CN102483409A - 检出对象的检出方法和定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在各种环境下可迅速、低成本、简便且高精度地对检出对象进行检出、定量的检出对象的检出方法和定量方法。检出检体中的检出对象的方法包含以下步骤：将第1结合物和第2结合物与检体混合，其中，所述第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与检出对象的第1亲和性物质结合而成，所述第2结合物是具有亲水性的第2物质与检出对象的第2亲和性物质结合而成；将所得混合物置于刺激响应性聚合物发生凝集的条件下，使混合物在展开载体上展开，或者使所得混合物在展开载体上展开，将混合物置于刺激响应性聚合物发生凝集的条件下；确认展开载体上的源自第1结合物或第2结合物的存在而产生的信号，信号与检出对象非存在下不同时，则判别检体中存在检出对象。第1亲和性物质和第2亲和性物质可以与检出对象的不同部位结合。

Description

检出对象的检出方法和定量方法
技术领域
本发明涉及检出对象的检出方法和定量方法。
背景技术
一直以来，可利用乳胶凝集法作为检出被检体中的检出对象的方法。乳胶凝集法是在检出生物体试样等流体中的抗原时，将担载了与抗原特异性结合的抗体或其片段的乳胶与流体混合，通过测定乳胶的凝集程度来检出或定量抗原的方法(例如参照专利文献1)。
根据该乳胶凝集法，是作为检体添加的抗原与多种乳胶结合抗体交联，促进乳胶的凝集。如上所述，步骤简单，因此可以简便且迅速地检出抗原。但是抗原为微量时，难以发生该交联，因此乳胶不能充分凝集。因此难以检出微量的抗原。
因此，ELISA法或CLEIA法的利用酶底物反应的方法也得到广泛应用。这些方法中，例如使与抗原特异性结合的一次抗体与抗原结合，使具有酶的二次抗体与该一次抗体结合。这里，通过添加酶的底物、测定酶催化的反应的程度来检出或定量抗原。
根据这些方法，例如如果使用发光试剂作为底物，则添加底物后的发光的检出灵敏度高，因此可检出微量的抗原。
但是，在利用酶底物反应的方法中，二次抗体或发光试剂等特殊试剂大多是必须的，作业成本高。还必须抑制发光试剂的脱色(脱色现象)，因此不得不使测定步骤在极短的时间内完成，因此可能导致测定精度不充分。
另一方面，该方法还包含对试样和各试剂进行温育的步骤、对系统进行洗涤的步骤、测定发光的步骤等多个阶段，操作繁杂。并且各阶段所需的时间极长，不适合大规模处理。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公昭58-11575号公报
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明人等开发了检出对象的检出和定量技术，该技术中使用了含有刺激响应性聚合物的物质与检出对象的亲和性物质结合而成的结合物、以及具有电荷的物质与检出对象的亲和性物质结合而成的结合物(国际公开WO2008/001868号小册子)。该技术是将上述2种结合物与检体混合，将所得混合物置于刺激响应性聚合物发生凝集的条件下，然后通过浊度测定等来判定刺激响应性聚合物的凝集程度发生了降低，则判定此时检体中存在检出对象。
根据该技术，只使用含有刺激响应性聚合物的物质、亲和性物质和具有电荷的物质即可实现，无需特别使用特殊的试剂即可进行，因此成本低且简便。并且，只是测定凝集抑制的程度即可，并不是利用酶的催化反应的系统，因此可以迅速地进行。
但是，上述技术中，为了判别检出对象的存在，大多情形下必须使用进行浊度测定等的精密仪器，优选在设备完善的实验室等的环境中进行检出或定量。但是，环境污染检查、食品检查等情形通常是在实验室外等设备不完善场所进行检出和定量，因此难以判别检出对象的存在。
本发明针对上述情况而设，其课题在于提供在各种环境下可以迅速、低成本、简便且高精度地检出、定量检出对象的检出对象的检出方法和定量方法。
解决课题的手段
本发明人等发现：使2种结合物与检体的混合物在展开载体上展开，则由于有无检出对象的存在，源自展开载体上的上述结合物的存在而产生的信号有很大差异，从而完成了本发明。具体来说，本发明具有以下的构成。
[1]检出检体中的检出对象的方法，该方法包含以下步骤：
将第1结合物和第2结合物与上述检体混合，其中，所述第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与上述检出对象的第1亲和性物质结合而成，所述第2结合物是具有亲水性的第2物质与上述检出对象的第2亲和性物质结合而成；
将所得混合物置于上述刺激响应性聚合物发生凝集的条件下，使上述混合物在展开载体上展开，或者使所得混合物在展开载体上展开，将上述混合物置于上述刺激响应性聚合物发生凝集的条件下；
确认上述展开载体上的源自第1结合物或第2结合物的存在而产生的信号，上述信号与上述检出对象非存在下不同时，则判别上述检体中存在检出对象，
该方法中，第1亲和性物质和第2亲和性物质可以与上述检出对象的不同部位结合。
[2][1]所述的方法，其中，源自第1结合物的存在而产生的信号的强度比上述检出对象非存在下弱时，判别上述检体中存在检出对象。
[3][1]所述的方法，其中，上述混合物是在除去了第1结合物的凝集体之后，在上述展开载体上展开，源自第1结合物的存在而产生的信号的强度比上述检出对象非存在下强时，判别上述检体中存在检出对象。
[4]对检体中的检出对象进行定量的方法，该方法包含以下步骤：
将第1结合物和第2结合物与上述检体混合，其中，所述第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与上述检出对象的第1亲和性物质结合而成，所述第2结合物是具有亲水性的第2物质与上述检出对象的第2亲和性物质结合而成；
将所得混合物置于上述刺激响应性聚合物发生凝集的条件下，使上述混合物在展开载体上展开，或者使所得混合物在展开载体上展开，将上述混合物置于上述刺激响应性聚合物发生凝集的条件下；
测定上述展开载体上的源自第1结合物或第2结合物的存在而产生的信号的强度，根据上述检出对象的量和信号强度在上述规定条件下的相关式算出上述检体中的检出对象的量，
该方法中，第1亲和性物质和第2亲和性物质可以与上述检出对象的不同部位结合。
[5][4]所述的方法，该方法是测定源自第1结合物的凝集体的存在而产生的信号。
[6][4]所述的方法，其中，上述混合物是在除去第1结合物的凝集体之后，在上述展开载体上展开，测定源自第1结合物的存在而产生的信号的强度。
[7][1]～[6]中任一项所述的方法，其中，第1结合物具有有色颗粒，上述信号与基于上述有色颗粒的存在而显示的颜色相关。
[8][1]～[7]中任一项所述的方法，其中，第1结合物或第2结合物具有在上述展开载体上显色或发光的物质，上述信号与基于上述显色或发光的物质的存在而显示的颜色或光相关。
[9]试剂盒，该试剂盒用于对检出对象进行检出和/或定量，该试剂盒具备第1结合物、第2结合物和用于展开上述结合物的展开载体，其中，所述第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与上述检出对象的第1亲和性物质结合而成，所述第2结合物是具有亲水性的第2物质与上述检出对象的第2亲和性物质结合而成。
[10][9]所述的试剂盒，其中，第1结合物具有有色颗粒。
[11][9]或[10]所述的试剂盒，其中，第1结合物或第2结合物具有在上述展开载体上显色或发光的物质。
发明效果
根据本发明，检出对象存在时，第1亲和性物质和第2亲和性物质与该结合对象结合，因此，与第1亲和性物质结合的刺激响应性聚合物和与第2亲和性物质结合的第2物质互相接近。由此，电荷部分或亲水性部分配置于刺激响应性聚合物的附近，因此对刺激进行响应的刺激响应性聚合物的凝集受到抑制。因此，使混合物在展开载体上展开时的信号根据检出对象的存在量而变化，因此，基于该变化的有无或程度，可以简便地检出或定量检出对象。
以上的顺序均无需特别使用任何特殊的试剂、仪器即可进行，因此可在各种环境下、低成本且简便地实施。并且，只是确认展开后的信号即可，并不是利用酶的催化反应的系统，因此可以迅速地进行。
附图说明
图1是本发明的一个实施方式涉及的方法中使用的结合物的概略构成图。
图2是表示上述实施方式涉及的结合物的使用状态的模式图。
图3是表示本发明的一个实施方式涉及的方法的顺序图。
图4是表示本发明的另一个实施方式涉及的方法的顺序图。
图5是表示本发明的另一个实施方式涉及的方法的顺序图。
图6是在本发明的另一实施方式涉及的方法中使用的、具备展开载体的展开器具的平面图。
图7是图6的展开器具的VII-VII线截面图。
图8是表示图6的展开载体变化的图。
图9是表示实施本发明的一个实施例涉及的方法的结果的照片。
图10是表示实施本发明的另一个实施例涉及的方法的结果的照片。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的一个实施方式进行说明。
<检出方法>
[混合·凝集]
本发明的检出方法中，首先，将结合物与检体混合，将该结合物置于刺激响应性聚合物发生凝集的条件下。这里所使用的结合物至少为2种，对其中作为必须构成要素的第1结合物和第2结合物进行详细说明。
[第1结合物]
第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与检出对象的第1亲和性物质结合而成。
(第1物质)
本发明中使用的第1物质是含有刺激响应性聚合物的物质，该刺激响应性聚合物是对于外部刺激进行响应、引起结构变化，可调节凝集和分散的聚合物。刺激没有特别限定，可举出：温度变化、光的照射、酸或碱的添加(pH的变化)、电场变化等。
特别是本发明中，刺激响应性聚合物可以利用可由于温度变化而发生凝集和分散的温度响应性聚合物。温度响应性聚合物可举出：具有最低临界溶液温度(以下也称为LCST)的聚合物或具有最高临界溶液温度的聚合物(以下也称为UCST)。例如，具有LCST为37℃的最低临界溶液温度的聚合物在低于LCST的温度的水溶液中完全分散，如果将水温升高至LCST以上，则可以立即凝集。另外，具有UCST为5℃的最高临界溶液温度的聚合物在超过UCST的温度的水溶液中完全分散，如果将水温降低至UCST以下，则可以立即凝集。
本发明中使用的具有最低临界溶液温度的聚合物可举出：含有N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰基吡咯烷、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基丙烯酰基吗啉等N取代(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物；羟丙基纤维素、聚乙烯基醇部分乙酰化物、聚乙烯基甲基醚、(聚氧乙烯-聚氧丙烯)嵌段共聚物、聚氧乙烯月桂基胺等聚氧乙烯烷基胺衍生物；聚氧乙烯失水山梨糖醇月桂酸酯等聚氧乙烯失水山梨糖醇酯衍生物；(聚氧乙烯壬基苯基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯辛基苯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基苯基醚)(甲基)丙烯酸酯类；和(聚氧乙烯月桂基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯油基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基醚)(甲基)丙烯酸酯类等的聚氧乙烯(甲基)丙烯酸酯衍生物等。并且可以使用这些聚合物以及含有这些的至少2种以上单体的共聚物。还可以利用N-异丙基丙烯酰胺与N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。使用含有(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物时，可以使其它可共聚的单体在具有最低临界溶液温度的范围内与该聚合物共聚。本发明中，其中可优选利用含有选自N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰基吡咯烷、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基丙烯酰基吗啉的至少1种单体的聚合物或者N-异丙基丙烯酰胺与N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。还可以利用具有以Val-Pro-Gly-X-Gly(X为脯氨酸以外的氨基酸)为代表的五聚肽的重复序列的、来自弹性蛋白的多肽等。
本发明中使用的具有最高临界溶液温度的聚合物可以利用含有选自丙烯酰基甘氨酰胺、丙烯酰基哌啶酰胺、丙烯酰基天冬酰胺和丙烯酰基谷氨酰胺等的至少1种单体的聚合物。还可以是含有它们的2种单体的共聚物。在具有最高临界溶液温度的范围内，可以使丙烯酰胺、乙酰丙烯酰胺、生物素醇丙烯酸酯(ビオチノ一ルアクリレ一ト)、N-生物素基-N’-甲基丙烯酰基亚丙基酰胺、丙烯酰基肌氨酰胺、甲基丙烯酰肌氨酰胺、丙烯酰基甲尿嘧啶等其它可共聚的单体与这些聚合物共聚。
本发明中，刺激响应性聚合物可以利用可根据pH的变化发生凝集和分散的pH响应性聚合物。引起pH响应性聚合物的结构变化的pH没有特别限定，从可抑制施加刺激时的第1结合物、后述的第2结合物以及检体的变性等导致的检出、定量精度降低的角度考虑，优选pH4～10，进一步优选pH5～9。
上述pH响应性聚合物可例举含有羧基、磷酸、磺酰基、氨基等基团作为官能基团的聚合物。更具体来说，可以是(甲基)丙烯酸、马来酸、苯乙烯磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、(甲基)丙烯酸磷酰基乙酯、甲基丙烯酸氨基乙酯、氨基丙基(甲基)丙烯酰胺、二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺等具有解离基团的单体聚合而成的聚合物，还可以是在不损害pH响应能力的程度下，这些具有解离基团的单体与其它乙烯基单体(例如，(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯等(甲基)丙烯酸酯类；乙酸乙烯基酯、丙酸乙烯基酯等乙烯基酯类；苯乙烯、氯乙烯、N-乙烯基吡咯烷酮等乙烯基化合物；(甲基)丙烯酰胺类等)共聚而成的聚合物。
(微粒)
第1物质可以含有担载着刺激响应性聚合物和后述的亲和性物质的微粒。为了使展开载体上的信号根据凝集的程度发生变化，这里所使用的微粒必须具有单独的微粒比后述的展开载体的孔径小、且凝集时比展开载体的孔径大的平均粒径，其具体组成只要是可以担载刺激响应性聚合物和亲和性物质即可，没有特别限定。
以往的乳胶凝集法中，乳胶根据检出对象的存在而凝集，必须检出该凝集，为此，为了提高检出灵敏度，微粒优选具有大的粒径。而与此相对，本发明的方法中，微粒越是小的粒径，则每单位体积的比表面积增加，与检出对象的结合增加，由此使得刺激响应性聚合物的凝集抑制更有效，因此优选微粒的粒径小。不过，微粒的平均粒径必须设定为：在非凝集时比展开载体的孔径小，在凝集时比展开载体的孔径大。这样，在使用微粒时，可考虑凝集抑制的效率、凝集的方法(特别是直径的变化)、以及展开载体的孔径等适当设定微粒的平均粒径。通常，该平均粒径的下限优选为0.001μm，更优选为0.010μm，最优选为0.1μm微米，上限优选为0.5μm，更优选为0.3μm，最优选为0.2μm。
从在展开载体上展开时形成与颜色相关的信号、该信号可容易地确认或测定的角度考虑，微粒优选为有色颗粒。有色颗粒没有特别限定，可以是含有金属胶体颗粒(例如胶体金颗粒)、聚苯乙烯胶乳等合成高分子、明胶等天然高分子的均匀的球状颗粒等。不过，第1结合物不仅用于本发明的方法中，也可用于国际公开WO2008/001868号小册子中所述的检出方法中，这种情形下，可通过施加磁力来分离凝集体，由此提高检出精度(详细内容见国际公开WO2008/001868号小册子)。因此，为了提高通用性，微粒优选含有磁性物质，所述磁性物质可以由多元醇和磁铁矿构成。
多元醇只要是构成单元中至少具有2个羟基且可与铁离子结合的醇结构体即可，没有特别限定，例如可举出：葡聚糖、聚乙烯醇、甘露醇、山梨醇、环糊精。例如日本特开2005-82538号公报中公开了使用葡聚糖的微粒状磁性物质的制造方法。还可以使用如甲基丙烯酸缩水甘油基酯聚合物这样的具有环氧基、开环后形成多元醇结构体的化合物。
(第1亲和性物质)
第1亲和性物质例如可以是识别检出对象的不同抗原决定簇的单克隆抗体。这里所使用的抗体可以是任何型的免疫球蛋白分子，也可以是Fab等具有抗原结合位点的免疫球蛋白分子片段。另外，抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。
[第1结合物的制作]
第1结合物通过将第1物质与第1亲和性物质结合而制作。该结合方法没有特别限定，例如可以在第1物质一侧(例如刺激响应性聚合物部分)和第1亲和性物质(例如第1抗体)一侧的双方结合互为亲和性的物质(例如，抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶)，经由这些物质使第1物质与第1亲和性物质结合。
具体来说，生物素与刺激响应性聚合物的结合如国际公开WO01/009141所述，可使生物素等与甲基丙烯酸基或丙烯酸基等聚合性官能基团结合，制成加成聚合性单体，再与其它单体共聚来进行。抗生物素蛋白等与第1亲和性物质的结合可按照常规方法进行。接着，将结合了生物素的刺激响应性聚合物和结合了抗生物素蛋白的第1亲和性物质混合，则经由抗生物素蛋白和生物素的结合，使第1亲和性物质和刺激响应性聚合物结合。
另一种方法还可利用以下的方法：在制造聚合物时，使具有羧基、氨基或环氧基等官能基团的单体与其它单体共聚，经由该官能基团，按照该技术领域周知的方法，使抗体亲和性物质(例如Melon Gel(瓜胶)、蛋白A、蛋白G)与聚合物结合。使第1抗体与这样得到抗体亲和性物质结合，由此可以制作刺激响应性聚合物与检出对象抗原的第1抗体结合的第1结合物。
或者，在制造聚合物时，使具有羧基、氨基或环氧基等官能基团的单体与其它单体共聚，按照常规方法使检出对象抗原的第1抗体与这些官能基团直接结合。
或者，使第1亲和性物质和刺激响应性聚合物与微粒状的磁性物质结合。
在将第1物质置于刺激响应性聚合物发生凝集的条件下之后，通过离心进行分离，可以纯化第1结合物。第1结合物的纯化可按照以下方法进行：使微粒状的磁性物质与刺激响应性聚合物结合，进一步结合第1亲和性物质，然后置于刺激响应性聚合物发生凝集的条件下，施加磁力，回收磁性物质。
微粒状的磁性物质与刺激响应性聚合物的结合可按照经由反应性官能基团进行结合的方法，或者将聚合性不饱和键导入磁性物质中的多元醇上的活性氢或多元醇上，进行接枝聚合的方法等的本技术领域周知的方法进行(例如，参照ADV.Polym.Sci.，Vol.4.，p111，1965或J.Polymer Sci.，Part-A，3，p1031，1965)。
[第2结合物]
本发明的方法中，除第1结合物之外，还使用第2结合物，该第2结合物是具有亲水性的第2物质与检出对象的第2亲和性物质结合而成。由此可以使检出灵敏度提高。
(第2物质)
具有亲水性的第2物质例如为具有电荷的高分子化合物，优选为聚阴离子或聚阳离子。聚阴离子是指具有多个阴离子基团的物质，聚阳离子是指具有多个阳离子基团的物质。聚阴离子的例子可举出：DNA和RNA等核酸。这些核酸是沿着核酸骨架存在多个磷酸二酯基，由此具有聚阴离子的性质。聚阴离子也包含：含多个羧基的多肽(含有谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的多肽)，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磺酸和含有丙烯酸或甲基丙烯酸作为聚合成分的聚合物，羧甲基纤维素、透明质酸和肝素等多糖等。而聚阳离子的例子可举出：聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚烷基胺、聚乙烯亚胺或聚丙基乙烯亚胺等。聚阴离子(羧基)或聚阳离子(氨基)的官能基团数目优选为25个以上。还可举出具有羧基的胶乳颗粒等。
具有亲水性的第2物质例如为水溶性的高分子化合物，可举出：聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等含有醚键的高分子，聚乙烯基醇等含有醇式羟基的高分子，葡聚糖、环糊精、琼脂糖、羟丙基纤维素等水溶性多糖类，含有中性氨基酸的多肽等。
这些具有亲水性的物质可以在高分子链中或末端具有用于结合第2亲和性物质的官能基团等。另外，具有亲水性的第2物质可以以1种单独使用，也可以将多种混合利用。
(第2亲和性物质)
第2亲和性物质是可在与第1亲和性物质不同的部位、与第1亲和性物质同样地与检出对象结合的物质。第1亲和性物质和第2亲和性物质例如可以是识别检出对象的不同抗原决定簇的单克隆抗体。
[制作方法]
第2结合物通过使第2物质与第2亲和性物质直接或间接结合来制作。例如，可以在第2物质一侧以及第2亲和性物质(例如第2抗体)一侧的双方结合互为亲和性的物质(例如抗生物素蛋白和生物素、谷氨酰胺和谷氨酰胺S转移酶)，经由这些物质使第2物质和第2亲和性物质间接结合，但并不限于此。
使第2物质和第2亲和性物质直接结合时，可以经由官能基团结合，例如使用官能基团时，可以按照Ghosh等人的方法(Ghosh等人.，Bioconjugate Chem.，1，71～76，1990)的马来酰亚胺-硫醇偶联来结合。具体来说可以举出以下2种方法。
第1种方法中，首先，向核酸的5’末端导入巯基(别名：氢硫基)，另一方面，使6-马来酰亚胺基己酸琥珀酰亚胺酯(例如“EMCS(商品名)”((株)同仁化学研究所制造))与抗体反应，导入马来酰亚胺基。接着将这2种物质经由巯基和马来酰亚胺基结合。
第2种方法中，首先，与第1种方法同样，向核酸的5’末端导入巯基，进一步使同型双官能性试剂N，N-1，2-苯撑双马来酰亚胺与该巯基反应，由此向核酸的5’末端导入马来酰亚胺基，另一方面，向抗体导入巯基。接着将这2种物质经由巯基和马来酰亚胺基结合。
除此之外，将核酸导入蛋白质的方法例如已知：Nucleic AcidsResearch第15卷5275页(1987年)和Nucleic Acids Research第16卷3671页(1988年)中记载的方法。这些技术可应用于核酸与抗体的结合。
根据Nucleic Acids Research第16卷3671页(1988年)，首先，使寡核苷酸与六亚甲基四胺、碳二亚胺和1-甲基咪唑反应，由此向寡核苷酸的5’末端的羟基中导入巯基。将导入了巯基的寡核苷酸进行纯化，然后使用二硫苏糖醇还原，然后加入2，2’-二吡啶二硫化物，经由二硫键向寡核苷酸的5’末端导入吡啶基。另一方面，使亚氨基硫烷与蛋白质反应，导入巯基。这些导入了吡啶二硫化物的寡核苷酸与导入了巯基的蛋白质混合，使吡啶基与巯基特异性反应，从而使蛋白质与寡核苷酸结合。
根据Nucleic Acids Research第15卷5275页(1987年)，首先向寡核苷酸的3’末端导入氨基，与同型双官能性试剂二硫代-双-丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(简称二硫双丙酰-NHS)反应。反应后添加二硫苏糖醇，由此还原二硫双丙酰-NHS分子中的二硫键，向寡核苷酸的3’末端导入巯基。关于蛋白质的处理，可使用如日本特开平5-48100号公报所示的异型双官能性交联剂。首先，使具有可与蛋白质中的官能基团(例如氨基)反应的第1反应性基团(琥珀酰亚胺)、以及可与巯基反应的第2反应性基团(例如马来酰亚胺等)的异型双官能性交联剂与蛋白质反应，向蛋白质中导入第2反应性基团，制成预先活化的蛋白质试剂。将这样得到的蛋白质试剂与硫醇化多核苷酸的巯基共价键合。
在使用核酸以外的聚阴离子或聚阳离子时，也可以向它们的末端等导入巯基，按照与上述同样的操作，制作第2结合物。
再次，返回检出方法顺序的说明。将上述的2种结合物与检体的混合物置于刺激响应性聚合物发生凝集的条件下，则存在检出对象时，刺激响应性聚合物由于检出对象的电荷部分或亲水性部分而受到凝集抑制，发生分散。而不存在检出对象时，刺激响应性聚合物未受到凝集抑制，发生凝集。可以将第1结合物、第2结合物以及检体全部同时混合，也可以将每1种分别混合。
参照图1～图2对该现象进行说明。
如图1所示，第1结合物10含有刺激响应性聚合物11，该刺激响应性聚合物11经由抗生物素蛋白15和生物素17与检出对象50的第1抗体13结合。另外，第1结合物10含有微粒状的磁性物质19，在该磁性物质19的表面结合作为第1物质的刺激响应性聚合物11。而第2结合物20中，检出对象50的第2抗体23与第2物质21结合。第1抗体13和第2抗体23可以与检出对象50的不同部位结合，因此同样可以与检出对象50结合。第2结合物20经由检出对象50和刺激响应性聚合物11与磁性物质19接近，此时，第2物质21位于磁性物质19的附近。
如图2所示，将第1结合物10、第2结合物20和检体的混合物置于规定条件下，在存在检出对象50时，刺激响应性聚合物11由于第2结合物20中的电荷部分或亲水性部分而受到凝集抑制，发生分散。(图2(A))。而不存在检出对象50时，刺激响应性聚合物11未受到凝集抑制，发生凝集(图2(B))。本实施方式中的构成是：第2结合物20的电荷部分或亲水性部分位于磁性物质19的附近，但并不限于此，也可以是检出对象的电荷部分或亲水性部分位于磁性物质19的附近的构成。
为了使刺激响应性聚合物11凝集，例如在使用温度响应性聚合物时，可以将加入了混合液的容器移至温度响应性聚合物发生凝集的温度下的恒温槽中。温度响应性聚合物有2种：具有最高临界溶液温度(以下简称为“UCST”)的聚合物，和具有最低临界溶液温度(以下简称为“LCST”)的聚合物。例如，使用LCST为37℃的、具有最低临界溶液温度的聚合物时，通过将加入了混合液的容器移至37℃以上的恒温槽中，可以使温度响应性聚合物凝集。另外，使用UCST为5℃的、具有最高临界溶液温度的聚合物时，通过将加入了混合液的容器移至低于5℃的恒温槽中，可以使温度响应性聚合物凝集。
已知LCST伴随着温度响应性聚合物的周边的盐浓度的增加而降低。因此，通过将规定浓度的盐(例如NaCl)添加到在某一温度下分散有温度响应性聚合物的溶液中，可以使温度响应性聚合物在一定温度下凝集。
本发明中使用的盐可举出：硫酸锂、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵等硫酸盐；氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化钡等卤化物；硝酸镁、硝酸钙等的硝酸盐；硫氰化钾等硫氰酸盐；碳酸钠、碳酸钾等碳酸盐；硼酸盐；磷酸盐等。这些盐可单独或将2种以上组合使用。还可举出：乙酸钠等单羧酸的钠盐，天冬氨酸钠、谷氨酸钠、亚氨基二乙酸钠、马来酸钠、丙二酸钠、草酸钠、琥珀酸二钠或酒石酸钠等二羧酸的钠盐，柠檬酸二钠等三羧酸的钠盐，乙二胺四乙酸二钠等四羧酸的钠盐等有机酸盐等，也可以利用它们的钾盐等有机酸盐等。这些盐可以单独或将2种以上组合使用。
为了使温度响应性聚合物凝集，例如可以添加盐的水溶液，形成所需的盐浓度。用于使温度响应性聚合物凝集的盐的必须添加量根据盐的种类、水溶液的温度、温度响应性聚合物的种类、温度响应性聚合物的浓度而不同，在水溶液中，终浓度大约为50mM～5M、优选为100～1000mM的范围。
使用pH响应性聚合物时，可以向加入了混合液的容器中加入酸溶液或碱溶液。具体来说，可以在加入了pH为引起pH响应性聚合物发生结构变化的范围之外的分散混合液的容器中，加入酸溶液或碱溶液，将容器内的pH变更为引起pH响应性聚合物发生结构变化的范围。例如，使用在pH5以下发生凝集、超过pH5则分散的pH响应性聚合物时，可以在加入了超过pH5下为分散的混合液的容器中加入酸溶液，形成pH为5以下。另外，使用pH10以上发生凝集、低于pH10则分散的pH响应性聚合物时，可以在加入了在低于pH10为分散的混合液的容器中加入碱溶液，使pH为10以上。引起pH响应性聚合物发生结构变化的pH没有特别限定。优选pH4～10，进一步优选pH5～9。具体来说，可举出：含多个羧基的多肽(含有谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的多肽)，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、以及含有丙烯酸或甲基丙烯酸作为聚合成分的聚合物，羧甲基纤维素、透明质酸、肝素等多糖类，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚烷基胺、聚乙烯亚胺和聚丙基乙烯亚胺等。
使用光响应性聚合物时，可以对加入了混合液的容器照射可以使聚合物凝集的波长的光。使其凝集的优选的光根据光响应性聚合物中所含的光响应性官能基团的种类和结构而不同，通常可优选使用波长190～800nm的紫外光或可见光。此时，强度优选0.1～1000mW/cm2。从可提高测定精度的角度考虑，光响应性聚合物优选在照射用于浊度测定的光时难以发生分散的聚合物，换言之优选发生凝集的聚合物。使用在照射用于浊度测定的光时发生分散的聚合物作为光响应性聚合物时，可通过缩短光照射时间来提高测定精度。具体来说，可举出：偶氮苯、螺苯并吡喃和螺苯并噻喃等含有光响应性官能基团的聚合物等。
将第1结合物10、第2结合物20和检体的混合物置于上述条件下，当存在检出对象50时，刺激响应性聚合物11由于第2结合物20中的电荷部分或亲水性部分而受到凝集抑制，发生分散(图2(A))。而不存在检出对象50时，刺激响应性聚合物11未受到凝集抑制，发生凝集(图2(B))。
温度响应性聚合物的凝集可以在第1结合物和第2结合物与检出对象结合后进行，也可以同时并列进行，从可缩短处理时间的角度考虑，优选后者。
这里，最低临界溶液温度如下确定。首先，将试样放入吸光光度计的池中，以1℃/分钟的速度使试样升温。在该期间记录550nm下的透过率变化。这里，以聚合物溶解为透明时的透过率为100％，以完全凝集时的透过率为0％时，求出透过率达到50％时的温度作为LCST。
最高临界溶液温度如下确定。以1℃/分钟的速度将试样冷却，与最低临界溶液温度的情形同样，记录550nm下的透过率变化。这里，以聚合物溶解为透明时的透过率为100％，以完全凝集时的透过率为0％时，求出透过率达到50％时的温度作为UCST。
[判别]
使检体与结合物的混合物在展开载体上展开，确认该展开载体上源自结合物的存在而产生的信号，该信号与检出对象非存在下不同时，则判别检体中存在检出对象。即，如图2所示，根据检出对象的有无，各混合物中的凝集状态不同，因此各混合物的展开状态也不同。因此，在确认到与检出对象非存在下不同的信号时，则可以判别检体中存在检出对象。这样，判别仅凭对展开载体上的信号进行确认即可，无需特别使用特殊的试剂、仪器即可进行，因此可在各种环境下、低成本且简便地实施检出。
如后所述，将混合物置于刺激响应性聚合物发生凝集的条件下的时期可以是在展开之前(将混合物置于凝集条件之后展开)，也可以与展开同时进行(在展开中置于凝集条件)。
(展开载体)
本发明的方法中使用的展开载体只要可在水溶液中使微粒展开即可，没有特别限定。可以是以往公知的色谱用载体。具体来说，可举出：有孔的立体结构膜，例如尼龙膜、硝基纤维素膜等，还可以是合成或天然高分子膜的任意形式。但展开载体必须具有比上述微粒的平均粒径大且比凝集体的凝集直径小的孔径，从可以对应各种微粒的通用性的角度考虑，优选具有0.01μm～0.5μm左右的孔径。
展开和判别的具体顺序没有特别限定，可以是任意的。以下说明优选的顺序。
图3是表示本发明的一个实施方式涉及的方法的顺序图。该实施方式中，将检体和第1结合物在上述条件下混合，温育，进一步将第2结合物在上述条件下混合，温育。本实施方式中，在该时刻，刺激响应性聚合物发生凝集的条件已经成立。
然后，将展开载体由其下端至规定高度的位置浸入混合物中，在该状态下使混合物展开。这样，检体中不存在检出对象时，当大量凝集体在混合物中形成时，凝集体直径比孔径大，因此集中在弯月面，可以确认到源自凝集体中的结合物(通常为微粒)的存在而产生的有色的条带(信号的一个例子)。与此相对，检体中存在检出对象时，根据检出对象的存在量，凝集体的量显著降低，比孔径小的非凝集体在展开载体上移动，因此，未确认到源自凝集体的存在而产生的有色条带或者是变浅，同时可以在广范围内确认到源自非凝集体中的结合物(通常为微粒)的存在而产生的有色区域(信号的一个例子)。
因此，源自凝集体的存在而产生的强度(信号有色区域的浓度)比检出对象非存在下弱时，则可以判别检体中存在检出对象。另外，本实施方式中，根据信号有色区域的位置与检出对象非存在下的情形不同，也可以判别检体中存在检出对象。
图4是表示本发明的另一实施方式涉及的方法的顺序图。本实施方式中，如图4(a)所示，在偏离展开载体的下端的位置(为了方便，并未图示，实际上可以是无法视觉辨认)配置可在室温下使刺激响应性聚合物(特别是具有LCST的聚合物)发生凝集的有效量的盐(例如NaCl)。不将混合物置于发生凝集的条件下(例如置于比刺激响应性聚合物的LCST低的温度下)即开始展开。
这样，检体中不存在检出对象时，混合物虽然移动至配置了盐的位置，但是在该位置发生凝集，无法移动，因此发生集中。与此相对，检体中存在检出对象时，混合物即使移动至配置了盐的位置也受到凝集抑制，因此可以通过该位置进一步移动。因此未确认到源自凝集体的存在而产生的有色条带或者是变淡，同时可以在广范围内确认到源自非凝集体中的结合物(通常为微粒)的存在而产生的有色区域(信号的一个例子)。
因此，源自凝集体的存在而产生的强度(信号有色区域的浓度)比检出对象非存在下弱时，可以判别检体中存在检出对象。另外，本实施方式中，源自非凝集体中的结合物(通常为微粒)的存在而产生的有色区域的范围与非存在下的情形不同，也可以判别检体中存在检出对象。
上述实施方式中，在弯月面可以确认到有色条带，因此在难以将液面保持恒定的环境下，有色条带可能不鲜明，但在本实施方式中，可以在配置了盐的位置确认到有色条带，因此与液面无关，可以使有色条带鲜明化。该效果对于在实验室外等环境下进行检出时尤其重要。
配置盐的位置没有特别限定，可以是自展开载体的下端至上端的任意位置。不过从在任何方向使用展开载体(即，两个端部可朝向上下的任意方向)均可获得同样信号的角度考虑，优选在展开载体的中央附近配置盐。该效果在实验室外等环境下进行检出时尤其重要。还可以在展开载体上设置显示展开载体的方向的印记等，由此可以使配置盐的位置的自由度增加。
本实施方式中是在展开载体上配置盐，只要是刺激响应性聚合物可发生凝集的条件即可，没有特别限定。具体来说，可以只将展开载体的规定位置设置为可凝集的温度，也可以配置达到凝集pH的酸或碱，或者可以照射光。
图5是表示本发明的另一实施方式的方法的顺序图。本实施方式中，如图5(a)所示，在偏离展开载体下端的位置(为了方便，并未图示，实际上可以是无法视觉辨认)上配置当与结合物并存时则可以在展开载体上显色或发光的物质。使用所述展开载体，按照与图3同样的顺序进行展开，则如图5(b)所示，检体中存在检出对象时，比孔径小的非凝集体在展开载体上移动至显色或发光物质的位置，因此可以在该位置上确认到显色或发光(信号的一个例子)。与此相对，检体中不存在检出对象时，大量凝集体在混合物中形成，因此难以确认到显色或发光。根据该方案，通过适当选择显色或发光的强度，可以使检出灵敏度和精度更为提高。本方案中，显色或发光相当于信号。
显色或发光的物质可以从以往周知的物质中适当选择。显色物质可举出：三嗪、1，10-菲咯啉等在可见光区具有吸收带的物质。发光物质可举出：鲁米诺、荧光素酶等的荧光、化学发光的物质。从可肉眼确认、无需光照射仪器等的角度考虑，优选显色物质，但并不限于此。使用磁性物质时，可以测定磁量，这种情形下磁量相当于信号。
图5的方案中，使结合物有色构成，当检体中不存在检出对象时，源自凝集体的存在而产生的有色区域可以在弯月面所对应的位置确认。这样，信号可以是1种也可以是多种，可适当选择。
图6是在本发明的另一实施方式涉及的方法中使用的、具备展开载体30的展开器具40的平面图，图7是图6的展开器具40的VII-VII线截面图。
如图7所示，在展开器具40中，水平配置的展开载体30的一端(图6中为下端，图7中为左端)上配置过滤器47，同时在偏离该一端的位置31上配置若与结合物并存则在展开载体30上显色或发光的物质。另外，展开载体30的另一端与吸液体49接触。
过滤器47可以用与展开载体30相同或不同的材料构成，但必须是不透过凝集体且使非凝集体透过、即具有比上述微粒的平均粒径大且比凝集体的凝集直径小的孔径。另外，吸液体49只要是可吸收混合物中的溶剂即可，没有特别限定。
该状态的展开载体30、过滤器47和吸液体49通过上夹具41和下夹具42保持，过滤器47通过供给口部43露出，位置31可通过窗口部44由外部观察。另外，保持的方式没有特别限定，从将上夹具41和下夹具42再利用的角度考虑，优选上夹具41和下夹具42可以自由安装和拆卸。
使用所述展开器具40，将按照与图3同样的顺序制备的混合物装入过滤器47中，由此，在凝集体被过滤器47除去之后，混合物在展开载体上展开。因此，检体中存在检出对象时，大量的非凝集体透过过滤器47，由展开载体30上移动至位置31，在位置31中可以确认到显色或发光。与此相对，检体中不存在检出对象时，在混合物中形成的大量的凝集体残留在过滤器47上，而可透过过滤器47的非凝集体极少或不存在，因此难以在位置31确认到显色或发光。
因此，源自凝集体的存在而产生的信号(这里为显色和发光)的强度比检出对象非存在下强时，则可以判别检体中存在检出对象。该实施方式与上述的实施方式不同，在展开期间、必须将展开载体以同样的姿势持续保持在混合物中这样的限制较小，因此对于实验室外等不存在支撑台、或者由于风等使外界大气流动的环境也可以适应，因此优选。
<定量方法>
根据本发明的定量方法，首先，将第1结合物、第2结合物和检体混合，将该混合物置于刺激响应性聚合物发生凝集的规定条件下。接着，使混合物在展开载体上展开，测定该展开载体上源自结合物的存在而产生的信号的强度，根据检出对象的量和信号强度在规定条件下的相关式算出检体中的检出对象的量。展开之前的顺序与上述的检出方法通用，因此省略其说明。
(测定)
测定可根据要测定的信号的种类，按照以往公知的顺序进行，可以肉眼或使用测定仪器进行。另外，以下说明的相关式中使用的信号强度可以是测定值本身，也可以是根据信号强度的范围分类的组的评分值，评分值是指例如如下所述。
评分0：未确认到信号
评分1：信号微弱
评分2：明确确认到信号
(相关式)
制作与上述规定条件相同条件下的检出对象的量与信号强度的相关式。关于构成该相关式的检出对象的量和信号强度的测定，数据越多越可得到可靠性高的相关式。这里，数据只要是与2个以上的检出对象的量相关即可，优选与3个以上的检出对象的量相关。
这里，检出对象的量与信号强度的相关式不仅是表示检出对象的量与信号强度的直接相关的式子，也可以是检出对象的量、与反映信号强度的参数或上述评分值的相关式。
(计算)
通过将展开混合物时的信号强度值代入制作的相关式中，可以算出检体中的检出对象的量。
(检出对象)
按照以上的检出方法可检出的对象可举出：环境污染物、饮食品污染物、用于临床诊断的物质，具体的来说可举出：二
Figure BPA00001476468200211
英、环境激素、农药、PCB、有机汞等，朊病毒、霉菌毒素、河豚毒素、抗生素、防霉剂等，体液、尿液、痰、粪便等中所含的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白E、人白蛋白、人血纤蛋白原(血纤蛋白及其分解产物)、α-甲胎蛋白(AFP)、C反应蛋白(CRP)、肌红蛋白、癌胚抗原、肝炎病毒抗原、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘催乳素(HPL)、HIV病毒抗原、细菌毒素、细菌抗原、酶、激素(例如人促甲状腺激素(TSH)、胰岛素等)、药物等。
<试剂盒>
本发明也包含用于对检出对象进行检出和/或定量的试剂盒。该试剂盒具备第1结合物、第2结合物和展开载体，其中，所述第1结合物是具有含刺激响应性聚合物的凝集性物质的第1物质与检出对象的第1亲和性物质结合而成，所述第2结合物是具有亲水性的第2物质与上述检出对象的第2亲和性物质结合而成，所述展开载体用于将该结合物展开。第1物质或第2物质优选具有有色颗粒。另外，第1结合物或第2结合物优选具有在上述展开载体上显色或发光的物质。各构成要素的详细内容如上所述，在此省略。
实施例
本发明的实施例中使用的代表性试剂如下所述。
PBS缓冲液：将10倍浓度的市售PBS(将81mM Na2HPO4、14.7mM KH2PO4、26.8mM KCl、1370mM NaCl、pH7.4ニツポンジ一ン(株)制造)用纯净水稀释为1/10(V/V)使用。
纯净水：用MILLIPORE公司制造的“Direct-Q”(商品名)纯化的水。
实施例1
本实施例中给出了使用抗TSHβ抗体结合-温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒作为第1结合物、使用抗TSHα抗体结合聚丙烯酸钠作为第2结合物，检出人促甲状腺激素(TSH)的例子。
(第1结合物的制备)
使用Leinco Technologies Inc.制造的抗人TSHβ抗体(抗人促甲状腺激素β，克隆：195小鼠，类：小鼠IgG)，由旭テクノグラス公司用硫代-NHS-生物素进行生物素化，制备生物素化抗人TSHβ抗体。
链霉抗生物素结合-温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒是将250μLマグナビ一ト(株)制造的Therma-Max(注册商标)LSA链霉抗生物素(0.4％质量)置于1.5mL的微量管中，进一步加入50μL(0.75mg/mL)溶解于PBS缓冲液的生物素化抗人TSHβ抗体，在4℃下颠倒混合15分钟。将上述微量管加热至37℃，然后用磁石回收上述磁性颗粒，除去上清部分。向其中加入250μL PBS缓冲液，进行冷却，使上述磁性颗粒分散。进一步将过量的生物素添加到管内，覆盖链霉抗生物素的生物素结合部位。再次将微量管加热至37℃，然后用磁石回收上述磁性颗粒，除去上清部分，由此制备抗人TSHβ抗体化温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒。
在含有该抗人TSHβ抗体化温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒的管内加入500μL含有0.5％(w/v)BSA(シグマ公司制造)、0.5％(w/v)Tween(注册商标)20、10mM EDTA的PBS缓冲液(pH7.4)，通过冷却使其分散，制备第1结合物的分散溶液。
(第2结合物的制备)
首先，在1mL作为检出对象的人促甲状腺激素(TSH)的第2亲和性物质即抗人TSHα抗体(抗人促甲状腺激素α，克隆：176小鼠，小鼠IgG，Leinco Technology，Inc.制造，1mg/mL)中加入6mg 2-巯基乙醇，在37℃下反应120分钟。反应后通过Slide-A-Lyzer(商品名)透析盒、10K MWCO(Pierce)，用500mL PBS缓冲液进行透析，除去过量的2-巯基乙醇，使用排阻极限分子量10000的超滤膜(MILLIPORE公司制造[Amicon U1tra-4U1tracel 10k])浓缩至0.5mL，得到小鼠抗人TSHα抗体的还原抗体。将0.5mL该还原抗体和100μL马来酰亚胺化聚丙烯酸钠在4℃下反应过夜，接着使用Superdex-200 10/300GL(GEヘルスケア公司制造)进行凝胶过滤，由此制备标记抗体。将该标记抗体(该抗体也称作聚丙烯酸钠-抗人TSHα抗体结合物)用含有0.5％(w/v)BSA(シグマ公司制造)、0.5％(w/v)Tween(注册商标)20、10mMEDTA的PBS缓冲液(pH7.4)稀释，使蛋白质浓度为4μg/mL，由此制备第2结合物。
上述马来酰亚胺化聚丙烯酸钠如下制备。首先，在安装了氮气导入管、温度计和搅拌装置的100mL的三颈烧瓶内，将2g丙烯酸(和光纯药工业公司制造)、0.021g 2-氨基乙烷硫醇(和光纯药工业公司制造)和0.023g偶氮二异丁腈(和光纯药工业公司制造)溶解于50mLN，N-二甲基甲酰胺中，用1小时进行氮置换。然后，在70℃下用7小时进行聚合反应。将所得反应液减压浓缩至10mL，用二乙醚进行再沉淀，使粘稠状的物质形成粉状。滤取白色沉淀，进一步用真空干燥机干燥过夜，由此得到氨基末端聚丙烯酸(收量1.5g)。将0.5克该氨基末端聚丙烯酸和10mL N，N-二甲基甲酰胺加入到安装了氮气导入管和搅拌装置的50mL茄型烧瓶中，进行溶解。向其中加入3mgEMCS(N-(6-马来酰胺己酰氧基)琥珀酰亚胺)(同仁化学研究所制造)，反应过夜。将所得反应液减压浓缩至1mL，用二乙醚进行再沉淀，使粘稠的物质形成粉状。滤取白色沉淀，进一步用真空干燥机干燥过夜，得到马来酰亚胺基末端聚丙烯酸。该马来酰亚胺基末端聚丙烯酸的数均分子量约为130000(GPC系统：岛津制作所制造，柱：東ソ一公司制造，TSKgel Super AW3000，6mm ID.×150mm，流动相：0.1M硝酸钠)，收量为0.4g。
(检体的制备)
将TSH：Aspen Bio Pharma，Inc.制造的人促甲状腺激素(活性8.5IU/mg，WHO80/558)的溶液(浓度30μg/mL)用オ一ソ·クリニカル·ダイアグノステイクス公司制造的“ビトロス(注册商标)TSH，校准仪1(キヤリブレ一タ1)”稀释为0.06mIU/L、0.0012mIU/L，分别将其作为检体2、3。除了不含有人促甲状腺激素活性之外，其余均按照同样的顺序制备，将其作为检体1。
(展开)
将150μL第1结合物的分散溶液和200μL第2结合物的分散溶液注入到微量管内，用旋涡搅拌器搅拌1秒钟，然后分别注入50μL各检体1～3，用旋涡搅拌器搅拌后，在室温(21℃)下温育5分钟。从管中采取反应液总量，注入到预先在37℃下保温的反应试管(参照图3)中，在37℃下保温5分钟。
然后，将尺寸5mm×50mm、具有0.1μm以下的孔径的、作为展开载体的MILLIPORE公司制造的膜滤器“Hi-Flow Membrane#SNHF0400”(商品名)放入反应管内的反应液中，使其自下端浸泡至约10mm的位置，静置1分钟。然后将膜滤器小心地提起，观察膜滤器上的情形。该结果如图9所示。
(判别)
如图9所示，在不含有检出对象的检体1中，可以在弯月面所对应的位置(自下端约10mm)处确认到源自凝集体中的结合物(磁性颗粒)的存在而产生的褐色条带。与此相对，在含有检出对象的检体2、3中，未在弯月面所对应的位置上确认到褐色条带，可以在广范围内确认到褐色区域。因此，当弯月面所对应的位置的褐色条带的浓度比检出对象非存在下弱时，可以判别检体中存在检出对象。另外，即使褐色区域的位置并未集中在弯月面位置上，而是在广范围内分布，也可以判别检体中存在检出对象。
实施例2
本实施例中给出使用抗HBs抗体结合-温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒作为第1结合物、使用抗HBs抗体结合聚乙二醇作为第2结合物、检出HBs抗原的例子。
(第1结合物的制备)
使用PIERCE公司制造的EZ-Link硫代-NHS-生物素试剂盒，Product#21420(商品名)，按照试剂盒所附的生物素化方法对(株)特殊免疫研究所制造的抗HBs单克隆抗体(抗原决定簇：a，克隆编号Hyb-824)进行生物素化，制备生物素化抗HBs单克隆抗体。
在1.5mL的微量管中加入500μL温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒即マグナビ一ト(株)制造的Therma-Max(注册商标)LSA链霉抗生物素(30)(0.2％质量)，进一步加入50μL(0.75mg/mL)溶解于PBS缓冲液的生物素化抗HBs单克隆抗体，在4℃下用15分钟颠倒混合。将上述微量管加热至37℃，然后用磁石回收上述磁性颗粒，除去上清部分，制备抗HBs单克隆抗体化温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒。
在含有该抗HBs单克隆抗体化温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒的管中加入500μL含有0.5％(w/v)BSA(シグマ公司制造)、0.5％(w/v)Tween(注册商标)20、10mM EDTA的PBS缓冲液(pH7.4)，通过冷却使上述磁性颗粒分散，制备第1结合物的分散溶液。
(第2结合物的制备)
使用(株)特殊免疫研究所制造的抗HBs单克隆抗体(抗原决定簇：d，克隆编号Hyb-3423)和抗HBs单克隆抗体(抗原决定簇：y，克隆编号Hyb-3457)代替抗人TSHα抗体，以及使用2-巯基乙胺盐酸盐代替2-巯基乙醇，除此之外按照与实施例1同样的顺序得到两种抗HBs单克隆抗体的还原抗体。使用马来酰亚胺化聚乙二醇代替马来酰亚胺化聚丙烯酸钠，除此之外按照与实施例1同样的顺序，由这些还原抗体得到两种标记抗体，制备第2结合物。所使用的马来酰亚胺化聚乙二醇是SUNBRIGHT ME-400MA(商品名)日油(株)制造，重均分子量40,000。
(检体的制备)
将(株)特殊免疫研究所制造的纯化HBs抗原用0.5％BSA(シグマ公司制造)和PBS缓冲液(pH7.4)稀释为1000ng/mL的浓度。将该稀释物用人血清稀释为10ng/mL的浓度，作为阳性检体(检体2)，其中，所述人血清是用オ一ソ·クリニカル·ダイアグノステイツクス公司制造的“ビトロス(注册商标)”HBs抗原(批号2330)试剂盒判断为阴性的人血清。将该人血清作为阴性检体(检体1)。
(展开)
使用100μL第1结合物的分散溶液、100μL第2结合物的分散溶液和5μL检体，除此之外按照与实施例1同样的顺序在膜滤器上进行展开，观察膜滤器上的情形。该结果如图10所示。
(判别)
如图10所示，在不含有检出对象的检体1中，可以在弯月面所对应的位置(图中箭头所示位置)处确认到源自凝集体中的结合物(磁性颗粒)的存在而产生的褐色条带。与此相对，在含有检出对象的检体2中，未在弯月面所对应的位置上确认到褐色条带，可以在广范围内确认到褐色区域。因此可知，当弯月面所对应的位置的褐色条带的浓度比检出对象非存在下弱时，可以判别检体中存在检出对象。另外，即使褐色区域的位置并未集中在弯月面位置上，而是广范围分布，也可以判别检体中存在检出对象。
符号说明
10第1结合物
11刺激响应性聚合物
13第1抗体(第1亲和性物质)
15抗生物素蛋白
17生物素
19磁性物质
20第2结合物
21第2物质
23第2抗体(第2亲和性物质)
30展开载体
40展开器具
41上夹具
42下夹具
43供给口部
44窗口部
47过滤器
50检出对象

Claims (11)

1.检出检体中的检出对象的方法，该方法包含以下步骤：
将第1结合物和第2结合物与上述检体混合，其中，所述第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与上述检出对象的第1亲和性物质结合而成，所述第2结合物是具有亲水性的第2物质与上述检出对象的第2亲和性物质结合而成；
将所得混合物置于上述刺激响应性聚合物发生凝集的条件下，使上述混合物在展开载体上展开，或者使所得混合物在展开载体上展开，将上述混合物置于上述刺激响应性聚合物发生凝集的条件下；
确认上述展开载体上的源自第1结合物或第2结合物的存在而产生的信号，上述信号与上述检出对象非存在下不同时，则判别上述检体中存在检出对象，
该方法中，第1亲和性物质和第2亲和性物质可以与上述检出对象的不同部位结合。
2.权利要求1所述的方法，其中，源自第1结合物的存在而产生的信号的强度比上述检出对象非存在下弱时，判别上述检体中存在检出对象。
3.权利要求1所述的方法，其中，上述混合物是在除去了第1结合物的凝集体之后，在上述展开载体上展开，源自第1结合物的存在而产生的信号的强度比上述检出对象非存在下强时，判别上述检体中存在检出对象。
4.对检体中的检出对象进行定量的方法，该方法包含以下步骤：
将第1结合物和第2结合物与上述检体混合，其中，所述第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与上述检出对象的第1亲和性物质结合而成，所述第2结合物是具有亲水性的第2物质与上述检出对象的第2亲和性物质结合而成；
将所得混合物置于上述刺激响应性聚合物发生凝集的条件下，使上述混合物在展开载体上展开，或者使所得混合物在展开载体上展开，将上述混合物置于上述刺激响应性聚合物发生凝集的条件下；
测定上述展开载体上的源自第1结合物或第2结合物的存在而产生的信号的强度，根据上述检出对象的量和信号强度在上述规定条件下的相关式算出上述检体中的检出对象的量，
该方法中，第1亲和性物质和第2亲和性物质可以与上述检出对象的不同部位结合。
5.权利要求4所述的方法，该方法是测定源自第1结合物的凝集体的存在而产生的信号。
6.权利要求4所述的方法，其中，上述混合物是在除去第1结合物的凝集体之后，在上述展开载体上展开，测定源自第1结合物的存在而产生的信号的强度。
7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，第1结合物具有有色颗粒，上述信号与基于上述有色颗粒的存在而显示的颜色相关。
8.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，第1结合物或第2结合物具有在上述展开载体上显色或发光的物质，上述信号与基于上述显色或发光的物质的存在而显示的颜色或光相关。
9.试剂盒，该试剂盒用于对检出对象进行检出和/或定量，该试剂盒具备第1结合物、第2结合物和用于展开上述结合物的展开载体，其中，所述第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与上述检出对象的第1亲和性物质结合而成，所述第2结合物是具有亲水性的第2物质与上述检出对象的第2亲和性物质结合而成。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中，第1结合物具有有色颗粒。
11.权利要求9或10所述的试剂盒，其中，第1结合物或第2结合物具有在上述展开载体上显色或发光的物质。
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