CN114008061B - 放射性标记的moem型寡核苷酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明包含式(I)的放射性标记的MOEM型寡核苷酸其中n、X1、X2、连接基(1)、连接基(2)、Q*和受体靶向部分如说明书中所定义。式(I)的放射性标记的寡核苷酸可用于确定组织或体液中的寡核苷酸的生物分布和药代动力学。
Description
本发明涉及式I的新型放射性标记的MOEM型寡核苷酸及其制备方法
其中，
n、X1和X2、连接基1和2、Q*以及受体靶向部分在下文讨论，还涉及它们用于确定组织或体液中的寡核苷酸的生物分布和药代动力学的用途。
为了使反义治疗方法有效，必须将寡核苷酸引入患者体内并且必须到达待治疗的特定组织。必须在用治疗药物治疗之前作为一个步骤确定该药物的生物分布和药代动力学。因此，需要能够检测体液或组织内的寡核苷酸。Agrawal等人,Clin.Pharmacokinetics28,7(1995)，回顾了反义寡核苷酸的药代动力学的某些方面。在反义寡核苷酸等药理化合物的体内药代动力学研究中使用的另一种成熟方法需要对化合物进行放射性标记以进行检测。在动物模型中，已将放射性标记的寡核苷酸施用于动物，并通过提取寡核苷酸随后进行放射自显影来评估其在体液和组织内的分布(参见Agrawal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.88,7595-7599(1991)。
35S-标记是一种成熟且广泛应用的技术。对于生物学研究，已使用H-膦酸酯化学制备了35S-标记的寡核苷酸硫代磷酸酯(参见Garegg等人,Chem.Scr.25,280-282(1985)。
用14C和3H对合成寡核苷酸进行放射性同位素标记目前是通过使用成熟的固相自动合成来完成的。在这种方法中，14C或3H核苷亚磷酰胺的组装需要两步过程，如US 5,847,104所示。然而，这种方法有几个缺点。由于放射性同位素是在第一步引入的，(a)两步后的放射化学收率是有限的；(b)此操作经常遇到稀释问题，即通常将天然丰度同位素作为载体掺入以保持可控的合成规模，从而导致最终寡核苷酸的比活力较低，以及(c)亚磷酰胺3是一种易于降解的反应活性物质，作为最终的放射性前体，对储存和运输提出了严格的要求。
鉴于现有技术方法的缺陷，需要获得具有高比活力的放射性标记的寡核苷酸的其他方法。
因此，本发明的目的是提供一种用于寡核苷酸放射性标记的新方法。
发现新开发的式I的放射性标记的寡核苷酸可以实现该目标
其中，
n为0或1；
X1和X2彼此独立地是S或O；
连接基1是C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的乙二醇桥或下式的基于丙三醇的桥
其中m为整数1至6；
连接基2是任选地氨基基团保护的氨基C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的氨基乙二醇桥；
Q*代表式III的残基
其中，
n为整数1至4，
R1和R2彼此独立地是氢、CF3、C1-6烷基，或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成C3-5-环烷烃环；
Z*是放射性标记的C1-C6烷基基团；并且
受体靶向部分是向寡核苷酸添加额外功能性的部分。
在此，阐述以下定义以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
术语“C1-6-烷基”表示具有1至6个碳原子且在更特定的实施例中具有1至4个碳原子的一价直链或支链饱和烃基。C1-6-烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，优选地甲基或乙基。
术语“C2-12-烷基”表示具有2至12个碳原子，在更特定的实施例中具有4至8个碳原子，在甚至更特定的实施例中具有6个碳原子的一价直链或支链饱和烃基。具体实例是丁基、戊基、己基、庚基或辛基及其异构体，但优选为正己基。
术语C3-5-环烷烃环代表3至5个碳原子的碳环并包括环丙烷-、环丁烷-或环戊烷-环。
术语“C2-12-亚烷基基桥”代表2至12个碳原子、在更特定的实施例中4至8个碳原子且在甚至更特定的实施例中6个碳原子的二价直链或支链饱和烃基。具体实例是丁烯、戊二烯、己烯、庚烯或辛烯及其异构体，但优选为正己烯。
术语“氨基C2-12-亚烷基基桥”代表包含与具有2至12个碳原子、在更特定的实施例中具有4至8个碳原子且在甚至更特定的实施例中具有6个碳原子的支链饱和烃基连接的氨基基团的二价基团。具体实例是氨基丁烯、氨基戊二烯、氨基己烯、氨基庚烯或氨基辛烯及其异构体，但优选为氨基正己烯(-NH-(CH2)6-)。
术语“乙二醇单元”代表式–(CH2)2-O-的单元，其作为桥连单元可包含1至10个乙二醇单元，优选2至6个乙二醇单元。
术语“基于丙三醇单元丙三醇的桥”的特征在于下式
其中m为整数1至6，优选为1至3，更优选为1。
术语“氨基保护基团”表示旨在保护氨基基团的基团并且包括苯甲酰基、苄氧羰基、苯甲氧甲酰基(CBZ或Z)、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、叔丁氧羰基(BOC)、和三氟乙酰基。这些基团的其他实例可以见于T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第2版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，N.Y.，1991，第7章；E.Haslam，“Protective Groups in OrganicChemistry”，J.G.W.McOmie，编辑，Plenum Press，New York，N.Y.，1973，第5章，和T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，NewYork，NY，1981。
本文中所使用的术语寡核苷酸被定义为技术人员通常将其理解为包含两个或更多个共价连接的核苷酸的分子。为了用作具有治疗价值的寡核苷酸，寡核苷酸通常被合成为长度为7至30个核苷酸。
寡核苷酸可包括任选地经修饰的DNA、PNA、RNA或LNA核苷单体或其组合。
LNA核苷单体是经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖环的C2'与C4'之间包含连接基基团，称为桥。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。
如本文所用，任选地修饰是指与等效DNA、PNA、RNA或LNA核苷相比，通过引入糖部分或核碱基部分的一种或多种修饰而修饰的核苷。在一个优选的实施例中，所述经修饰的核苷包含经修饰的糖部分，并且可以例如包含一个或多个2'取代的核苷和/或一个或多个LNA核苷。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。
DNA、RNA或LNA核苷酸通常由磷酸二酯(P＝O)连接和/或通过将两个核苷共价偶联在一起的硫代磷酸酯(P＝S)核苷酸间键合连接。
因此，在一些寡核苷酸中，所有核苷酸间键合可以由磷酸二酯(P＝O)组成，在其他寡核苷酸中，所有核苷酸间键合可以由硫代磷酸酯(P＝S)组成，或者在仍其他寡核苷酸中，核苷酸间键合的序列不同并且包含磷酸二酯(P＝O)和硫代磷酸酯(P＝S)核苷酸间键合两者。
PNA代表肽核酸，它由经典的核碱基部分组成，而不是包含通过肽键连接的重复的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元的磷酸二酯(P＝O)或硫代磷酸酯(P＝S)核苷酸间键合。
核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例的寡核苷酸中，对于LNA核苷，核碱基部分用大写字母A、T、G和MeC(5-甲基胞嘧啶)描述，对于DNA核苷，核碱基部分用小写字母a、t、g、c和Mec描述。修饰的核碱基包括但不限于带有保护基团的核碱基，例如叔丁基苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或二甲基甲脒基(dimethylformamidino)(参见维基百科，Phosphoramidit-Synthese,https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese,2016年3月24日)。
优选地，寡核苷酸由任选地修饰的DNA或LNA核苷单体或其组合组成，长度为10至25个核苷酸。
寡核苷酸合成的原理在本领域中是众所周知的，并且在文献和如维基百科这样的公共网站中详细描述(参见例如Oligonucleotide synthesis；Wikipedia,the freeencyclopedia；https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis,of March15,2016)。
现在更大规模的寡核苷酸合成是使用计算机控制的合成仪自动进行的。
通常，寡核苷酸合成是一种固相合成，其中正在组装的寡核苷酸经由其3'-末端羟基共价结合至固体支持物材料，并在整个链组装过程中与其保持连接。合适的支持物是市售的大孔聚苯乙烯支持物，如GE Healthcare的Primer support 5G或Kinovate的HL支持物。
寡核苷酸合成在原理上是将核苷酸残基逐步添加到生长链的5'-末端，直到组装出所需的序列。
通常，每次添加都称为合成循环，且在原理上由化学反应组成
a1)将固体支持物上受保护的羟基基团解封，
a2)将作为活化亚磷酰胺的第一个核苷与固相支持物上的游离羟基偶联，
a3)氧化或硫化相应的P-连接核苷以形成相应的磷酸二酯(P＝O)或相应的硫代磷酸酯(P＝S)；
a4)任选地，将固相支持物上的任何未反应的羟基封端；
a5)使附着在固相支持物上的第一个核苷的5'羟基解封；
a6)将作为活化的亚磷酰胺的第二个核苷偶联以形成相应的P-连接的二聚体；
a7)氧化或硫化相应的P-连接的二核苷以形成相应的磷酸二酯(P＝O)或相应的硫代磷酸酯(P＝S)；
a8)任选地，将任何未反应的5'羟基封端；
a9)重复前面的步骤a5到a8，直到组装出所需的序列。
在本发明的上下文中，术语“放射性标记的”用于残基Q*，特别是用于代表放射性标记的C1-6-烷基基团，优选为放射性标记的C1-4-烷基基团，更优选为放射性标记的甲基或乙基基团，甚至更优选为放射性标记的甲基基团的取代基Z*。
因此，对这些基团合适的放射性标记意味着用其相应的放射性同位素14C或3H替换天然氢或碳原子，但优选用3H替换氢原子。
术语“受体靶向部分”代表向寡核苷酸添加额外功能性的部分。
此类部分可以选自具有增强寡核苷酸功能性的潜力的任何蛋白质受体靶向部分。它们包括但不限于靶向特定分子如适体或非核苷酸蛋白质受体靶向部分的抗体或功能性肽或寡核苷酸，其具有增强寡核苷酸向身体组织或体液递送的潜力。
在一个优选的实施例中，所述受体靶向部分是唾液酸糖蛋白受体靶向部分，更优选为GalNAc部分。
GalNAc部分具有式VII
其中R3是氢或羟基保护基团并且n为0至10的整数，优选0至5的整数，更优选1至3的整数，但最优选地为2，相应的盐、对映异构体和/或立体异构体。
合适的羟基保护基团是酰基，特别地是C1-12-烷基羰基基团，更特别地是任选地被C1-6-烷基或苯基取代的C1-6-烷基羰基基团。更优选为乙酰基、新戊酰基或苯甲酰基，其中乙酰基是最优选的羟基保护基团。
在一个优选的实施例中，所述GalNAc部分具有式VII其中R3是氢且n是2。
GalNAc部分经由肽键–CO-NH-与连接基2连接。
GalNAc簇化合物可以根据PCT公开WO2017021385制备。
在一个优选的实施例中，Q*代表式III的残基
其中，
n为整数1或2，更优选是1，
R1和R2彼此独立地是氢、C1-2-烷基，优选为甲基，或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成环丙基环。
在进一步优选的实施例中，n是1且
R1和R2为氢或者
R1是甲基且R2是氢或者
R1和R2一起形成环丙基环。
Z*是放射性标记的C1-4-烷基基团，更优选地是放射性标记的甲基或乙基基团，甚至更优选地是放射性标记的甲基基团。
在一个实施例中，X1是O且X2是S。在另一个实施例中，X1是S且X2是O，在仍另一个实施例中，X1和X2两者是O或S。
如上所述，连接基1是C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的乙二醇桥或下式的基于丙三醇的桥
其中m为整数1至6。
连接基1更优选地是C4-8-亚烷基桥，甚至更优选地是C6-亚烷基桥。
连接基2是任选地氨基基团保护的氨基C2-12-亚烷基桥或含有1至10个乙二醇单元的氨基乙二醇桥；
连接基2更优选地是氨基C4-8-亚烷基桥，甚至更优选地是氨基-C6-亚烷基桥。
在另一个实施例中，所述放射性标记的寡核苷酸具有式Ib
其中R1、R2、X2、n、Z*和连接基1如上所述并且其中上面概述的优选选项同样适用。
在一个优选实施例中，X2是S。
在另一个实施例中，所述放射性标记的寡核苷酸具有式Ic
其中R1和R2、X1和X2、n、Z*、连接基1和连接基2如上所述并且其中上面概述的优选选项同样适用。
最优选的实施例是式Ib和Ic的放射性标记的寡核苷酸。
式Ib和Ic的放射性标记的寡核苷酸可以用以下化合物说明。
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-MOEM
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-C6SH-MOEM
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-MOEM
5'-MOEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C
其中C6SH意指C6(己烯)硫醇连接基；MOEM是3H标记的N-甲氧
基乙烯马来酰亚胺；*代表硫代磷酸酯桥；A、C、G、T是LNA核苷单体且a、t、c、g是DNA核苷单体。
本文公开的化合物具有以下核碱基序列。
SEQ ID NO 1:cagagttacttgccaact
SEQ ID NO 2:gcattggtattca
SEQ ID NO 3:gagttacttgccaact
SEQ ID NO 4:ttacacttaattatacttcc
本发明的放射性标记的寡核苷酸具有0.037TBq/mmol(1Ci/mmol)至3.7TBq/mmol(80Ci/mmol)，优选0.111TBq/mmol(3Ci/mmol)至1.85TBq/mmol(50Ci/mmol)，更优选0.185TBq/mmol(5Ci/mmol)至0.925TBq/mmol(25Ci/mmol)的比活力。
本发明还包括用于制备式I的放射性标记的寡核苷酸的方法，该方法包括式V的硫醇
其中，
n为0或1；
X1和X2彼此独立地是S或O；
连接基1是C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的乙二醇桥或式II的基于丙三醇的桥
其中m为整数1至6；
连接基2是任选地氨基基团保护的氨基C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的氨基乙二醇桥；
受体靶向部分是向寡核苷酸添加额外功能性的非核苷酸部分，特别地是去唾液酸糖蛋白受体靶向部分，优选GalNAc部分；
与式VI的放射性标记的马来酰亚胺化合物缀合
其中R1和R2、n和Z*如上所述。
缀合反应可以在有机碱和有机溶剂的存在下或在水性缓冲体系中在0℃至50℃的反应温度下进行。
合适的有机碱是叔胺，例如N,N-二异丙基乙胺(Hünig碱)。
合适的水性缓冲液是例如具有6至9的pH范围内的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
合适的溶剂是极性非质子溶剂，例如N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
含有所得放射性标记的寡核苷酸的反应混合物可以不含溶剂并且可以将粗产物溶解在合适的水性缓冲溶液中用于进一步纯化。
纯化主要包括色谱、浓缩和分离步骤，应用本领域技术人员所熟知的技术。
色谱是制备型HPLC，通常使用C-18反相柱，使用水和有机溶剂作为流动相。
从色谱法获得的级分的浓缩可以经由切向流过滤进行，特别地是经合适的膜进行透滤。
最后，从洗脱液中分离放射性标记的寡核苷酸通常可以通过冻干进行或可以储存在溶液中。
式VI的放射性标记的马来酰亚胺化合物的合成可遵循以下概述的反应方案。
R1和R2、n和Z*如上所述并且Y1和Y2彼此独立地是氢或C1-6烷基。上述偏好同样适用。
文献报道了几种合成马来酰亚胺衍生物的方法(N.B.Metha等人,J.Org.Chem.,1960,25,1012)。上述方案中描述的常见方法涉及经取代的胺和马来酸酐的缩合，随后是马来酰胺酸中间体的脱水。
本发明进一步包括放射性标记的寡核苷酸用于确定组织或体液中的寡核苷酸的生物分布和药代动力学的用途。此外，氚标记的寡核苷酸可应用于生物科学，包括定量全身放射自显影(QWBA)、靶标结合以及转运蛋白外排和吸收研究。
本发明还包括一种用于确定组织或体液中的寡核苷酸的生物分布和药代动力学的方法，该方法包括
a)将有效量的放射性标记的寡核苷酸施用于待检查的组织或体液，并且
b)测量组织或体液中的放射性标记的寡核苷酸的生物分布和药代动力学，并且任选地
c)对待通过放射自显影检查的组织或体液中的放射性标记的寡核苷酸进行成像。
本发明进一步包含式X的寡核苷酸
其中，
n为0或1；
X1和X2彼此独立地是S或O；
连接基1是C2-12-亚烷基桥、含有1至9个乙二醇单元的乙二醇桥或式II的基于丙三醇的桥
其中m为整数1至6；
连接基2是任选地氨基基团保护的氨基C2-12-亚烷基桥、含有1至9个乙二醇单元的氨基乙二醇桥；
Q代表式IIIa的残基
其中n为整数1至4，
R1和R2彼此独立地是氢、CF3、C1-6烷基，或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成C3-5-环烷烃环；
Z是C1-C6烷基基团；并且
受体靶向部分是向所述寡核苷酸添加额外功能性的部分。
描述式I的放射性标记的寡核苷酸的优选实施例同样适用于式X的非放射性标记的寡核苷酸。
因此Q代表式IIIa的残基
其中，
n为整数1或2，更优选是1，
R1和R2彼此独立地是氢或C1-6烷基，更优选地是氢；
Z是C1-4-烷基基团，更优选地是甲基或乙基，甚至更优选地是甲基。
在一个实施例中，X1是O且X2是S。在另一个实施例中，X1是S且X2是O，在仍另一个实施例中，X1和X2两者是O或S。
如上所述，连接基1是C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的乙二醇桥或下式的基于丙三醇的桥
其中m为整数1至6。
连接基1更优选地是C2-8-亚烷基桥，甚至更优选地是C6-亚烷基桥。
连接基2是任选地氨基基团保护的氨基C2-12-亚烷基桥或含有1至10个乙二醇单元的氨基乙二醇桥；
连接基2更优选地是氨基C2-8-亚烷基桥，甚至更优选地是氨基-C6-亚烷基桥。
在另一个实施例中，所述寡核苷酸具有式Ib'
其中R1、R2、X2、n、Z和连接基1如上所述并且其中上面概述的优选选项同样适用。
在一个优选实施例中，X2是S。
在另一个实施例中，所述放射性标记的寡核苷酸具有式Ic’
其中，
其中R1和R2、X1和X2、n、Z、连接基1和连接基2如上所述并且其中上面概述的优选选项同样适用。
实例：
缩写：
Bq 贝克勒尔
Ci 居里
Da 道尔顿
DCM 二氯甲烷
DI 去离子的
DIPEA N,N-二异丙基乙胺(Hünig碱)
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
GBB 基于丙三醇的桥
HV 高真空
i iso
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
min 分钟
MOEM 甲氧基乙烯马来酰亚胺
MOMCPM 1-(甲氧基甲基)环丙基马来酰亚胺
MOMEM 1-(2-甲氧基-1-甲基-乙基)马来酰亚胺
MS 质谱
MTBE 甲基叔丁基醚
MW 分子量
MWCO 截留分子量
n 正常
NaOtBu 叔丁氧基钠
PBS 磷酸盐缓冲盐水
p 对位
ppm 百万分率
QWBA 定量全身放射自显影
rpm 每分钟转数
rt 室温
SAX 强阴离子交换
SCX 强阳离子交换
t 叔
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
通用方法：
所有用作起始材料的寡核苷酸均由罗氏制药有限公司(Roche Pharma)研发部合成。氚标记的[3H]甲基硝基苯磺酸酯(三氚甲基4-硝基苯磺酸酯；摩尔活力：3TBq/mmol＝80Ci/mmol)获得自RC Tritec(Teufen,CH)，呈在甲苯中的溶液。PBS缓冲液购自ThermoFisher Scientific(Paisley,UK)，浓度为一倍(1x)和十倍(10x)。所有其他试剂和溶剂均从标准商业来源获得，无需进一步纯化即可使用。使用HIDEX 300SL和ULTIMATE GOLD混合物(PerkinElmer Inc.,Waltham,MA,USA)完成氚化合物的液体闪烁计数。马来酰亚胺衍生物的合成的分析通过HPLC Agilent 1260Infinity II进行：波长为220nm，Waters XBridgeC18，4.6x 150mm，3.5μm柱，40℃，洗脱液为[A]＝水+5％ MeCN+0.05％ TFA和[B]＝MeCN+0.05％ TFA，流速为1.0mL/min，梯度如下：10分钟内0％[B]至50％[B]，12分钟后至80％。通过UPLC Agilent 1290确定寡核苷酸1-4：波长为260nm，ACQUITY UPLC寡核苷酸BEH C18，2.1x 50mm,1.7μm柱，80℃([A]＝水/甲醇/六氟异丙醇/TEA：950/25/21/2.3mL；[B]＝水/甲醇/六氟异丙醇/TEA：175/800/21/2.3mL)，流速为0.5mL/min，梯度如下：13分钟内10％[B]至25％[B]。使用正相硅胶快速柱(4g)通过TELEDYNE(Lincoln,NE,USA)IscoCombiFlash进行大规模纯化。溶剂[A]是庚烷且溶剂[B]是甲基叔丁基醚。色谱柱最初以20％[B]平衡，流速为18mL/min，在214nm处监测吸光度。洗脱梯度由以下组成：在20％[B]等度条件下4分钟，然后在14分钟内线性梯度升至100％[B]，最后在100％[B]的等度条件下5分钟。质谱通过配备单重四极杆(SQ)和ESI质谱检测器的Waters Acquity UPLC H-class系统进行。使用具有内部固体闪烁体的-放射性HPLC检测器RAMONA Quattro(Raytest,Straubenhardt,Germany)测量放射化学纯度。通过以下进行MOEM*的制备型HPLC：GilsonPLC 2020，XBridge C18柱，5μm，10mm×250mm使用水+5％MeCN+0.05％ TFA作为流动相[A]以及MeCN+0.05％ TFA作为流动相[B]梯度为18分钟内0％[B]至70％[B]。1H NMR测量在Bruker Avance III 600MHz光谱仪上进行。所用的氘溶剂取决于产物的溶解度，并已在每种情况下进行了详细说明。化学位移以ppm为单位给出，s代表单峰，d代表双峰，dd代表双二重峰，m代表多重峰，J代表间接偶极-偶极耦合。浓度由Eppendorf/>basic在260nm波长和相应计算的摩尔消光系数确定。
实例1
[3H-甲基]N-甲氧基乙烯马来酰亚胺(MOEM*)的合成
(式VI的马来酰亚胺化合物，其中n＝1，R1和R2＝H)
方案：
a)外-4-(2-羟乙基)-1,7-二甲基-10-氧杂-4-氮杂-三环[5.2.1.02,6]癸-8-烯-3,5-二酮(M3)的合成
在rt向可商购的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺M1(200mg,1.42mmol)的乙腈(2.0mL)溶液中添加2,5-二甲基呋喃M2(722mg,802μL,7.51mmol)。将混合物在密封玻璃管中在65℃搅拌20h。在真空中除去溶剂并在HV中干燥以得到粗制Diels-Alder加合物M3，其为4:1比例的外型/内型混合物，为淡黄色油状物。通过Isco快速色谱法纯化内型/外型混合物以分离高纯度的外型衍生物。收率(外)：185mg(55％)。MS(ESI)：m/z＝238.1[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6)δppm 6.36(s,2H),4.69(br s,2H),3.41(s,4H),2.88(s,2H),1.53(s,6H)。
b)[3H-甲氧基]-外-4-(2-甲氧基乙基)-1,7-二甲基-10-氧杂-4-氮杂-三环[5.2.1.02,6]癸-8-烯-3,5-二酮(M5*)的合成
将1.67GBq(45mCi)的[3H]-甲基硝基苯磺酸酯M4*(125μg,0.561μmol)的甲苯溶液用冷(非放射性)甲基4-硝基苯磺酸酯M4(122μg,0.561μmol)至1:1的比例以实现约40Ci/mmol的比活力。蒸发溶液，转移到密封管中并在氩气流下浓缩至干。在rt向固体残余物(M4*+M4)中添加Diels Alder加合物M3(666μg,2.81μmol)在80μL甲苯中的溶液，然后添加2M叔丁氧基钠在THF中的溶液(1.7μL,3.37μmol)。将混合物在密封管中在rt搅拌2.5小时。HPLC分析显示所需的中间产物M5*具有50％的放射化学纯度。将反应混合物用DCM(1mL)稀释并通过SCX-2/SAX柱(Silycycle，500mg，用DCM预处理)过滤直接纯化以除去碱性和酸性化合物。用DCM(5mL)洗涤柱，并将所得溶液通过蒸发浓缩至体积100μL，以给出放射性标记的中间体M5*。
M5*的粗溶液不经进一步纯化而直接用于下一步。
c)[3H-甲基]N-甲氧基乙烯马来酰亚胺(MOEM*)的合成
将获得的M5*的粗溶液转移到密封管中，用甲苯(70μL)稀释并在90℃下加热2h。
HPLC分析显示完全转化为脱保护的产物MOEM*并保留未反应的[3H]甲基硝基苯磺酸酯M4*。允许反应混合物冷却至rt，然后在氩气流下将溶剂浓缩至干。将残余物通过制备型HPLC纯化，以给出所需产物[3H-甲基]甲氧基乙烯马来酰亚胺(MOEM*)，为洗脱剂混合物中的溶液。将相应的制备型HPLC级分(在洗脱液混合物中含有MOEM*)直接用于与寡核苷酸1、2、3和4的缀合。放射收率：253.5MBq(6.85mCi)＝15.2％。放射性浓度：34.8MBq/mL(0.94mCi/mL)，放射化学纯度：99％。由于低电离，MS无法确定比活力。假设比活力为40Ci/mmol。
实例2(非放射性缀合
(式VI的马来酰亚胺化合物，其中n＝1，R1和R2＝H)
实例中使用的寡核苷酸
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH；MW：7709.5g/mol；(寡核苷酸1)
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-C6SH；MW：4537.6g/mol；(寡核苷酸2)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH；MW：5491.5g/mol；(寡核苷酸3)
5'-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；MW：6742.3g/mol；(寡核苷酸4)
一般过程：
将1当量的具有5'或3'末端巯基连接基的寡核苷酸溶解于PBS(体积因子：250mL/g)中。将1.3当量的溶解于THF(体积因子：200mL/g)中的可商购的甲氧基乙烯马来酰亚胺(MOEM)添加至水溶液中，并在室温下搅拌1小时。UPLC分析显示马来酰亚胺完全添加到寡核苷酸中。为了将缓冲液交换成水，将反应混合物转移到Pro纯化系统(MWCO:3.000Da)并以4000rpm离心。添加DI水并将该过程再重复4次以完成交换。将所得水溶液冻干以分离寡核苷酸，为无色粉末，收率范围为70％-95％，纯度为90％-99％。
根据一般过程，寡核苷酸(寡核苷酸1至4)已与MOEM缀合。
a)由寡核苷酸1合成缀合物1
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-MOEM；收率：70％，纯度：90％，MS(m/z)：7859.4[M-(H)]-
b)由寡核苷酸2合成缀合物2
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-C6SH-MOEM；收率：93％，纯度：97％，MS(m/z)：4689.5[M-(H)]-
c)由寡核苷酸3合成缀合物3
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-MOEM；收率：83％，纯度：95％，MS(m/z)：5642.6[M-(H)]-
d)由寡核苷酸4合成缀合物4
5'-MOEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；收率：92％，纯度：99％，MS(m/z)：6892.7[M-(H)]-
实例3(放射性缀合)
(式VI的马来酰亚胺化合物，其中R1和R2＝H)
实例中使用的寡核苷酸
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH；MW：7709.5g/mol；(寡核苷酸1)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH；MW：5491.5g/mol；(寡核苷酸3)
5'-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；MW：6742.3g/mol；(寡核苷酸4)
一般过程：
将2当量的具有5'或3'末端巯基连接基的寡核苷酸溶解于PBS(10x)(体积因子：250mL/g)中。将1当量的MOEM*(直接用于制备型HPLC洗脱液，放射性浓度为35MBq/mL(0.94mCi/mL))添加至寡核苷酸水溶液中，并在室温下搅拌1.5小时。UPLC分析显示MOEM*与寡核苷酸的缀合的范围为30％至45％。添加10当量的溶解于THF(体积因子：700mL/g)中的冷(非放射性)MOEM，并在rt搅拌1小时。UPLC显示完全缀合。将反应混合物转移到Pro纯化系统(MWCO:3.000Da)并以4000rpm离心。添加PBS(1x)并重复该过程4次以完成溶剂交换并收到经纯化的产物。确定所得缓冲溶液的浓度和活性。计算的放射化学的收率范围为69％-72％，比摩尔活力可达到0.61TBq/mmol(16.5Ci/mmol)至0.74TBq/mmol(20.1Ci/mmol)。放射化学纯度在96.0％至98.4％范围内。
根据一般过程，寡核苷酸(寡核苷酸1、3和4)已缀合。
a)由寡核苷酸1合成缀合物1*[3H]
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-[3H]-MOEM*；收率72％，放射化学纯度：96.1％，活力：14.1MBq(0.38mCi)，比摩尔活力：0.74TBq/mmol(20.1Ci/mmol)。
b)由寡核苷酸3合成缀合物3*[3H]
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-[3H]-MOEM；收率69％，放射化学纯度：96.0％，活力：28.1MBq(0.76mCi)，比摩尔活力：0.61TBq/mmol(16.5Ci/mmol)。
c)由寡核苷酸4合成缀合物4*[3H]
5'-[3H]-MOEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；收率72％，放射化学纯度：98.4％，活力：29.2MBq(0.79mCi)，比摩尔活力：0.68TBq/mmol(18.3Ci/mmol)。
实例4
[1H/3H-甲基]-1-(甲氧基甲基)环丙基马来酰亚胺(MOMCPM*)_的合成(式VI的马来酰亚胺化合物，其中R1和R2一起为环丙基)
通用方案：
a)外-2-[1-(羟甲基)环丙基]-4,7-二甲基-3a,7a-二氢-4,7-环氧异吲哚-1,3-二酮(M13)的合成
/>
在rt向可商购的1-[1-(羟甲基)环丙基]马来酰亚胺M11(209mg,1.25mmol)的乙腈(2.0mL)溶液中添加2,5-二甲基呋喃M2(643mg,713μL,6.63mmol)。将混合物在密封玻璃管中在65℃搅拌22小时。在真空中除去溶剂并在HV中干燥以得到粗制Diels-Alder加合物M13，其为4:1比例的外型/内型混合物，为淡黄色油状物。通过Isco快速色谱法纯化内型/外型混合物以分离高纯度的外型衍生物。收率(外)：211mg(64％)。MS(ESI)：m/z＝264.1[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6)δppm 6.35(s,2H),4.70(br s,1H),3.38(s,2H),2.78(s,2H),1.50(s,6H),0.89–0.93(m,2H),0.63–0.67(m,2H)。
b)外-2-[1-(甲氧基甲基)环丙基]-4,7-二甲基-3a,7a-二氢-4,7-环氧异吲哚-1,3-二酮(M15)的合成
在密封管中，将甲基硝基苯磺酸酯M4(50mg,0.23mmol)和M13(72.7mg,0.276mmol)溶解在甲苯(2.5mL)中。将溶液冷却至0℃。在该温度下，将叔丁氧基钠溶液(2M在THF中，403μL，806μmol)缓慢滴入反应溶液中。颜色立即从无色变为深棕色。移除冰浴并将混合物在rt搅拌过夜。HPLC分析显示所需的中间产物M15。将反应混合物用叔丁基甲基醚(30mL)稀释并用2M碳酸钠(10mL)和饱和氯化钠溶液(10mL)萃取。将有机相用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干以得到淡黄色液体。HPLC分析显示纯度为90％的所需中间体M15。粗产物不经进一步纯化而直接用于下一步。
b*)[3H-甲氧基]-外-2-[1-(甲氧基甲基)环丙基]-4,7-二甲基-3a,7a-二氢-4,7-环氧异吲哚-1,3-二酮(M15*)的合成
将0.93GBq(25mCi)的[3H]-甲基硝基苯磺酸酯M4*(70μg,0.313μmol)的甲苯溶液用冷(非放射性)甲基4-硝基苯磺酸酯M4(68μg,0.313μmol)至1:1的比例以实现约40Ci/mmol的比活力。蒸发溶液，转移到密封管中并在氩气流下浓缩至干。在rt向固体残余物(M4*+M4)中添加Diels Alder加合物M13(411μg,1.56μmol)在80μL甲苯中的溶液，然后添加叔丁氧基钠溶液(2M在THF中，1.0μL，1.88μmol)。将混合物在密封管中在rt搅拌5.5小时。HPLC分析显示所需的中间产物M15*具有66％的放射化学纯度。将反应混合物用DCM(1mL)稀释并通过SCX-2/SAX柱(Silycycle，500mg，用DCM预处理)过滤直接纯化以除去碱性和酸性化合物。用DCM(5mL)洗涤柱，并将所得溶液通过蒸发浓缩至体积100μL，以给出放射性标记的中间体M15*。
M15*的粗溶液不经进一步纯化而直接用于下一步。
c)1-[(1-甲氧基甲基)-环丙基]马来酰亚胺(MOMCPM)的合成
将粗品M15(30mg,108μmol)转移到密封管中，溶解在甲苯(4.4mL)中并在110℃下加热2小时。HPLC分析显示完全转化为脱保护的产物MOMCPM。允许反应混合物冷却至rt，然后在氩气流下将溶剂浓缩至干。将残余物通过制备型HPLC纯化，以给出所需产物MOMCPM，为洗脱剂混合物中的溶液。将在洗脱液混合物中含有MOMCPM的相应制备型HPLC级分用乙酸乙酯(50mL)稀释并用氯化钠(每次30mL)萃取3次。将有机相用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干以给出16mg(收率82％)，纯度为98％。
1H NMR(CDCl3)δppm 6.64(s,2H),3.41(s,2H),3.36(s,3H),1.03–1.05(m,1H),0.98-1.00(m,2H),0.92–1.08(m,1H)
c*)1-[(1-甲氧基-[3H]-甲基)-环丙基]马来酰亚胺(MOMCPM*)的合成
将获得的M15*的粗溶液转移到密封管中，用甲苯(100μL)稀释并在110℃下加热2h。
HPLC分析显示完全转化为脱保护的产物MOMCOM*并保留未反应的[3H]甲基硝基苯磺酸酯M4*。允许反应混合物冷却至rt，然后在氩气流下将溶剂浓缩至干。将残余物通过制备型HPLC纯化，以给出所需产物1-[(1-甲氧基-[3H]-甲基)-环丙基]马来酰亚胺(MOMCPM*)，为洗脱剂混合物中的溶液。将相应的制备型HPLC级分(在洗脱液混合物中含有MOMCPM*)直接用于与寡核苷酸3和4的缀合。放射收率：140.6MBq(3.80mCi)＝15.2％。放射性浓度：30.3MBq/mL(0.82mCi/mL)，放射化学纯度：99％。由于低电离，MS无法确定比活力。假设比活力为40Ci/mmol。
实例5(非放射性缀合)
(式VI的马来酰亚胺化合物，其中n＝1，R1和R2为环丙基)
实例中使用的寡核苷酸
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH；MW：5491.5g/mol；(寡核苷酸3)
5'-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；MW：6742.3g/mol；(寡核苷酸4)
一般过程：
将1当量的具有5'或3'末端巯基连接基的寡核苷酸溶解于PBS(体积因子：250mL/g)中。将1.3当量溶解于THF(体积因子：200mL/g)中的1-[(1-甲氧基甲基)-环丙基]马来酰亚胺(MOMCPM)添加至水溶液中，并在室温下搅拌1小时。UPLC分析显示马来酰亚胺完全添加到寡核苷酸中。为了将缓冲液交换成水，将反应混合物转移到Pro纯化系统(MWCO:3.000Da)并以4000rpm离心。添加DI水并将该过程再重复4次以完成交换。将所得水溶液冻干以分离寡核苷酸，为无色粉末，收率范围为86％-95％，纯度为95％-98％。
根据一般过程，寡核苷酸(寡核苷酸3、4)已与MOMCPM缀合。
a)由寡核苷酸3合成缀合物13
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-MOMCPM；收率：85％，纯度：95％，MS(m/z)：5668.6[M-(H)]-
b)由寡核苷酸4合成缀合物14
5'-MOMCPM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；收率：98％，纯度：98％，MS(m/z)：6818.7[M-(H)]-
实例5(放射性缀合)
(式VI的马来酰亚胺化合物，其中n＝1，R1和R2为环丙基)
实例中使用的寡核苷酸
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH；MW：5491.5g/mol；(寡核苷酸3)
5'-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；MW：6742.3g/mol；(寡核苷酸4)
一般过程：
将1.2当量的具有5'或3'末端巯基连接基的寡核苷酸溶解于PBS(10x)(体积因子：250mL/g)中。将1当量的MOMCPM*(直接用于制备型HPLC洗脱液，放射性浓度为30.3MBq/mL(0.82mCi/mL))添加至寡核苷酸水溶液中，并在室温下搅拌2小时。UPLC分析显示MOMCPM*与寡核苷酸的缀合的范围为26％至44％。添加10当量的溶解于乙腈(体积因子：700mL/g)中的冷(非放射性)MOMCPM，并在rt搅拌2小时。UPLC显示完全缀合。将反应混合物转移到Pro纯化系统(MWCO:3.000Da)并以4000rpm离心。添加PBS(1x)并重复该过程4次以完成溶剂交换并收到经纯化的产物。确定所得缓冲溶液的浓度和活性。计算的放射化学的收率范围为90％-799％，比摩尔活力可达到0.63TBq/mmol(17.0Ci/mmol)至0.77TBq/mmol(20.8Ci/mmol)。放射化学纯度在97.3％至98.1％范围内。
根据一般过程，寡核苷酸(寡核苷酸3和4)已与MOMCPM*缀合。
a)由寡核苷酸3合成缀合物13*[3H]
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-[3H]-MOMCPM；收率90％，放射化学纯度：98.1％，活力：26.2MBq(0.71mCi)，比摩尔活力：0.63TBq/mmol(17.0Ci/mmol)。
b)由寡核苷酸4合成缀合物14*[3H]
5'-[3H]-MOMCPM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；收率99％，放射化学纯度：97.3％，活力：34.8MBq(0.94mCi)，比摩尔活力：0.77TBq/mmol(20.8Ci/mmol)。
实例6
[1H/3H-甲基]-1-(2-甲氧基-1-甲基-乙基)马来酰亚胺(MOMEM(*))_的合成(式VI的马来酰亚胺化合物，其中n＝1，R1＝甲基且R2＝H)
通用方案：
a)外-4-(2-羟基-1-1甲基-乙基)-4,7-二甲基-3a,7a-二氢-4,7-环氧异吲哚-1,3-二酮(M23)的合成
在rt向可商购的1-(2-羟基-1-甲基-乙基)马来酰亚胺M21(132mg,0.85mmol)的乙腈(2.0mL)溶液中添加2,5-二甲基呋喃M2(450mg,500μL,4.68mmol)。将混合物在密封玻璃管中在65℃搅拌20h。在真空中除去溶剂并在HV中干燥以得到粗制Diels-Alder加合物M23，其为4:1比例的外型/内型混合物，为淡黄色油状物，纯度为98％。通过Isco快速色谱法纯化内型/外型混合物以分离高纯度的外型衍生物。收率(外)：123mg(58％)。MS(ESI)：m/z＝269.2[M+NH4]+。1H NMR(DMSO-d6)δppm 6.36(d,J＝1.6Hz,2H),4.54-5.09(m,1H),3.90–4.15(m,1H),3.67(dd,J＝10.8,8.1Hz,1H),3.49(dd,J＝10.8,6.4Hz,1H),2.82-2.87(m,1H),2.77-2.81(m,1H),1.53(d,J＝4.0Hz,6H),1.17(d,J＝7.0Hz,3H)。
b)外-2-(2-甲氧基-1-甲基-乙基)-4,7-二甲基-3a,7a-二氢-4,7-环氧异吲哚-1,3-二酮(M25)的合成
在密封管中，将溶解在甲苯(2mL)中的甲基硝基苯磺酸酯M4(49.8mg,0.23mmol)和M23(57.6mg,0.23mmol)冷却至0℃。逐滴添加叔丁氧基钠溶液(2M在THF中,138μL,0.28mmol)。颜色由无色变为棕色。将混合物在室温下搅拌3小时。HPLC分析显示转化为所需的中间产物。将反应混合物通过两个SAX-SCX柱(Sillicycle，500mg，用甲苯预处理)过滤直接纯化。用甲苯(各5mL)洗涤柱，并将所得溶液通过蒸发浓缩至干，以给出无色油状物。将粗产物通过Isco快速色谱法通过庚烷和MTBE的梯度(15分钟内从0％至60％ MTBE)纯化。收率：59mg(97％)。MS(ESI)：m/z＝266.1[M+H]+。
1H NMR(DMSO-d6)δppm 6.36(s,2H),4.17–4.27(m,1H),3.69(dd,J＝10.0,8.9Hz,1H),3.69(dd,J＝10.0,8.9Hz,1H),3.42(dd,J＝9.9,5.9,1H),3.19(s,3H),2.82-2.87(m,2H),1.53(d,J＝3.6Hz,6H),1.19(d,J＝7.1Hz,3H)。
b*)[3H-甲氧基]-外-2-(2-甲氧基-1-甲基-乙基)-4,7-二甲基-3a,7a-二氢-4,7-环氧异吲哚-1,3-二酮(M25*)的合成
将0.93GBq(25mCi)的[3H]-甲基硝基苯磺酸酯M4*(70μg,0.313μmol)的甲苯溶液用冷(非放射性)甲基4-硝基苯磺酸酯M4(68μg,0.313μmol)至1:1的比例以实现约40Ci/mmol的比活力。蒸发溶液，转移到密封管中并在氩气流下浓缩至干。在rt向固体残余物(M4*+M4)中添加外型Diels Alder加合物M23(393μg,1.56μmol)在80μL甲苯中的溶液，然后添加叔丁氧基钠溶液(2M在THF中，1.0μL，1.88μmol)。将混合物在密封管中在rt搅拌2.5小时。HPLC分析显示所需的中间产物M25*具有63％的放射化学纯度。将反应混合物用DCM(1mL)稀释并通过SCX-2/SAX柱(Silycycle，500mg，用DCM预处理)过滤直接纯化以除去碱性和酸性化合物。用DCM(5mL)洗涤柱，并将所得溶液通过蒸发浓缩至体积100μL，以给出放射性标记的中间体M25*。
M25*的粗溶液不经进一步纯化而直接用于下一步。
c)1-(1-甲氧基-1-甲基-乙基)马来酰亚胺(MOMEM)的合成
将55mg(0.207mmol)的M25转移到密封管中，溶解在甲苯(500μL)中并在90℃下加热16小时。HPLC分析显示完全转化为脱保护的产物MOMEM。允许反应混合物冷却至rt，然后将溶剂浓缩至干。将残余物通过快速色谱法纯化以给出所需产物甲氧基乙烯马来酰亚胺(MOMEM)，纯度>96％。19mg(54％)可以作为无色油状物分离。MS(ESI)：m/z＝170.08[M+H]+。
1H NMR(DMSO-d6)δppm 6.98(s,2H),4.23(ddd,J＝9.5,7.1,5.4Hz,1H),3.67(t,J＝9.8Hz,1H),3.39(dd,J＝10.0,5.3Hz,1H),3.19(s,3H),1.24(d,J＝7.1Hz,3H)。
c*)[3H-甲基]-1-(1-甲氧基-1-甲基-乙基)马来酰亚胺(MOMEM*)的合成
将获得的M25*的粗溶液转移到密封管中，用甲苯(100μL)稀释并在110℃下加热2h。
HPLC分析显示完全转化为脱保护的产物MOMEM*并保留未反应的[3H]甲基硝基苯磺酸酯M4*。允许反应混合物冷却至rt，然后在氩气流下将溶剂浓缩至干。将残余物通过制备型HPLC纯化，以给出所需产物[3H-甲基]甲氧基乙烯马来酰亚胺(MOMEM*)，为洗脱剂混合物中的溶液。将相应的制备型HPLC级分(在洗脱液混合物中含有MOMEM*)直接用于与寡核苷酸3和4的缀合。放射收率：122.1MBq(3.3mCi)＝13.2％。放射性浓度：30.0MBq/mL(0.81mCi/mL)，放射化学纯度：99％。由于低电离，MS无法确定比活力。假设比活力为40Ci/mmol。
实例7(非放射性缀合)
(式VI的马来酰亚胺化合物，其中n＝1，R1＝甲基且R2＝H)
实例中使用的寡核苷酸
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH；MW：5491.5g/mol；(寡核苷酸3)
5'-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；MW：6742.3g/mol；(寡核苷酸4)
一般过程：
将1当量的具有5'或3'末端巯基连接基的寡核苷酸溶解于PBS(体积因子：250mL/g)中。将1.3当量溶解于THF(体积因子：200mL/g)中的1-(1-甲氧基-1-甲基-乙基)马来酰亚胺(MOMEM)添加至水溶液中，并在室温下搅拌1小时。UPLC分析显示马来酰亚胺完全添加到寡核苷酸中。为了将缓冲液交换成水，将反应混合物转移到Pro纯化系统(MWCO:3.000Da)并以4000rpm离心。添加DI水并将该过程再重复4次以完成交换。将所得水溶液冻干以分离寡核苷酸，为无色粉末，收率范围为83％-98％，纯度为93％-98％。
根据一般过程，寡核苷酸(寡核苷酸3和4)已与MOMEM缀合。
a)由寡核苷酸3合成缀合物23
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-MOMEM；收率：83％，纯度：98％，MS(m/z)：5656.6[M-(H)]-
b)由寡核苷酸4合成缀合物24
5'-MOMEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；收率：93％，纯度：98％，MS(m/z)：6906.7[M-(H)]-
实例8(放射性缀合)
(式VI的马来酰亚胺化合物，其中n＝1，R1＝甲基且R2＝H)
实例中使用的寡核苷酸
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH；MW：5491.5g/mol；(寡核苷酸3)
5'-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；MW：6742.3g/mol；(寡核苷酸4)
一般过程：
将1.2当量的具有5'或3'末端巯基连接基的寡核苷酸溶解于PBS(10x)(体积因子：250mL/g)中。将1当量的MOMEM*(直接用于制备型HPLC洗脱液，放射性浓度为30.0MBq/mL(0.81mCi/mL))添加至寡核苷酸水溶液中，并在室温下搅拌2小时。UPLC分析显示MOMEM*与寡核苷酸的缀合的范围为62％至66％。添加10当量的溶解于THF(体积因子：700mL/g)中的冷(非放射性)MOMEM，并在rt搅拌2小时。UPLC显示完全缀合。将反应混合物转移到Pro纯化系统(MWCO:3.000Da)并以4000rpm离心。添加PBS(1x)并重复该过程4次以完成溶剂交换并收到经纯化的产物。确定所得缓冲溶液的浓度和活性。计算的放射化学的收率范围为87％-89％，比摩尔活力可达到0.39TBq/mmol(10.5Ci/mmol)至0.48TBq/mmol(12.0Ci/mmol)。放射化学纯度在93.4％至94.3％范围内
根据一般过程，寡核苷酸，寡核苷酸3和4已与MOMEM缀合。
a)由寡核苷酸3合成缀合物23*[3H]
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-[3H]-MOMEM；收率87％，放射化学纯度：94.3％，活力：16.7MBq(0.45mCi)，比摩尔活力：0.48TBq/mmol(12.0Ci/mmol)。
b)由寡核苷酸4合成缀合物24*[3H]
5'-[3H]-MOMEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C；收率89％，放射化学纯度：93.4％，活力：14.8MBq(0.40mCi)，比摩尔活力：0.39TBq/mmol(10.5Ci/mmol)。
Claims (14)
1.一种式I的放射性标记的寡核苷酸
其中，
n为0或1；
X1和X2彼此独立地是S或O；
连接基1是C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的乙二醇桥或式II的基于丙三醇的桥
其中m为整数1至6；
连接基2是任选地氨基基团保护的氨基C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的氨基乙二醇桥；
Q*代表式III的残基
其中，
n’为1，
R1和R2彼此独立地是氢、C1-2-烷基，或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成环丙基环；
Z*是3H-标记C1-C6烷基基团；并且
受体靶向部分是式IV的GalNAc部分，其相应的盐、对映异构体和/或立体异构体
其中R3是氢或羟基保护基团并且n”为0至10的整数。
2.根据权利要求1所述的放射性标记的寡核苷酸，其中Z*是3H-标记的甲基或乙基基团。
3.根据权利要求1或2所述的放射性标记的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含由任选地经修饰的DNA、PNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成的7至30个核苷酸的连续核苷酸序列。
4.式Ib的根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的寡核苷酸
其中R1、R2、X2、n’、Z*和连接基1如权利要求1-3中任何一项所定义。
5.式Ic的根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的寡核苷酸
其中R1和R2、X1和X2、n’、Z*、连接基1和连接基2如权利要求1-3中任何一项所定义。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的寡核苷酸，其中n”为0至5的整数。
7.根据权利要求6所述的放射性标记的寡核苷酸，其中n”为1至3的整数。
8.根据权利要求6所述的放射性标记的寡核苷酸，其中n”为2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的放射性标记的寡核苷酸，其具有0.037TBq/mmol至3.7TBq/mmol的比活力。
10.根据权利要求9所述的放射性标记的寡核苷酸，其具有0.111TBq/mmol至1.85TBq/mmol的比活力。
11.根据权利要求9所述的放射性标记的寡核苷酸，其具有0.185TBq/mmol至0.925TBq/mmol的比活力。
12.一种用于制备根据权利要求1-11中任一项所述的其中Q*代表式III的残基的式I的放射性标记的寡核苷酸的方法，所述方法包括将式V的硫醇
其中，
n为0或1；
X1和X2彼此独立地是S或O；
连接基1是C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的乙二醇桥或式II的基于丙三醇的桥
其中m为整数1至6；
连接基2是任选地氨基基团保护的氨基C2-12-亚烷基桥、含有1至10个乙二醇单元的氨基乙二醇桥；
受体靶向部分是如权利要求1-11中任何一项所定义的；
与式VI的放射性标记的马来酰亚胺化合物缀合
其中R1和R2、n’和Z*如权利要求1-11中任何一项所定义。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的放射性标记的寡核苷酸在制备用于确定组织或体液中的寡核苷酸的生物分布和药代动力学的检测试剂中的用途。
14.权利要求13的用途，其包括；
a)将有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的放射性标记的寡核苷酸施用于待检查的组织或体液，以及
b)测量所述组织或体液中的根据权利要求1至11中任一项所述的放射性标记的寡核苷酸的所述生物分布和所述药代动力学，以及任选地
c)将待通过放射自显影检查的所述组织或所述体液中的根据权利要求1至11中任一项所述的放射性标记的寡核苷酸进行成像。
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