KR101221186B1 - 올리고머 합성용 중합체성 비드 - Google Patents

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라주 케이. 쿠마르
켄지로우 모리
타츠야 코니시
아야코 마츠나와
타케오 마츠무라
치에코 키타우라
강 자오
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닛토덴코 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 올리고머 합성에서 사용하기 위한 고체 지지체 매체, 매체의 제조 방법, 및 매체의 사용 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 (a) 올레핀 단량체, 가교제, 관능화 시약 및 개시제를 포함하는 유기상을 제공하는 단계; 및 (b) 유기상을 중합체성 비드를 형성시키는데 효과적인 시간 및 온도 조건 하에 수성상과 접촉시키는 단계를 포함한다.
올리고머 합성, 올리고뉴클레오티드 합성, 고체 지지체, 중합체성 비드

Description

올리고머 합성용 중합체성 비드{POLYMERIC BEADS FOR OLIGOMER SYNTHESIS}
본 발명은 올리고머 합성에서 사용하기 위한 고체 지지체 매체, 매체의 제조 방법, 및 매체의 사용 방법에 관한 것이다.
고체 상태 합성은 광범위한 중합체성 화합물 예컨대 핵염기-함유 중합체 (예를 들어 올리고뉴클레오티드 및 이의 유사체), 아미노산 함유 중합체 (예를 들어 단백질, 펩티드, 및 이의 유사체)의 제조에 적용가능하다. 고체 상태 합성은 조합 방법에 의한 화합물의 제조에 또한 적용가능하다.
올리고뉴클레오티드는 다양한 생물학적 및 생화학적 용도에서 사용되어 왔다. 이는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)용 프라이머 및 프로브로서, 표적 확인, 약물 발견 및 개발에서 사용되는 안티센스(antisense) 작용제로서, 리보자임으로서, 앱타머(aptamer)로서, 및 면역계의 일반적인 자극제로서 사용되어 왔다. 올리고뉴클레오티드의 인기가 증가함에 따라, 더 큰 크기의 뱃치(batch), 및 더 많은 수의 소형 뱃치에 대한 요구가 점차 증가되었다. 추가적으로, 올리고뉴클레오티드 합성 비용을 감소시키는 것, 및 올리고뉴클레오티드 생성물의 순도를 개선시키고 수율을 증가시키는 것에 대한 강조가 증가되었다.
다수의 혁신이 올리고뉴클레오티드 합성 분야에 도입되었다. 이러한 혁신 중에서, 우수한 직교성 보호기, 활성화제, 시약 및 합성 조건이 개발되었다. 올리고뉴클레오티드 자체가 다양하게 변형 및 개선되었다. 이러한 것들 중에는, 특정 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화력을 개선시키는 화학, 생체내 올리고뉴클레오티드의 안정성을 증가시키는 화학, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 (PK) 및 독성학적 (Tox) 성질을 증강시키는 화학 등이 있다. 이러한 신규 화학에는 올리고뉴클레오티드의 1개 이상의 구성성분 부분의 화학적 변형이 일반적으로 수반된다.
따라서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 천연-발생 올리고뉴클레오티드, 뿐만 아니라 변형 올리고뉴클레오티드가 포함되는 화합물의 부류를 포함한다. 천연-발생 올리고뉴클레오티드 및 변형 올리고뉴클레오티드 모두 다양한 환경에 유용한 것으로 증명되었고, 채택된 특정 변형을 설명하기 위해 이루어진 적절한 변형과 함께 유사한 공정에 의해 모두 제조될 수 있다. 천연 발생 올리고뉴클레오티드, 즉, 짧은 가닥의 DNA 또는 RNA는 하기에 각각 올리고-RNA 및 올리고-DNA로 명명된 하기 화학식의 구성원인 것으로 구현될 수 있다:
Figure 112007024999891-pct00001
[식중, m은 1 내지 약 100의 정수이고, Bx는 천연 발생 핵염기이다].
포스페이트가 중성 pH에서 쉽게 해리되기 때문에, 생리적인 pH에서, 올리고뉴클레오티드는 음이온으로 발생하고, 일반적으로 올리고뉴클레오티드는 염으로서 무정형 또는 결정질의 고체 상으로 발생할 것이다. 따라서, 달리 변형되지 않는 한, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 상기의 각각의 음이온성, 염 및 유리 산 형태를 포함한다.
본질적으로, 천연 발생 올리고뉴클레오티드는 하기 뉴클레오티드로 표시되는 단량체성 서브유닛 m개의 올리고머인 것으로 생각될 수 있다:
Figure 112007024999891-pct00002
[식중, 각각의 Bx는 핵염기이고, 마지막 잔기는 뉴클레오시드 (즉, 3'-포스페이트 기가 없는 뉴클레오티드)이다].
상기 언급된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 친화력, 안정성, PK, Tox, 및 기타 성질을 개선시키기 위해, 다양한 화학 변형이 올리고뉴클레오티드에 이루어졌다. 일반적으로, 용어 올리고뉴클레오티드는, 현재 당업계에서 사용되는 바와 같이, 하기 화학식의 화합물을 특히 포함한다:
Figure 112007024999891-pct00003
[식중, m은 1 내지 약 100의 정수이고, 각각의 G1은 O 또는 S이고, 각각의 G2는 OH 또는 SH이고, 각각의 G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고, 각각의 G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, -CH=CH- 등과 같은 2가 모이어티(moiety)이고, 각각의 R2'은 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고, 각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고, 각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고, 각각의 q는 0 또는 1이고, 각각의 R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고, 각각의 G6는 O, S, CH2 또는 NH이고, 각각의 G7은 H, PO3H2, 또는 공액 기이고, 각각의 Bx는 본원에 기술된 바와 같은 (즉 천연 발생 또는 변형) 핵염기이다].
올리고뉴클레오티드의 표준 합성 방법에는 [Caruthers et al.]에 의해 최초로 기술된 고체 상 방법이 포함된다 (예를 들어, 참조문헌으로 본원에 포함된 미국 특허 5,750,666, 특히 올리고뉴클레오티드, 특히 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 제조의 출발 재료 및 일반적인 방법이 개시되어 있고 참조문헌으로 본원에 명확하게 포함되는 부분인 컬럼 3-58 참조). 이러한 방법은 추후에 [Koester et al.]에 의해 개선되었다 (예를 들어, 참조문헌으로 본원에 포함된 미국 특허 RE34,069, 특히 개시되어 있고 참조문헌으로 본원에 특히 포함되는 부분인 컬럼 참조). 이러한 방법은 하기에 더욱 상세하게 논의된 바와 같이 다양한 발명가들에 의해 더욱 개선되었다. 특히 RNA 합성 방법이 각각 참조문헌으로 전체적으로 본원에 포함된 미국 특허 6,111,086, 6,008,400, 및 5,889,136에 개시되어 있다. 참조문헌으로 본원에 명백하게 포함되는 미국 특허 6,008,400의 컬럼 7-20이 특히 관련된다.
[Koester et al.]의 방법에 의해 올리고뉴클레오를 제작하기 위한 일반적인 공정이 하기에 기술될 것이다.
먼저, 적절한 뉴클레오시드를 고체 지지체 매체 (SS)에 링커를 통해 공유결합으로 연결시킴으로써 합성 지지체를 제조한다. 이같은 합성 지지체는 하기와 같다:
Figure 112007024999891-pct00004
[식중, SS는 고체 지지체 매체이고, LL은 G3를 통해 뉴클레오시드를 지지체에 연결시키는 연결 기이다]. 일반적으로 연결 기는 합성 동안 최종 3'-뉴클레오시드 (및 따라서 발생기의 올리고뉴클레오티드)를 고체 지지체 매체에 공유 결합시키지만, 5'-보호기 및 적용가능하다면 임의의 2'-보호기가 제거되는 조건에 직교인 조건 하에 절단되는 2관능성 기이다. T'은 제거가능한 보호기이고, 나머지 변수는 앞서 정의되었으며, 하기에 더욱 상세하게 기술된다. 적절한 합성 지지체는 Amersham Biosciences로부터 상표명 Primer Support 200™으로 수득될 수 있다. 그 후 합성 지지체가 부착된 고체 지지체 매체를 적절한 용매, 예를 들어 아세토니트릴에서 팽윤시키키고, 적절한 고체 상 합성 기구, 예컨대 Amersham Biosciences로부터 입수가능한 합성기 중 하나, 예컨대 AKTAoligopilot™, 또는 OligoProcess™ 상표 DNA/RNA 합성기의 컬럼 내로 도입할 수 있다.
상기 방법에서, 합성은 올리고머의 3'-말단에서 5'-말단으로 수행된다. 각각의 사이클에서, 하기의 단계들이 수행된다: (1) T'의 제거, (2) 커플링 (coupling), (3) 산화, (4) 캡핑(capping). 각각의 단계 (1)-(4)에 1회 이상의 세척 단계가 이어질 수 있고, 일반적으로 이어지며, 이로써 가용성 재료를 컬럼으로부터 세척하기 위해, 또는 시약 및/또는 활성화제를 컬럼을 통과하여 밀어내기 위해, 또는 양쪽 모두를 위해 세정 용매가 컬럼 내로 도입된다. 단계 (1)-(4)가 하기에 묘사된다:
Figure 112007024999891-pct00005
일반적으로, T'은 합성 말기에 고체 지지체 매체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하는데 사용된 것들, 뿐만 아니라 합성 동안 사용된 다른 보호기를 제거하는데 사용된 것들에 직교인 조건 하에 제거될 수 있도록 선택된다. 올리고뉴클레오티드 합성에 대해 당업계에서 인정된 보호기는 DMT (4,4'-디메톡시트리틸)이다. DMT 기는 약한 산 조건 하에 제거가능하기 때문에 특히 유용하다. 따라서, 허용가능한 제거 시약은 적절한 용매, 예컨대 아세토니트릴 내의 3％ DCA이다. 사용되는 경우, 세척 용매는 편리하게 아세토니트릴일 수 있다.
전형적으로 지지체는 제어 세공 유리 또는 중합체성 비드 지지체이다. 일부 중합체성 지지체가 하기 특허에 개시되어 있다: 각각 참조문헌으로 본원에 명확하 게 포함된, 미국 특허 6,016,895; 미국 특허 6,043,353; 미국 특허 5,391,667 및 미국 특허 6,300,486.
보호기 T'의 제거 후, 합성 사이클의 다음 단계는 다음 뉴클레오시드 합성단위체(synthon)의 커플링이다. 이는 지지체에 결합된 탈보호된 뉴클레오시드를, 하기에 제시된 바와 같이, 활성화제의 존재 하에 뉴클레오시드 포스포르아미디트와 반응시킴으로써 달성된다:
Figure 112007024999891-pct00006
아미디트는 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00007
[식중, pg는 인 보호기, 예컨대 시아노에틸 기이고, NRN1RN2는 아민 이탈기, 예컨대 디이소프로필 아미노이다]. 아미디트의 제작에 관한 정보에 대해서는 [Koester et al., 상기 문헌] 참조. 전형적으로 사용되는 활성화제로는, 예를 들어, 테트라졸, 디시아노 이미다졸, 또는 피리디늄 염이 포함된다. 기타 적절한 아미디트, 및 아미디트의 제작 방법은 하기 특허에 기재되어 있다: 특히 아미디트의 제작에 특히 관련되어 있기 때문에, 각각 참조문헌으로 본원에 명확하게 포함된, 미국 특허 6,133,438; 미국 특허 5,646,265; 미국 특허 6,124,450; 미국 특허 5,847,106; 미국 특허 6,001,982; 미국 특허 5,705,621; 미국 특허 5,955,600; 미국 특허 6,160,152; 미국 특허 6,335,439; 미국 특허 6,274,725; 미국 특허 6,329,519. 적절한 활성화제는 [Caruther et al.]의 특허 및 [Koester et al.]의 특허에 기재되어 있다. 특히 적절한 활성화제는 하기 특허에 기재되어 있다: 각각 참조문헌으로 본원에 명백하게 포함된, 미국 특허 6,031,092 및 미국 특허 6,476,216.
합성 사이클의 다음 단계는 산화이고, 이는 P(III) 종이 적절한 산화제로 P(V) 산화 단계로 산화되는 것을 가리킨다:
Figure 112007024999891-pct00008
[식중, G1은 O 또는 S이다].
산화제는 G1의 도입에 적절한 산화 작용제이다. G1이 산소인 경우, 적절한 산화제는 상기의 [Caruthers et al.]의 특허에 기재되어 있다. G2가 황인 경우, 산화제는 티아화(thiation) 작용제 또는 황-전달 시약으로 또한 지칭될 수 있다. 적절한 티아화 작용제로는 소위 보케이지(Beaucage) 시약, 3H-1,2-벤조티올, 페닐아세틸 디술피드 (PADS로 또한 지칭됨; 예를 들어 각각 참조문헌으로 본원에 포함된 미국 특허 6,114,519 및 6,242,591 참조) 및 티오우람 디술피드 (예를 들어, 미국 특허 5,166,387에 개시된 N,N,N',N'-테트라메틸티오우람 디술피드)가 포함된다. 세척은 적절한 용매, 예컨대 아세토니트릴일 수 있다.
산화 단계에 캡핑 단계가 이어지고, 이는 본원에 도해되지는 않았지만 합성에 중요한 단계인데, 단계 1에서 커플링 단계가 진행되지 않은 유리 5'-OH 기가 후 속 합성 사이클에서 커플링되는 것이 차단되도록 하기 때문이다. 적절한 캡핑 시약은 [Caruthers et al.]의 특허, [Koester et al.]의 특허, 및 본원에 기술된 기타 특허에 기재되어 있다. 적절한 캡핑 시약에는 무수 아세트산 및 N-메틸이미다졸의 배합물이 포함된다.
합성 사이클 단계 (1)-(4)를 (원한다면) n-1회 반복하여 지지체-결합 올리고뉴클레오티드를 생산한다:
Figure 112007024999891-pct00009
[식중, 각각의 변수는 본원에 정의된 바와 같다].
일반적으로, 보호기 pg는 상기의 [Caruthers et al.] 또는 [Koester et al.]에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제거될 수 있다. pg가 시아노에틸 기인 경우, [Koester et al.]의 방법, 예를 들어 염기성 용액과의 반응이 인 보호기의 제거에 일반적으로 적절하다. 일부 경우에는, N1-시아노에틸 티미딘 기와 같은 부가물의 형성을 피하는 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 참조문헌으로 본원에 명백하게 포함된 미국 특허 6,465,628에 교시된 바와 같은 트리에틸아민 (TEA)과 같은 3차 아민 시약을 포함하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 핵염기가 보호되는 경우, 이 는 염기성 조건 하에 탈보호된다. 탈보호된 올리고뉴클레오티드가 지지체로부터 절단되어 하기의 5'-보호 올리고뉴클레오티드가 제공되고:
Figure 112007024999891-pct00010
그 후, 이를 역상 액체 크로마토그래피에 의해 정제하고, 아세트산에서 5'-말단을 탈보호시키고, 탈염시키고, 동결건조시키거나 다른 방식으로 건조시키고, 필요할 때까지 불활성 대기에서 보관할 수 있다. 임의로, G3H 기를 공액 기로 유도체화시킬 수 있다. 생성된 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식을 갖는 것으로 가시화될 수 있다:
Figure 112007024999891-pct00011
고체 상 지지체 매체 상에서의 합성이 공지되어 있지만, 특히 로딩 (고체 지지체 매체 1 g 당 고체 지지체 매체에 결합된 첫번째 뉴클레오시드의 mmol, 또는 간단히 mmol/g로 표시됨), 다양한 합성 사이클 동안의 일관된 팽윤성, 및 합성 동안 생산된 전장 올리고머의 품질과 관련하여, 성질이 개선된 고체 지지체 매체가 요구된다. 추가적으로, 지지체는 제작하기 쉬워야 한다. 본 발명은 이러한 것들, 뿐만 아니라 또다른 중요한 목적에 관한 것이다.
발명의 개요
일부 실시양태에서, 본 발명은 유기상을 제공하는 단계 및 중합체성 비드를 형성시키는데 효과적인 시간, 온도 및 압력 조건 하에 상기 유기상을 수성상과 접촉시키는 단계를 포함하는 중합체성 비드의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 유기상은 단량체, 개시제 및 유기 용매(들)을 포함하고, 수성상은 물 및 분산 시약을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단량체는 올레핀 단량체, 가교 단량체 및 관능화 단량체를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 유기 용매(들)은 1종 이상의 액체 탄화수소; 및/또는 탄소수 5 내지 12의 알콜을 포함한다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 올레핀 단량체는 1종 이상의 아릴-비닐 화합물을 포함하고, 바람직하게는 스티렌 및/또는 에틸스티렌을 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기를 갖는, 바람직하게는 2개의 비-공액 비닐 기가 5 또는 6원의 방향족 고리인 방향족 모이어티에 부착된 올레핀계 가교 단량체이고, 가장 바람직하게는 디비닐벤젠이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 관능화 단량체는 탈보호될 때 산 또는 산 무수물과 반응하여 에스테르 또는 아미드를 형성할 수 있는 관능기가 산출되는 보호된 관능 기를 갖는 올레핀계 단량체, 또는 보호된 히드록실기를 갖는 올레핀계 단량체이고, 바람직하게는 아세톡시스티렌이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 개시제는 안정화된 과산화물 또는 아조 화합물이고, 가장 바람직하게는 벤조일퍼옥시드이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 유기 용매는 1종 이상의 액체 알칸, 벤젠, 톨루엔, 자일렌 및/또는 탄소수 5 내지 12의 알콜이고, 바람직하게는 유기 용매는 1종 이상의 옥탄, 가장 바람직하게는 이소옥탄, 및/또는 2-에틸헥사놀을 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 분산 시약은 폴리알콜, 바람직하게는 폴리비닐알콜을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 다양한 성분들이 하기의 양으로 존재한다: 초기에 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율은 약 60％ 내지 약 96％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율은 약 3％ 내지 9.9％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율은 약 1％ 내지 약 20％이고; 초기에 유기상에 존재하는 단량체의 중량 백분율은 약 33％ 내지 약 67％이고; 초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율은 약 33％ 내지 약 67％이고; 유기 용매 중에 존재하는 액체 탄화수소의 중량 백분율은 약 0％ 내지 약 80％이고; 초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수가 5 내지 12인 알콜의 중량 백분율은 약 20％ 내지 약 100％이고; 초기에 수성상에 존재하는 분산 시약의 중량 백분율은 약 0.01％ 내지 약 20％이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 다양한 성분들이 하기의 양으로 존재한다: 초기에 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율은 약 75％ 내지 약 94％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율은 약 4％ 내지 9.9％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율은 약 2％ 내지 약 10％이고; 초기에 유기상에 존재하는 단량체의 중량 백분율은 약 35％ 내지 약 60％이고; 초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율은 약 40％ 내지 약 65％이고; 유기 용매 중에 존재하는 탄화수소의 중량 백분율은 약 5％ 내지 약 70％이고; 초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수가 5 내지 12인 알콜의 중량 백분율은 약 30％ 내지 약 95％이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 다양한 성분들이 하기의 양으로 존재한다: 초기에 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율은 약 82％ 내지 약 91.5％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율은 약 5.5％ 내지 9.9％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율은 약 3％ 내지 약 8％이고; 초기에 유기상에 존재하는 단량체의 중량 백분율은 약 40％ 내지 약 50％이고; 초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율은 약 50％ 내지 약 60％이고; 유기 용매 중에 존재하는 액체 탄화수소의 중량 백분율은 약 10％ 내지 약 60％이고; 초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수가 5 내지 12인 알콜의 중량 백분율은 약 40％ 내지 약 90％이다.
본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, 상기 유기상을 상기 수성상과 접촉시키는 단계는 약 25℃ 내지 약 95℃, 더욱 바람직하게는 약 70℃ 내지 약 85℃, 가장 바람직하게는 약 75℃ 내지 약 80℃의 온도에서 일어난다.
본 발명은 가교 단량체를 포함하는 다수의 단량체로부터 제조된 폴리스티렌 지지체를 사용하는 것을 포함하는, 소정의 서열의 폴리뉴클레오티드의 합성 방법으로, 상기 다수의 단량체 중에 초기에 존재하는 가교 단량체가 약 3 중량％ 내지 9.9 중량％인 방법을 또한 제공한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 다수의 단량체 중에 초기에 존재하는 가교 단량체는 약 5.5％ 내지 9.9％이고, 가장 바람직하게는 약 7％이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 가교 단량체는 디비닐벤젠이다.
본 발명은 임의의 본원에 기술된 방법에 의해 형성된 중합체성 비드를 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 비드의 로딩 용량은 비드 1g 당 약 100 μ㏖ 내지 비드 1g 당 약 350 μ㏖이다. 일부 실시양태에서, 비드의 평균 입자 크기는 약 5 내지 약 500 ㎛, 바람직하게는 약 10 내지 약 300 ㎛, 가장 바람직하게는 약 30 내지 약 150 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드의 평균 세공 크기는 약 5 내지 약 500 nm, 바람직하게는 약 10 내지 약 100 nm, 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 100 nm이다. 일부 실시양태에서, 비드의 비표면적은 약 5 내지 약 200 ㎡/g, 바람직하게는 약 10 내지 약 100 ㎡/g 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 70㎡/g이다.
본 발명은 하기 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을 제공한다:
Figure 112007024999891-pct00012
[식중:
G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
G6는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
각각의 R2'는 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
q는 0 또는 1이고;
R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
Bx는 핵염기이고;
T'는 H 또는 제거가능한 보호기이고;
LL은 연결 모이어티이고;
SS는 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 비드이다];
Figure 112007024999891-pct00013
[식중:
m은 0 내지 약 100의 정수이고;
각각의 G1은 O 또는 S이고;
각각의 G2는 OH 또는 SH이고;
각각의 G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
각각의 G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
각각의 R2'은 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 q는 0 또는 1이고;
각각의 R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 G6는 독립적으로 O, S, CH2 또는 NH이고;
각각의 Bx는 핵염기이고;
pg는 제거가능한 인 보호기이고;
T'는 제거가능한 보호기이고;
LL은 연결 모이어티이고;
SS는 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 비드이다].
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 올레핀 단량체, 가교 단량체, 관능화 단량체 및 개시제를 포함하는 유기상을 제공하는 단계; 및 (b) 중합체성 비드가 형성되기에 효과적인 시간, 온도 조건 하에 유기상을 수성상과 접촉시키는 단계를 포함하는 중합체성 비드의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 수성상은 물 및 분산 시약을 포함하고, 분산 시약은, 일부 실시양태에서, 폴리알콜, 예를 들어 폴리비닐 알콜을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수성상은 물 및 분산 시약을 포함하고, 분산 시약은, 일 부 실시양태에서, 폴리알콜을 포함하며; 유기상은 1종 이상의 액체 탄화수소 및/또는 탄소수 5 내지 12의 알콜을 포함하는 유기 용매를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올레핀 단량체는 단일 비-방향족 불포화 기를 함유한다. 일부 추가적인 실시양태에서, 올레핀 단량체는 아릴-비닐 화합물, 예를 들어 스티렌이다.
일부 실시양태에서, 가교 단량체는 올레핀계 가교 단량체이다. 일부 실시양태에서, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기를 갖는 올레핀계 가교 단량체이다. 일부 추가적인 실시양태에서, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기가 5 또는 6원의 방향족 고리인 방향족 모이어티에 부착된 올레핀계 가교 단량체이다. 일부 실시양태에서, 가교 단량체는 디비닐벤젠이다.
일부 실시양태에서, 관능화 단량체는 보호된 관능기를 갖는 올레핀계 관능화 단량체이고, 보호된 관능기가 탈보호될 때, 산 또는 산 무수물과 반응하여 바람직하게는 에스테르 또는 아미드를 형성할 수 있는 관능기가 산출된다. 일부 실시양태에서, 관능화 단량체는 보호된 히드록실기를 갖는 올레핀계 단량체이다. 일부 실시양태에서, 관능화 단량체는 1개 이상의 프로파노일옥시스티렌 또는 아세톡시스티렌이고, 아세톡시스티렌이 가장 특히 바람직하다.
일부 실시양태에서, 유기상은 유기 용매를 추가로 포함하고, 이는, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 액체 탄화수소 및/또는 탄소수 5 내지 12의 알콜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기 용매는 1종 이상의 액체 탄화수소, 예를 들어 1종 이상의 액체 알칸, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 예를 들어 옥탄, 예를 들어 이소옥탄 및 /또는 탄소수 5 내지 12의 알콜, 예를 들어 2-에틸헥사놀을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합 개시제는 안정화된 과산화물, 예를 들어 벤조일퍼옥시드 또는 아조 화합물이다.
일부 실시양태에서, 올레핀 단량체는 아릴-비닐 화합물이고, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기를 갖는 올레핀계 가교 단량체이다. 추가적인 실시양태에서, 올레핀 단량체는 아릴-비닐 화합물이고, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기가 5 또는 6원의 방향족 고리인 방향족 모이어티에 부착된 올레핀계 가교 단량체이다. 일부 추가적인 실시양태에서, 올레핀 단량체는 스티렌이고, 가교 단량체는 디비닐벤젠이다. 일부 추가적인 실시양태에서, 올레핀 단량체는 아릴-비닐 화합물이고, 관능화 단량체는 탈보호될 때 산 또는 산 무수물과 반응하여 바람직하게는 에스테르 또는 아미드를 형성할 수 있는 관능기가 산출되는 보호된 관능기를 갖는 올레핀계 단량체이다.
일부 실시양태에서, 올레핀 단량체는 아릴-비닐 화합물이고, 관능화 단량체는 보호된 히드록실기를 갖는 올레핀계 단량체이다. 추가적인 실시양태에서, 올레핀 단량체는 스티렌 또는 에틸스티렌이고, 관능화 단량체는 아세톡시스티렌이다. 추가적인 실시양태에서, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기가 5 또는 6원의 방향족 고리인 방향족 모이어티에 부착된 올레핀계 단량체이고, 관능화 단량체는 탈보호될 때 산 또는 산 무수물과 반응하여 에스테르 또는 아미드를 형성할 수 있는 관능기가 산출되는 보호된 관능기를 갖는 올레핀계 단량체이다. 추가적인 실시양태에서, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기가 5 또는 6원의 방향족 고리인 방향 족 모이어티에 부착된 올레핀계 가교 단량체이고, 관능화 단량체는 보호된 히드록실기를 갖는 올레핀계 단량체이다. 추가적인 실시양태에서, 가교 단량체는 디비닐벤젠이고, 관능화 단량체는 아세톡시스티렌이다.
일부 실시양태에서, 올레핀 단량체는 아릴-비닐 화합물이고, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기가 5 또는 6원의 방향족 고리인 방향족 모이어티에 부착된 올레핀계 가교 단량체이고, 관능화 단량체는 탈보호될 때 산 또는 산 무수물과 반응하여 에스테르 또는 아미드를 형성할 수 있는 관능기가 산출되는 보호된 관능기를 갖는 올레핀계 단량체이다.
추가적인 실시양태에서, 올레핀 단량체는 아릴-비닐 화합물이고, 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기가 5 또는 6원의 방향족 고리인 방향족 모이어티에 부착된 올레핀계 가교 단량체이고, 관능화 단량체는 보호된 히드록실기를 갖는 올레핀계 단량체이다.
추가적인 실시양태에서, 올레핀 단량체는 스티렌이고, 가교 단량체는 디비닐벤젠이며, 관능화 단량체는 아세톡시스티렌이다.
각각의 상기 실시양태 중 일부에서, 수성상은 물 및 분산 시약이고, 분산 시약은, 일부 실시양태에서, 폴리비닐알콜을 포함한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 상기 접촉은 수성상 및 유기상을, 예를 들어 수성상 및 유기상을 교반시킴으로써, 진탕시키는 것을 추가로 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비드를 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 1종 이상의 세척 용매로 세척되고, 세척 용매 중 적어 도 하나는 아세톤, 물 또는 메탄올을 포함한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 디비닐벤젠은 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 약 3 내지 약 20 중량％; 또는 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 약 4 내지 약 15 중량％; 또는 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 약 5.5 내지 약 10 중량％인 양으로 초기에 유기상에 존재한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 아세톡시스티렌은 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 약 1 내지 약 20 중량％; 또는 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 약 2 내지 약 10 중량％; 또는 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 약 3 내지 약 8 중량％인 양으로 초기에 유기상에 존재한다.
수성상이 물 및 분산 시약을 포함하는 일부 실시양태에서, 유기상은 1종 이상의 액체 탄화수소 및/또는 탄소수 5 내지 12의 알콜을 포함하는 유기 용매를 추가로 포함한다. 일부 이같은 실시양태에서, 초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율은 약 33％ 내지 약 67％이고; 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 중량 백분율은 약 33％ 내지 약 67％이고; 초기에 전체 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율 약 60％ 내지 약 96％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율은 약 3％ 내지 약 20％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율은 약 1％ 내지 약 20％이고; 유기 용매 중에 존재하는 탄화수소의 중량 백분율은 약 0％ 내지 약 80％이고; 초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수 5 내지 12의 알콜의 중량 백분율은 약 20％ 내지 약 100％이다. 추가적인 이같은 실시양태에서, 초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율은 약 40％ 내지 약 65％이고; 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 중량 백분율은 약 35％ 내지 약 60％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율은 약 75％ 내지 약 94％이고; 초기에 전체 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율은 약 4％ 내지 약 15％이고; 초기에 전체 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율은 약 3％ 내지 약 8％이고; 유기 용매 중에 존재하는 탄화수소의 중량 백분율은 약 5％ 내지 약 70％이고; 초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수 5 내지 12의 알콜의 중량 백분율은 약 30％ 내지 약 95％이다. 추가적인 이같은 실시양태에서, 초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율은 약 50％ 내지 약 60％이고; 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 중량 백분율은 약 40％ 내지 약 50％이고; 초기에 전체 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율은 약 82％ 내지 약 91.5％이고; 초기에 전체 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율은 약 5.5％ 내지 약 10％이고; 초기에 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율은 약 3％ 내지 약 8％이고; 유기 용매 중에 존재하는 탄화수소의 중량 백분율은 약 10％ 내지 약 60％이고; 초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수 5 내지 12의 알콜의 중량 백분율은 약 40％ 내지 약 90％이다. 일부 이같은 실시양태에서, 분산 시약은 폴리비닐알콜을 포함한다. 추가적인 이같은 실시양태에서, 올레핀 단량체는 스티렌 또는 에틸스티렌이고, 가교 단량체는 디비닐벤젠이고, 관능화 단량체는 아세톡시스티렌이고, 탄화수소는 이소옥탄이고, 탄소수 5 내지 12의 알콜은 2-에틸헥사놀이다. 일부 이같은 실시양태에서, 초기에 수성상에 존재하는 분산 시약의 중량 백분율은 약 0.01％ 내 지 약 20％이다.
본원에 기술된 방법의 일부 실시양태에서, 유기상 및 수성상은 약 25℃ 내지 약 95℃; 또는 약 40℃ 내지 약 90℃; 또는 약 70℃ 내지 약 85℃; 또는 약 75℃ 내지 약 80℃의 온도로 가열된다.
본 발명은 (a) 본 발명의 방법에 의해 생산된 중합체성 비드를 제공하고, 임의로 상기 비드를 활성화 시약과 반응시켜 활성화된 중합체성 비드를 제공하는 단계; (b) 상기의 임의로 활성화된 중합체성 비드를 1개 이상의 연결 시약과 반응시켜 지지체-결합 링커를 갖는 비드를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 지지체-결합 링커를 뉴클레오시드와 연결시켜 지지체-결합 뉴클레오시드를 형성시키는 단계를 포함하는, 지지체-결합 뉴클레오시드의 제조 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 본 발명의 방법에 의해 생산된 중합체성 비드를 제공하고, 임의로 상기 비드를 활성화 시약과 반응시켜 활성화된 중합체성 비드를 제공하는 단계; 및 (b) 상기의 임의로 활성화된 중합체성 비드를 링커-함유 뉴클레오시드와 반응시켜 지지체-결합 뉴클레오시드를 형성시키는 단계를 포함하는, 지지체-결합 뉴클레오시드의 제조 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 임의의 상기 방법에 의해 제조된 지지체-결합 뉴클레오시드를 제공하고, 상기 지지체-결합 뉴클레오시드는 1개 이상의 보호된 히드록실기를 갖는 단계; (b) 지지체-결합 뉴클레오시드의 히드록실기를 탈보호시키는 단계; (c) 지지체-결합 뉴클레오시드를 활성화된 보호된 뉴클레오시드와 접촉시켜 포스파이트 중간체를 생산하는 단계; (d) 포스파이트 중간 체를 산화 시약과 접촉시켜 포스포르트리에스테르 중간체를 생산하는 단계; (e) 임의로, 미반응 뉴클레오시드를 캡핑시키는 단계; (f) 임의로, 단계 (b)-(e)를 1회 이상 반복하는 단계; 및 (g) 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하는 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 또한 제공한다. 일부 이같은 실시양태에서, 단계 (b)의 탈보호 단계는 산-분해성(acid-labile) 보호기의 제거를 포함한다.
본 발명은 (a) 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 임의의 상기 방법에 의해 제조된 지지체-결합 뉴클레오시드를 제공하고, 상기 지지체-결합 뉴클레오시드는 1개 이상의 보호된 히드록실기를 갖는 단계; (b) 지지체-결합 뉴클레오시드의 히드록실기를 탈보호시키는 단계; (c) 지지체-결합 뉴클레오시드를 활성화된 보호된 뉴클레오시드와 접촉시켜 포스파이트 중간체를 생산하는 단계; (d) 포스파이트 중간체를 산화 시약과 접촉시켜 포스포르트리에스테르 중간체를 생산하는 단계; (e) 임의로, 미반응 뉴클레오시드를 캡핑시키는 단계; (f) 임의로, 단계 (b)-(e)를 1회 이상 반복하는 단계; 및 (g) 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하는 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 또한 제공한다. 일부 이같은 실시양태에서, 단계 (b)의 탈보호 단계는 산-분해성 보호기의 제거를 포함한다.
본 발명은 하기 화학식 화학식 I의 화합물을 또한 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112007024999891-pct00014
[식중, LL은 연결 모이어티이고; SS는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드이며; 기타 구성성분 변수는 하기에 기술되는 바와 같다]. 일부 실시양태에서, G3, G5 및 G6는 각각 O이고; 추가적인 실시양태에서, R2' 중 하나는 H이고, R3' 및 R4'는 각각 H이다.
본 발명은 화학식 II의 화합물을 추가로 제공한다:
[화학식 II]
Figure 112007024999891-pct00015
[식중, 구성성분 변수는 하기에 기술되는 바와 같다]. 일부 실시양태에서, 각각의 G3, G5 및 G6는 O이다. 추가적인 이같은 실시양태에서, 각각의 인접한 R2' 기 쌍 중 하나는 H이고, 각각의 R3' 및 각각의 R4'은 H이다.
본 발명은 a) 화학식 III의 화합물을 제공하는 단계:
Figure 112007024999891-pct00016
및 b) 화학식 III의 화합물을 화학식 I의 화합물을 형성시키는데 효과적인 조건 하에 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드와 반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 I의 화합물의 제조 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, G3, G5 및 G6은 각각 O이다. 추가적인 실시양태에서, R2' 중 하나는 H이고, R3' 및 R4'는 각각 H이다.
본 발명은 a) 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드를 제공하는 단계; b) 2관능성 링커 LL의 한 말단을 비드의 관능기에 부착시키는 단계; 및 c) 2관능성 링커 LL의 다른쪽 말단을 화학식 IV의 화합물과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 형성시키는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조 방법을 또한 제공한다:
Figure 112007024999891-pct00017
일부 실시양태에서, G3, G5 및 G6는 각각 O이다. 추가적인 실시양태에서, R2' 중 하나는 H이고, R3' 및 R4'는 각각 H이다.
본 발명은 화학식 II의 화합물의 제조 방법으로:
[화학식 II]
Figure 112007024999891-pct00018
[식중, LL은 연결 모이어티이고, SS는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드이며, 기타 구성성분 변수는 하기에 기술되는 바와 같다], a) 상기 기술된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 제공하는 단계;
[화학식 I]
Figure 112007024999891-pct00019
[식중, T'은 제거가능한 보호기이다]; b) 보호기 T'를 제거하여 탈보호된 지지체-결합 뉴클레오시드를 형성시키는 단계; c) 단계 (b)의 탈보호된 지지체-결합 뉴클레오시드를 화학식 V의 보호된 뉴클레오시드 아미디트와 반응시켜:
Figure 112007024999891-pct00020
[식중, 구성성분 변수는 하기에 정의되는 바와 같다], 화학식 VI의 포스파이트 화합물을 형성시키는 단계:
Figure 112007024999891-pct00021
d) 화학식 VI의 포스페이트를 산화 또는 황화시켜 m이 1인 화학식 II의 화합물을 형성시키는 단계; e) 임의로, 미반응 뉴클레오시드를 캡핑시키는 단계; 및 f) 임의로, 단계 (b)-(e)를 1회 이상 반복하는 단계를 포함하는 방법을 또한 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 각각의 인접한 R2' 기 쌍 중 하나는 H이고, 각각의 R3' 및 각각의 R4'은 H이다.
상기 합성 방법의 일부 실시양태에서, 생성된 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하는 단계가 방법에 추가로 포함된다.
본 발명은 (a) 화학식 SS-LL-ZZ [식중, SS는 본 발명의 중합체성 비드이고, LL는 임의의 링커이고, ZZ는 아미노산의 카르복실기 또는 아미노기와 고정(anchoring) 연결을 형성할 수 있는 화학기이다]의 중합체 기재를 제공하는 단계; (b) 카르복실기 또는 아미노기에 보호기를 갖는 첫번째 아미노산 합성단위체를 중 합체 기재와 커플링시키는 단계; (c) 커플링된 첫번째 아미노산으로부터 보호기를 제거하여, 유리 아미노 또는 카르복실기를 생성시키는 단계; 및 (d) 유리 아미노 또는 카르복실기를 두번째 아미노산 합성단위체와 반응시켜, 펩티드 사슬을 형성시키는 단계를 포함하는, 아미노산 단량체를 포함하는 올리고머의 제조 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, (e) 두번째 아미노산 합성단위체로부터 보호기를 제거하여, 상기 펩티드 사슬 상에 유리 아미노 또는 카르복실기를 생성시키는 단계; 및 (f) 상기 펩티드 사슬 상의 상기 유리 아미노 또는 카르복실기를 추가의 보호된 아미노산 합성단위체와 반응시켜, 상기 펩티드 사슬을 연장시키는 단계가 방법에 추가로 포함된다. 추가적인 실시양태에서, 단계 e 및 f를 여러번 수행한다. 일부 실시양태는 상기 펩티드 사슬을 실질적으로 분해시키지 않으면서 상기 고정 연결을 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 합성단위체는 천연 발생 아미노산이다. 또다른 실시양태에서, 아미노산 합성단위체는 펩티드 핵산 합성단위체이다.
본 발명은 화학식 X의 화합물의 제조 방법으로:
Figure 112007024999891-pct00022
[식중, 구성성분 변수는 하기에 정의되는 바와 같다], (a) 화학식 SS-LL-ZZ [식중, SS는 제67항의 중합체성 비드이고, LL는 링커이고, ZZ는 아미노산과 고정 연결을 형성할 수 있는 화학기이다]의 중합체 기재를 제공하는 단계; (b) 상기 고정 연결을 통해 화학식 XX의 첫번째 아미노산을 상기 중합체 기재에 커플링시키는 단계:
Figure 112007024999891-pct00023
[식중, 구성성분 변수는 하기에 정의되는 바와 같다]; (c) 커플링된 첫번째 아미노산으로부터 상기 아미노 보호기를 제거하여, 유리 아미노기를 생성시키는 단계; 및 (d) 상기 유리 아미노기를 화학식 XX의 두번째 아미노산과 반응시켜, 펩티드 사슬을 형성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, (e) 상기 아미노 보호기를 상기 두번째 아미노산으로부터 제거하여, 상기 펩티드 사슬 상에 말단 유리 아미노기 아미노기를 생성시키는 단계; 및 (f) 상기 펩티드 사슬 상의 상기 유리 아미노기를 화학식 XX의 추가의 아미노산과 반응시켜, 상기 펩티드 사슬을 연장시키는 단계가 방법에 추가로 포함된다. 일부 실시양태에서, 단계 e 및 f를 여러번 수행한다. 일부 실시양태는 펩티드 사슬의 아미노산 모이어티 상에 남아 있는 1개 이상의 보호기를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태는 상기 펩티드 사슬을 실질적으로 분해시키지 않으면서 상기 고정 연결을 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 고정 연결을 형성할 수 있는 화학기는 클로로-, 브로모- 및 및 요오도-치환 알킬, 아미노-치환 알킬, 아미노 및 아릴-치환 알킬, 아미노- 및 알킬아릴-치환 알킬, 히드록시-치환 알킬, 또는 실질적으로 상기 폴리펩티드의 분해 없이 절단될 수 있는 스페이서(spacer) 기를 갖는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 클로로-치환 알킬은 클로로메틸이고, 아미노-치환 알킬은 아미노메틸이고, 아미노- 및 알킬-치환 아릴은 "-아미노벤질이고, 아미노- 및 알킬아릴-치환 알킬은 "-아미노-3- 및 "-아미노-4-메틸벤질로 구성되는 군으로부터 선택되고, 히드록시-치환 알킬은 히드록시메틸이다. 일부 실시양태에서, 화학기는 아미노-치환 알킬, 아미노- 및 아릴 치환 알킬, 및 아미노- 및 알킬아릴-치환 알킬로부터 선택된 아미노-함유 모이어티로부터 유도되고; 화학기는 4-(할로알킬)아릴-저급 알칸산, Boc-아미노아실-4-(옥시메틸)아릴-저급 알칸산, N-Boc-p-아실벤즈히드릴아민, N-Boc-4'-(저급 알킬)-p-아실벤즈히드릴아민, N-Boc-4'-(저급 알콕시)-p-아실벤즈히드릴아민, 및 4- 히드록시메틸페녹시-저급 알칸산으로 구성되는 군으로부터 유도된 스페이서 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화합물 X는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00024
[식중, 구성성분 변수는 하기에 정의되는 바와 같다].
추가적인 실시양태에서, 화합물 X는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00025
[식중, 구성성분 변수는 하기에 정의되는 바와 같다].
일부 실시양태에서, 화학식 XX의 아미노산은 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00026
[식중, 구성성분 변수는 하기에 정의되는 바와 같다].
추가적인 실시양태에서, 화학식 XX의 아미노산은 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00027
[식중, 구성성분 변수는 하기에 정의되는 바와 같다].
일부 실시양태에서, 본 발명의 중합체성 비드의 로딩 용량은 비드 1g 당 적 어도 약 50 μ㏖; 비드 1g 당 적어도 약 100 μ㏖; 비드 1g 당 적어도 약 150 μ㏖; 비드 1g 당 적어도 약 200 μ㏖; 비드 1g 당 적어도 약 250 μ㏖; 비드 1g 당 적어도 약 300 μ㏖; 비드 1g 당 적어도 약 350 μ㏖; 비드 1g 당 적어도 약 400 μ㏖; 또는 비드 1g 당 적어도 약 450 μ㏖이다. 일부 실시양태에서, 비드의 로딩 용량은 비드 1g 당 약 100 μ㏖ 내지 비드 1g 당 약 350 μ㏖이다.
유리하게는, 본 발명의 비드는 제작 및 다양한 링커 및 뉴클레오시드와 함께 사용하기가 비교적 용이하다. 추가적으로, 본 발명의 비드는 다양한 자동화된 고체-상 합성 기기에 사용될 수 있다. 본 발명의 비드는 로딩 용량이 우수하고, 지지체 1g 당 100 mmol을 초과하는 첫번째 뉴클레오시드/올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 비드는 다양한 합성 시약 및 용매와의 상용성, 광범위한 합성 용액에 걸친 일정한 팽윤 성질, 유리한 배압(backpressure) 프로파일, 비드 및 세공 크기의 우수한 균일성, 및 결과적인 양호한 합성 (전장 올리고머) 성능을 포함하여, 우수한 물리적 성질을 갖는다.
본 발명의 비드 제조 방법은 용이하게 실행될 수 있고, 확장성이며(scalable), 비용 프로파일이 우수하다. 상기 기술된 바와 같이 제작 및 사용이 용이한 것과 관련된 장점에 더하여, 본 발명의 비드는 뉴클레오시드, 아미노산, 또는 이의 유도체를 지지체에 공유결합으로 부착시키는데 사용될 수 있는 다양한 링커의 사용에 적용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 비드는 고품질 (전장) 올리고뉴클레오티드 및 기타 중합체성 종이 효율적으로 제작되도록 한다.
본 발명은 올리고머 합성을 위한 가교된 관능화 중합체성 비드, 이의 제조 방법, 올리고머 합성에서 이를 사용하는 방법, 지지체-결합 뉴클레오시드, 및 이의 제조 및 사용 방법, 뿐만 아니라 지지체-결합 올리고뉴클레오티드 및 아미드-연결 올리고머, 이의 사용 방법, 및 본 발명에 따른 중합체성 비드를 사용하여 제조된 올리고뉴클레오티드 및 아미드-연결 올리고머를 제공한다.
일부 실시양태에서, 비드는 (a) 올레핀 단량체, 가교 단량체, 관능화 단량체 및 개시제를 포함하는 유기상을 제공하는 단계; 및 (b) 중합체성 비드를 형성시키는데 효과적인 시간, 온도 조건 하에 유기상을 수성상과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 비드는 가교된 폴리올레핀을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 비드는 가교된 폴리스티렌을 포함한다. 본원에 기술된 본 발명의 방법에 따르면, 비드는 원하는 성질을 갖는 비드를 형성시키는데 적절한 조건 하에서의 올레핀 및 가교제를 포함하는 조성물의 자유-라디칼 반응에 의해 형성된다. 바람직한 올레핀은 스티렌이다.
수성상은 일반적으로 물 및 분산 시약을 포함하고, 이는 안정적인 비드의 형성을 촉진하는 것으로 여겨진다. 분산 시약은 단일 화합물, 또는 분산제들의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분산 시약은 1종 이상의 폴리알콜, 폴리아크릴산, 카르복시메틸 셀룰로스, 젤라틴, 탄화 칼슘, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 황산 바륨, 벤토나이트를 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 분산 시약은 폴리비닐 알콜을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 일부 실시양태에서, 분산 시약은 수성상 중량의 약 0.01％ 내지 약 20％, 또는 약 0.1％ 내지 약 10％인 양으로 수성상에 존재한다.
유기상은 올레핀 단량체, 가교 단량체, 관능화 단량체, 및 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기상은 1종 이상의 유기 용매를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 올레핀 단량체는 단일 비-방향족 불포화 기, 예를 들어 비닐 기를 함유한다. 바람직하게는, 올레핀계 단량체는 아릴 모이어티, 예를 들어 페닐 기를 또한 함유한다. 따라서, 일부 바람직한 실시양태에서, 올레핀 단량체는 아릴-비닐 화합물이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 올레핀 단량체는 스티렌 또는 에틸스티렌이다.
유기상은 1종 이상의 가교 단량체, 즉, 중합된 사슬을 가교시키는 2관능성 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가교 단량체는 비스-올레핀계 가교 단량체; 즉, 별도의 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 분자이다. 일부 실시양태에서, 올레핀계 가교 단량체는 2개의 비-공액 비닐 기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올레핀계 가교 단량체는 방향족 모이어티에 부착된 2개의 비-공액 비닐 기를 갖고, 일부 실시양태에서, 방향족 모이어티는 5 또는 6원의 방향족 고리, 예를 들어 페닐 고리이다. 한 바람직한 실시양태에서, 가교 단량체는 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-디비닐벤젠, 또는 1개 이상의 이러한 것의 혼합물이다. 더욱 바람직하게는, 가교 단량체는 1,3- 또는 1,4-디비닐벤젠을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 비드는 1종 이상의 관능화 단량체에 의해 기여되는 1가지 이상의 유형의 관능기를 추가로 포함한다. 관능화 단량체는 링커 모이어티에 또는 직접적으로 뉴클레오시드, 아미노산, 또는 조합 합성용 코어 모이어티의 관능기에 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기를 기여하는 중합체 또는 바람직하게는 단량체이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 관능기는 -OH이다. 관능기는 중합 동안 스티렌 및/또는 가교 단량체와 반응성인 관능화 단량체에 의해 기여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관능화 단량체는 관능기에 공유결합으로 부착된 1개 이상의 올레핀계 기를 갖는다. 일부 바람직한 실시양태에서, 관능화 기는 아실옥실 기이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 관능화제는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00028
[식중, RF는 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬로부터 선택된다].
특히 바람직한 관능화 단량체는 아세톡시스티렌, 프로파노일옥시스티렌이고, 아세톡시스티렌이 가장 특히 바람직하다.
일부 실시양태에서, 관능기는 1개 이상의 보호기로 보호되고, 이는 올리고머 합성 전에 제거되어야 한다. 이같은 관능기에는 아실 기, 예를 들어 아세틸, 프로파노일, 벤조일 및 기타 관능기 보호기가 포함된다. 따라서, 본 발명의 실시양태에는 보호된 관능화된 가교 폴리올레핀계 중합체 및 탈보호된 관능화된 가교 폴리올레핀계 중합체 모두가 포함된다. 일부 실시양태에서, 관능기가 탈보호될 때, 산 또는 산 무수물과의 반응에 적절한 관능기가 산출되어, 바람직하게는 에스테르 또는 아미드가 형성된다.
유기상은 1종 이상의 유기 용매를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 용매로는 1종 이상의 액체 탄화수소 및/또는 탄소수 5 내지 12의 알콜이 포함된다. 일부 실시양태에서, 유기 용매는 1종 이상의 액체 탄화수소, 바람직하게는 1종 이상의 액체 알칸, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 예를 들어 1종 이상의 옥탄 및/또는 탄소수 5 내지 12의 알콜을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 유기 용매는 이소옥탄 및 2-에틸헥사놀을 포함한다.
유기상은 1종 이상의 개시제를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 개시제로는 자유 라디칼 중합 반응을 개시시킬 수 있는 화합물, 예를 들어 안정화된 과산화물 또는 아조 화합물이 포함된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 개시제는 벤조일 퍼옥시드, 디라우로일 퍼옥시드, 1,1-디(t-부틸페록시)-2-메틸시클로헥산, 디-t-부틸 퍼옥시드, 디스테아로일 퍼옥시드, 디-t-헥실 퍼옥시드, t-부틸 쿠밀 퍼옥시드, 1,1-디(t-헥실 페록시)-3,3,5-트리메틸시클로헥산, 1,1-디(t-부틸페록시)시클로헥산, 1,1,3,3-테트라메틸부틸페록시-2-에틸헥사노에이트, t-헥실 페록시-2-에틸헥사노에이트, 2,2'-아조비스이소부티로니트릴, 2,2'-아조비스-2-메틸부티로니트릴, 또는 2,2'-아조비스-2,4-디메틸발레로니트릴로부터 선택된다. 한 바람직한 실시양태에서, 개시제는 벤조일퍼옥시드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 바람직한 실시양태에서, 올레핀 단량체는 스티렌 또는 에틸스티렌이고, 가교 단량체는 디비닐벤젠이며, 관능화 단량체는 아세톡시스티렌이다. 일부 이같은 실시양태에서, 유기 용매는 이소옥탄 및 2-에틸헥사놀이고, 개시제는 벤조일퍼옥시드이다.
본 발명에 따른 한 바람직한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성에 적절한, 관능화된 가교 폴리스티렌 비드의 제조 방법으로, (a) 물 및 폴리비닐 알콜 (PVA)을 혼합하여 수성 용액을 형성시키는 단계; (b) 이소옥탄 및 2-에틸헥사놀 용매, 스티렌 단량체, 디비닐벤젠 가교 단량체, 벤조일퍼옥시드 개시제 및 아세톡시스티렌 관능화 단량체를 혼합하여 유기 용액을 형성시키는 단계; 및 (c) 수성 용액과 유기 용액을 혼합하여, 올리고뉴클레오티드 합성에 적절한, 관능화된 가교 폴리스티렌 비드를 형성시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에 따르면, 유기상과 수성상의 접촉은, 예를 들어 교반에 의해, 두 상을 진탕시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 두 상을 5 시간 동안, 7 시간 동안, 10 시간 동안, 12 시간 동안, 또는 15 시간 동안 또는 그 이상으로 진탕시킨다. 일반적으로, 원하는 비드 크기 분포가 생성되는 것을 촉진하기 위해, 유기상과 수성상의 혼합물을 고정된 속도에서 교반하는 것이 이롭다. 일부 바람직한 실시양태에서, 혼합물을 패들(paddle), 앵커(anchor) 패들, 프로펠러(propeller) 또는 디스크 터빈(disk turbine)에 의해 250 rpm에서 원하는 시간 동안 교반한다.
일반적으로, 진탕 동안 유기상 및 수성상을 약 25℃ 내지 약 95℃; 약 40℃ 내지 약 90℃; 약 70℃ 내지 약 85℃; 또는 약 75℃ 내지 약 80℃의 온도로 가열한다.
유기상과 수성상의 반응 후, 비드를 1종 이상의 세척 용매로 세척하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 세척 용매 중 1종 이상은 아세톤, 물 또는 메탄올이다. 세척은 고체 지지체 매체를 세척하기 위한 여러 기술 중 임의의 것에 의해, 예를 들어 반응 혼합물을 여과하고 세척 용매로 필터 상의 비드를 세척함으로써 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 그 후 비드를, 예를 들어 비드를 적절한 용매, 예를 들어 아세톤 내에 분산시키고, 현탁액을 체로 거름으로써, 크기에 의해 분리하여 원하는 크기의 비드를 수집할 수 있다. 그 후, 예를 들어 진공 하에 비드를 건조시킬 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 가교 단량체, 예를 들어 디비닐벤젠은 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 약 3 중량％ 내지 약 20 중량％, 약 4 중량％ 내지 약 15 중량％, 또는 약 5.5 중량％ 내지 약 10 중량％인 양으로 초기에 유기상에 존재한다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 가교 단량체, 예를 들어 디비닐벤젠 대 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 몰비는 약 1:27 내지 약 1:8; 약 1:25 내지 약 1:10; 또는 약 1:20 내지 약 1:13이다.
일부 추가적인 바람직한 실시양태에서, 관능화 단량체, 예를 들어 아세톡시스티렌은 하는 초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 약 1 중량％ 내지 약 20 중량％, 약 2 중량％ 내지 약 10 중량％, 또는 약 3％ 내지 약 8 중량％인 양으로 초기에 유기상에 존재한다.
일부 추가적인 바람직한 실시양태에서, 관능화 단량체, 예를 들어 아세톡시스티렌 대 초기에 유기상에 존재하는 단량체의 몰비는 약 1:99 내지 약 1:10; 또는 약 1:62 내지 약 1:18이다. 일부 추가적인 바람직한 실시양태에서, 몰비는 약 1:46 내지 약 1:21이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 유기상은 1종 이상의 액체 탄화수소 및/또는 탄소수 5 내지 12의 알콜, 바람직하게는 이소옥탄 및 2-에틸헥사놀을 포함하는 유기 용매를 추가로 포함하고;
초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율은 약 33％ 내지 약 67％, 또는 약 40％ 내지 약 65％, 또는 약 50％ 내지 약 60％이고;
초기에 유기상에 존재하는 전체 단량체의 중량 백분율은 약 33％ 내지 약 67％, 또는 약 35％ 내지 약 60％, 또는 약 40％ 내지 약 50％이고;
초기에 전체 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체, 바람직하게는 스티렌 또는 에틸스티렌의 중량 백분율은 약 60％ 내지 약 96％, 또는 약 75％ 내지 약 94％, 또는 약 82％ 내지 약 91.5％이고;
초기에 전체 단량체 중에 존재하는 가교 단량체, 바람직하게는 1종 이상의 디비닐벤젠의 중량 백분율은 약 3％ 내지 약 20％, 또는 약 4％ 내지 약 15％, 또는 약 5.5％ 내지 약 10％이고;
초기에 전체 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체, 바람직하게는 아세톡시스티렌의 중량 백분율은 약 1％ 내지 약 20％, 또는 약 2％ 내지 약 10％, 또는 약 3％ 내지 약 8％이고;
유기 용매 중에 존재하는 탄화수소, 바람직하게는 이소옥탄의 중량 백분율은 약 0％ 내지 약 80％, 또는 약 5％ 내지 약 70％, 또는 약 10％ 내지 약 60％이고;
초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수가 5 내지 12인 알콜, 바람직하게는 2-에틸헥사놀의 중량 백분율은 약 20％ 내지 약 100％, 또는 약 30％ 내지 약 95％, 또는 약 40％ 내지 약 90％이다.
일부 이같은 실시양태에서, 수성상은 물 및 분산 시약, 바람직하게는 폴리알콜 예컨대 폴리비닐알콜을 포함하고, 이때 분산 시약은 수성상의 중량의 약 0.01％ 내지 약 20％, 또는 약 0.1％ 내지 약 10％인 양으로 수성상에 존재한다.
본원의 방법의 일부 실시양태에서, 수성상의 부피 대 유기상의 부피의 비는 약 2:3 내지 약 50:1; 또는 약 1:1 내지 약 20:1; 또는 약 3:2 내지 약 10:1이다.
본 발명은 (a) 본 발명의 방법에 의해 생산된 중합체성 비드를 제공하고, 임의로 상기 비드를 활성화 시약과 반응시켜 활성화된 중합체성 비드를 제공하는 단계; (b) 활성화된 중합체성 비드를 1개 이상의 연결 시약과 반응시켜 지지체-결합 링커를 갖는 비드를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 지지체-결합 링커를 뉴클레오시드와 연결시켜 지지체-결합 뉴클레오시드를 형성시키는 단계를 포함하는 지지체-결합 뉴클레오시드의 제조 방법을 또한 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 방법에 의해 생산된 중합체성 비드를 제공하고, 임의로 상기 비드를 활성화 시약과 반응시켜 활성화된 중합체성 비드를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 활성화된 중합체성 비드를 링커-함유 뉴클레오시드와 연결시켜 지지체-결합 뉴클레오시드를 형성시키는 단계를 포함하는 지지체-결합 뉴클레오시드의 제조 방법을 또한 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 방법에 의해 제조된 지지체-결합 뉴클레오시드를 제공하는 단계; (b) 예를 들어 산-분해성 보호기를 제거함으로써, 지지체-결합 뉴클레오시드의 히드록시 기를 탈보호시키는 단계; (c) 지지체-결합 뉴클레오시드를 활성화된 보호된 뉴클레오시드와 접촉시켜, 포스파이트 중간체를 생산하는 단계; (d) 포스파이트 중간체를 산화 시약과 접촉시켜, 포스포르트리에스테르 중간체를 생산하는 단계; (e) 임의로, 미반응 뉴클레오시드를 캡핑시키는 단계; (f) 임의로, 단계 (b)-(e)를 1회 이상 반복하는 단계; 및 (g) 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하는 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112007024999891-pct00029
[식중:
G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
G6는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
각각의 R2'는 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
q는 0 또는 1이고;
R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
Bx는 핵염기이고;
T'는 H 또는 제거가능한 보호기이고;
LL은 연결 모이어티 또는 단일 결합이고;
SS는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드이다].
화학식 I의 화합물의 일부 바람직한 실시양태에서, G3, G5 및 G6은 각각 O이다. 화학식 I의 화합물의 일부 추가적인 바람직한 실시양태에서, 1개 이상의 R2'는 H이고, R3' 및 R4'은 각각 H이다.
본 발명에 따라 화학식 II의 화합물이 또한 제공된다:
[화학식 II]
Figure 112007024999891-pct00030
[식중:
m은 0 내지 약 100의 정수이고;
각각의 G1은 O 또는 S이고;
각각의 G2는 OH 또는 SH이고;
각각의 G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
각각의 G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
각각의 R2'은 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 q는 0 또는 1이고;
각각의 R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 G6는 독립적으로 O, S, CH2 또는 NH이고;
각각의 Bx는 핵염기이고;
T'는 제거가능한 보호기이고;
LL은 연결 모이어티이고;
SS는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드이다].
화학식 II의 화합물의 일부 바람직한 실시양태에서, 각각의 G3, G5 및 G6은 O이다. 화학식 II의 화합물의 일부 추가적인 바람직한 실시양태에서, 각각의 인접한 R2' 기 쌍 중 적어도 1개는 H이고, 각각의 R3' 및 각각의 R4'은 H이다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 제조 방법으로:
[화학식 I]
Figure 112007024999891-pct00031
[식중:
G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
각각의 R2'는 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
q는 0 또는 1이고;
R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
Bx는 핵염기이고;
pg는 제거가능한 인 보호기이고;
T'는 H 또는 제거가능한 보호기이고;
LL은 연결 모이어티 또는 단일 결합이고;
SS는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드이다],
a) 화학식 III의 화합물을 제공하는 단계:
[화학식 III]
Figure 112007024999891-pct00032
; 및 b) 화학식 III의 화합물을 화학식 I의 화합물을 형성시키는데 효과적인 조건 하에 본 발명의 비드와 반응시키는 단계를 포함하는 방법을 또한 제공한다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, G3, G5 및 G6은 각각 O이다. 일부 추가적인 실시양태에서, 1개 이상의 R2'는 H이고, R3' 및 R4'는 각각 H이다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 제조 방법으로:
[화학식 I]
Figure 112007024999891-pct00033
[식중:
G3는 O, S, 또는 NH이고;
G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
각각의 R2'는 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
q는 0 또는 1이고;
R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
Bx는 핵염기이고;
T'는 H 또는 제거가능한 보호기이고;
LL은 연결 모이어티이고;
SS는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드이다],
a) 본 발명의 비드를 제공하는 단계;
b) 2관능성 링커 LL의 한 말단을 비드의 관능기에 부착시키는 단계; 및
c) 2관능성 링커 LL의 다른쪽 말단을 화학식 IV의 화합물과 반응시켜:
[화학식 IV]
Figure 112007024999891-pct00034
화학식 I의 화합물을 형성시키는 단계를 포함하는 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, G3, G5 및 G6는 각각 O이다. 추가적인 실시양태에서, 1개 이상의 R2'는 H이고, R3' 및 R4'는 각각 H이다.
본 발명에 따라, 화학식 II의 화합물의 제조 방법으로:
[화학식 II]
Figure 112007024999891-pct00035
[식중:
m은 0 내지 약 100의 정수이고;
각각의 G1은 O 또는 S이고;
각각의 G2는 OH 또는 SH이고;
각각의 G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
각각의 G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
각각의 R2'은 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 q는 0 또는 1이고;
각각의 R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
각각의 G6는 O, S, CH2 또는 NH이고;
각각의 Bx는 핵염기이고;
T'는 H 또는 보호기이고;
LL은 연결 모이어티 또는 단일 결합이고;
SS는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 비드이다],
a) 화학식 I의 화합물을 제공하는 단계;
[화학식 I]
Figure 112007024999891-pct00036
[식중, T'은 제거가능한 보호기이다];
b) 보호기 T'를 제거하여 탈보호된 지지체-결합 뉴클레오시드를 형성시키는 단계;
c) 단계 (b)의 탈보호된 지지체-결합 뉴클레오시드를 화학식 V의 보호된 뉴클레오시드 아미디트와 반응시켜:
[화학식 V]
Figure 112007024999891-pct00037
[식중, RN1 및 RN2는 탄소수 1 내지 6의 알킬이다], 화학식 VI의 포스파이트 화합물을 형성시키는 단계:
[화학식 VI]
Figure 112007024999891-pct00038
d) 화학식 VI의 포스페이트를 산화 또는 황화시켜 m이 1인 화학식 II의 화합물을 형성시키는 단계;
e) 임의로, 미반응 뉴클레오시드를 캡핑시키는 단계; 및
f) 임의로, 단계 (b)-(e)를 1회 이상 반복하는 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다.
일부 실시양태에서, 각각의 G3, G5 및 G6는 O이다. 추가적인 실시양태에서, 각각의 인접한 R2' 기 쌍 중 1개 이상은 H이고, 각각의 R3' 및 각각의 R4'은 H이다. 일부 추가적인 실시양태에서, 이러한 방법은 생성된 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 중합체성 비드는 아미드-연결 올리고머, 예를 들어 단백질, 펩티드, 및 이의 유사체, 및 아미드-연결 핵염기- 또는 핵염기 유사체-함유 올리고머 예컨대 펩티드 핵산의 제조에 또한 유용하다. 본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 아미노기 및 카르복실기 모두를 갖는 단량체성 종을 지칭한다. 따라서, "아미노산"에는 펩티드 및 단백질에서 나타나는 바와 같은 천연 발생 α-아미노산, 이의 유사체, 기타 천연 발생 아미노산 예컨대 γ-아미노 부티르산, 및 이로부터 올리고머성 화합물이 제조될 수 있는 기타 비-천연 발생 아미노산이 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 아미노산 단량체를 포함하는 올리고머의 제조 방법으로,
(a) 화학식 SS-LL-ZZ [식중, SS는 본 발명의 중합체성 비드이고, LL는 임의의 링커이고, ZZ는 아미노산의 카르복실기 또는 아미노기와 고정 연결을 형성할 수 있는 화학기이다]의 중합체 기재를 제공하는 단계;
(b) 첫번째 아미노산 합성단위체를 아미노산의 카르복실기 또는 아미노기를 통해 상기 중합체 기재와 커플링시키고, 상기 합성단위체는 커플링되지 않은 카르복실기 또는 아미노기에 보호기를 갖는 단계;
(c) 커플링된 첫번째 아미노산으로부터 보호기를 제거하여, 유리 아미노 또는 카르복실기를 생성시키는 단계; 및
(d) 유리 아미노 또는 카르복실기를 두번째 아미노산 합성단위체와 반응시켜, 펩티드 사슬을 형성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서:
(e) 두번째 아미노산 합성단위체로부터 보호기를 제거하여, 상기 펩티드 사슬 상에 말단 유리 아미노 또는 카르복실기를 생성시키는 단계; 및
(f) 상기 펩티드 사슬 상의 상기 유리 아미노 또는 카르복실기를 추가의 보호된 아미노산 합성단위체와 반응시켜, 상기 펩티드 사슬을 연장시키는 단계가 방법에 추가로 포함된다.
더 긴 종을 원하는 일부 실시양태에서, 단계 e 및 f를 여러번 수행한다. 원하는 서열이 달성되면, 조립된 사슬을 실질적으로 분해시키지 않으면서 고정 연결을 절단한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 아미노산 합성단위체는 천연 발생 아미노산, 이의 유사체, 또는 펩티드 핵산이다.
일부 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 화학식 X의 화합물의 제조 방법으로:
[화학식 X]
Figure 112007024999891-pct00039
[식중:
n은 2 이상이고,
각각의 L1-Ln은 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 천연 발생 핵염기, 비-천연 발생 핵염기, 방향족 모이어티, DNA 인터칼레이터(intercalator), 핵염기-결합 기, 헤테로고리형 모이어티, 및 리포터(reporter) 리간드로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고, L1-Ln 중 1개 이상은 천연 발생 핵염기, 비-천연 발생 핵염기, DNA 인터칼레이터, 또는 핵염기-결합 기이고;
각각의 C1-Cn은 (CR6R7)y이고, 식중 R6는 수소이고 R7은 천연 발생 알파 아미노산의 측쇄로 구성되는 군으로부터 선택되거나, 또는 R6 및 R7은 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4 및 SR5 (식중 R3 및 R4는 상기 정의된 바와 같고, R5는 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시-, 알콕시-, 또는 알킬티오-치환 (C1-C6)알킬이다)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R6 및 R7은 함께 지환식 또는 헤테로고리형 시스템을 완성시키고;
각각의 D1-Dn은 (CR6R7)Z (식중 R6 및 R7은 상기 정의된 바와 같다)이고;
각각의 y 및 z는 0 또는 1 내지 10의 정수이고, 합 y + z는 2 초과 10 이하이고;
각각의 G1-Gn은 임의 방향의 -NR3CO-, -NR3CS-, -NR3SO- 또는 -NR3SO2- (식중 R3는 상기 정의된 바와 같다)이고;
각각의 A1-An 및 B1-Bn은:
(a') A는 화학식 (IIa), (IIb) 또는 (IIc)의 기이고, B는 N 또는 R3N+이고, 단 1개 이상의 A는 화학식 (IIc)의 기이거나; 또는
(b') A는 화학식 (IId)의 기이고, B는 CH이거나; 또는
(c') A는 화학식 (IIa) 또는 (IIb)의 기이고, B는 N 또는 R3N+이고, 단 1개 이상의 y 또는 z는 1 또는 2가 아니도록 선택되고:
Figure 112007024999891-pct00040
(식중:
X는 O, S, Se, NR3, CH2 또는 C(CH3)2이고;
Y는 단일 결합, O, S 또는 NR4이고;
각각의 p 및 q는 0 또는 1 내지 5의 정수이고, 합 p+q는 10 이하이고;
각각의 r 및 s는 0 또는 1 내지 5의 정수이고, 합 r+s는 10 이하이고;
각각의 R1 및 R2는 수소, 히드록시- 또는 알콕시- 또는 알킬티오-치환될 수 있는 (C1- C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R3 및 R4는 수소, (C1-C4)알킬, 히드록시- 또는 알콕시- 또는 알킬티오-치환 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오 및 아미노로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다);
Q는 -CO2H, -CONR'R", -SO3H 또는 -SO2NR'R", 또는 -CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고;
I는 -NHR'"R"" 또는 -NR'"C(O)R"" (식중 R', R", R'" 및 R""는 수소, 알킬, 아미노 보호기, 리포터 리간드, 인터칼레이터, 킬레이터(chelator), 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 올리고뉴클레오티드 및 가용성 및 불용성 중합체로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다)이다],
(a) 화학식 SS-LL-ZZ [식중, SS는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 중합체성 비드이고, LL는 링커이고, ZZ는 아미노산과 고정 연결을 형성할 수 있는 화학기이다]의 중합체 기재를 제공하는 단계;
(b) 상기 고정 연결을 통해 상기 중합체 기재를 화학식 XX의 첫번째 아미노산과 커플링시키는 단계:
[화학식 XX]
Figure 112007024999891-pct00041
[식중:
L은 천연 발생 핵염기, 비-천연 발생 핵염기, 방향족 모이어티, DNA 인터칼레이터, 핵염기-결합 기, 헤테로고리형 모이어티, 및 리포터 리간드로 구성되는 군으로부터 선택되고, 임의로 아미노기는 아미노 보호기에 의해 보호되고;
각각의 C는 (CR6R7)y이고, 식중 R6는 수소이고 R7은 천연 발생 알파 아미노산의 측쇄로 구성되는 군으로부터 선택되거나, 또는 R6 및 R7은 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4 및 SR5 (식중 R3 및 R4는 상기 정의된 바와 같고, R5는 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시-, 알콕시-, 또는 알킬티오-치환 (C1-C6)알킬이다)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R6 및 R7은 함께 지환식 또는 헤테로고리형 시스템을 완성시키고;
각각의 D는 (CR6R7)Z (식중 R6 및 R7은 상기 정의된 바와 같다)이고;
각각의 y 및 z는 0 또는 1 내지 10의 정수이고, 합 y + z는 2 초과 10 이하이고;
각각의 A 및 B는:
(a') A는 화학식 (IIc)의 기이고, B는 N 또는 R3N+이거나; 또는
(b') A는 화학식 (IId)의 기이고, B는 CH이거나; 또는
(c') A는 화학식 (IIa) 또는 (IIb)의 기이고, B는 N 또는 R3N+이고, 단 1개 이상의 y 또는 z는 1 또는 2가 아니도록 선택되고:
Figure 112007024999891-pct00042
(식중:
X는 O, S, Se, NR3, CH2 또는 C(CH3)2이고;
Y는 단일 결합, O, S 또는 NR4이고;
각각의 p 및 q는 0 또는 1 내지 5의 정수이고, 합 p+q는 10 이하이고;
각각의 r 및 s는 0 또는 1 내지 5의 정수이고, 합 r+s는 10 이하이고;
각각의 R1 및 R2는 수소, 히드록시- 또는 알콕시- 또는 알킬티오-치환될 수 있는 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R3 및 R4는 수소, (C1-C4)알킬, 히드록시- 또는 알콕시- 또는 알킬티오-치환 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오 및 아미노로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다);
각각의 E는 COOH, CSOH, SOOH, SO2OH 또는 이의 활성화 또는 보호된 유도체이고;
각각의 F는 NHR3 또는 NPgR (식중 R3는 상기 정의된 바와 같고, 및 Pg는 아미노 보호기이다)이다];
(c) 커플링된 첫번째 아미노산으로부터 상기 아미노 보호기를 제거하여, 유리 아미노기를 생성시키는 단계; 및
(d) 상기 유리 아미노기를 화학식 XX의 두번째 아미노산과 반응시켜, 펩티드 사슬을 형성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서:
(e) 상기 아미노 보호기를 상기 두번째 아미노산으로부터 제거하여, 상기 펩티드 사슬 상에 말단 유리 아미노기를 생성시키는 단계; 및
(f) 상기 펩티드 사슬 상의 상기 유리 아미노기를 화학식 XX의 추가의 아미노산과 반응시켜, 상기 펩티드 사슬을 연장시키는 단계가 방법에 추가로 포함된다. 일부 실시양태에서, 단계 e 및 f를 여러번 수행한다. 일부 추가적인 실시양태는 펩티드 사슬의 아미노산 모이어티 상에 남아 있는 1개 이상의 보호기를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 원하는 서열의 합성이 완결되면, 상기 조립된 사슬을 실질적으로 분해시키지 않으면서 상기 고정 연결을 지지체로부터 절단한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 상기 고정 연결을 형성할 수 있는 화학기는 클로로-, 브로모- 및 요오도-치환 알킬, 아미노-치환 알킬, 아미노 및 아릴-치환 알킬, 아미노- 및 알킬아릴-치환 알킬, 히드록시-치환 알킬, 또는 실질적으로 상기 폴리펩티드의 절단 없이 분해될 수 있는 스페이서 기를 갖는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 클로로-치환 알킬은 클로로메틸이고, 아미노-치환 알킬은 아미노메틸이고, 아미노- 및 알킬-치환 아릴은 α-아미노벤질이고, 아미노- 및 알킬아릴-치환 알킬은 α-아미노-3- 및 α-아미노-4-메틸벤질로 구성되는 군으로부터 선택되고, 히드록시-치환 알킬은 히드록시메틸이다. 일부 추가적인 실시양태에서, 화학기는 아미노-치환 알킬, 아미노- 및 아릴 치환 알킬, 및 아미노- 및 알킬아릴-치환 알킬로부터 선택된 아미노-함유 모이어티로부터 유도되고; 화학기는 4-(할로알킬)아릴-저급 알칸산, Boc-아미노아실-4-(옥시메틸)아릴-저급 알칸산, N-Boc-p-아실벤즈히드릴아민, N-Boc-4'-(저급 알킬)-p-아실벤즈히드릴아민, N-Boc-4'-(저급 알콕시)-p-아실벤즈히드릴아민, 및 4-히드록시메틸페녹시-저급 알칸산으로 구성되는 군으로부터 유래된 스페이서 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화합물 X는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00043
[식중:
각각의 L은 수소, 페닐, 헤테로고리형 모이어티, 천연 발생 핵염기, 및 비-천연 발생 핵염기로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R7'는 수소 및 천연 발생 알파 아미노산의 측쇄로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
n은 1 내지 60의 정수이고;
각각의 k, l, 및 m은 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이고;
각각의 p는 0 또는 1이고;
Rh는 OH, NH2 또는 -NHLysNH2이고;
Ri는 H 또는 COCH3이다].
추가적인 실시양태에서, 화합물 X는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00044
[식중:
각각의 L은 수소, 페닐, 헤테로고리형 모이어티, 천연 발생 핵염기, 및 비-천연 발생 핵염기로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R7'는 수소 및 천연 발생 알파 아미노산의 측쇄로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
n은 1 내지 60의 정수이고;
각각의 k, l, 및 m은 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이고;
각각의 p는 0 또는 1이고;
Rh는 OH, NH2 또는 -NHLysNH2이고;
Ri는 H 또는 COCH3이다].
추가적인 실시양태에서, 상기 화학식 (XX)의 아미노산은 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00045
[식중:
각각의 L은 수소, 페닐, 헤테로고리형 모이어티, 천연 발생 핵염기, 및 비-천연 발생 핵염기로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R7'는 수소 및 천연 발생 알파 아미노산의 측쇄로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 k, l, 및 m은 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이다].
추가적인 실시양태에서, 상기 화학식 (XX)의 아미노산은 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00046
[식중:
각각의 L은 수소, 페닐, 헤테로고리형 모이어티, 천연 발생 핵염기, 및 비-천연 발생 핵염기로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R7'는 수소 및 천연 발생 알파 아미노산의 측쇄로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 k, l, 및 m은 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이다].
한 실시양태에서, 본 발명은 우수한 성질, 예컨대 비드 크기 분포, 세공 크기, 밀도, 팽윤 성질에서의 뛰어난 균일성 및/또는 올리고머 합성에 전형적으로 사용되는 용매 및 시약에 대한 내성을 갖는, 가교된, 관능화된 폴리스티렌 비드를 제공한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 비드는 로딩 특성이 매우 우수하다. 일부 바람직한 실시양태에서, 비드의 로딩 용량은 비드 1 g 당 적어도 약 50 μ㏖; 비드 1 g 당 적어도 약 100 μ㏖; 비드 1 g 당 적어도 약 150 μ㏖; 비드 1 g 당 적어도 약 200 μ㏖; 비드 1 g 당 적어도 약 250 μ㏖; 비드 1 g 당 적어도 약 300 μ㏖; 비드 1 g 당 적어도 약 350 μ㏖; 비드 1 g 당 적어도 약 400 μ㏖; 또는 비드 1 g 당 적어도 약 450 μ㏖이다. 일부 실시양태에서, 비드의 로딩 용량은 비드 1 g 당 약 100 μ㏖ 내지 비드 1 g 당 약 350 μ㏖이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 비드의 평균 입자 크기는 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛ 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 비드의 평균 입자 크기는 약 5 ㎛ 내지 약 500 ㎛ 범위이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 비드의 평균 입자 크기는 약 10 ㎛ 내지 약 300 ㎛ 범위이다.
본 발명의 중합체성 비드 지지체는 조합 방법에 의해 합성되는 임의의 광범위한 단량체성 및 중합체성 분자의 제조에 적용될 수 있다. 조합 라이브러리가 그 자체로 유용하고, 이같은 라이브러리 및 이를 포함하는 화합물이 상업적으로 매우 중요한 것으로 현재 널리 인정되고 있다. 실제로, 조합 라이브러리의 많은 상업적인 양상을 연구하기 위해 화학의 한 학과가 개발되었다. 각각의 전통적인 조합 접근법의 장점을 최대화시키기 위해, 조합적인 디콘볼루션(deconvolution)을 위한 새로운 전략들이 여러 집단에 의해 독립적으로 개발되었다. 선별 기술이 펩티드 ([Geysen et al., J. Immun. Meth., 1987, 102, 259]; [Houghten et al., Nature, 1991, 354, 84]; [Owens et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 181, 402]; [Doyle, PCT WO 94/28424]; [Brennan, PCT WO 94/27719]); 핵산 ([Wyatt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 1356]; [Ecker et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 1853]); 비펩티드 및 소형 분자 ([Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 9367]; [Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc, 1992, 114, 10646]; [Bartlett et al., WO 91/19735]; [Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90, 10922]; [DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90, 6909]; [Cody et al., 미국 특허 5,324,483]; [Houghten et al., PCT WO 94/26775]; [Ellman, 미국 특허 5,288,514]; [Still et al., WO 94/08051]; [Kauffman et al., PCT WO 94/24314]; [Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 1994, 33, 2059]; [Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engel, 1994, 33, 2061]; [Lebl et al., WO 94/28028])의 라이브러리와 함께 사용되었다. 각각의 상기 문헌은 전체적으로 참조문헌으로 본원에 포함된다. 상기 참고문헌들의 리뷰는 이러한 기술들 중 가장 고도의 것은 펩티드 및 핵산의 선별을 위한 것임을 나타낸다.
현재까지 보고된 대부분의 기술에는 펩티드 및 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고머의 더욱더 단순화된 부분집합의 반복 합성 및 스크리닝이 수반된다. 사용된 단량체 또는 서브-단량체에는 아미노산, 아미노산-유사 분자, 즉 카르바메이트 전구체, 및 뉴클레오티드가 포함되고, 양쪽 모두 2관능성이다. 이러한 기술을 사용하여, 세포-기재 분석법에서의 활성에 대해, 또는 정제된 단백질 표적의 결합 및/또는 억제에 대해 라이브러리가 분석되었다.
일부 조합 접근법에서는 다중 다양성 부위를 갖는 다관능성 스캐폴드(scafold), 및 이러한 부위를 다양한 빌딩 블럭으로 유도체화시켜 다양한 소형 분자 화합물의 라이브러리를 형성시키는 것이 사용된다. 각각의 개별적인 화합물이 별도로 합성 및 단리될 수 있거나, 또는 여러 바람직한 화합물들의 혼합물로서 합성 및 사용될 수 있도록 라이브러리가 생성될 수 있다. 화합물들의 혼합물은 스캐폴드 및/또는 빌딩 블럭의 혼합물을 사용하여 수득할 수 있다.
조합 라이브러리의 다양성은 사용된 각각의 스캐폴드 및 빌딩 블럭의 고유의물리적 및 화학적 성질, 각각의 유도체화 단계에서 사용된 여러 빌딩 블럭의 수, 유도체화 화학에서 발생한 결합의 물리적 및 화학적 성질, 및 스캐폴드와 빌딩 블럭 화학의 상호작용에 의해 표현된다. 함께 사용되어, 이러한 상호작용은 조합 라이브러리 내의 각각의 개별적인 화합물에 대한 독특한 형상을 제공한다.
본 발명의 중합체성 비드 지지체는 이같은 조합 방법에 의해 합성되는 임의의 광범위한 단량체성 및 올리고머성 단량체의 제조에 적용가능한다. 여기에는 통상적인 소형 분자 약물, 및 더 큰 종 예컨대 올리고머성 펩티도모방체(peptidomimetic), 펩토이드(peptoid), 및 뉴클레오티드, 뿐만 아니라 기타 예비구성(preorganized) 또는 강성 스캐폴드로부터 유도된 올리고머성 분자가 포함된다.
예를 들어, 산, 아민 및 아미노산은 다양한 관능기와의 반응성 및 상업적인 공급원으로부터의 다양한 구조의 다수의 이같은 화합물의 이용가능성으로 인해 조합 화학에서의 용도가 중대한 것으로 인식되는 빌딩 블럭의 부류이다. 예를 들어, 아미노산은 소형 분자 조합 라이브러리의 합성에서 널리 사용되었다. 치환된 헤테로고리 라이브러리의 구축에서 주요 빌딩 블록으로 아미노산을 사용하는 것은 여러 집단에 의해 공지된 약물작용발생단(pharmacophore)의 연구를 위해, 고리형 요소에서 및 답사용(prospecting) 라이브러리에서 실행되었다 ([Bunin and Ellman, J. Am. Chem. Soc, 1992, 114, 10997]; [DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6909]; [Nefzi, et al., Tetrahedron Lett., 1997, 38, 931]; [Bartlett, et al., Book of Abstracts, 213th American Chemical Society National Meeting, San Francisco, 1997, American Chemical Society, Washington D.C., ORGN-273]).
일부 조합 절차에서, 스캐폴드는 복수의 차폐된 (즉, 보호된) 관능기 (다양성 부위)를 갖는다. 모든 다양성 부위는 보호 및 탈보호 계획이 자연적으로 직교이도록, 즉 임의의 다른 차폐기의 통합성에 영향을 미치지 않으면서 선택적으로 탈보호될 수 있도록 하는 방식으로 보호 또는 차폐된다. 이는 올리고머성 또는 단량체성 화합물의 합성 동안 스캐폴드가 부착 또는 구축될 때 개별적인 다양성 부위들이 선택적으로 관능화되도록 한다. 별법적으로, 또한 이는, 원한다면, 다중 다양성 부위가 동시에 반응되도록 한다.
다양성 부위는 다양한 빌딩 블럭과 조합될 수 있다. 조합에 이용가능한 부위로는 반응성 아미노 및 히드록시기가 포함된다. 다양성 부위에서의 스캐폴드의 유도체화는 카르복실산, 산 할로겐화물, 무수물, 술폰산, 술포닐 할로겐화물, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 케톤, 알데히드, 아민 및 아미노산이 포함되지만 이에 한정되지 않는 여러가지 빌딩 블럭을 사용하여 달성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 고체 지지체에 부착된 단환식 또는 이환식 스캐폴드 상에 관능기를 부가하는 것을 제공한다. 조합 라이브러리의 제조는 직접적으로 또는 합성 조건에 대해 안정적이지만 합성 말기에 절단되어 화합물을 용액 내로 방출할 수 있는 링커를 통해 고체 지지체에 부착된 단환식 또는 이환식 스캐폴드로 시작된다. 바람직한 링커에는 에스테르, 특히 숙신산으로부터 유도된 것들이 포함된다. 별법적으로, 지지체에 부착된 불변 모이어티, 예컨대 DMT, 에틸렌 글리콜 또는 유사한 디올에 스캐폴드가 커플링될 수 있다.
스캐폴드는 균일할 수 있거나, 또는 관능기 및 매달린 다양한 치환체의 여러 상대적인 배향을 제공하는 단환식 및/또는 이환식 고리 시스템의 구조적으로 다양한 집단일 수 있다. 보호된 히드록시 또는 아미노기 또는 원한다면 빌딩 블럭과 선택적으로 반응할 수 있는 기타 차폐된 관능기의 형태로 추가적인 조합 부위가 스캐폴드 상에 존재할 수 있다. 조합 라이브러리에서 사용된 스캐폴드 및 빌딩 블럭은, 함께 사용되어, 생성된 라이브러리 구성원에 다양한 성질 ("다양성")을 제공하는 여러 관능기를 갖는다. 이러한 관능기에는 수소-결합 공여체 및 수용체, 이온성 모이어티, 극성 모이어티, 소수성 모이어티, 방향족 모이어티, 및 전자-공여체 및 수용체가 포함된다. 다함께, 개별적인 스캐폴드 및 빌딩 블럭들의 성질은 이들이 발견된 개별적인 화합물의 독특함에 기여한다. 따라서, 이같은 화합물들의 라이브러리는 무수한 성질, 즉 "다양성"을 가질 것이다. 총괄적으로, 개별적인 라이브러리 화합물을 함께 형성하는 개별적인 스캐폴드 및 빌딩 블럭들의 성질은 화합물의 독특함에 기여하고, 세포성, 효소성 또는 핵산 표적 부위와의 상호작용을 위한 특정 특성을 이에 부여한다.
본원에서 사용된 용어 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식의 괄호 [ ] 내에 포함된 서브유닛을 m개 갖는 올리고머를 의미한다:
올리고뉴클레오티드
Figure 112007024999891-pct00047
[식중 기타 변수들은 상기 정의되어 있고, 하기에 더욱 상세하게 기술된다]. 제조되는 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 형상으로 도시되지만, 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥 형상으로 사용되는 것이 일반적인 것으로 이해된다. 예를 들어, 일반적으로 siRNA로 지칭되는 안티센스 방법에서, 두 가닥의 RNA 또는 RNA-유사 올리고뉴클레오티드가 제조되어 함께 어닐링(anealing)되고, 2개의 뉴클레오티드가 종종 말단에서 오버랩된다. 따라서, 단일 가닥 및 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 모두의 제작이 본 발명에서 구현된다.
핵염기
핵염기 Bx는 동일하거나 상이할 수 있고, 천연 발생 핵염기 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U) 및 사이토신 (C), 뿐만 아니라 변형된 핵염기를 포함한다. 변형된 핵염기는 천연-발생 핵염기에 구조적으로 관련되지만 화학적으로 변형되어 천연-발생 핵염기가 지니지 않은 일부 성질을 변형된 핵염기에 부여하는 헤테로고리형 모이어티를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "핵염기"는 "핵산 염기 또는 이의 모방체"와 동의어인 것으로 의도된다. 일반적으로, 핵염기는 올리고뉴클레오티드의 염기에 수소 결합할 수 있는 1개 이상의 원자 또는 원자의 기를 함유하는 임의의 구조이다.
본원에서 사용된 용어 "비변형" 또는 "천연" 핵염기에는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 사이토신 (C) 및 우라실 (U)이 포함된다. 변형된 핵염기에는 기타 합성 및 천연 핵염기 예컨대 5-메틸사이토신 (5-m-C), 5-히드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3) 우라실 및 사이토신 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다. 추가적인 변형된 핵염기에는 삼환식 피리미딘 예컨대 페녹사진 사이티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 사이티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프(clamp) 예컨대 치환된 페녹사진 사이티딘 (예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 카르바졸 사이티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 사이티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)이 포함된다. 변형된 핵염기에는 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈과 같은 기타 헤테로고리로 퓨린 또는 피리미딘 염기가 대체된 것들이 포함된다. 추가적인 핵염기에는 미국 특허 3,687,808에 개시된 것들, [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들, 및 [Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것들이 포함된다.
일부 이러한 핵염기들은 본 발명의 올리고머성 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용하다. 여기에는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린 (2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신 포함)이 포함된다. 5-메틸사이토신 치환은 0.6-1.2 ℃만큼 핵산 듀플렉스(duplex) 안정성을 증가시키는 것으로 나타났고 ([Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 현재 바람직한 염기 치환이고, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우 더욱 특히 바람직하다.
일부 상기 언급된 변형된 핵염기 뿐만 아니라 기타 변형된 핵염기의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 상기 언급된 미국 특허 3,687,808, 뿐만 아니라 미국 특허 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 및 5,681,941 (이들 중 일부는 본 출원과 공동 소유이고, 각각 참조문헌으로 본원에 포함됨), 및 미국 특허 5,750,692 (본 출원과 공동 소유이고, 또한 참조문헌으로 본원에 포함됨)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 추가적인 변형이 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, 리간드가 접합된 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 한 추가적인 변형에는 올리고뉴클레오티드에 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포성 분포 또는 세포성 흡수를 증강시키는 1개 이상의 추가적인 비-리간드 모이어티 또는 접합체를 화학적으로 연결시키는 것이 수반된다. 이같은 모이어티에는 지질 모이어티 예컨대 콜레스테롤 모이어티 ([Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553]), 담즙산 ([Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053]), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 ([Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306]; [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765]), 티오콜레스테롤 ([Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533]), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 ([Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111]; [Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327]; [Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49]), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 ([Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651]; [Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 ([Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969]), 또는 아다만탄 아세트산 ([Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651]), 팔미틸 모이어티 ([Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229]), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 ([Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923])가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
이같은 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941가 포함되지만 이에 한정되지는 않고, 이들 중 일부는 본 출원과 공동 소유이고, 각각 참조문헌으로 본원에 포함된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 1개 이상의 헤테로고리형 염기 모이어티 대신 다환식 헤테로고리형 화합물을 갖는 올리고머성 화합물, 예를 들어 올리고뉴클레오티드가 제조된다. 다수의 삼환식 헤테로고리형 화합물이 종래에 보고되었다. 이러한 화합물들은 안티센스 용도에서 일상적으로 사용되어, 표적 가닥에 대한 변형된 가닥의 결합 성질을 증가시킨다. 가장 연구된 변형은 구아노신을 표적으로 하고, 따라서 이는 G-클램프 또는 사이티딘 유사체로 명명되었다. 많은 이러한 다환식 헤테로고리형 화합물은 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112007024999891-pct00048
두번째 가닥 내의 구아노신과 3개의 수소 결합을 이루는 대표적인 사이토신 유사체로는 1,3-디아자페녹사진-2-온 (R10 = O, R11 - R14 = H) ([Kurchavov, et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846]), 1,3-디아자페노티아진-2-온 (R10 = S, R11 - R14 = H) ([Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873- 3874]) 및 6,7,8,9-테트라플루오로-1,3-디아자페녹사진-2-온 (R10 = O, R11 - R14 = F) ([Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388])이 포함된다. 올리고뉴클레오티드 내로 혼입된 이러한 염기 변형은 상보적인 구아닌과 혼성화하는 것으로 또한 나타났고, 후자는 아데닌과 혼성화하여, 확대된 스태킹(stacking) 상호작용에 의해 나선형 열 안정성을 증강시키는 것으로 또한 나타났다 (본 출원과 공동 소유이고, 참조문헌으로 전체적으로 본원에 포함된, 발명의 명칭이 "Modified Peptide Nucleic Acids"이고 2002년 5월 24일 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 10/155,920; 및 발명의 명칭이 "Nuclease Resistant Chimeric Oligonucleotides"이고 2002년 5월 24일 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 10/013,295 참조).
사이토신 유사체/치환체가 강성 1,3-디아자페녹사진-2-온 스캐폴드 (R10 = O, R11 = -O-(CH2)2-NH2, R12 -14 = H)에 부착된 아미노에톡시 모이어티를 가질 때 추가적인 나선-안정화 성질이 관찰되었다 ([Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532]). 결합 연구는 단일 혼입이 모델 올리고뉴클레오티드의 이의 상보적인 표적 DNA 또는 RNA에 대한 결합 친화력을 5-메틸 사이토신 (dC5me)에 비해 18°까지의 ΔTm으로 증강시킬 수 있다는 것을 나타냈고, 이는 단일 변형에 대한 가장 최고의 공지된 친화력 증강이다. 한편, 나선형 안정성에서의 이득은 올리고뉴클레오티드의 특이성을 손상시키지 않는다. Tm 데이타는 dC5me에 비해 완전한 매치(match)와 미스매칭된(mismatched) 서열 간의 더 큰 차이를 나타낸다. 속박된(tethered) 아미노기가 상보적인 구아닌의 후그스틴(Hoogsteen) 면(面), 즉 O6와 상호작용하여 4개의 수소 결합을 형성하는 추가적인 수소 결합 공여체로서 작용한다는 것이 제안되었다. 이는 G-클램프의 증가된 친화력이 확대된 염기 스태킹과 추가적인 특이적 수소 결합의 조합에 의해 매개된다는 것을 의미한다.
본 발명에 적용가능한 추가적인 삼환식 헤테로고리형 화합물 및 이의 사용 방법이 미국 특허 일련 번호 6,028,183 (2000년 5월 22일 허여), 및 미국 특허 일련 번호 6,007,992 (1999년 12월 28일 허여)에 개시되어 있고, 이들의 내용은 일반적으로 본 출원에 할당되고, 참조문헌으로 전체적으로 본원에 포함된다. 이같은 화합물에는 하기의 화학식을 갖는 것들이 포함된다:
Figure 112007024999891-pct00049
식중 R11에는 (CH3)2N-(CH2)2-O-; H2N-(CH2)3-; Ph-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)3-; H2N-; 플루오로페닐-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)3-; 프탈이미딜-CH2-O-C(=O)-N(H)- (CH2)3-; Ph-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)2-O-; Ph-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)3-O-; (CH3)2N- N(H)-(CH2)2-O-; 플루오레닐-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)2-O-; 플루오레닐-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)3-O-; H2N-(CH2)2-O-CH2-; N3-(CH2)2-O-CH2-; H2N-(CH2)2-O-, 및 NH2C(=NH)NH-가 포함된다.
하기 화학식의 삼환식 헤테로고리형 화합물이 또한 개시된다:
Figure 112007024999891-pct00050
[식중:
R10a는 O, S 또는 N-CH3이고; R11a는 A(Z)x1이고, 식중 A는 스페이서이고, Z는 독립적으로 검출가능한 표지에 임의로 결합된 표지 결합기이지만, R11a는 아민, 보호된 아민, 니트로 또는 시아노가 아니고; X1은 1, 2 또는 3이고; Rb는 독립적으로 -CH=, -N=, -C(C1 -8 알킬)= 또는 -C(할로겐)=이지만, 인접한 Rb가 모두 -N=이지 않거나, 또는 2개의 인접한 Rb가 함께 하기 화학식의 고리를 형성하고:
Figure 112007024999891-pct00051
식중 Rc는 독립적으로 -CH=, -N=, -C(C1 -8 알킬)= 또는 -C(할로겐)=이지만, 인접한 Rb가 모두 -N=이지 않다].
손상되지 않은 서열 특이성과 함께 페녹사진 유도체의 증강된 결합 친화력은 이들이 더욱 강력한 안티센스-기재 약물의 개발을 위한 유용한 핵염기 유사체이도록 한다. 실제로, 페녹사진 치환을 함유하는 헵타뉴클레오티드가 RNA분해효소H를 활성화시킬 수 있고, 세포성 흡수를 증강시키고, 증가된 안티센스 활성을 나타낸다는 것을 나타내는 유망한 데이타가 시험관내 실험에서 유도되었다 ([Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532]). 단일 치환이 20량체 2'-데옥시포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 생체내 효능을 상당히 개선시키는 것으로 나타난 바와 같이 활성 증강은 G-클램프의 경우에 더욱 더 표명되었다 ([Flanagan, W. M.; Wolf, J.J.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513- 3518]). 그럼에도 불구하고, 올리고뉴클레오티드 디자인을 최적화시키고, 생물학적 활성에 대한 이러한 헤테로고리형 변형의 영향을 더 잘 이해하기 위해, 올리고머의 뉴클레아제 안정성에 대한 이의 효과를 평가하는 것이 중요하다.
본 발명에 적용가능한 추가적인 삼환식 및 사환식 헤테로아릴 화합물에는 하기 화학식을 갖는 것들이 포함된다:
Figure 112007024999891-pct00052
[식중 R14는 NO2이거나 또는 R14 및 R12 모두 독립적으로 -CH3이다]. 이러한 화합물의 합성은 미국 특허 일련 번호 5,434,257 (1995년 7월 18일 허여), 미국 특허 일련 번호 5,502,177 (1996년 3월 26일 허여), 및 미국 특허 일련 번호 5,646, 269 (1997년 7월 8일 허여)에 개시되어 있고, 이들의 내용은 일반적으로 본 출원에 할당되고, 전체적으로 본원에 포함된다.
본 발명에 적용가능한 추가적인 삼환식 헤테로고리형 화합물은 "257, 177 및 269" 특허에 또한 개시되어 있고, 하기 화학식을 갖는 것들, 이의 토토머(tautomer), 용매화물 또는 염을 포함한다:
Figure 112007024999891-pct00053
[식중 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고 a와 b의 합은 0 또는 1이고; A는 N, C 또는 CH이고; X는 S, O, C=O, NH 또는 NCH2, R6이고; Y는 C=O이고; Z는 A와 함께 5 또는 6개의 고리 원자를 포함하는 아릴 또는 헤테로아릴 고리 구조를 형성하고, 헤테로아릴 고리는 1개의 O 고리 헤테로원자, 1개의 N 고리 헤테로원자, 1개의 S 고리 헤테로원자, 탄소 원자에 의해 분리된 1개의 O 및 1개의 N 고리 헤테로원자, C 원자에 의해 분리된 1개의 S 및 1개의 N 고리 헤테로원자, 탄소 원자에 의해 분리된 2개의 N 고리 헤테로원자, 또는 2개 이상이 탄소 원자에 의해 분리된 3개의 N 고리 헤테로원자를 포함하고, 아릴 또는 헤테로아릴 고리 탄소 원자는 H 이외의 것으로 치환되지 않거나 또는 다리를 형성하지 않는 1개 이상의 고리 탄소 원자가 R20 또는 =O로 치환되거나; 또는 Z는 A와 함께 6개의 고리 원자를 포함하는 아릴 고리 구조를 형성하고, 아릴 고리 탄소 원자는 H 이외의 것으로 치환되지 않거나 또는 다리를 형성하지 않는 1개 이상의 고리 탄소 원자가 R6 또는 =O로 치환되고; R6는 독립적으로 H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, NO2, N(R3)2, CN 또는 할로이거나, 또는 R6는 인접한 Z 기의 R6와 함께 페닐 고리를 완성시키고; R20은 독립적으로 H, C1 -6 알킬, C2 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, NO2, N(R21)2, CN, 또는 할로이거나, 또는 R20은 인접한 R20과 함께 5 또는 6개의 고리 원자를 함유하는 고리를 완성시키고; R21은 독립적으로 H 또는 보호기이고; R3는 보호기 또는 H이다].
"257, 177 및 269" 특허에 포함된 염기의 더욱 구체적인 예는 하기 화학식의 화합물들이다:
Figure 112007024999891-pct00054
[식중, 각각의 R16은 독립적으로 수소 및 다양한 치환체 기로부터 선택된다].
하기의 화학식을 갖는 추가적인 다환식 염기 모이어티가 본 출원과 공동 소유이고 참조문헌으로 본원에 포함된 미국 특허 출원 일련 번호 09/996,292 (2001년 11월 28일 출원)에 개시되어 있다:
Figure 112007024999891-pct00055
[식중 A6는 O 또는 S이고; A7은 CH2, N-CH3, O 또는 S이고; 각각의 A8 및 A9는 수소이거나, 또는 A8 및 A9 중 1개는 수소이고 A8 및 A9 중 다른 1개는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure 112007024999891-pct00056
(식중 G는 -CN, -OA10, -SA10, -N(H)A10, -ON(H)A10 또는 -C(=NH)N(H)A10이고; Q1은 H, -NHA10, -C(O)N(H)A10, -C(=S)N(H)A10 또는 -C(=NH)N(H)A10이고; 각각의 Q2는 독립적으로 H 또는 Pg이고; A10은 H, Pg, 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬, 아세틸, 벤질, -(CH2)p3NH2, -(CH2)p3N(H)Pg, D 또는 L α-아미노산, 또는 D, L 또는 라세믹 α-아미노산으로부터 유도된 펩티드이고; Pg는 질소, 산소 또는 티올 보호기이고; 각각의 p1은 독립적으로 2 내지 약 6이고; p2는 1 내지 약 3이고; p3는 1 내지 약 4이다)].
당 및 당 치환
하기 화학식의 당 모이어티는 본 발명에 의해 구현되는 바와 같은 일반적인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 당 부분을 나타낸다:
Figure 112007024999891-pct00057
[식중 각각의 점선 (----)은 인접한 인 원자에 대한 부착점을 가리킨다].
R'2에 해당되는 적절한 2'-치환체에는 OH, F, O-알킬 (예를 들어 O-메틸), S-알킬, N-알킬, O-알케닐, S-알케닐, N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐, N-알키닐; O-알킬- O-알킬이 포함되고, 이때 알킬, 알케닐 및 알키닐은 각각 치환 또는 비치환 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 또는 알키닐이다. O[(CH2)gO]hCH3, O(CH2)gOCH3, O(CH2)gNH2, O(CH2)gCH3, O(CH2)gONH2, 및 O(CH2)gON[(CH2)gCH3]2 (식중 g 및 h는 1 내지 약 10이다)가 특히 바람직하다. 기타 바람직한 올리고뉴클레오티드는 하기의 것들 중 하나를 2' 위치에 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 성질을 갖는 기타 치환체. 바람직한 2'-변형에는 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 또한 공지됨)가 포함된다 ([Martin et al., Helv. Chim, Acta, 1995, 78, 486-504]). 추가적인 바람직한 변형에는 하기의 실시예에 기술된 바와 같은 2'-DMAOE로 또한 공지된 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 하기의 실시예에 또한 기술된 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (2'-O-디메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로 당업계에 또한 공지됨), 즉, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2가 포함된다.
기타 바람직한 변형에는 2'-메톡시 (2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'- OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴 (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴 (2'-O-CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)가 포함된다. 2'-변형은 아라비노 (상향) 위치 또는 리보 (하향) 위치에 존재할 수 있다. 바람직한 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형이 올리고뉴클레오티드 상의 또다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 또는 5' 말단 뉴클레오티드의 2'-5' 연결 올리고뉴클레오티드 및 5' 위치에서 또한 이루어질 수 있다.
추가적인 대표적인 치환체 기로는 화학식 Ia 또는 IIa의 기가 포함된다:
Figure 112007024999891-pct00058
[식중: Rb는 O, S 또는 NH이고; Rd는 단일 결합, O 또는 C(=O)이고; Re는 C1-C10 알킬, N(Rk)(Rm), N(Rk)(Rn), N=C(Rp)(Rq), N=C(Rp)(Rr)이거나 또는 하기의 화학식 IIIa:
Figure 112007024999891-pct00059
를 갖는다].
각각의 Rs, Rt, Ru 및 Rv는 독립적으로 수소, C(O)RW, 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환 C2-C10 알키닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 화학 관능기 또는 공액 기 (식중 치환체 기는 히드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 선택된다)이거나; 또는 임의로, Ru 및 Rv는 함께 이들이 부착된 질소 원자와 함께 프탈이미도 모이어티를 형성하고; 각각의 Rw는 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬, 트리플루오로메틸, 시아노에틸옥시, 메톡시, 에톡시, t-부톡시, 알릴옥시, 9-플루오레닐메톡시, 2-(트리메틸실릴)-에톡시, 2,2,2-트리클로로에톡시, 벤질옥시, 부티릴, 이소-부티릴, 페닐 또는 아릴이고; Rk는 수소, 질소 보호기 또는 -Rx-Ry이고; Rp는 수소, 질소 보호기 또는 -Rx-Ry이고; Rx는 결합 또는 연결 모이어티이고; Ry는 화학 관능기, 공액 기 또는 고체 지지체 매체이고; 각각의 Rm 및 Rn은 독립적으로 H, 질소 보호기, 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환 C2-C10 알키닐 (식중 치환체 기는 히드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐로부터 선택된다), NH3 +, N(Ru)(Rv), 구아니디노 및 아실 (식중 아실은 산 아미드 또는 에스테르이다)이거나; 또는 Rm 및 Rn은, 함께, 질소 보호기이거나, N 및 O로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 임의로 포함하는 고리 구조에서 연결되거나, 또는 화학 관능기이고; Rj는 ORz, SRz, 또는 N(Rz)2이고; 각각의 R2는 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C1-C8 할로알킬, C(=NH)N(H)Ru, C(=O)N(H)Ru 또는 OC(=O)N(H)Ru이고; Rf, Rg 및 Rh는 약 4 내지 약 7개의 탄소 원자를 갖거나 약 3 내지 약 6 탄소 원자 및 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 고리 시스템을 포함하고, 상기 고리 시스템은 지방족, 불포화 지방족, 방향족, 또는 포화 또는 불포화 헤테로고리형이다.
Rj는 1 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 할로알킬, 2 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 2 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 알키닐, 6 내지 약 14개의 탄소 원자를 갖는 아릴, N(Rk)(Rm) ORk, 할로, SRk 또는 CN이고; ma는 1 내지 약 10이고; 각각의 mb는 독립적으로 0 또는 1이고; mc는 0 또는 1 내지 10의 정수이고; md는 1 내지 10의 정수이고; me는 0, 1 또는 2이고; 단, mc는 0일 때, md는 1을 초과한다.
화학식 I의 대표적인 치환체 기는 미국 특허 6,172,209에 개시되어 있다. 화학식 II의 대표적인 고리형 치환체 기는 미국 특허 6,271,358에 개시되어 있다.
특히 유용한 당 치환체 기로는 O[(CH2)gO]hCH3, O(CH2)gOCH3, O(CH2)gNH2, O(CH2)gCH3, 0(CH2)gONH2 및 O(CH2)gON[(CH2)gCH3)]2 (식중 g 및 h는 1 내지 약 10이다)가 포함된다.
일부 특히 유용한 본 발명의 올리고머성 화합물은 하기의 치환체 기 중 1개를 갖는 뉴클레오시드를 1개 이상 함유한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 성질을 갖는 기타 치환체. 바람직한 변형에는 2'-메톡시에톡시 [2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 또한 공지됨] ([Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486]), 즉, 알콕시알콕시 기가 포함된다. 추가적인 바람직한 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로 또한 공지된 O(CH2)2ON(CH3)2 기이다. 대표적인 아미노옥시 치환체 기는 참조문헌으로 전체적으로 본원에 포함된, 1999년 6월 25일 출원되고 발명의 명칭이 "Aminooxy-Functionalized Oligomers"인 공동 소 유의 미국 특허 출원 일련 번호 09/344,260; 및 1999년 8월 9일 출원되고 발명의 명칭이 "Aminooxy-Functionalized Oligomers and Methods for Making Same"인 미국 특허 출원 일련 번호 09/370,541에 기술되어 있다.
기타 특히 유리한 2'-변형에는 2'-메톡시 (2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)가 포함된다. 유사한 변형이 뉴클레오시드 및 올리고머 상의 또다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오시드 상의 당의 3' 위치에서 또는 2'-위치로부터의 결합을 갖는 뉴클레오시드 예컨대 2'-5' 연결 올리고머의 3'-위치에서 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 또한 이루어질 수 있다. 올리고머는 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 또한 가질 수 있다. 이같은 변형된 당 구조물의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,0531 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920 (이들 중 일부는 공동 소유이고, 각각 참조문헌으로 본원에 포함됨), 및 공동 소유의 미국 특허 출원 08/468,037 (1995년 6월 5일 출원되고, 또한 참조문헌으로 본원에 포함됨)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
화학식 III 및 IV에 제시된 대표적인 구아니디노 치환체 기는 발명의 명칭이 "Functionalized Oligomers"이고, 1999년 7월 7일 출원되었으며, 2002년 10월 23일에 등록료가 납부된 공동 소유의 미국 특허 출원 09/349,040에 개시되어 있다.
대표적인 아세트아미도 치환체 기는 참조문헌으로 전체적으로 본원에 포함된 미국 특허 6,147,200에 개시되어 있다. 대표적인 디메틸아미노에틸옥시에틸 치환체 기는 발명의 명칭이 "2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Modified Oligonucleotides"이고 1999년 8월 6일 출원된 국제 특허 출원 PCT/US99/17895에 개시되어 있고, 이는 참조문헌으로 전체적으로 본원에 포함된다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 이러한 뉴클레오시드에, 포스페이트 기가 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 형성에서, 포스페이트 기는 인접한 뉴클레오시드들을 서로 공유결합으로 연결시켜 선형 중합체성 화합물을 형성시킨다. 이러한 선형 중합체성 구조의 각각의 말단이 혼성화 또는 공유 결합의 형성에 의해 연결되어 원형 구조를 형성할 수 있지만, 개방형 선형 구조가 일반적으로 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트 기는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 간 결합을 형성하는 것으로 일반적으로 지칭된다. RNA 및 DNA의 정상적인 뉴클레오시드 간 결합은 3'에서 5'으로의 포스포디에스테르 결합이다.
본 발명이 임의의 원하는 최종 용도를 위한 올리고뉴클레오티드를 생산하는데 적용될 수 있지만 (예를 들어 중합효소 연쇄 반응에서 사용하기 위한 프로브로서), 올리고뉴클레오티드의 한 바람직한 용도는 안티센스 요법에서의 용도이다. 안티센스 요법에서 종종 사용되는 한가지 작용 방식은 DNA 가닥이 세포 내로 도입되어, 이 DNA가 RNA 가닥에 혼성화되는 소위 RNA분해효소 H 메카니즘이다. DNA-RNA 하이브리드는 제한효소인 RNA분해효소 H에 의해 인지되고, 이는 RNA 가닥을 절 단한다. 정상적인 경우에, RNA 가닥은 전령 RNA (mRNA)이고, 이는 절단된 후 리보솜에서 상응하는 펩티드 또는 단백질 서열로 번역될 수 없다. 이러한 방식으로, DNA가 특정 유전자의 발현을 조절하는 작용제로서 사용될 수 있다.
DNA의 짧은 신축물을 올리고뉴클레오티드 내로 혼입시킴으로써, 표적 펩티드 또는 단백질의 발현을 조정하는데 RNA분해효소 H 메커니즘을 효과적으로 사용할 수 있다는 것이 발견되었다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DNA 신축물 및 RNA 또는 2'-변형 RNA의 신축물이 혼입된 올리고뉴클레오티드를 유전자 발현을 효과적으로 조절하는데 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2개의 2'-변형 RNA 신축물이 플랭킹된(flanked) DNA 신축물을 포함한다. 바람직한 2'-변형에는 본원에 기술된 바와 같은 2'-MOE가 포함된다.
리보실 당 모이어티를 또한 광범위하게 연구하여, 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드와 비교하여 올리고뉴클레오티드의 성질에 대한 변형 효과를 평가하였다. 당 모이어티의 2'-위치는 변형에 대해 가장 많이 연구된 부위 중 하나이다. 특정 2'-치환체 기는 친지성을 증가시키고 올리고뉴클레오티드의 표적 RNA에 대한 결합 친화력, 화학적 안정성 및 핵산분해효소 저항성과 같은 성질을 증강시키는 것으로 나타났다. 증강된 결합 친화력을 나타내는 2'-위치에서의 많은 변형은 또한 당 고리가 C3-엔도 형상이 되도록 한다.
RNA는 "A 형태" 기하배열로 명명된 것으로 존재하고, DNA는 "B 형태" 기하배열로 존재한다. 일반적으로, RNA:RNA 듀플렉스는 DNA:DNA 듀플렉스보다 더욱 안정 하거나, 융점 (Tm)이 더 높다 ([Sanger et al., Principles of Nucleic Acid Structure, 1984, Springer-Verlag; New York, NY.]; [Lesnik et al., Biochemistry, 1995, 34, 10807-10815]; [Conte et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25, 2627-2634]). RNA의 증가된 안정성은 여러 구조적 특징에 귀착되었고, 가장 현저하게는 개선된, A-형태 기하배열로부터 생성된 염기 스태킹 상호작용에 귀착되었다 ([Searle et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056]). RNA 내의 2' 히드록실의 존재는 당이 C3' 엔도 푸커(pucker), 즉, 노던(Northern) 푸커로 또한 명명된 푸커로 편향되도록 하고, 이는 듀플렉스가 A-형태 기하배열을 선호하도록 야기한다. 반면에, 데옥시 핵산은 C2' 엔도 당 푸커, 즉, 서던(Southern) 푸커로 또한 공지된 푸커를 선호하고, 이는 덜 안정적인 B-형태 기하배열을 부여하는 것으로 생각된다 ([Sanger, W. (1984) Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, New York, NY]). 또한, RNA의 2' 히드록실기는 물에 의해 매개되는 수소 결합의 네트워크를 형성할 수 있고, 이는 RNA 듀플렉스를 안정화시키는 것을 돕는다 ([Egli et al., Biochemistry, 1996, 55, 8489-8494]).
그러나, DNA:RNA 하이브리드 듀플렉스는 순수한 RNA:RNA 듀플렉스보다 일반적으로 덜 안정적이고, 이들의 서열에 따라 DNA:DNA 듀플렉스보다 더 또는 덜 안정적일 수 있다 ([Searle et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056]). 하이브리드 듀플렉스의 구조는 A-형상 기하배열과 B-형상 기하배열의 중간이고, 이로써 스태킹 상호작용이 불량해질 수 있다 ([Lane et al., Eur. J. Biochem., 1993, 215, 297-306]; [Fedoroff et al., J. Mol. Biol., 1993, 233, 509-523]; [Gonzalez et al., Biochemistry, 1995, 34, 4969-4982]; [Horton et al., J. Mol. Biol., 1996, 264, 521-533]). DNA:RNA 하이브리드의 안정성은 안티센스 요법에서 중심적인데, 이는 메커니즘이 변형된 DNA 가닥이 mRNA 가닥에 결합하는 것을 필요로 하기 때문이다. mRNA를 효과적으로 억제하기 위해, 안티센스 DNA는 mRNA와의 결합 친화력이 매우 높아야 한다. 그렇지 않으면, DNA와 표적 mRNA 가닥 간의 원하는 상호작용이 드물게 발생함으로써, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능이 감소한다.
핵산분해효소 저항성을 개선시키거나, 또는 안티센스 가닥의 이의 표적 mRNA에 대한 친화력을 증강시키기 위해 다양한 합성 변형이 제안되었다 ([Crooke et al., Med. Res. Rev., 1996, 16, 319-344]; [De Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res., 1995, 28, 366-374]). 올리고뉴클레오티드 내의 천연의, 쉽게 분해되는 포스포디에스테르 결합의 대체물로서 다양한 변형된 인-함유 결합이 연구되었다. 일반적으로, 이들의 대부분, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포네이트 및 모스포로디티오에이트 모두의 경우에 상보적인 표적에 대한 결합이 감소되고 하이브리드 안정성이 저하된 올리고뉴클레오티드가 생성되었다.
RNA는 "A 형태" 기하배열로 명명된 것으로 존재하고, DNA는 "B 형태" 기하배열로 존재한다. 일반적으로, RNA:RNA 듀플렉스는 DNA:DNA 듀플렉스보다 더욱 안정하거나, 융점 (Tm)이 더 높다 ([Sanger et al., Principles of Nucleic Acid Structure, 1984, Springer-Verlag; New York, NY.]; [Lesnik et al., Biochemistry, 1995, 34, 10807-10815]; [Conte et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25, 2627-2634]). RNA의 증가된 안정성은 여러 구조적 특징에 귀착되었고, 가장 현저하게는 개선된, A-형태 기하배열로부터 생성된 염기 스태킹 상호작용에 귀착되었다 ([Searle et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056]). RNA 내의 2= 히드록실의 존재는 당이 C3= 엔도 푸커, 즉, 노던 푸커로 또한 명명된 푸커로 편향되도록 하고, 이는 듀플렉스가 A-형태 기하배열을 선호하도록 야기한다. 반면에, 데옥시 핵산은 C2' 엔도 당 푸커, 즉, 서던 푸커로 또한 공지된 푸커를 선호하고, 이는 덜 안정적인 B-형태 기하배열을 부여하는 것으로 생각된다 ([Sanger, W. (1984) Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, New York, NY]). 또한, RNA의 2= 히드록실기는 물에 의해 매개되는 수소 결합의 네트워크를 형성할 수 있고, 이는 RNA 듀플렉스를 안정화시키는 것을 돕는다 ([Egli et al., Biochemistry, 1996, 55, 8489-8494]).
그러나, DNA:RNA 하이브리드 듀플렉스는 순수한 RNA:RNA 듀플렉스보다 일반적으로 덜 안정적이고, 이들의 서열에 따라 DNA:DNA 듀플렉스보다 더 또는 덜 안정적일 수 있다 ([Searle et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056]). 하이브리드 듀플렉스의 구조는 A-형상 기하배열과 B-형상 기하배열의 중간이고, 이로써 스태킹 상호작용이 불량해질 수 있다 ([Lane et al., Eur. J. Biochem., 1993, 215, 297-306]; [Fedoroff et al., J. Mol. Biol., 1993, 233, 509-523]; [Gonzalez et al., Biochemistry, 1995, 34, 4969-4982]; [Horton et al., J. Mol. Biol., 1996, 264, 521-533]). DNA:RNA 하이브리드의 안정성은 안티센스 요법의 주요 양상인데, 이는 제안된 메커니즘이 변형된 DNA 가닥이 mRNA 가닥에 결합하는 것을 필요로 하기 때문이다. 이상적으로, 안티센스 DNA는 mRNA와의 결합 친화력이 매우 높아야 한다. 그렇지 않으면, DNA와 표적 mRNA 가닥 간의 원하는 상호작용이 드물게 발생함으로써, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능이 감소한다
증가된 핵산분해효소 저항성 및 뉴클레오티드에 대한 매우 높은 결합 친화력을 부여하는 한 합성 2'-변형은 2=-메톡시에톡시 (MOE, 2'-OCH2CH2OCH3) 측쇄이다 ([Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000]; [Freier et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25, 4429-4443]). MOE 치환의 즉각적인 장점 중 하나는 결합 친화력에서의 개선이고, 이는 많은 유사한 2' 변형 예컨대 O-메틸, 0-프로필, 및 O-아미노프로필보다 크다 ([Freier and Altmann, Nucleic Acids Research, (1997) 25:4429-4443]). 2=-O-메톡시에틸-치환 올리고뉴클레오티드는 생체내 사용에 대해 유망한 특징을 갖는 유전자 발현의 안티센스 억제제인 것으로 또한 나타났다 ([Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]; [Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176]; [Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637]; 및 [Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926]). DNA와 비교하여, 이는 개선된 RNA 친화력 및 더 높은 핵산분해효소 저항성을 나타낸다. 2=-O-메톡시에틸-리보뉴클레오시드 날개 및 중앙의 DNA-포스포로티오에이트 창이 있는 키메라 올리고뉴클레오티드는 저용량에서 동물 모델에서 종양의 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 또한 나타났다. MOE 치환 올리고뉴클레오티드는 여러 질환 상태에서 안티센스 작용제로서 눈에 띄는 전망을 나타냈다. 한 이같은 MOE 치환 올리고뉴클레오티드는 CMV 망막염의 치료를 위한 임상 시험에서 현재 연구되고 있다.
LNA (2' 및 4' 위치가 다리에 의해 연결된 올리고뉴클레오티드) 또한 열 안정성이 높은, 상보적인 DNA, RNA 또는 LNA와의 듀플렉스를 형성한다. 원편광 이색성 (CD: circular dichroism) 스펙트럼은 완전히 변형된 LNA가 수반된 듀플렉스 (특히 LNA:RNA)가 A-형태의 RNA:RNA 듀플렉스와 구조적으로 유사하다는 것을 나타낸다. LNA:DNA 듀플렉스의 핵 자기 공명 (NMR: nuclear magnetic resonance) 조사로 LNA 단량체의 3'-엔도 형상이 확인되었다. 이중 가닥 DNA의 인식이 또한 증명되었고, 이는 LNA에 의한 가닥 침입을 시사한다. 미스매치된 서열의 연구는 LNA가 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍형성 규칙을 따르고, 상응하는 변형되지 않은 기준 가닥에 비해 선택성이 일반적으로 개선된 것을 나타낸다.
2'-히드록실기가 당 고리의 4' 탄소 원자에 연결된 LNA에서는 2'-C,4'-C-옥시메틸렌 결합이 형성되고, 따라서 이환식 당 모이어티가 형성된다. 결합은 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 다리연결시키는 메틸렌 (-CH2-)n 기 (식중 n은 1 또는 2이다)일 수 있다 ([Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456]). LNA 및 LNA 유사체는 상보적인 DNA 및 RNA와의 매우 높은 듀플렉스 열 안정성 (Tm = +3 내지 +10 ℃), 3'-엑소누클레아제(exonucleolytic) 분해에 대한 안정성 및 양호한 용해도 성질을 나타낸다. 기타 바람직한 다리 기에는 2'-데옥시-2'-CH2OCH2-4' 다리가 포함된다.
별법적인 링커
포스페이트 디에스테르 및 포스포로티오에이트 디에스테르 결합에 더하여, 또다른 링커들이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 일차적인 관심은 포스페이트 디에스테르 및 포스포로티오에이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드에 관한 것이어야 하지만, 1가지 유형을 초과하는 결합을 갖는 키메라 화합물, 뿐만 아니라 하기에 더욱 상세하게 기술되는 바와 같은 비-포스페이트/포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 갖는 올리고머 또한 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 문맥에서 구현된다.
당업계의 기술 내에서 구현되는 예시적인 비-포스페이트/포스포로티오에이트 디에스테르 결합에는 하기의 것들이 포함된다: 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트 (3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄(chiral) 포스포네이트 포함), 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트 포함), 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트. 추가적인 결합에는 하기의 것들이 포함된다: 티오디에스테르 (-O-C(O)-S-), 티오노카르바메이트 (-O-C(O)(NJ)-S-), 실록산 (-O-Si(J)2-O-), 카르바메이트 (-O-C(O)-NH- 및 -NH-C(O)-O-), 술파메이트 (-O-S(O)(O)-N- 및 -N-S(O)(O)-N-, 모르폴리노 술파미드 (-O-S(O)(N(모르폴리노)-), 술폰아미드 (-O-SO2-NH-), 술피드 (-CH2-S-CH2-), 술포 네이트 (-O-SO2-CH2-), N,N'-디메틸히드라진 (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-), 티오포름아세탈 (-S-CH2-O-), 포름아세탈 (-O-CH2-O-), 티오케탈 (-S-C(J)2-O-), 케탈 (-O-C(J)2-O-), 아민 (-NH-CH2-CH2-), 히드록실아민 (-CH2-N(J)-O-), 히드록실이민 (-CH=N-O-), 및 히드라지닐 (-CH2-N(H)-N(H)-).
뉴클레오시드 간 결합에 관한 각각의 상기 하위구조에서, J는 통상적으로 수소 또는 알킬 기 또는 연결 유형에 따라 변하는 더욱 복잡한 기인 치환체 기를 나타낸다.
천연 발생 결합의 -O-P-O- 원자의 변형 또는 치환이 수반되는 상기 기술된 바와 같은 연결 기에 더하여, 5'-메틸렌 기 뿐만 아니라 1개 이상의 -O-P-O- 원자의 변형을 포함하는 연결기가 본 발명의 범주에 포함된다. 이러한 유형의 연결은 당업계에 잘 문서화되어 있고, 하기의 것들이 비제한적으로 포함된다: 아미드 (-CH2-CH2-N(H)-C(O)) 및 -CH2-O-N=CH-; 및 알킬인 (-C(J)2-P(=O)(OJ)-C(J)2-C(J)2-). J는 상기 기술된 대로이다.
올리고뉴클레오티드 합성
상기 기술된 바와 같이, 지지체 매체, 예를 들어 고체 지지체 매체 상에서, 올리고뉴클레오티드가 일반적으로 제조된다. 일반적으로, 첫번째 합성단위체 (예를 들어 단량체, 예컨대 뉴클레오시드)가 먼저 지지체 매체에 부착된 후, 지지체-결합 합성단위체에 연속적으로 단량체를 커플링시킴으로써 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 이러한 반복적인 신장으로 결국 최종 올리고머성 화합물 또는 기타 중합체 예컨대 폴리펩티드가 생성된다. 적절한 지지체 매체는 가용성 또는 불용성일 수 있거나, 또는 여러 용매에서의 용해도가 가변성이어서 성장하는 지지체-결합 중합체가 원하는 대로 용액 내에 또는 용액 외부에 있도록 할 수 있다. 전통적인 지지체 매체 예컨대 고체 지지체 매체는 대부분 불용성이고, 올리고머가 표적 길이에 도달할 때까지 시약 및 용매가 성장 사슬과 반응하고/하거나 이를 세척하는 동안 통상적으로 반응 용기 내에 놓이고, 그후 올리고머가 지지체로부터 절단되고, 필요하다면 추가적으로 후처리하여(worked up), 최종 중합체 화합물이 생산된다. 더욱 최근의 접근법으로 가용성 중합체 지지체를 포함하는 가용성 지지체가 도입되어, 반복적으로 합성된 생성물을 합성 중 원하는 시점에 침전 및 용해시키는 것이 허용되었다 ([Gravert et al., Chem. Rev., 1997, 97, 489-510]).
용어 지지체 매체는 올리고머성 화합물 및 관련된 화합물 예컨대 펩티드의 합성에 대해 당업계에 공지된 모든 형태의 지지체를 포함하도록 의도된다. 본 발명에 적용가능한 일부 대표적인 지지체 매체에는 하기의 것들이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다: 제어 세공 유리 (CPG: controlled pore glass); 옥살릴-제어 세공 유리 (예를 들어, [Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527] 참조); 실리카-함유 입자, 예컨대 다공성 유리 비드 및 실리카 겔 예컨대 트리클로로-[3-(4-클로로메틸)페닐]프로필실란과 다공성 유리 비드의 반응에 의해 형성된 것 ([Parr and Grohmann, Angew. Chem. Internal. Ed. 1972, 11, 314] 참조, 상표명 "PORASIL E"로 Waters Associates (Framingham, Mass., USA)에서 판매); 1,4-디 히드록시메틸벤젠 및 실리카의 모노 에스테르 ([Bayer and Jung, Tetrahedron Lett, 1970, 4503] 참조, 상표명 "BIOPAK"으로 Waters Associates에서 판매); TENTAGEL (예를 들어, [Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373] 참조); 폴리스티렌/디비닐벤젠의 공중합체인, 가교된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체가 비딩된(beaded) 매트릭스 또는 POROS, (Perceptive Biosystems에서 입수가능); 가용성 지지체 매체, 폴리에틸렌 글리콜 PEG ([Bonora et al., Organic Process Research & Development, 2000, 4, 225-231] 참조).
본 발명에 적용가능한 추가적인 지지체 매체에는 펜던트 장쇄 폴리스티렌 (PS) 그래프트가 있는 폴리에틸렌 (PE) 필름인 PEPS 지지체 (106 정도의 분자량 ([Berg, et al., J. Am. Chem. Soc, 1989, 111, 8024] 및 국제 특허 출원 WO 90/02749 참조))가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 필름의 로딩 용량은 비딩된 매트릭스의 용량만큼 높고, 부가적인 유연성은 다중 합성이 동시에 일어나도록 한다. PEPS 필름은 각각 개별적인 구획으로 기능하는, 분리된, 표지된 시트 형태의 방식일 수 있다. 모든 동일한 단계의 합성 사이클 동안, 시트는 단일 반응 용기에서 함께 유지되어, 통상적인 방법에 의한 단일 펩티드의 속도와 유사한 속도로 다수의 펩티드의 동시 제조를 허용한다. 또한, 예를 들어, 부직포, 편포, 스틱 또는 마이크로웰 플레이트와 같은 다른 기하배열의 PEPS 중합체로의 실험은 합성 효율에서의 어떠한 제한도 나타내지 않았다.
본 발명에 적용가능한 추가적인 지지체 매체에는 공지된 양의 N-t-부톡시카 르보닐-베타-알라닐-N'-아크릴로일헥사메틸렌디아민을 포함하는 N,N'-비스아크릴로일에틸렌디아민과 가교된 디메틸아크릴아미드의 공중합체를 기초로 하는 입자가 비제한적으로 포함된다. 여러 스페이서 분자가 베타 알라닐 기를 통해 전형적으로 부가되고, 그 후 아미노산 잔기 서브유닛이 부가된다. 또한, 베타 알라닐-함유 단량체는 수지 비드를 형성하기 위한 중합 동안 아크릴로일 사프코신 단량체로 대체될 수 있다. 중합 후 비드와 에틸렌디아민의 반응이 이어져서, 공유 결합된 관능기로서 일차 아민을 함유하는 수지 입자가 형성된다. 폴리아크릴아미드계 지지체는 폴리스티렌계 지지체보다 비교적 더욱 친수성이고, 일반적으로 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등이 포함되는 극성 비양성자성 용매와 함께 사용된다 ([Atherton, et al., J. Am. Chem. Soc, 1975, 97, 6584], [Bioorg. Chem. 1979, 8, 351], 및 [J. C. S. Perkin I 538 (1981)] 참조).
본 발명에 적용가능한 추가적인 지지체 매체에는 수지와 사용된 유기 합성 반응 조건에 또한 실질적으로 불활성인 또다른 재료의 복합체가 비제한적으로 포함된다. 한 예시적인 복합체 ([Scott, et al., J. Chrom. Sci., 1971, 9, 577] 참조)에서는 반응성 클로로메틸 기를 함유하는 소수성의 가교된 스티렌 중합체로 코팅된 유리 입자가 사용되고, 이는 Northgate Laboratories, Inc. (Hamden, Conn., USA)에서 공급된다. 또다른 예시적인 복합체는 폴리스티렌이 그래프트된 불소화 에틸렌 중합체의 코어를 함유한다 ([Kent and Merrifield, Israeli Chem. 1978, 17, 243] 및 [van Rietschoten in Peptides 1974, Y. Wolman, Ed., Wiley and Sons, New York, 1975, pp. 113-116] 참조). PEPS 이외의 접촉성 고체 지지체 매 체, 예컨대 면 시트 ([Lebl and Eichler, Peptide Res. 1989, 2, 232]) 및 히드록시프로필아크릴레이트-코팅 폴리프로필렌 막 ([Daniels, et al., Tetrahedron Lett. 1989, 4345]). 성장 펩티드 사슬을 고정시키고 구획화된 합성을 수행하기 위한 아크릴산이 그래프트된 폴리에틸렌-로드(rod) 및 96-미량역가 웰. ([Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3998). 전통적으로 사용된 중합체 비드를 함유하는 "티백(tea bag)". ([Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 5131]). 밀도가 상이한 2가지 상이한 지지체의 동시 사용 ([Tregear, Chemistry and Biology of Peptides, J. Meienhofer, ed., Ann Arbor Sci. Publ., Ann Arbor, 1972 pp. 175-178]). 다기관을 통한 반응 용기의 조합 ([Gorman, Anal. Biochem., 1984, 136, 397]). 멀티컬럼 고체-상 합성 (예를 들어, [Krchnak, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1989, 33, 209]), 및 [Holm and Meldal., in "Proceedings of the 20th European Peptide Symposium", G. Jung and E. Bayer, eds., Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1989 pp. 208-210]). 셀룰로스 페이퍼 (Eichler, et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 1989, 54, 1746]). 펩티드의 지지체-매개 합성이 또한 보고되었다 ([Synthetic Peptides: A User's Guide, Gregory A. Grant, Ed. Oxford University Press 1992]; US-A-4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679; 5,132,418; 4,725,677 및 Re-34,069 참조).
지지체-결합 올리고뉴클레오티드 합성은 성장 사슬의 한쪽 말단에 뉴클레오티드를 순차적으로 부가하는 것에 의존한다. 전형적으로, 첫번째 뉴클레오시드 ( 존재하는 임의의 고리밖(exocyclic) 아민 관능기 상에 보호기가 있음)가 적합한 유리 비드 지지체에 부착되고, 활성화된 포스파이트 화합물 (전형적으로 뉴클레오티드 포스포르아미디트이고, 또한 적합한 보호기를 지님)이 단계적으로 부가되어, 성장 올리고뉴클레오티드가 신장된다. 고체-상 합성을 위한 추가적인 방법은 Caruthers의 미국 특허 4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679; 및 5,132,418; 및 Koster의 미국 특허 4,725,677 및 Re. 34,069에서 확인할 수 있다.
지지체 매체를 기초로 하는 올리고머성 화합물 및 관련 화합물의 합성에 일상적으로 사용되는 시판되는 장치는, 예를 들어, Applied Biosystems (Foster City, CA)가 포함되는 여러 판매자들이 판매하고 있다. 당업계에 공지된 이같은 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가적으로 또는 별법적으로 사용될 수 있다. 자동화 합성 기술이 포함되는 적절한 고체 상 기술은 [F. Eckstein (ed.), Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, Oxford University Press, New York (1991)]에 기술되어 있다.
일반적으로, 인 보호기 (pg)는 화학식 -CH2CH2-GW, (식중 Gw는 전자 끄는 기이다)의 β-제거가능 기를 갖는 O 또는 S 또는 알콕시 또는 알킬티오 기이다. 본 발명과 함께 사용하는 것에 적용가능한 pg의 적절한 예로는 Caruthers의 미국 특허 4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679; 및 5,132,418; 및 Koester의 미국 특허 4,725,677 및 Re. 34,069에 기재된 것들이 포함된다. 일반적 으로, 알킬 또는 시아노에틸 끄는 기가 바람직한데, 이는 시판되는 포스포르아미디트에 메틸 또는 시아노에틸 인 보호기가 일반적으로 혼입되어 있기 때문이다.
pg의 제거 방법은 제거될 특정 pg에 따라 좌우된다. β-제거가능 기, 예컨대 [Koster et al.]의 특허에 개시된 것들은 약염기 용액에서 일반적으로 제거됨으로써, 재배열에 의해 산성 β-수소가 추출되고 -CH2CH2-Gw 기가 제거되어, 상응하는 아크릴로-화합물 CH2=CH-Gw가 형성된다. 반면에, 알킬 기는 알킬 기의 α-탄소 상에서의 친핵성 공격에 의해 일반적으로 제거된다. 이같은 PG는 본원에 인용된 바와 같은 [Caruthers et al.]의 특허에 기술되어 있다.
당업자는 P(III)의 P(V)로의 산화가 다양한 시약에 의해 수행될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또한 당업자는 P(V) 종이 포스페이트 트리에스테르, 포스포로티오에이트 디에스테르, 또는 포스포로디티오에이트 디에스테르로 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. P(V) 결합의 각각의 유형은 본원에 기술된 바와 같은 용도 및 장점을 갖는다. 따라서, 용어 "산화제"는 P(III) 종 (예를 들어 포스파이트)을 P(V)으로 변환시킬 수 있는 임의의 시약인 것으로 광범위하게 이해되어야 한다. 따라서 용어 "산화제"는 "티아화 시약"과 동일한 의미를 갖는 것으로 또한 간주되는 "황화제"를 포함한다. 달리 변형되지 않는 한, 산화는 III에서 V로의 P 산화 상태에서의 부수적인 증가와 함께 산소 또는 황의 도입을 가리킨다. 산화제가 P(III) 종 내로 산소를 도입하여 P(V) 종이 되는 것을 가리키는 것이 중요한 경우, 산화제는 본원에서 "산소-도입 산화 시약"으로 언급될 것이다.
포스포르아미디트 프로토콜 하에 포스페이트 디에스테르 결합을 만들기 위한 산화 시약 (즉 산소-도입 산화 시약)은, 예를 들어, 본원에 인용된 바와 같은 [Caruthers et al.] 및 [Koester et al.]에 기술되어 있다. 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는데 사용된 황화 시약의 예로는 황 원소, 디벤조일테트라술피드, 3-H-1,2-벤지디티올-3-온 1,1-디옥시드 (보케이지 시약으로 또한 공지됨), 테트라에틸티우람 디술피드 (TETD), 및 비스(O,O-디이소프로폭시 포스피노티오일) 디술피드 (스텍(Stec) 시약으로 또한 공지됨)가 포함된다. 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 만들기 위한 산화 시약에는 [Cole et al. 미국 특허 6,242,591]에 기술된 바와 같은 페닐아세틸디술피드 (PADS)가 포함된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 포스포로티오에이트 디에스테르 및 포스페이트 디에스테르 결합이 당 서브유닛 간에 교대될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 포스포로티오에이트 결합이 단독으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 티아화 시약은 디티우람 디술피드일 수 있다. 일부 적절한 디티우람 디술피드의 개시에 대해서는 미국 특허 5,166,387 참조. 캡핑 및 산화가 동일한 단계에서 수행될 수 있도록, 한 디티우람 디술피드를 표준 캡핑 시약과 함께 사용할 수 있다는 것이 뜻밖에 발견되었다. 이는 캡핑 및 산화가 별도의 단계에서 일어나야 하고, 일반적으로 단계들 사이에 컬럼 세척이 포함되는 표준 산화 시약, 예컨대 보케이지 시약과 대조적이다.
5'-보호기 bg 또는 T'은 핵염기를 보호하는데 사용된 보호기에 대해 직교이고, 적합한 경우 2'-O-보호기에 대해, 뿐만 아니라 고체 지지체 매체에 대한 3'-링 커에 대해 직교이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 5'-보호기는 산 분해성이다. 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 5'-보호기는 임의 치환된 트리틸 기 및 임의 치환된 픽실 기로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 픽실 기는 알킬, 알콕시, 할로, 알케닐 및 알키닐 기로부터 선택된 1개 이상의 치환체로 치환된다. 일부 실시양태에서, 트리틸 기는 약 1 내지 약 3개의 알콕시 기, 특히 약 1 내지 약 3개의 메톡시 기로 치환된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 트리틸 기는 1 또는 2개의 메톡시 기로 4- 및 (적용가능하다면) 4'-위치에서 치환된다. 특히 허용가능한 트리틸 기는 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT 또는 DMTr)이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "시약 밀어넣기(push)"은 임의의 활성 화합물 (즉 시약, 활성화제, 부산물, 또는 용매 이외의 기타 물질)이 실질적으로 없는 용매의 부피를 의미하고, 후속되는 시약 용액에 앞서 컬럼 상에 또는 컬럼을 통해 시약 용액을 밀어넣기 위한 목적으로 및 이를 추진하는 효과로 이러한 부피의 용매가 컬럼에 도입된다. 시약 밀어넣기는 전체 컬럼 부피일 필요가 없지만, 일부 경우에는 컬럼 부피의 1배 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시약 밀어넣기는 직후의 합성 단계를 위해 사용되는 시약 용액에 의해 형성된 전방부 바로 앞의 컬럼의 단면으로부터 시약, 부산물 및/또는 활성화제를 실질적으로 제거하는데 필요한 최소의 부피를 적어도 포함한다. 후속 시약 용액 전방부가 위치한 컬럼의 단면 내의 화합물의 농도가 후속 시약 용액의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않도록 충분히 낮으면, 시약, 부산물 또는 활성화제 여부와 상관없이 활성 화합물이 실질적으로 제거된 것으로 간주된다. 당업자는 "시약 밀어넣기"에 필요한 용매의 부피가 용매, 컬럼 상에 있는 시약, 활성화제, 부산물 등의 용매 내에서의 용해도, 컬럼으로부터 제거될 시약, 활성화제, 부산물 등의 양 등에 따라 변할 것임을 인지할 것이다. 각각의 시약 밀어넣기에 대해 적합한 부피를 선택하는 것은, 특히 하기의 실시예를 참조로, 당업자의 기술 내에 속하는 것으로 간주된다.
본원에서 사용된 "컬럼 세척"은, 달리 변형되지 않는 한, "시약 밀어넣기"와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 컬럼 세척은 후속 시약 용액이 컬럼에 적용되기 전에 컬럼 부피의 적어도 1배가 컬럼을 통과하도록 허용되는 것을 의미할 수 있다. 컬럼 세척의 컬럼 부피 (CV)가 명시된 경우, 이는 충전되지 않은 컬럼의 내부 부피와 등가인 부피의 용매가 컬럼 세척에 사용되는 것을 가리킨다.
본 발명의 문맥에서, 세척 용매는 합성 단계들 사이에 컬럼에 적용되는 활성 화합물이 실질적으로 없는 용매이다. "세척 단계"는 세척 용매가 컬럼에 적용되는 단계이다. "시약 밀어넣기"와 "컬럼 세척" 모두 "세척 단계"의 이러한 정의 내에 포함된다.
세척 용매는 순수한 화합물 또는 화합물들의 혼합물일 수 있고, 용매는 활성 화합물을 용해시킬 수 있다.
본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 한 세척 단계에서 사용된 세척 용매는 50％ v/v를 초과하지 않는 약간의 백분율의 아세토니트릴을 포함할 수 있다.
캡핑 및 산화 단계의 순서를 원한다면 뒤집을 수 있다. 즉, 캡핑은 산화에 선행하거나 후속할 수 있다. 또한, 적절한 티아화 시약의 선택으로, 산화 및 캡핑 단계가 단일 단계로 조합될 수 있다. 예를 들어, 무수 아세트산으로의 캡핑이 N,N'-디메틸디티우람 디술피드의 존재 하에 수행될 수 있다는 것이 뜻밖에 발견되었다.
다양한 용매를 산화 반응에서 사용할 수 있다. 적절한 용매는 본원에 인용된 [Caruthers et al.] 및 [Koester et al.]의 특허에서 확인된다. [Cole et al.]의 특허에는 아세토니트릴이 페닐아세틸디술피드용 용매로 기술되어 있다. 기타 적절한 용매로는 톨루엔, 잔텐, 디클로로메탄 등이 포함된다.
올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 절단하기 위한 시약은, 예를 들어, 본원에서 인용된 바와 같은 [Caruthers et al.] 및 [Koester et al.]의 특허에 기재되어 있다. 인 보호기가 0-CH2CH2CN인 경우, 티미딘 (T) 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 알킬화 아민, 예컨대 트리에틸아민의 존재 하에 절단하는 것이 양호한 실행으로 간주되는데, 이는 이로써 시아노-에틸화 티미딘 뉴클레오티드 (CNET)의 생성이 방지되는 것으로 현재 공지되어 있기 때문이다. CNET 부가물의 방지는 참조문헌으로 본원에 포함된 미국 특허 6,465,628에 일반적으로 기술되어 있고, 특히 컬럼 20-30의 실시예에 기술되어 있으며, 이는 참조문헌으로 특히 포함된다.
당업계에 공지된 표준 절차, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (예를 들어 역상 HPLC), 분별 침전 등에 의해 올리고뉴클레오티드를 후처리할 수 있다. 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티 드가 고체 지지체 매체에서 절단될 때 5'-OH 보호기는 여전히 최종 뉴클레오시드 상에 존재한다. 그 후, 이러한 소위 DMT-온(on) (또는 트리틸-온) 올리고뉴클레오티드를 크로마토그래피에 적용하고, DMT 기를 유기 산에서의 처리에 의해 제거한 후, 올리고뉴클레오티드를 탈염시키고 추가로 정제하여, 최종 생성물이 형성된다.
5'-히드록실 보호기는 적절한 조건 하에 선택적으로 제거되는 임의의 기일 수 있다. 특히, 산성 조건 하에 (예를 들어 디클로로아세트산 (DCA), 트리클로로아세트산 (TCA), 또는 아세트산의 존재 하에) 쉽게 절단되기 때문에, 4,4'-디메톡시트리페닐메틸 (DMT) 기가 5'-위치에서의 보호에 바람직한 기이다. 지지체-결합 올리고뉴클레오티드로부터 DMT를 제거하는 것은 DCA (예를 들어, 적절한 용매 내의 약 3 내지 약 10％ DCA (v/v))로 일반적으로 수행된다. 지지체로부터 절단 후 올리고뉴클레오티드를 제거하는 것은 일반적으로 아세트산으로 수행된다.
본원에서 기술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고머성 모이어티와의 키메라로서 제조될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "올리고머성 화합물"은 핵산 분자의 영역과 혼성화할 수 있는 중합체성 구조를 지칭하고, "올리고머성 모이어티"는 이같은 올리고머성 화합물의 일부를 지칭한다. 올리고머성 화합물에는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 변형된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 모방체가 포함된다. 올리고머성 화합물은 선형 또는 원형일 수 있고, 분지를 포함할 수 있다. 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 이중 가닥인 경우 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 올리고머성 화합물은 단량체성 서브유닛들이 연결된 골격을 포함하고, 이때 각각의 연결된 단량체성 서브유닛은 헤테로고리형 염기 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 단량체성 서브유닛들을 연결시키는 결합, 단량체성 서브유닛 및 헤테로고리형 염기 모이어티는 구조마다 상이할 수 있어서, 헤미머(hemimer), 갭머(gapmer) 및 키메라(chimera)를 포함하여 생성된 올리고머성 화합물에 다수의 모티프가 발생하도록 한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 일반적으로 헤테로고리형 염기 모이어티이다. 이같은 헤테로고리형 염기의 가장 통상적인 2가지 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "올리고뉴클레오시드"는 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오시드 간 결합을 통해 연결된 뉴클레오시드들을 지칭한다. 이러한 유형의 뉴클레오시드 간 결합은 단쇄 알킬, 시클로알킬, 혼합된 헤테로원자 알킬, 혼합된 헤테로원자 시클로알킬, 1종 이상의 단쇄 헤테로원자성 및 1종 이상의 단쇄 헤테로고리형을 포함한다. 이러한 뉴클레오시드 간 결합에는 실록산, 술피드, 술폭시드, 술폰, 아세틸, 포름아세틸, 티오포름아세틸, 메틸렌 포름아세틸, 티오포름아세틸, 알케닐, 술파메이트; 메틸렌이미노, 메틸렌히드라지노, 술포네이트, 술폰아미드, 아미드, 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분부를 갖는 기타의 것들이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
상기 기술된 대체 뉴클레오시드 간 결합의 합성을 위한 합성안은 미국 특허 5,466,677; 5,034,506; 5,124,047; 5,278,302; 5,321,131; 5,519,126; 4,469,863; 5,455,233; 5,214,134; 5,470,967; 5,434,257에 개시되어 있다. 뉴클레오시드 간 결합에 관한 추가적인 배경 정보는 WO 91/08213; WO 90/15065; WO 91/15500; WO 92/20822; WO 92/20823; WO 91/15500; WO 89/12060; EP 216860; PCT/US 92/04294; PCT/US 90/03138; PCT/US 91/06855; PCT/US 92/03385; PCT/US 91/03680; 미국 특허 출원 07/990,848; 07,892,902; 07/806,710; 07/763,130; 07/690,786; [Stirchak, E.P., et al., Nucleic Acid Res., 1989, 17, 6129-6141]; [Hewitt, J.M., et al., 1992, 11, 1661-1666]; [Sood, A., et al., J. Am. Chem. Soc, 1990, 112, 9000-9001]; [Vaseur, JJ. et al., J. Amer. Chem. Soc, 1992, 114, 4006-4007]; [Musichi, B., et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 4231-4233]; [Reynolds, R.C., et al., J. Org. Chem., 1992, 57, 2983-2985]; [Mertes, M.P., et al., J. Med. Chem., 1969, 12, 154-157]; [Mungall, W.S., et al., J. Org. Chem., 1977, 42, 703-706]; [Stirchak, E.P., et al., J. Org. Chem., 1987, 52, 4202-4206]; [Coull, J.M., et al., Tet. Lett., 1987, 28, 745]; 및 [Wang, H., et al., Tet. Lett., 1991, 32, 7385- 7388]에서 확인할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 합성에 사용된 포스포르아미디트는 다양한 시판원으로부터 입수가능하다 (Glen Research (Sterling, Virginia); Amersham Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, New Jersey); Cruachem Inc. (Aston, Pennsylvania); Chemgenes Corporation (Waltham, Massachusetts); Proligo LLC (Boulder, Colorado); PE Biosystems (Foster City, California); Beckman Coulter Inc. (Fullerton, California)가 포함됨). 이러한 시판원들은 일반적으로 순도가 98％보다 양호한 고순도의 포스포르아미디트를 판매한다. 판매된 모든 아미디트에 대 해 일괄적인 순도를 제공하지 않는 것들은 대부분의 경우에 분석법을 포함할 것이고, 구입된 각각의 벌(lot)은 구입된 특정 포스포르아미디트의 순도를 적어도 제공한다. 시판되는 포스포르아미디트는 대부분 자동화된 DNA 합성용으로 제조되고, 따라서 원하는 서열의 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 즉각적인 사용을 위해 제조된다. 포스포르아미디트는, 예를 들어 [Caruthers et al.] (미국 특허 4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679; 및 5,132,418) 및 [Koester et al.] (미국 특허 RE 34,069)에 개시된 방법에 의해 제조할 수 있다.
이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 예컨대 이중 가닥 RNA를, 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 제작할 수 있다. RNA 합성의 경우, 아미디트 시약의 2'-OH를 적절한 제거가능한 보호기로 보호하는 것이 필요하다. 2'-OH용의 적절한 보호기는 미국 특허 6,008,400, 6,111,086 및 5,889,136에 기술되어 있다. RNA 합성을 위한 특히 적절한 2'-보호기는 미국 특허 6,111,086에 기술된 바와 같은 ACE 보호기이다. 일부 실시양태에서, RNA 합성에서 사용된 아미디트에 대해 상이한 5'-보호기를 사용하는 것이 유리한 것으로 간주된다. 적절한 5'-보호기는 미국 특허 6,008,400에 기재되어 있다. 특히 적절한 5'-보호기는 미국 특허 6,008,400에 교시된 바와 같은 트리메틸실릴옥시 (TMSO) 기이다. 특히 실시예 1, 컬럼 10-13 참조. 이중 가닥 RNA의 각각의 가닥을 별도로 합성한 후 어닐링시켜, 이중 가닥 (듀플렉스) 올리고뉴클레오티드를 형성시킬 수 있다.
올리고뉴클레오티드 용도
예시적인 바람직한 안티센스 화합물에는 실례(實例)가 되는 바람직한 안티센 스 화합물들 중의 하나의 5'-말단으로부터 8개 이상의 연속적인 핵염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열이 포함된다 (나머지 핵염기는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 안티센스 화합물의 5'-말단의 바로 상류에서 시작하여 DNA 또는 RNA가 약 8 내지 약 80개의 핵염기를 함유할 때까지 계속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속적인 신축물이다). 유사하게, 바람직한 안티센스 화합물은 실례가 되는 바람직한 안티센스 화합물들 중의 하나의 3'-말단으로부터 8개 이상의 연속적인 핵염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열로 표시된다 (나머지 핵염기는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 안티센스 화합물의 3'-말단의 바로 하류에서 시작하여 DNA 또는 RNA가 약 8 내지 약 80개의 핵염기를 함유할 때까지 계속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속적인 신축물이다). 본원에 설명된 경험적으로 유도된 바람직한 안티센스 화합물이 일단 주어지면, 당업자는, 과도한 실험 없이, 추가적인 바람직한 안티센스 화합물을 확인할 수 있을 것이다.
표적에 혼성화하여 표적의 발현을 억제하는 본 발명의 안티센스 및 기타 화합물이 실험을 통해 확인되고, 이러한 화합물들의 대표적인 서열들이 본 발명의 바람직한 실시양태로 본원에서 확인된다. 안티센스 화합물의 특정 서열이 본원에 기재되지만, 이들은 본 발명의 취지 내의 특정 실시양태를 설명 및 기술한다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 추가적인 바람직한 안티센스 화합물이 당업자에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에서 유용한 바람직한 안티센스 화합물의 구체적인 예로는 변형된 골격 또는 비-천연 뉴클레오시드 간 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 포함된 다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드에는 인 원자가 골격 내에 유지된 것들 및 인 원자가 골격 내에 없는 것들이 포함된다. 본 명세서의 목적을 위해서, 그리고 당업계에서 종종 참조되는 바와 같이, 인 원자가 뉴클레오시드 간 골격 내에 없는 변형된 올리고뉴클레오티드 또한 올리고뉴클리오시드인 것으로 간주된다.
RNA 분해효소 H-의존적 안티센스
특정 유전자 발현을 억제하는 한 방법에는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 "안티센스" 작용제로 사용하는 것이 수반된다. 안티센스 기술은 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 유사체가 특정 표적 전령 RNA (mRNA) 서열을 향하게 하는 것이 수반된다. 외인성 "안티센스" 분자와 내인성 mRNA의 상호작용은 다양한 경로에 의해 전사를 조정한다. 이같은 경로에는 전사 저지, RNA분해효소 H 채용, 및 RNAi (예를 들어 siRNA)가 포함된다. 안티센스 기술은 비교적 예측가능한 방식으로 특정 단백질 활성이 조정되도록 한다.
하기의 비제한적이고 설명적인 실시예를 참조로 본 발명이 추가로 이해될 것이고, 이는 일반적으로 상기에 기술된 방법에 의해 수행될 수 있다.
실시예 1
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸 스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 7시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 2
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 15시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비 드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 3
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 20시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 4
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 80℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 5
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 85℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과 하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 6
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (250g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 7
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (110 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 8
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (15 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 9
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (20 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드 를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 10
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (40 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (250 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 11
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸 스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (350 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 12
탈이온수 (1500 ㎖) 및 폴리비닐 알콜 (40 g)을 기계적 교반기, 콘덴서 및 질소 도입구가 설비된 반응 용기 (2L) 내에 놓았다. 전체적인 중합 공정에 걸쳐 반응을 질소 대기 하에 유지시켰다. 스티렌 (190 g), 55％-디비닐벤젠 (45％-에틸스티렌) (30 g), 아세톡시스티렌 (10 g), 벤조일퍼옥시드 (4 g), 이소옥탄 (90 g), 2-에틸헥사놀 (200 g)로 구성된 유기 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 고정 속도 (450 rpm)에서 교반하여, 원하는 비드 크기 분포를 생성시켰다. 그 후, 반응기를 75℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하여 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 건조시켰다. 탈이온수 (300 ㎖), 에탄올 (1000 ㎖) 및 건조된 비 드를 기계적 교반기 (200 rpm) 및 콘덴서가 설비된 반응 용기 (2 L) 내에 놓았다. 그 후, 반응기를 70℃로 가열하였다. 12시간 후, 모터를 정지시키고, 형성된 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 세척하였다. 비드를 아세톤에 분산시킨 후, 체로 거르고, 진공 하에 여과시켰다.
실시예 13: 5'-O- DMT 티미딘 -3'-O-숙시네이트의 고체 지지체에의 로딩
보호된 뉴클레오시드의 로딩을 표준 조건 하에 실험 1로부터 수득된 고체 지지체를 사용하여 수행하였다. 고체 지지체, 후니그(Hunig) 염기 (12 당량), HBTU 활성화제 (4 당량), 트리에틸 암모늄 염으로서의 DMT T 뉴클레오시드 숙시네이트 (2.0 당량)을 둥근바닥 플라스크에 넣고, 이를 밀폐시켜 실온에서 10시간 동안 기계적으로 진탕시켰다. 그 후, 지지체를 아세토니트릴 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 올리고머화에 사용된 Cap A 및 Cap B 용액 (각각 20 ㎖)의 혼합물을 고체 지지체에 첨가한 후, 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 하룻밤 동안 기계적으로 진탕시켰다. 지지체를 아세토니트릴 (200 ㎖), 메탄올 (100 ㎖) 및 최종적으로 무수 에테르 (200 ㎖)로 세척하였다. 최종적으로 지지체를 완전히 건조시키고, 보관하였다.
실시예 14: 5'-O- DMT - N4 - 벤조일 -2'- 데옥시사이티딘 -3'-O-숙시네이트의 고체 지지체에의 로딩
보호된 뉴클레오시드의 로딩을 표준 조건 하에 실험 1로부터 수득된 고체 지지체를 사용하여 수행하였다. 고체 지지체, 후니그 염기 (12 당량), HBTU 활성화제 (4 당량), 트리에틸 암모늄 염으로서의 5'-O-DMT-N4-벤조일-2'-데옥시사이티딘- 3'-O-숙시네이트 (2.0 당량)을 둥근바닥 플라스크에 넣고, 이를 밀폐시켜 실온에서 10시간 동안 기계적으로 진탕시켰다. 그 후, 지지체를 아세토니트릴 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 올리고머화에 사용된 Cap A 및 Cap B 용액 (각각 20 ㎖)의 혼합물을 고체 지지체에 첨가한 후, 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 하룻밤 동안 기계적으로 진탕시켰다. 지지체를 아세토니트릴 (200 ㎖), 메탄올 (100 ㎖) 및 최종적으로 무수 에테르 (200 ㎖)로 세척하였다. 최종적으로 지지체를 완전히 건조시키고, 보관하였다.
실시예 15: 5'-O- DMT - N6 - 벤조일 -2'- 데옥시아데노신 -3'-O-숙시네이트의 고체 지지체에의 로딩
보호된 뉴클레오시드의 로딩을 표준 조건 하에 실험 1로부터 수득된 고체 지지체를 사용하여 수행하였다. 고체 지지체, 후니그 염기 (12 당량), HBTU 활성화제 (4 당량), 트리에틸 암모늄 염으로서의 5'-O-DMT-N6-벤조일-2'-데옥시아데노신-3'-O-숙시네이트 (2.0 당량)을 둥근바닥 플라스크에 넣고, 이를 밀폐시켜 실온에서 10시간 동안 기계적으로 진탕시켰다. 그 후, 지지체를 아세토니트릴 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 올리고머화에 사용된 Cap A 및 Cap B 용액 (각각 20 ㎖)의 혼합물을 고체 지지체에 첨가한 후, 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 하룻밤 동안 기계적으로 진탕시켰다. 지지체를 아세토니트릴 (200 ㎖), 메탄올 (100 ㎖) 및 최종적으로 무수 에테르 (200 ㎖)로 세척하였다. 최종적으로 지지체를 완전히 건조시키고, 보관하였다.
실시예 16: 5'-O- DMT - N2 - 이소부티릴 -2'- 데옥시구아노신 -3'-O-숙시네이트의 고체 지 지체에의 로딩
보호된 뉴클레오시드의 로딩을 표준 조건 하에 실험 1로부터 수득된 고체 지지체를 사용하여 수행하였다. 고체 지지체, 후니그 염기 (12 당량), HBTU 활성화제 (4 당량), 트리에틸 암모늄 염으로서의 5'-O-DMT-N2-이소부티릴-2'-데옥시구아노신-3'-O-숙시네이트 (2.0 당량)을 둥근바닥 플라스크에 넣고, 이를 밀폐시켜 실온에서 10시간 동안 기계적으로 진탕시켰다. 그 후, 지지체를 아세토니트릴 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 올리고머화에 사용된 Cap A 및 Cap B 용액 (각각 20 ㎖)의 혼합물을 고체 지지체에 첨가한 후, 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 하룻밤 동안 기계적으로 진탕시켰다. 지지체를 아세토니트릴 (200 ㎖), 메탄올 (100 ㎖) 및 최종적으로 무수 에테르 (200 ㎖)로 세척하였다. 최종적으로 지지체를 완전히 건조시키고, 보관하였다.
실시예 17: 5'-O- DMT -2'-O- 메톡시에틸 -5- 메틸우리딘 -3'-O-숙시네이트의 고체 지지체에의 로딩
보호된 뉴클레오시드의 로딩을 표준 조건 하에 실험 1로부터 수득된 고체 지지체를 사용하여 수행하였다. 고체 지지체, 후니그 염기 (12 당량), HBTU 활성화제 (4 당량), 트리에틸 암모늄 염으로서의 5'-O-DMT-2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘-3'-O-숙시네이트 (2.0 당량)을 둥근바닥 플라스크에 넣고, 이를 밀폐시켜 실온에서 10시간 동안 기계적으로 진탕시켰다. 그 후, 지지체를 아세토니트릴 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 올리고머화에 사용된 Cap A 및 Cap B 용액 (각각 20 ㎖)의 혼합물을 고체 지지체에 첨가한 후, 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 하룻밤 동안 기계적으로 진탕시켰다. 지지체를 아세토니트릴 (200 ㎖), 메탄올 (100 ㎖) 및 최종적으로 무수 에테르 (200 ㎖)로 세척하였다. 최종적으로 지지체를 완전히 건조시키고, 보관하였다.
실시예 18: 5'-O- DMT - N4 - 벤조일 -2'-O- 메톡시에틸사이티딘 -3'-O-숙시네이트의 고체 지지체에의 로딩
보호된 뉴클레오시드의 로딩을 표준 조건 하에 실험 1로부터 수득된 고체 지지체를 사용하여 수행하였다. 고체 지지체, 후니그 염기 (12 당량), HBTU 활성화제 (4 당량), 트리에틸 암모늄 염으로서의 5'-O-DMT-N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸사이티딘-3'-O-숙시네이트 (2.0 당량)을 둥근바닥 플라스크에 넣고, 이를 밀폐시켜 실온에서 10시간 동안 기계적으로 진탕시켰다. 그 후, 지지체를 아세토니트릴 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 올리고머화에 사용된 Cap A 및 Cap B 용액 (각각 20 ㎖)의 혼합물을 고체 지지체에 첨가한 후, 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 하룻밤 동안 기계적으로 진탕시켰다. 지지체를 아세토니트릴 (200 ㎖), 메탄올 (100 ㎖) 및 최종적으로 무수 에테르 (200 ㎖)로 세척하였다. 최종적으로 지지체를 완전히 건조시키고, 보관하였다.
실시예 19: 5'-O- DMT - N6 - 벤조일 -2'-O- 메톡시에틸아데노신 -3'-O-숙시네이트의 고체 지지체에의 로딩
보호된 뉴클레오시드의 로딩을 표준 조건 하에 실험 1로부터 수득된 고체 지지체를 사용하여 수행하였다. 고체 지지체, 후니그 염기 (12 당량), HBTU 활성화제 (4 당량), 트리에틸 암모늄 염으로서의 5'-O-DMT-N6-벤조일-2'-O-메톡시에틸아 데노신-3'-O-숙시네이트 (2.0 당량)을 둥근바닥 플라스크에 넣고, 이를 밀폐시켜 실온에서 10시간 동안 기계적으로 진탕시켰다. 그 후, 지지체를 아세토니트릴 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 올리고머화에 사용된 Cap A 및 Cap B 용액 (각각 20 ㎖)의 혼합물을 고체 지지체에 첨가한 후, 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 하룻밤 동안 기계적으로 진탕시켰다. 지지체를 아세토니트릴 (200 ㎖), 메탄올 (100 ㎖) 및 최종적으로 무수 에테르 (200 ㎖)로 세척하였다. 최종적으로 지지체를 완전히 건조시키고, 보관하였다.
실시예 20: 5'-O- DMT - N2 - 이소부티릴 -2'-O- 메톡시에틸구아노신 -3'-O-숙시네이트의 고체 지지체에의 로딩
보호된 뉴클레오시드의 로딩을 표준 조건 하에 실험 1로부터 수득된 고체 지지체를 사용하여 수행하였다. 고체 지지체, 후니그 염기 (12 당량), HBTU 활성화제 (4 당량), 트리에틸 암모늄 염으로서의 5'-O-DMT-N2-이소부티릴-2'-O-메톡시에틸구아노신-3'-O-숙시네이트 (2.0 당량)을 둥근바닥 플라스크에 넣고, 이를 밀폐시켜 실온에서 10시간 동안 기계적으로 진탕시켰다. 그 후, 지지체를 아세토니트릴 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 올리고머화에 사용된 Cap A 및 Cap B 용액 (각각 20 ㎖)의 혼합물을 고체 지지체에 첨가한 후, 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 하룻밤 동안 기계적으로 진탕시켰다. 지지체를 아세토니트릴 (200 ㎖), 메탄올 (100 ㎖) 및 최종적으로 무수 에테르 (200 ㎖)로 세척하였다. 최종적으로 지지체를 완전히 건조시키고, 보관하였다.
실시예 21: 완전히 변형된 5'-d( TCC - CGC - CTG - TGA - CAT - GCA - TT )-3' 포스포로티오에이 트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT 티미딘-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 22: 완전하게 변형된 5'-d( GTT - CTC - GCT - GGT - GAG - TTT - CA )-3' 포스포로 티오에이트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT N6-벤조일-2'-데옥시아데노신-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리 고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 23: 완전하게 변형된 5'-d( GCC - CAA - GCT - GGC - ATC - CGT - CA )-3' 포스포로 티오에이트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT N6-벤조일-2'-데옥시아데노신-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 24: 완전하게 변형된 5'-d( TCC - GTC - ATC - GCT - CCT - CAG - GG )-3' 포스포로티오에이트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT N2-이소부티릴-2'-데옥시구아노신-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트 릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 25: 완전하게 변형된 5'-d( GTT - CTC - GCT - GGT - GAG - TTT - CA )-3' 포스포로티오에이트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT N6-벤조일-2'-데옥시아데노신-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 26: 완전하게 변형된 5'-[2'-O- 메톡시에틸 -( TGTG ]-d( CTA - TTC - TGT -G-)-[2'-O-메 톡시에 틸-( AATT ]-3' 포스포로티오에이트 18량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 5'-O-DMT-2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하 여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 27: 완전하게 변형된 5'-[2'-O- 메톡시에틸 -( CAGC ]-d( AGC - AGA - GTC - TTC -A-)-[2'-O-메 톡 시에틸-( TCAT ]-3' 포스포로티오에이트 21량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 5'-O-DMT-2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 28: 완전하게 변형된 5'-[2'-O- 메톡시에틸 -( GCTCC ]-d( TTC - CAC - TGA -T)-[2'-O-메 톡시에 틸-( CCTGC ]-3' 포스포로티오에이트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 5'-O-DMT-2'-O-메 톡시에틸-5-메틸사이티딘-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 29: 완전하게 변형된 5'-[2'-O- 메톡시에틸 -( GCTCC ]-d( TTC - CAC - TGA -T)-[2'-O-메 톡시에 틸-( CCTGC ]-3' 포스포로티오에이트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 5'-O-DMT-2'-O-메톡시에틸-5-메틸사이티딘-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 30: 완전하게 변형된 5'-[2'-O- 메톡시에틸 -( GCCTC ]-d( AGT - CTG - CTT -C)-[2'-O-메 톡시에 틸-( GCACC ]-3' 포스포로티오에이트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 5'-O-DMT-2'-O-메톡시에틸-5-메틸사이티딘-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 아세토니트릴:3-피콜린 (1:1 v/v) 내의 페닐아세틸 디술피드의 0.2 M 용액을 사용하여 2분 동안 황화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 31: 5'-d( TCC - CGC - CTG - TGA - CAT - GCA - TT )-3' 포스페이트 디에스테르 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT 티미딘-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 표준 요오드 용액을 사용하여 2분 동안 산화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스페이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 32: 5'-d( GTT - CTC - GCT - GGT - GAG - TTT - CA )-3' 포스페이트 디에스테르 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT N6-벤조일-2'-데옥시아데노신-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 표준 요오드 용액을 사용하여 2분 동안 산화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스페이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 33: 5'-d( GCC - CAA - GCT - GGC - ATC - CGT - CA )-3' 포스페이트 디에스테르 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT N6-벤조일-2'-데옥시아데노신-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 표준 요오드 용액을 사용하여 2분 동안 산화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스페이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 34: 5'-d( TCC - GTC - ATC - GCT - CCT - CAG - GG )-3' 포스페이트 디에스테르 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT N2-이소부티릴-2'-데옥시구아노신-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 표준 요오드 용액을 사용하여 2분 동안 산화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스페이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 35: 5'-d( GTT - CTC - GCT - GGT - GAG - TTT - CA )-3' 포스페이트 20량체의 합성
Amersham Biosciences의 Akta 100 DNA/RNA 합성기 상에서 약 420 마이크로몰의 규모로 시아노에틸 포스포르아미디트 및 상기와 같이 제조된 DMT N6-벤조일-2'-데옥시아데노신-유도체화 고체 지지체를 사용하여 상기 서열의 합성을 수행하였다. 트리틸 제거를 톨루엔 내의 10％ 디클로로아세트산 (부피/부피)을 사용하여 수행하였다. 표준 요오드 용액을 사용하여 2분 동안 산화를 수행하였다. 합성 말기에, 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 절단하고, 수산화암모늄을 사용하여 55℃에서 12 시간 동안 탈보호시켰다. 미정제 재료를 통상적인 방식으로 정제하여, 원하는 포스페이트 올리고뉴클레오티드가 산출되었다.
실시예 36: 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 일반적인 절차
2.2mM 합성을 하기의 절차에 따라 수행하였다:
1. 11.0 g의 200 ㎛ 로딩 지지체를 35 ㎜ 통과(flow-through) 컬럼 내로 배출시킨다;
2. 약 150 ㎖의 톨루엔을 컬럼에 첨가하고, 수분 동안 지지체가 팽윤되도록 한다. 팽윤된 지지체는 컬럼의 바닥 플레이트로부터 지지체 베드의 최상부까지가 약 5.2 ㎝이어야 한다.
3. 컬럼의 최상부 네트 어댑터를 약 7.2 ㎝로 내려서, 지지체 베드와 컬럼 최상부 플레이트 사이에 2 ㎝ 간격이 생기게 한다.
4. 컬럼 잠금 메카니즘을 고정시킨다.
5. 뉴클레오시드 포스포르아미디트를 사용하여 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성을 수행하여, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드 간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 생산한다.
단계 5의 합성은 표준 시약을 사용하여 링커 (예를 들어 유니링커(unilinker))를 통해 지지체에 첫번째 뉴클레오시드를 부착시키는 것을, 이같은 첫번째 합성단위체를 함유하도록 지지체가 미리 유도체화되지 않은 경우, 포함할 수 있다. 별법적으로, 지지체가 미리 유도체화된 경우, 유도체화된 지지체가 상기 기술된 바와 같이 컬럼 상에 로딩되고, 포스포르아미디트 합성단위체의 부가로 합성이 진행된다. 또한, 지지체 (유도체화 또는 유도체화되지 않음)가 컬럼 상에의 로딩 전에 미리 팽윤된 경우, 팽윤된 지지체는 상기 언급된 2 ㎝ 간격이 허용되도록 로딩된다.
실시예 37: 중합체성 비드의 합성
비드의 성질에 대한 다양한 실험 파라미터들의 효과를 결정하기 위해, 여러 비드들을 상이한 제조 조건 하에 생산하고, 이들의 물리적 성질을 시험하였다. 결과가 하기 표에 요약된다.
Figure 112007024999891-pct00060
당업자는 수많은 변화 및 변형이 본 발명의 바람직한 실시양태에 이루어질 수 있고, 이같은 변화 및 변형이 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항이 본 발명의 진정한 취지 및 범주 내에 속하는 모든 이같은 변종을 포함하도록 의도된다.
본 특허 문서에서 언급된 각각의 특허, 특허 출원, 및 서적이 포함되는 출판된 간행물은 참조문헌으로 전체적으로 본원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원은 2004년 9월 2일 출원된 미국 특허 가출원 60/606,873을 우선권으로 청구하고, 이의 전체적인 개시내용은 참조문헌으로 본원에 포함된다.

Claims (32)

  1. (a) 유기상을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 유기상을 25℃ 내지 95℃의 온도에서 수성상과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 중합체성 비드의 제조 방법으로,
    상기 유기상은 올레핀 단량체, 가교 단량체, 관능화 단량체, 개시제, 유기 용매를 포함하고;
    상기 올레핀 단량체는 1종 이상의 아릴-비닐 화합물을 포함하고;
    상기 가교 단량체는 방향족 모이어티에 부착된 2개의 비-공액 비닐 기를 갖는 올레핀계 가교 단량체이고;
    상기 관능화 단량체는 보호된 히드록실기를 갖는 올레핀계 단량체이고,
    상기 유기 용매는 1종 이상의 액체 탄화수소, 탄소수가 5 내지 12인 알콜, 또는 양자 모두를 포함하고;
    상기 수성상은 물 및 분산 시약을 포함하고;
    초기에 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율이 60％ 내지 96％이고;
    초기에 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율이 3％ 내지 9.9％이고;
    초기에 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율이 1％ 내지 20％이고;
    초기에 유기상에 존재하는 단량체의 중량 백분율이 33％ 내지 67％이고;
    초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율이 33％ 내지 67％이고;
    유기 용매 중에 존재하는 액체 탄화수소의 중량 백분율이 0％ 내지 80％이고;
    초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수가 5 내지 12인 알콜의 중량 백분율이 20％ 내지 100％이며;
    초기에 수성상에 존재하는 분산 시약의 중량 백분율이 0.01％ 내지 20％인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    초기에 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율이 75％ 내지 94％이고;
    초기에 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율이 4％ 내지 9.9％이고;
    초기에 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율이 2％ 내지 10％이고;
    초기에 유기상에 존재하는 단량체의 중량 백분율이 35％ 내지 60％이고;
    초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율이 40％ 내지 65％이고;
    유기 용매 중에 존재하는 탄화수소의 중량 백분율이 5％ 내지 70％이고;
    초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수가 5 내지 12인 알콜의 중량 백분율이 30％ 내지 95％인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    초기에 단량체 중에 존재하는 올레핀 단량체의 중량 백분율이 82％ 내지 91.5％이고;
    초기에 단량체 중에 존재하는 가교 단량체의 중량 백분율이 5.5％ 내지 9.9％이고;
    초기에 단량체 중에 존재하는 관능화 단량체의 중량 백분율이 3％ 내지 8％이고;
    초기에 유기상에 존재하는 단량체의 중량 백분율이 40％ 내지 50％이고;
    초기에 유기상에 존재하는 유기 용매의 중량 백분율이 50％ 내지 60％이고;
    유기 용매 중에 존재하는 액체 탄화수소의 중량 백분율이 10％ 내지 60％이고;
    초기에 유기 용매 중에 존재하는 탄소수가 5 내지 12인 알콜의 중량 백분율이 40％ 내지 90％인 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 올레핀 단량체는 스티렌, 에틸스티렌, 또는 양자 모두를 포함하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 올레핀계 가교 단량체의 방향족 모이어티는 5원 또는 6원 방향족 고리인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 가교 단량체는 디비닐벤젠인 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 관능화 단량체는 아세톡시스티렌인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 개시제는 안정화된 과산화물 또는 아조 화합물인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 안정화된 과산화물은 벤조일퍼옥시드를 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 유기 용매는 1종 이상의 액체 알칸, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 탄소수 5 내지 12의 알콜, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 유기 용매는 1종 이상의 옥탄, 탄소수 5 내지 12의 알콜, 또는 양자 모두를 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 유기 용매는 이소옥탄, 2-에틸헥사놀, 또는 양자 모두를 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 분산 시약은 폴리알콜을 포함하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 분산 시약은 폴리비닐알콜을 포함하는 방법.
  19. 삭제
  20. 제1항에 있어서, 유기상 및 수성상을 70℃ 내지 85℃의 온도로 가열하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 유기상 및 수성상을 75℃ 내지 80℃의 온도로 가열하는 방법.
  22. 제1항의 방법에 의해 형성된 중합체성 비드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 비드의 로딩 용량이 비드 1g 당 100 μ㏖ 내지 비드 1g 당 350 μ㏖인 중합체성 비드.
  24. 제22항에 있어서, 상기 비드의 평균 입자 크기가 10-300 ㎛인 중합체성 비드.
  25. 제22항에 있어서, 상기 비드의 평균 세공 크기가 10-100 ㎚인 중합체성 비드.
  26. 제22항에 있어서, 상기 비드의 비표면적이 10-100 ㎡/g인 중합체성 비드.
  27. 하기 화학식 I의 화합물:
    [화학식 I]
    Figure 112007024999891-pct00061
    [식중:
    G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
    G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
    G6는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
    각각의 R2'는 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
    각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
    각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
    q는 0 또는 1이고;
    R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
    Bx는 핵염기이고;
    T'는 H 또는 제거가능한 보호기이고;
    LL은 연결 모이어티이고;
    SS는 제22항의 비드이다].
  28. 하기 화학식 II의 화합물:
    [화학식 II]
    Figure 112011072529191-pct00062
    [식중:
    m은 0 내지 100의 정수이고;
    각각의 G1은 O 또는 S이고;
    각각의 G2는 OH 또는 SH이고;
    각각의 G3는 O, S, CH2, 또는 NH이고;
    각각의 G5는 O, S, CH2, CFH, CF2, 또는 -CH=CH-이고;
    각각의 R2'은 H, OH, O-rg (식중, rg는 제거가능한 보호기이다), 2'-치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
    각각의 R3'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
    각각의 R4'는 H, 치환체이거나, 또는 R2'와 함께 다리를 형성하거나, R3'와 함께 다리를 형성하거나, 또는 R5'와 함께 다리를 형성하고;
    각각의 q는 0 또는 1이고;
    각각의 R5'은 H, 치환체이거나, 또는 R4'와 함께 다리를 형성하고;
    각각의 G6는 독립적으로 O, S, CH2 또는 NH이고;
    각각의 Bx는 핵염기이고;
    pg는 제거가능한 인 보호기이고;
    T'는 제거가능한 보호기이고;
    LL은 연결 모이어티이고;
    SS는 제22항의 비드이다].
  29. 삭제
  30. 삭제
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