维素酯透析膜(截留分子量：10000)”
<试验例1：物质测定传感器的合成>
将测定对象物质设定为抗生物素蛋白(Fw：68000)，将金属粒子设定为包含金(Au)的粒子，使用N-异丙基丙烯酰胺(简称NIPAAm，Fw：113.16)(使用己烷(Fw：86.18)将和光纯药工业股份有限公司制造的NIPAAm再结晶所得的物品)作为热响应性高分子，使用生物素单体(Fw：368，N-生物素基-N′-(甲基)丙烯酰基三亚甲基酰胺)作为与测定对象物质特异地反应的标识粒子，使用三乙四胺(简称TETA，Fw：146.24)作为带电物质，通过以下方法来制造物质测定传感器。
(金属粒子溶液的制备)
金属粒子溶液的制备是通过柠檬酸还原法来进行。
在500mL圆底烧瓶中加入1mM四氯金酸盐水溶液250mL，一面搅拌一面进行加热直到即将沸腾之前为止。沸腾后，添加38.8mM柠檬酸三钠水溶液25mL，确认到溶液的颜色由淡黄色变化为深红色。进而一面搅拌一面加热10分钟后，在室温下持续搅拌15分钟。使用孔径1μm的薄膜过滤器对溶液进行抽吸过滤，将金胶体溶液移至玻璃试剂瓶中，保存在冷暗处(4℃)(0.18g-Au/L金胶体溶液)。另外，利用所述方法所制备的金属粒子即金胶体的粒径为约13nm。
另外，将作为还原剂及分散剂而发挥作用的柠檬酸三钠水溶液的添加量设定为11.6mL，制备粒径为约30nm的金胶体溶液。
(包含热响应性高分子、标识粒子及带电物质的三元共聚物的合成)
(1)共聚物：聚(N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酰基三乙四胺)(简称Poly(NIPAAm/TETA))(以下也称为“NIP-TETA”)的合成
在聚合之前，按以下顺序来合成作为反应中间体的丙烯酰基三乙四胺(简称acTETA)。一面将浸渍在冰浴中的29.24g(0.2mol)的TETA与1，4-二恶烷200mL的混合溶液搅拌，一面逐滴地滴加丙烯酰氯(简称AC)1.72mL(0.02mol)与1，4-二恶烷50mL的混合溶液进行反应。滴加结束后，将白色的沉淀过滤分离，使用1，4-二恶烷来清洗沉淀，由此去掉未反应的AC。将所得的沉淀溶解在少量的甲醇(约50mL)中。在该溶液中添加氢氧化钾-甲醇溶液(氢氧化钾为1.18g(0.02mol))50mL进行搅拌。将沉淀(KCl)过滤分离，将含有acTETA的滤液用于与NIPAAm单体的共聚合。
在500mL三口可分离式烧瓶中，以单体的供给比(NIP的物质量∶TETA的物质量)成为90.0∶10.0(mol比)的方式添加20.37g(0.18mol)的NIPAAm，添加作为聚合促进剂的3-巯基丙酸0.5mL及作为聚合起始剂的α，α′-偶氮双异丁腈0.3284g(0.002mol)，使用油浴加温至60℃，一面搅拌，一面在使用5w/v％邻苯三酚-10w/v％碱溶液(碱：NaOH)100mL的脱氧线上经通气的氮气环境下进行4小时聚合。聚合结束后，使用冷二乙醚通过沉淀法来进行2次聚合物的纯化。然后，在所得的聚合物中以总体积成为300mL的方式添加纯水，使沉淀溶解。使用排除极限(exclusion limit)5000的超滤膜对该溶液进行超滤直到150mL为止。将该操作进行6次，在滤液中添加少量的二硫化碳与银的标准溶液，确认到溶液未变为黑褐色后，进行冷冻干燥并保存在冷暗处。将NIP-TETA的结构式示于下述式(1)中。
[化1]
(2)三元共聚物：聚(N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酰基三乙四胺/丙烯酰基生物素)(简称Poly(NIPAAm/TETA/Bio))(以下也称为“NIP-TETA-Bio”)的合成
acTETA是以所述(1)NIP-TETA的合成的1/5倍的比例(scale)同样地进行制备。将所得的acTETA用于与NIP单体及生物素单体的共聚合。
在500mL三口可分离式烧瓶中，以单体的供给比(NIP的物质量∶TETA的物质量∶Bio的物质量)成为89.875∶10.000∶0.125(mol比)的方式添加NIPAAm单体(简称NIP)4.068g(0.03595mol)、生物素单体0.0184g(0.00005mol)、作为聚合促进剂的3-巯基丙酸0.1mL及作为聚合起始剂的α，α′-偶氮双异丁腈0.0657g(0.0004mol)，使用油浴将烧瓶加温至60℃，一面搅拌，一面在使用5w/v％邻苯三酚-10w/v％碱溶液(碱：NaOH)100mL的脱氧线上经通气的氮气环境下进行4小时聚合。聚合结束后，使用冷二乙醚通过沉淀法来进行2次聚合物的纯化。然后，在所得的聚合物中以总体积成为120mL的方式添加纯水，使沉淀溶解。使用排除极限5000的超滤膜对该溶液进行超滤直到60mL为止。将该操作进行6次，在滤液中添加少量的二硫化碳与银的标准溶液，确认到溶液未变为黑褐色后，进行冷冻干燥并保存于冷暗处。将NIP-TETA-Bio的结构式示于下述式(2)中。
[化2]
(物质测定传感器的制备：物质测定传感器1)
在50mL容量瓶(messflask)中添加2.0质量％NIP-TETA-Bio溶液6.25mL、0.18g-Au/L金属粒子溶液(粒径约13nm)15mL，以纯水进行稀释，调整为50mL。
使用水浴在90℃下加热30分钟，使用冰浴在0℃下冷却30分钟并进行搅拌。将该操作重复3次。将所得的溶液加入到截留分子量10000的赛璐玢管膜(cellophane tube)中，将该管膜浸渍在经纯水充满的1L烧杯中，每隔一天更换纯水而透析5天。
将物质测定传感器1的合成流程示于下述式(3)中。式中，x、y及z分别表示高分子中的NIP、TETA及Bio的摩尔分率。
[化3]
(物质测定传感器的制备：物质测定传感器2)
100mmol/L生物素溶液是通过使生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(以下也称为“NHS-Biotin”)(FW：341.36，赛默飞世尔科技(Thermo SCIENTIFIC)公司制造)6.8mg溶解在200μL的纯水中而制备。
在50mL容量瓶中添加2.0质量％NIP-TETA溶液6.25mL、0.18g-Au/L金属粒子溶液(粒径为13nm)15mL，以纯水进行稀释，调整为50mL。
使用水浴在90℃下加热30分钟，使用冰浴在0℃下冷却30分钟并进行搅拌。将该操作重复3次，由此获得NIP-TETA被覆金属粒子溶液(以下也称为“NIP-TETA-Au溶液”)。
于在20mL三角烧瓶中预先经冷却的NIP-TETA-Au溶液9mL中，添加利用与上文所述相同的方法所制备的100mmol/L生物素溶液200μL。一面搅拌该溶液，一面在冰浴中培养3小时。然后，将所得的溶液加入到截留分子量10000的赛璐玢管膜中，将该管膜浸渍在经纯水充满的1L烧杯中，每隔一天更换纯水而透析5天。
将物质测定传感器2的合成流程示于下述式(4)中。式中，x及y分别表示高分子中的NIP及TETA的摩尔分率，p表示对TETA导入Bio的比例。
[化4]
<试验例2：影响物质测定传感器溶液的透射率的抗生物素蛋白浓度的研究>
(磷酸缓冲生理食盐水的制备)
在200mL烧杯中添加氯化钠0.8g(0.014mol)、磷酸二氢钠1.15g(0.008mol)、氯化钾0.2g(0.003mol)、磷酸二氢钾0.2g(0.002mol)并加以溶解后，使用100mL容量瓶以纯水进行稀释，调整为100mL，制备磷酸缓冲生理食盐水(以下也称为“PBS”)。
(抗生物素蛋白溶液的制备)
将抗生物素蛋白2.5mg溶解于0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液500μL中，制备7.4μmol/L的抗生物素蛋白溶液。
(透射率的测定)
在所述制备的物质测定传感器溶液(物质测定传感器1、物质测定传感器2)中，添加浓度为7.4μmol/L的抗生物素蛋白溶液、作为复合化化合物的4.4mg/mL生物素化聚丙烯酸钠溶液及PBS，进行温度透射率测定。
在光路长1cm的石英制半微池(semi microcell)中依次添加物质测定传感器溶液300μL、抗生物素蛋白溶液100μL、生物素化聚丙烯酸钠溶液50μL。然后，添加纯水450μL、PBS溶液100μL，将最终液量调整为1mL。通过用手振荡来轻轻地搅拌该溶液，使各试样溶液均匀后，在金属粒子及热响应性高分子不具有吸收的波长850nm下测定透射率。测定条件如下。
[测定条件]
金属粒子的粒径：13nm
金属粒子溶液浓度：0.027g-Au/L
聚合物浓度：0.0625质量％
测定温度：20℃
波长：850nm
标准液：纯水
另外，对于所述物质测定传感器溶液(物质测定传感器1、物质测定传感器2)，使用使抗生物素蛋白浓度在0μmol～7.4μmol的范围内变化的溶液，测定温度变化时的透射率。测定条件如下。将由抗生物素蛋白的浓度变化所致的溶液的透射率的变化示于图2的(a)及图2的(b)中。
[测定条件]
金属粒子的粒径：13nm
金属粒子溶液浓度：0.0162g-Au/L
聚合物浓度：0.0625质量％
生物素化聚丙烯酸钠浓度：0.22mg/mL
测定波长：850nm
标准液：纯水
根据图2的(a)及图2的(b)的结果，可见由抗生物素蛋白的有无所致的透射率曲线的差异。由此得知，本发明的物质测定传感器适于抗生物素蛋白的检测。尤其关于物质测定传感器1，由于抗生物素蛋白的透射率曲线的差异大，因此得知与物质测定传感器的复合化效率良好。
<试验例3：金属粒子的粒径及生物素导入比例>
使用试验例1中制作的粒径约13nm及约30nm的金属粒子、与生物素导入比例不同的3种三元共聚物(三聚物)(生物素导入比例：0.125mol％、0.25mol％、0.375mol％)分别进行复合化，制备6种物质测定传感器3～物质测定传感器8。使用按照所述金属粒子溶液的制备的顺序所制备的粒径不同的2种金属粒子(13nm、30nm)、与按照所述NIP-TETA-Bio的合成顺序所合成的生物素导入比例不同的3种三元共聚物NIP-TETA-Bio(生物素导入比例，0.125mol％、0.25mol％、0.375mol％)。
在50mL容量瓶中添加2.0质量％NIP-TETA-Bio溶液(生物素导入比例，0.125mol％、0.25mol％、0.375mol％)6.25mL、及0.18g-Au/L金属粒子溶液(粒径约13nm、30nm)15mL，以纯水进行稀释，调整为50mL。
使用水浴在90℃下加热30分钟，使用冰浴在0℃下冷却30分钟并进行搅拌。将该操作重复3次。将所得的溶液加入到截留分子量10000的赛璐玢管膜中，将该管膜浸渍在经纯水充满的1L烧杯中，每隔一天更换纯水而透析5天。
将物质测定传感器3～物质测定传感器8的金属粒子的粒径及三聚物中的生物素导入比例示于表1中。
[表1]
表1
对于这些物质测定传感器3～物质测定传感器8，按照所述透射率的测定方法使所添加的抗生物素蛋白浓度在0μmol～7.4μmol的范围内变化，测定溶液的透射率。测定条件如下。将由抗生物素蛋白的浓度变化所致的溶液的透射率的变化示于图3的(a)～图3的(c)及图4的(a)～图4的(c)中。
另外，将各物质测定传感器中35℃下的抗生物素蛋白浓度与透射率的关系示于图5的(a)及图5的(b)中。图5的(a)为使用13nm金属粒子的物质测定传感器3～物质测定传感器5的结果，图5的(b)为使用30nm金属粒子的物质测定传感器6～物质测定传感器8的结果。
[测定条件]
金属粒子溶液浓度：0.0162g-Au/L
聚合物浓度：0.0625质量％
生物素化聚丙烯酸钠浓度：0.22mg/mL
测定波长：850nm
标准液：纯水
由图3的(a)～图3的(c)、图4的(a)～图4的(c)以及图5的(a)及图5的(b)的结果得知，在使用任一物质测定传感器的情况下，在物质测定传感器的相转变温度以上，透射率曲线的轮廓根据抗生物素蛋白浓度而变化。
<试验例4：物质测定传感器溶液的透射率>
在光路长1cm的石英制半微池中依次添加300μL的物质测定传感器4、7.4μmol/L抗生物素蛋白溶液100μL及8.0μmol/L生物素化聚丙烯酸钠溶液50μL，添加纯水450μL及100μL的PBS而将最终体积调整为1mL(实施例1)。
同样地，使用1)物质测定传感器溶液(物质测定传感器4)300μL、2)物质测定传感器溶液(物质测定传感器4)300μL及生物素化聚丙烯酸钠溶液50μL、3)物质测定传感器溶液(物质测定传感器4)300μL及抗生物素蛋白溶液100μL的各溶液，制作将最终体积调整为1mL的水溶液(比较例1、比较例2、参考例1)。
将实施例1、比较例1、比较例2及参考例1的测定溶液的构成示于表2中。
[表2]
表2
通过用手振荡来轻轻搅拌所制作的测定溶液，使各试样溶液均匀后，在波长850nm下测定温度变化时的透射率。测定条件如下。将结果示于图6中。
[测定条件]
金属粒子的粒径：13nm
金属粒子溶液浓度：0.0162g-Au/L
聚合物浓度：0.0625质量％
生物素化聚丙烯酸钠浓度：0.22mg/mL
测定波长：850nm
标准液：纯水
根据图6的结果，在比较例1及比较例2中，在溶液的相转变温度以上(LCST以上)，透射率降低。可认为其原因在于：因不存在抗生物素蛋白，因此构成物质测定传感器的热响应性高分子伴随着相转变而疏水化，由此导致溶解度降低，而且，在物质测定传感器与生物素化聚丙烯酸钠的系统中，由静电相互作用导致电荷抵消，由此引起溶解度降低。另一方面，实施例1与参考例1同样地，即便在溶液的相转变温度以上(LCST以上)，透射率也显示高的值。可认为其原因在于：物质测定传感器彼此、或物质测定传感器与生物素化聚丙烯酸钠经由抗生物素蛋白而相互作用，通过热响应性高分子上聚合的带电物质(TETA)与聚丙烯酸钠的带电基(聚阴离子)之间的立体限制来保持系统的亲水性。
<试验例5：牛血清基质共存条件下的物质测定传感器溶液的透射率>
在物质测定传感器4中，添加10vol％牛血清溶液(牛血清(BovineSerum)，翰步科(GIBCO)制造)、浓度为0μmol/L～7.4μmol/L的抗生物素蛋白溶液、4.4mg/mL生物素化聚丙烯酸钠溶液及工作缓冲液(WorkingBuffer)，进行温度变化时的透射率的测定。
在光路长1cm的石英制半微池中依次添加物质测定传感器溶液300μL、10vol％牛血清溶液25μL、抗生物素蛋白溶液100μL、生物素化聚丙烯酸钠溶液50μL。然后，添加纯水425μL、工作缓冲液(Working Buffer)100μL而将最终液量调整为1mL。通过用手振荡来搅拌该溶液，使各试样溶液均匀后，在波长850nm下测定透射率。测定条件如下。将由抗生物素蛋白的浓度变化所致的溶液的透射率的变化示于图7中。
<工作缓冲液(Working Buffer)的组成>
0.5w/v％的牛白蛋白
0.5w/v％的Triton X-100
10mmol/L的EDTA
NaCl 0.014mol/L
KCl 0.003mol/L
NaH2PO4 0.008mol/L
KH2PO4 0.002mol/L
[测定条件]
金属粒子的粒径：13nm
金属粒子溶液浓度：0.0162g-Au/L
聚合物浓度：0.0625质量％
生物素化聚丙烯酸钠浓度：0.22mg/mL
牛血清浓度：0.25vol％
测定波长：850nm
标准液：纯水
然后，在牛血清基质的共存下进行抗生物素蛋白的计量。
在物质测定传感器4中，添加浓度为0μmol/L～7.4μmol/L的抗生物素蛋白溶液、4.4mg/mL的生物素化聚丙烯酸钠溶液及PBS，进行DLS测定。
在玻璃池中依次添加金纳米复合体溶液600μL、抗生物素蛋白溶液200μL、生物素化聚丙烯酸钠溶液100μL。然后，添加纯水900μL、PBS溶液200μL，将最终液量调整为2mL。通过用手振荡来轻轻搅拌该溶液，使各试样溶液均匀后，在金纳米复合体溶液的相转变温度前后的30℃及40℃下进行DLS测定。测定是通过自动测定对1个试样进行3组。测定条件如下。将牛血清共存下与非共存下的35℃下的抗生物素蛋白浓度与透射率的关系示于图8中。
[测定条件]
金属粒子的粒径：13nm
金属粒子溶液浓度：0.0162g-Au/L
聚合物浓度：0.0625质量％
生物素化聚丙烯酸钠浓度：0.22mg/mL
牛血清浓度：0.25vol％
测定温度：35℃
测定波长：850nm
标准液：纯水
由图7及图8的结果得知，若牛血清共存则检测感度稍许降低，但无论有无牛血清，均显示出类似的S字状的相转变曲线。据此，通过进行基质匹配(matrix matching)，可将该物质测定传感器应用于测定对象物质的计量。
详细且参照特定的实施形态对本发明进行了说明，但本领域技术人员明确，可在不偏离本发明的精神及范围的情况下加以各种变更或修正。本发明是基于2012年9月4日提出申请的日本专利申请案(日本专利特愿2012-194085)，将其内容以参照的方式并入至本文中。
[符号的说明]
1：物质测定传感器
2：测定对象物质
3：复合化化合物
11：金属粒子
12：热响应性高分子
13：带电物质
14、15：标识粒子

Claims (11)

1.一种物质测定传感器，含有：
与测定对象物质特异地反应的标识粒子、
热响应性高分子、
在溶液中显示出正或负的动电位的带电物质、及
金属粒子，并且
所述金属粒子是由所述标识粒子与所述带电物质与所述热响应性高分子的共聚物所被覆。
2.根据权利要求1所述的物质测定传感器，其中所述金属粒子的平均粒径为10nm～50nm。
3.根据权利要求1或2所述的物质测定传感器，其中所述金属粒子为金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)及钯(Pd)中的任一种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的物质测定传感器，其中所述热响应性高分子为聚(N-异丙基丙烯酰胺)及聚(乙烯基甲基醚)中的至少一种。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的物质测定传感器，其中所述标识粒子为抗体、抗原、肽、单链DNA、单链RNA及这些物质的衍生物中的任一种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的物质测定传感器，其中所述带电物质在溶液中显示出正的动电位。
7.根据权利要求6所述的物质测定传感器，其中所述热响应性高分子具有氨基，所述带电物质为胺系化合物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的物质测定传感器，含有0.1质量％～0.4质量％的所述标识粒子。
9.一种物质测定传感器的制造方法，制造根据权利要求1至8中任一项所述的物质测定传感器，并且
在含有用来形成热响应性高分子的单体的溶液中，添加与测定对象物质特异地反应的标识粒子、及在溶液中显示出正或负的动电位的带电物质，进行聚合而形成三元共聚物，
在含有所得的三元共聚物的溶液中添加含有金属粒子的溶液后，进行加热冷却，由所述三元共聚物来被覆所述金属粒子。
10.一种物质测定传感器的制造方法，制造根据权利要求1至8中任一项所述的物质测定传感器，并且
在含有用来形成热响应性高分子的单体的溶液中，添加在溶液中显示出正或负的动电位的带电物质，进行聚合而形成共聚物，
在所得的共聚物中添加金属粒子，由所述共聚物来被覆所述金属粒子，
在被覆所述金属粒子的共聚物中添加与测定对象物质特异地反应的标识粒子而进行复合化。
11.一种测定对象物质的测定方法，在根据权利要求1至8中任一项所述的物质测定传感器中，
在所述物质测定传感器的带电物质显示出正的动电位的情况下，添加在溶液中显示出负的动电位且含有与测定对象物质特异地反应的标识粒子的复合化化合物，或者在所述物质测定传感器的带电物质显示出负的动电位的情况下，添加在溶液中显示出正的动电位且含有与测定对象物质特异地反应的标识粒子的复合化化合物，
在所述物质测定传感器的热响应性高分子为在下限临界溶液温度以上不溶解而引起相分离的热响应性高分子的情况下，对所述物质测定传感器的热响应性高分子的相转变温度以上的温度下的透射率进行测定，或者在所述物质测定传感器的热响应性高分子为在上限临界溶液温度以下不溶解而引起相分离的热响应性高分子的情况下，对所述物质测定传感器的热响应性高分子的相转变温度以下的温度下的透射率进行测定。
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