BR112020014494A2 - derivados de lna-ácido dicarboxílico, processo de preparação de derivados de lna-ácido dicarboxílico, uso dos derivados de lna-ácido dicarboxílico, suporte sólido e uso do suporte sólido - Google Patents
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Abstract
A presente invenção compreende derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I:
ou seus sais; em que:
- R1 é uma nucleobase ou nucleobase modificada;
- R2 é um grupo protetor hidróxi; e
- n é um número inteiro de 1 a 5.
Os derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I podem ser utilizados em suportes sólidos previamente carregados da fórmula III:
e servem de material de partida apropriado para a síntese de oligonucleotídeos.
Description
[001] A presente invenção refere-se a derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I:
I ou seus sais; em que: - R1 é uma nucleobase ou nucleobase modificada; - R2 é um grupo protetor hidróxi; e - n é um número inteiro de 1 a 5; a um processo de sua preparação, seu uso na preparação de um suporte sólido previamente carregado com LNA que contém os derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I, suporte sólido previamente carregado com LNA e seu uso na síntese de oligonucleotídeos.
[002] Oligonucleotídeos são geralmente preparados sobre um meio de suporte sólido. Geralmente, primeiro sínton (por exemplo, monômero, tal como nucleosídeo) é primeiramente ligado ao meio de suporte sólido e o oligonucleotídeo é sintetizado em seguida por meio de acoplamento sequencial de monômeros ao sínton ligado ao suporte sólido. Este alongamento iterativo eventualmente resulta em composto de oligonucleotídeo final que é dividido do suporte e, se necessário, adicionalmente trabalhado para produzir o composto de oligonucleotídeo final.
[003] Em desenvolvimento adicional, moléculas ligantes ligadas ao suporte sólido foram introduzidas para condução da síntese de oligonucleotídeos com mais eficiência, particularmente nos sintetizadores de processo automáticos utilizados hoje em dia. A Patente Internacional Publicada WO 2005/049621 ou WO 2006/029023, por exemplo, descreve esses compostos ligantes. Alongamento de oligonucleotídeos normalmente inicia-se em O-dimetoxitritila (O-DMT) sobre a molécula ligante.
[004] Na síntese de oligonucleotídeos de LNA, entretanto, concluiu-se que, até certo ponto, o primeiro acoplamento sobre a molécula ligante falhou, o que resulta em oligonucleotídeos finais com quantidade substancial de (N-1) impurezas, ou seja, oligonucleotídeos com um nucleosídeo faltante na extremidade 3’.
[005] O objeto da presente invenção foi, portanto, de reduzir muito a quantidade de impurezas (N-1) na extremidade 3’, pois essas impurezas dificilmente podem ser removidas por meio dos métodos de purificação cromatográfica do estado da técnica e causam, portanto, perda substancial de rendimento, por exemplo, por meio de estreita reunião de frações na etapa de cromatografia preparativa e/ou perfil de impureza insatisfatório no oligonucleotídeo LNA isolado.
[006] Concluiu-se que, com derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I conforme descrito acima, que podem ser ligados a uma resina sólida (Patente Internacional Publicada WO 1992/006103) e agem como resina previamente carregada, as falhas de N-1 podem ser muito reduzidas.
[007] As definições a seguir são estabelecidas para ilustrar e definir o significado e o escopo das várias expressões utilizadas para descrever a presente invenção.
[008] A expressão “alquila C1-6” indica um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado monovalente com 1 a 6 átomos de carbono e, em realização mais específica, 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos típicos incluem metila, etila, propila, isopropila, n-butila, i-butila, sec-butila ou t-butila, preferencialmente metila ou etila.
[009] A expressão “alcóxi C1-6” indica um grupo alquila C1-6, de maior preferência um grupo alquila C1-4, conforme definido acima, ligado a um átomo de oxigênio. Exemplos típicos incluem metóxi, etóxi, propóxi, isopropóxi, n-butóxi, i-butóxi e t-butóxi, preferencialmente metóxi ou etóxi.
[0010] A expressão “alcanoíla C1-6” indica um grupo alquila C1-6, de maior preferência um grupo alquila C1-4, conforme definido acima, ligado a um grupo carbonila. Exemplos típicos incluem acetila, etanoíla, propanoíla, i- propanoíla, n-butanoíla, i-butanoíla ou t-butanoíla, preferencialmente acetila.
[0011] A expressão “grupo protetor hidróxi utilizado para R2” indica grupos que se destinam a proteger um grupo hidróxi e incluem grupos de formação de éter e éster, particularmente grupos tritila modificados, tetra- hidropiranila, grupos acila, carbamoil, benzil e silil éteres (por exemplo, TBS, TBDPS). Exemplos adicionais desses grupos são encontrados em T. W.
Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª Ed., John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, NY, 1991, capítulos 2-3; E. Haslam, Protective Groups in Organic Chemistry, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, Nova Iorque, NY, 1973, capítulo 5; e T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nova Iorque, NY, 1981.
[0012] São preferidos grupos hidroxila sensíveis a ácidos, de maior preferência grupos tritila modificados por alcóxi. Modificado indica, neste contexto, a substituição de um, dois ou três dos anéis fenila por um ou mais grupos alcóxi C1-6, preferencialmente grupos metóxi.
[0013] O grupo protetor hidróxi de maior preferência é 4,4’-
dimetoxitritila (DMT).
[0014] A expressão “grupo protetor amino” indica grupos destinados a proteger um grupo amino e inclui alcanoíla C1-6, benzoíla, benziloxicarbonila, carbobenzilóxi (CBZ ou Z), 9-fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), p-metoxibenziloxicarbonila, p-nitrobenziloxicarbonila, t-butoxicarbonila (BOC), trifluoroacetila e dimetilformamidina (dmf). Exemplos adicionais desses grupos são encontrados em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª Ed., John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, NY, 1991, capítulo 7; E. Haslam, Protective Groups in Organic Chemistry, J. G. W.
McOmie, Ed., Plenum Press, Nova Iorque, NY, 1973, capítulo 5; e T. W.
Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nova Iorque, NY, 1981.
[0015] Grupos protetores amino preferidos são selecionados a partir de alcanoíla C1-6, benzoíla (bz) ou dimetilformamidina (dmf).
[0016] A expressão “nucleobase” ou “nucleobase modificada” utilizada para R1 indica as cinco nucleobases adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T), uracil (U) e suas modificações.
[0017] O termo “sal”, no contexto dos derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I de acordo com a presente invenção, indica sal de uma base orgânica ou inorgânica.
[0018] Sais inorgânicos são tipicamente sais alcalinos ou alcalino- terrosos tais como sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio, preferencialmente sais de sódio ou potássio de uma base de hidróxido alcalino ou alcalino-terroso inorgânico ou de alcoolato alcalino ou alcalino-terroso orgânico.
[0019] Sais orgânicos são tipicamente sais de amônio de amina orgânica, tipicamente de amina alifática ou amina aromática, preferencialmente de amina terciária, preferencialmente trialquilamina C1-4 ou piridina, de maior preferência trietilamina ou piridina.
[0020] Sais orgânicos são preferidos sobre os sais inorgânicos.
[0021] Os derivados de LNA-ácido dicarboxílico da Fórmula I podem ocorrer na forma de qualquer mistura do ácido livre e do sal da base orgânica ou inorgânica.
[0022] Nucleobase modificada típica é 5-metil citosina (5-MeC).
[0023] Em realização preferida, R1 é uma adenina (A), citosina (C), 5-metil citosina (5-MeC), guanina (G) ou timina (T) opcionalmente modificada e/ou protegida por grupo amino, preferencialmente adenina (A) protegida por grupo amino, citosina (C) protegida por grupo amino, 5-metil citosina (5-MeC) protegida por grupo amino, guanina (G) ou timina (T) protegida por grupo amino.
[0024] Embora os grupos protetores amino típicos tenham sido definidos acima, o grupo protetor amino preferido para adenina (A), citosina (C) e 5-metil citosina (5-MeC) é benzoíla, para guanina (G) é isobutanoíla (isobutirila) ou dimetilformamidina (dmf).
[0025] Em realização preferida, os derivados de LNA-ácido dicarboxílico de acordo com a presente invenção possuem a fórmula I:
I ou sais de amônio de uma de suas aminas orgânicas; em que: - R1 é uma adenina (A), citosina (C), 5-metil citosina (5-MeC),
guanina (G) ou timina (T) opcionalmente modificada e/ou protegida por grupo amino, preferencialmente adenina protegida por grupo amino, citosina (C) protegida por grupo amino, 5-metil citosina (5-MeC) protegida por grupo amino, guanina (G) ou timina (T) protegida por grupo amino; - R2 é um grupo protetor hidróxi sensível a ácido selecionado a partir de um grupo tritila modificada por alcóxi; e - n é um número inteiro de 1 a 5.
[0026] Em realização preferida adicional, os derivados de LNA- ácido dicarboxílico de acordo com a presente invenção possuem a fórmula I ou sais de amônio de aminas terciárias selecionadas a partir de trialquilamina C 1-4, de maior preferência trietilamina ou piridina; em que: - R1 é adenina (A) protegida por benzoíla, citosina (C) protegida por benzoíla, 5-metil citosina (5-MeC) protegida por benzoíla, guanidina (G) ou timina (T) protegida por dimetilformamidina ou isobutanoíla; - R2 é 4,4’-dimetoxitritila (DMT); e - n é 1.
[0027] Os derivados de LNA-ácido dicarboxílico de acordo com a presente invenção de preferência superior possuem a fórmula I e são caracterizados pelas definições a seguir: - R1 = adenina (A) protegida por benzoíla; R2 = 4,4’- dimetoxitritila (DMT); n = 1; na forma de sal de trietilamônio ou piridínio; - R1 = citosina (C) protegida por benzoíla; R2 = 4,4’- dimetoxitritila (DMT); n = 1; na forma de sal de trietilamônio ou piridínio; - R1 = 5-metil citosina (5-MeC) protegida por benzoíla; R2 = 4,4’-dimetoxitritila (DMT); n = 1; na forma de sal de trietilamônio ou piridínio; - R1 = guanina (G) protegida por isobutanoíla; R2 = 4,4’- dimetoxitritila (DMT); n = 1; na forma de sal de trietilamônio ou piridínio; - R1 = guanina (G) protegida por dimetilformamidina; R2 =
4,4’-dimetoxitritila (DMT); n = 1; na forma de sal de trietilamônio ou piridínio; e - R1 = timina (T); R2 = 4,4’-dimetoxitritila (DMT); n = 1 na forma de sal de trietilamônio ou piridínio.
[0028] Os derivados de LNA-ácido dicarboxílico de acordo com a presente invenção preferidos conforme indicado acima podem ocorrer na forma de ácidos livres ou na forma dos sais de amônio descritos acima, ou também como qualquer mistura dos sais de amônio e do ácido livre.
[0029] O processo de preparação de derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I compreende a reação de um álcool LNA da fórmula II:
II em que R1 e R2 são conforme definido acima, com um anidrido de ácido dicarboxílico C2-6 para formar os derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I na presença de uma base e solvente orgânico.
[0030] Álcoois LNA da fórmula II são, via de regra, disponíveis comercialmente ou podem ser preparados de acordo com Wengel et al, Tetrahedron 54 (1998) 3607-3630.
[0031] De forma similar, os anidridos de ácido dicarboxílico C2-6 são compostos disponíveis comercialmente. Anidrido dicarboxílico C2-6 típico é anidrido succínico.
[0032] Normalmente, em etapa inicial, o material de partida é liberado de água residual sob condições azeotrópicas com solvente orgânico apropriado, tal como tolueno.
[0033] Bases apropriadas foram descritas acima, mas são preferencialmente utilizadas aminas orgânicas.
[0034] A base tipicamente aplicada é preferencialmente amina terciária, de maior preferência trialquilamina C1-4 ou piridina, de preferência ainda maior trietilamina ou piridina.
[0035] Solvente orgânico apropriado é hidrocarboneto halogenado, tal como diclorometano.
[0036] A reação é convenientemente realizada sob atmosfera de gases inertes sob temperatura de reação de 10 °C a 40 °C.
[0037] Ao término da reação, tipicamente após cerca de duas horas, o sal de amônio pode ser obtido por meio de um processo de extração, aplicando-se adequadamente o solvente utilizado para a reação.
[0038] Remoção do solvente das fases orgânicas combinadas e purificação adicional opcional por meio de cromatografia do sal de amônio correspondente dos derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I pode ser fornecida em rendimento de 94-99,9% e pureza por HPLC de 97-99,5% em área (excluindo tolueno residual).
[0039] Os derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I podem ser também obtidos na forma de ácido livre. Isso pode ser realizado por meio da conversão de sal dos derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I de acordo com a presente invenção com ácido clorídrico ou um ácido orgânico tal como ácido cítrico em solvente orgânico apropriado, tal como em diclorometano ou acetato de etila.
[0040] Em realização adicional da presente invenção, os derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I podem ser utilizados para preparação de um suporte sólido previamente carregado da fórmula III:
em que R1, R2 e n são conforme definido acima e SUPORTE SÓLIDO é um material de suporte sólido apropriado para a síntese de oligonucleotídeos.
[0041] Materiais de suporte sólido apropriados são bem descritos, por exemplo, em Guzev, A. P., Solid-phase supports for oligonucleotide synthesis, em: Current protocols in nucleic acid chemistry (John Wiley & Sons, Inc.) (2013), Capítulo 3, Unidade 3.1, págs. 3.1.1-3.1.60. Suportes sólidos comerciais típicos são o Suporte de Primer série 5G da GE Healthcare ou os suportes sólidos NittoPhase® HL da Nitto Denko.
[0042] As definições e preferências fornecidas acima para R1, R2 e n aplicam-se, de forma similar, ao suporte sólido previamente carregado da fórmula III.
[0043] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um suporte sólido previamente carregado da fórmula III: em que R1, R2, n e SUPORTE SÓLIDO são conforme definido acima.
As preferências fornecidas acima para R1, R2, n e SUPORTE SÓLIDO aplicam-se, de forma similar, ao suporte sólido previamente carregado da fórmula III.
[0044] Em ainda outra realização da presente invenção, o suporte sólido previamente carregado da fórmula III:
em que R1, R2, n e SUPORTE SÓLIDO são conforme definido acima e podem ser utilizados como material de partida para a síntese de oligonucleotídeos. As definições e preferências fornecidas acima para R1, R2, n e SUPORTE SÓLIDO aplicam-se, de forma similar, ao suporte sólido previamente carregado da fórmula III.
[0045] Os derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I podem ser ligados ao suporte sólido por meio de métodos conhecidos pelos técnicos no assunto e, por exemplo, conforme descrito na Patente Internacional Publicada n° 1992/006103.
[0046] Os princípios da síntese de oligonucleotídeos são bem conhecidos na técnica e bem descritos na literatura e fóruns públicos como a Wikipédia (vide, por exemplo, Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis, de 15 de março de 2016).
[0047] A síntese de oligonucleotídeos em escala maior é atualmente conduzida automaticamente, utilizando sintetizadores controlados por computador.
[0048] Via de regra, a síntese de oligonucleotídeos é síntese de fase sólida, em que o oligonucleotídeo reunido é ligado covalentemente, por meio do seu grupo hidróxi 3’-terminal, a um material de suporte sólido e permanece ligado ao longo de todo o processo de montagem de cadeia.
Suportes sólidos apropriados são descritos acima.
[0049] Preferencialmente, o oligonucleotídeo consiste de monômeros de nucleosídeos de LNA ou DNA opcionalmente modificados ou suas combinações e possui 10 a 25 nucleotídeos de comprimento.
[0050] Considerando que o suporte sólido previamente carregado da fórmula III compreende um nucleosídeo de LNA, o nucleosídeo 3’ terminal da cadeia de oligonucleotídeos produzida é sempre um nucleosídeo de LNA.
[0051] A síntese de oligonucleotídeos, em princípio, é adição escalonada de resíduos de nucleotídeos ao terminal 5’ da cadeia em crescimento até a montagem da sequência desejada.
[0052] Via de regra, cada adição é indicada como ciclo sintético e, em princípio, consiste das reações químicas: a1. desbloqueio do grupo hidroxila protegido sobre o suporte sólido previamente carregado da fórmula III; a2. acoplamento do primeiro nucleosídeo como fosforamidita ativada com o grupo hidroxila livre sobre o suporte sólido; a3. oxidação ou sulfurização do nucleosídeo ligado por P correspondente para formar o fosfotriéster (P=O) correspondente ou o fosforotioato (P=S) correspondente; a4. opcionalmente, cobertura de quaisquer grupos hidroxila não reagidos sobre o suporte sólido; a5. desbloqueio do grupo 5’ hidroxila do segundo nucleosídeo ligado ao suporte sólido; a6. acoplamento do terceiro nucleosídeo como fosforamidita ativada para formar o trímero ligado a P correspondente; a7. oxidação ou sulfurização do dinucleosídeo ligado por P correspondente para formar o fosfotriéster (P=O) correspondente ou o fosforotioato (P=S) correspondente; a8. opcionalmente, cobertura de quaisquer grupos 5’ hidroxila não reagidos; a9. repetição das etapas a5 a a8 anteriores até a montagem da sequência desejada; e a10. desproteção global para obter o oligonucleotídeo bruto que pode ser adicionalmente purificado por meio de métodos de purificação de oligonucleotídeos típicos, por exemplo, com cromatografia e/ou ultrafiltragem e/ou liofilização.
[0053] Os exemplos a seguir ilustrarão a presente invenção sem limitá-la.
[0054] Abreviações: EtOAc = acetato de etila MeCN = acetonitrila MeOH = metanol DCM = diclorometano DMAP = 4-dimetilaminopiridina TEA = trietilamina THF = tetra-hidrofuran TLC = cromatografia de camada fina rt = temperatura ambiente eq = equivalente.
[0055] Esquema de processo:
[0056] Procedimento geral: Um frasco com fundo abaulado foi carregado com nucleosídeo 2 (1 eq) e anidrido succínico (1,5 eq). Para remoção azeotrópica de água residual, a mistura foi suspensa em tolueno absoluto (20 ml por 1 g de 2) à temperatura ambiente. Os voláteis seguintes foram extraídos a vácuo. Este procedimento foi repetido uma vez, tolueno foi extraído em seguida para gerar um sólido, mas não resíduo totalmente seco. Todas as operações seguintes foram conduzidas sob atmosfera de argônio. Ao sólido formado acima, adicionou-se DCM absoluto (18 ml por 1 g de 2). TEA (3,0 eq ref. 2a, 5,0 eq ref. 2b) foi adicionado em uma parcela e a mistura foi agitada à temperatura ambiente, de forma a obter-se, após 30 minutos, uma mistura de reação transparente. A conversão foi determinada por meio de TLC ou LC-MS (vide o Exemplo 1, Tabela 1 para 1a.TEA e Exemplo 2, Tabela 2 para 1b.TEA).
[0057] Normalmente, as conversões foram completas após duas horas, mas, em todos os casos, as misturas foram adicionalmente agitadas por mais uma hora à temperatura ambiente. A mistura de reação foi despejada em seguida a uma solução tampão de fosfato de trietilamônio (15 ml de tampão por
1 g de 2). Preparação da solução tampão: mistura de 85% de H3PO4 aquoso (8,5 ml, 1 eq), TEA (26 ml, 1,5 eq) e água (465,5 ml). As camadas formadas foram separadas e a camada aquosa foi adicionalmente extraída com DCM (2x10 ml por 1 g de 2). As camadas orgânicas combinadas foram filtradas através de uma almofada de Na2SO4 anidro e concentradas a vácuo. O produto bruto, obtido na forma de espuma branca, foi adicionalmente purificado por meio de filtragem através de uma coluna de sílica (20 g de sílica por 1 g do produto bruto; eluente: EtOH em DCM de 2,5% a 10%, a mistura é adicionalmente suplementada com 3% vol de TEA). As frações alvo foram concentradas até secar, imediatamente suspensas em tolueno absoluto e coevaporadas a vácuo. A coevaporação foi repetida mais uma vez.
EXEMPLO 1
[0058] Preparação de 1a.TEA: 8,6 g de 2a foram convertidos em 1a.TEA conforme descrito no procedimento geral para gerar 11,3 g de 1a.TEA em rendimento de 96% e 99,1% em área de pureza de HPLC (excluindo 0,67 eq mol de tolueno residual) (coluna: Apollo C-18 (10 µm) (4,6 x 250 mm), 10,65 min; fase móvel: gradiente de 40% MeCN + 60% de H3PO4 aquoso a 0,1%; velocidade de fluxo de 1,0 ml/min; temperatura de coluna: 40 °C; detecção: 210 nm, 254 nm; concentração de amostra: 1 mg/ml em MeCN; volume de injeção: 0,002 ml).
[0059] LC-MS ESI (m/z): 671,2 [M-H].
[0060] NMR 1H (D4-MeOH, 400 MHz): δ 7,77-7,73 (m, 1H), 7,50- 7,43 (m, 2H), 7,38-7,28 (m, 6H), 7,26-7,21 (m, 1H), 6,91-6,85 (m, 4H), 5,62 (s, 1H), 5,21 (s, 1H), 4,56 (s, 1H), 3,89-3,79 (m, 2H), 3,78 (s, 6H), 3,57 (d, J=11,2 Hz, 1H), 3,47 (d, J=11,2 Hz, 1H), 2,94 (q, J=7,3 Hz, 6H), 2,64-2,46 (m, 2H), 2,46-2,36 (m, 2H), 1,61 (d, J=1,2 Hz, 3H), 1,29 (t, J=7,3 Hz, 9H). TABELA 1 Método Adsorvente Eluente Tempo de retenção Detecção
Método Adsorvente Eluente Tempo de retenção Detecção Sílica gel Merck aquecimento com DCM/MeOH 9:1 incl. Rf = 0,55 (2a) TLC Placas de TLC UV 254 nm até uma gota de TEA Rf = 0,25 (1a.TEA) UV254 mancha amarela MeCN em HCO2H UV 244 nm Acquity UPLC BEH Rt = 3,62 min LC-MS aquoso a 0,1% de 5% ESI-: 1a.TEA [M- C18 (1a.TEA) a 100% H]=671,2 m/z EXEMPLO 2
[0061] Preparação de 1b.TEA: 8,9 g de 2b foram convertidos em 1b.TEA conforme descrito no procedimento geral para gerar 11,0 g de 1b.TEA em rendimento de 94% e 97,2% em área de pureza de HPLC (excluindo 0,75 eq mol de tolueno residual) (coluna: Apollo C-18 (10 µm) (4,6 x 250 mm), 9.18 min; fase móvel: gradiente de 40% MeCN + 60% de H3PO4 aquoso a 0,1%; velocidade de fluxo de 1,0 ml/min; temperatura de coluna: 40 °C; detecção: 210 nm, 254 nm; concentração de amostra: 1 mg/ml em MeCN; volume de injeção: 0,002 ml).
LC-MS ESI (m/z): 753,3 [M+H]+.
[0062] NMR 1H (D4-MeOH, 400 MHz): δ 8,70 (s, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,44-7,39 (m, 2H), 7,32-7,15 (m, 7H), 6,87-6,81 (m, 4H), 6,00 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,01-3,89 (m, 2H), 3,76 (s, 6H), 3,53-3,74 (m, 2H), 3,15 (q, J=7,3Hz, 6H), 3,09 (s, 3H), 3,07 (s, 3H), 2,63-2,46 (m, 2H), 2,45-2,33 (m, 2H), 1,26 (t, J=7,3Hz, 9H).
TABELA 2 Tempo de Método Adsorvente Eluente Detecção retenção Sílica gel Merck aquecimento a UV DCM/MeOH 9:1 incl. Rf = 0,55 (2b) TLC Placas de TLC 254 nm até mancha uma gota de TEA Rf = 0,25 (1b.TEA) UV254 amarela UV 303 nm MeCN em HCO2H ESI+: 1b.TEA Acquity UPLC Rt = 3,40 min LC-MS aquoso a 0,1% de [M+H]=753,3 m/z BEH C18 (1b.TEA) 5% a 100% ESI-: 1b.TEA [M- H]=751,3 m/z EXEMPLO 3
[0063] Preparação de 1c.TEA: 10 g de 2c foram convertidos em 1c.TEA conforme descrito no procedimento geral para gerar 13,6 g de 1c.TEA em rendimento de 98% e 98,6% em área de pureza de HPLC (excluindo 1,20 eq mol de tolueno residual) (coluna: Apollo C-18 (10 µm) (4,6 x 250 mm), 11,00 min; fase móvel: gradiente de 40% MeCN + 60% de H3PO4 aquoso a 0,1%; velocidade de fluxo de 1,0 ml/min; temperatura de coluna: 40 °C; detecção: 210 nm, 254 nm; concentração de amostra: 1 mg/ml em MeCN; volume de injeção: 0,002 ml).
[0064] LC-MS ESI (m/z): 768,5 [M-TEA+H]+.
[0065] NMR 1H (D4-MeOH, 400 MHz): δ 8,11 (s, 1H), 7,46–7,40 (m, 2H), 7,34–7,26 (m, 4H), 7,25–7,06 (m, 5H), 6,90–6,82 (m, 4H), 5,99 (s, 1H), 5,35 (s, 1H), 4,85 (s, 1H), 3,96 (q, J=8,3 Hz, 2H), 3,76 (s, 6H), 3,56–3,47 (m, 2H), 3,16 (q, J=7,3 Hz, 6H), 2,71 (hept, J=6,8 Hz, 1H), 2,61–2,38 (m, 4H), 1,27 (t, J=7,3 Hz, 9H), 1,21 (d, J=6,9 Hz, 6H).
EXEMPLO 4
[0066] Preparação de 1d.TEA: 10 g de 2d foram convertidos em 1d.TEA conforme descrito no procedimento geral para gerar 14,0 g de 1d.TEA em rendimento >99% e 99% em área de pureza de HPLC (excluindo 0,50 eq mol de tolueno residual) (coluna: Apollo C-18 (10 µm) (4,6 x 250 mm), 12,89 min; fase móvel: gradiente de 40% MeCN + 60% de H3PO4 aquoso a 0,1%; velocidade de fluxo de 1,0 ml/min; temperatura de coluna: 40 °C; detecção: 210 nm, 254 nm; concentração de amostra: 1 mg/ml em MeCN; volume de injeção: 0,002 ml).
[0067] LC-MS ESI (m/z): 775,5 [M-TEA+H]+.
[0068] NMR 1H (D4-MeOH, 400 MHz): δ 8,22 (s, 1H), 8,19 (s, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,59–7,52 (m, 1H), 7,51–7,42 (m, 4H), 7,40–7,32 (m, 4H), 7,28– 7,09 (m, 5H), 6,95–6,84 (m, 4H), 5,69 (s, 1H), 5,23 (s, 1H), 4,64 (s, 1H), 3,87 (dd, J=15,6 Hz, J=8,2 Hz, 2H), 3,79 (s, 6H), 3,55 (dd, J=34,1 Hz, J = 11,3 Hz, 2H), 3,13 (q, J = 7,3 Hz, 6H), 2,67–2,37 (m, 4H),1,83 (s, 3H), 1,27 (t, J=7,3 Hz, 9H).
EXEMPLO 5
[0069] Preparação de 1e.TEA: 10 g de 2c foram convertidos em 1c.TEA conforme descrito no procedimento geral para gerar 14,2 g de 1c.TEA em rendimento > 99% e 99,2% em área de pureza de HPLC (excluindo 1,00 eq mol de tolueno residual) (coluna: Apollo C-18 (10 µm) (4,6 x 250 mm), 5,17 min; fase móvel: gradiente de 40% MeCN + 60% de H3PO4 aquoso a 0,1%; velocidade de fluxo de 1,0 ml/min; temperatura de coluna: 40 °C; detecção: 210 nm, 254 nm; concentração de amostra: 1 mg/ml em MeCN; volume de injeção: 0,002 ml).
[0070] LC-MS ESI (m/z): 786,5 [M-TEA+H]+.
[0071] NMR 1H (D4-MeOH, 400 MHz): δ 8,73 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 8,11–8,05 (m, 2H), 7,68–7,61 (m, 1H), 7,59–7,52 (m, 2H), 7,47–7,42 (m, 2H, Ar H), 7,37–7,26 (m, 5H), 7,25–7,07 (m, 3H, Ar H), 6,91–6,82 (m, 4H), 6,24 (s, 1H), 5,44 (s, 1H), 4,93 (s,1H), 4,02 (dd, 2H, J=16,5 Hz, J=8,3 Hz), 3,77 (s, 6H), 3,57 (br, 2H), 3,12 (q, J=7,3 Hz, 6H), 2,65–2,35 (m, 4H), 1,25 (t, J=7,3 Hz, 9H).
EXEMPLO 6
[0072] Preparação de 1e.TEA e 1e (forma ácida): Composto 2e (6,71 g, 9,80 mmol) foi dissolvido em THF seco (70 ml) e concentrado a vácuo a 35 °C. O sólido foi adicionalmente seco a vácuo em seguida por quatro horas à temperatura ambiente e dissolvido em EtOAc seco (50 ml) e TEA (1,60 ml, 11,7 mmol), DMAP (0,30 g, 2,4 mmol) e anidrido succínico (1,37 g, 13,7 mmol) foram sequencialmente adicionados à solução de nucleosídeos. A mistura de reação foi aquecida em seguida a 50 ºC por 16 horas. A mistura de reação foi diluída com EtOAc (100 m) e hexano (5 ml) e extraída com solução de ácido cítrico a 10% (3 x 50 ml). A fase orgânica foi extraída com solução de NaHCO3 a 5% (4 x 50 ml), diluída com EtOAc (150 ml) e adicionalmente extraída com solução de ácido cítrico a 10% (2 x 75 ml) e água (2 x 75 ml). As frações de água e ácido cítrico combinadas foram extraídas de volta com EtOAc (2 x 50 ml). As fases orgânicas combinadas foram secas (Na2SO4) e concentradas sob pressão reduzida para obter o succinato 1e (forma ácida) na forma de espuma branca.
[0073] NMR 1H (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,27 (br s, 1 H), 11,28 (s, 1 H), 8,79 (s, 1 H), 8,51 (s, 1 H), 8,06 (br d, J=7,5 Hz, 2 H), 7,64 -7,70 (m, 1 H), 7,53 - 7,61 (m, 2 H), 7,39 (br d, J=7,6 Hz, 2 H), 7,32 (br t, J=7,7 Hz, 2 H), 7,23 - 7,28 (m, 4 H), 7,24 (br s, 1 H), 6,90 (br d, J=8,6 Hz, 4 H), 6,23 (s, 1 H), 5,58 (s, 1 H), 4,93 (s, 1 H), 4,02 - 4,07 (m, 2 H), 3,89 (br d, J=8,5 Hz, 1 H), 3,74 (s, 6 H), 3,53 (br d, J=11,2 Hz, 1 H), 3,41 (br d, J=11,2 Hz, 1 H), 2,40 - 2,45 (m, 2 H).
[0074] O sólido foi novamente dissolvido em MeCN (70 ml) e adicionou-se TEA (6,8 ml, 49 mmol). Após agitação por 10 minutos, a mistura foi concentrada a vácuo a 35 °C por 10 minutos e o restante foi seco a vácuo à temperatura ambiente por uma noite para obter sal de 1e.TEA (7,45 g de succinato x 0,6 TEA, rendimento de 90%, pureza de HPLC >98%).
[0075] Os dados analíticos para 1e.TEA foram de acordo com os relatados no Exemplo 5.
Claims (17)
1. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO da fórmula I:
I ou seus sais, caracterizado por: - R1 é uma nucleobase ou nucleobase modificada; - R2 é um grupo protetor hidróxi; e - n é um número inteiro de 1 a 5.
2. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1 ser uma adenina (A), citosina (C), guanina (G) ou timina (T) protegida por grupo amino e/ou opcionalmente modificada.
3. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por R1 ser adenina (A) protegida por grupo amino, citosina (C) protegida por grupo amina, 5-metil citosina (5-MeC) protegida por grupo amino, guanina (G) protegida por grupo amina ou timina.
4. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo grupo protetor amino ser selecionado a partir de alcanoíla C1-6, benzoíla (bz) ou dimetilformamidina (dmf).
5. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por R2 ser um grupo protetor hidroxila sensível a ácido selecionado a partir de um grupo tritila modificado por alcóxi, preferencialmente 4,4’-dimetoxitritila.
6. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por n ser 1.
7. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por, na forma de sal de uma base orgânica ou inorgânica.
8. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por, na forma de sal de amônio de uma amina orgânica.
9. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por, na forma de sal de amônio de amina terciária, preferencialmente trialquilamina C1-4 ou piridina, de maior preferência trietilamina ou piridina.
10. DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado por, na forma de qualquer mistura do ácido livre e do sal da base orgânica ou inorgânica.
11. PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO da fórmula I, caracterizado por compreender a reação de um álcool LNA da fórmula II:
II em que R1 e R2 são conforme definido acima, com um anidrido de ácido dicarboxílico C2-6, na presença de base e um solvente orgânico, para formar os derivados de LNA-ácido dicarboxílico da fórmula I.
12. PROCESSO de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo anidrido de ácido dicarboxílico C2-6 ser anidrido succínico.
13. PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 12, caracterizado pela base ser amina orgânica, preferencialmente amina terciária, de maior preferência trialquilamina C1-4 ou piridina e, de preferência ainda maior, trietilamina ou piridina.
14. PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo solvente orgânico ser hidrocarboneto halogenado.
15. USO DOS DERIVADOS DE LNA-ÁCIDO DICARBOXÍLICO da fórmula I conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 10 caracterizado pela preparação de um suporte sólido previamente carregado da fórmula III: em que R1, R2 e n são conforme definido acima e SUPORTE SÓLIDO é um material de suporte sólido apropriado para a síntese de oligonucleotídeos.
16. SUPORTE SÓLIDO previamente carregado da fórmula III:
caracterizado por R1, R2 e n serem conforme definido acima e SUPORTE SÓLIDO é um material de suporte sólido apropriado para a síntese de oligonucleotídeos.
17. USO DO SUPORTE SÓLIDO previamente carregado da fórmula III: caracterizado por R1, R2 e n serem conforme definido acima e SUPORTE SÓLIDO é um material de suporte sólido apropriado para a síntese de oligonucleotídeos, como material de partida na síntese de oligonucleotídeos.
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