JP6416602B2 - 多孔質樹脂ビーズおよびそれを用いる核酸の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)トリクロロ酢酸/ジクロロメタン溶液またはジクロロ酢酸/トルエン溶液等による、ヌクレオシド5’−OH基の脱保護。
(2)ヌクレオシドホスホロアミダイト(核酸モノマー)/アセトニトリル溶液、および、活性化剤(テトラゾール等)/アセトニトリル溶液による5’−OH基ヘのアミダイトのカップリング反応。
(3)無水酢酸/ピリジン/メチルイミダゾール/THF等による未反応の5’−OH基のキャッピング。
(4)ヨウ素/水/ピリジン等によるホスファイトの酸化。
[1] モノビニル単量体単位および架橋性ビニル単量体単位からなる共重合体であり、且つ脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有する多孔質樹脂ビーズであって、
架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中18.5〜55mol%であり、
多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が、60〜300nmであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。
[3] 架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中18.5〜40mol%である前記[1]に記載の多孔質樹脂ビーズ。
[4] 架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中18.5〜30mol%である前記[1]に記載の多孔質樹脂ビーズ。
[6] 多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が、70〜200nmである前記[1]〜[4]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[8] モノビニル単量体が、スチレン系単量体を含む前記[1]〜[6]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[9] モノビニル単量体が、スチレン系単量体である前記[1]〜[6]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[10] モノビニル単量体が、スチレンおよびp−ヒドロキシスチレンである前記[1]〜[6]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[12] 架橋性ビニル単量体が、ジビニルベンゼンを含む前記[1]〜[10]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[13] 架橋性ビニル単量体が、p−ジビニルベンゼンおよびm−ジビニルベンゼンである前記[1]〜[10]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[15] 脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基が、ヒドロキシ基である前記[1]〜[13]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[17] 多孔質樹脂ビーズ1gあたりのカルボキシ基と結合し得る基の量が、5〜500μmol/gである前記[1]〜[15]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[19] 多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径が、10〜500μmである前記[1]〜[15]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[20] 多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径が、20〜300μmである前記[1]〜[15]のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
[23] 多孔質樹脂ビーズ1gあたりの開裂性リンカー結合量が、5〜80μmol/gである前記[21]に記載の製造方法。
[24] 多孔質樹脂ビーズ1gあたりの開裂性リンカー結合量が、10〜80μmol/gである前記[21]に記載の製造方法。
(1)分散安定剤を分散または溶解した水中で、モノビニル単量体、架橋性ビニル単量体、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有するビニル単量体、多孔質化剤および重合開始剤を撹拌し、懸濁共重合させて、多孔質樹脂ビーズを製造する方法、
(2)分散安定剤を分散または溶解した水中で、モノビニル単量体、架橋性ビニル単量体、別の官能基を有するビニル単量体、多孔質化剤および重合開始剤を撹拌し、懸濁共重合させて、別の官能基を有する多孔質樹脂ビーズを製造した後、加水分解等によって、別の官能基を、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換する方法、
等が挙げられる。
(1)多孔質樹脂ビーズの製造
冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた500mLセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、ポリビニルアルコール(クラレ製)2.6g、蒸留水260gを入れ、300rpmで撹拌してポリビニルアルコールを溶解した。ここに、スチレン(和光純薬製)34.36g(全単量体中71.6mol%)、p−アセトキシスチレン(アルドリッチ製)3.82g(全単量体中5.1mol%)、ジビニルベンゼン(m−ジビニルベンゼンおよびp−ジビニルベンゼンの混合物、含有量55重量%、和光純薬製)25.45g(全単量体中23.3mol%)、2−エチルヘキサノール(和光純薬製)53.45g、イソオクタン(和光純薬製)22.91gおよびベンゾイルパーオキサイド(25重量%含水、日油製)1.27gを混合して得られた溶液を添加して、窒素気流下、室温にて撹拌(500rpm)した後、80℃に昇温して、10時間懸濁共重合を行った。
得られた多孔質樹脂ビーズ0.2gを水銀ポロシメーターPoreMaster60−GT(QuantaChrome製)に投入し、水銀接触角140°、水銀表面張力480dyn/cmの条件における水銀圧入法により、多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径を測定した。結果を表1に示す。
得られた多孔質樹脂ビーズを50v/v%エタノール水溶液中で超音波分散した。この分散液をサンプルとし、50v/v%エタノール水溶液を分散媒として用いたレーザー回折/散乱式粒度分布装置LA−920(堀場製作所製)で、多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径を測定した。結果を表1に示す。
得られた多孔質樹脂ビーズ1gを秤量し、10mLメスシリンダーへ投入した。その後、トルエンを添加し、一晩静置した後、メスシリンダーの目盛より、膨潤体積を読み取った。膨潤体積およびこれから算出される0.2mLカラムでの最大ビーズ充填量を表1に示す。
表2に示す配合で、実施例1で得られた多孔質樹脂ビーズ、DMT−dT−3’−succinate(Beijing OM Chemicals製)、O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU、Novabiochem製)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、アルドリッチ製)、アセトニトリル(和光純薬製)を混合し、撹拌しながら室温で12時間反応させた。次いで、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、得られた多孔質樹脂ビーズを減圧乾燥した。
得られたDMT−dT−3’−succinateを結合した多孔質樹脂ビーズを合成スケール1μmolになるように合成カラム(容積0.2mL)に入れ、ABI3400
DNA/RNA合成機(アプライドバイオシステムズ製)にセットして、ヌクレオシドホスホロアミダイト濃度4eq/合成スケール、DMT−onの条件にて60mer混合配列のDNAポリヌクレオチドを合成した。合成後、乾燥させた多孔質樹脂ビーズからのDNAポリヌクレオチドの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行った。フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のUV吸光度測定(測定波長:260nm)から核酸のOD収量(核酸合成量に相当)を求めた。次に、濾液をHPLC測定(ウォーターズ製のHPLC装置を使用)して、合成純度(Full−length(面積%)、目的の配列長をもつDNAポリヌクレオチドの割合)を求めた。結果を表3に示す。
スチレン20.16g(全単量体中44.8mol%)、p−アセトキシスチレン3.82g(全単量体中5.5mol%)、ジビニルベンゼン(含有量55重量%)50.9g(全単量体中49.8mol%)、2−エチルヘキサノール55.39g、イソオクタン23.74g、ベンゾイルパーオキサイド1.22gを用いた以外は実施例1と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−p−ヒドロキシスチレン共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た(単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ1gあたりのヒドロキシ基の量:466μmol/g)。
スチレン45.02g(全単量体中85.4mol%)、p−アセトキシスチレン3.65g(全単量体中4.4mol%)、ジビニルベンゼン(含有量55重量%)12.2g(全単量体中10.2mol%)、2−エチルヘキサノール55.39g、イソオクタン23.74g、ベンゾイルパーオキサイド1.22gを用いた以外は実施例1と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−p−ヒドロキシスチレン共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た(単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ1gあたりのヒドロキシ基の量:409μmol/g)。
p−アセトキシスチレン3.2g(全単量体中8.4mol%)、ジビニルベンゼン(含有量55重量%)50.62g(全単量体中91.6mol%)、2−エチルヘキサノール60.31g、イソオクタン25.85gを用いた以外は実施例1と同様にして、ジビニルベンゼン−p−ヒドロキシスチレン共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た(単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ1gあたりのヒドロキシ基の量:649μmol/g)。
スチレン32.27g(全単量体中61.5mol%)、p−アセトキシスチレン3.9g(全単量体中4.8mol%)、ジビニルベンゼン(含有量55重量%)11.1g(全単量体中9.3mol%)、メタクリロニトリル8.24g(全単量体中24.4mol%)、2−エチルヘキサノール59.57g、イソオクタン25.53g、ベンゾイルパーオキサイド1.10gを用いた以外は実施例1と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−p−ヒドロキシスチレン−メタクリロニトリル共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た(単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ1gあたりのヒドロキシ基の量:488μmol/g)。
Claims (4)
- スチレン系単量体単位および架橋性ビニル単量体単位からなる共重合体であり、且つ脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有する多孔質樹脂ビーズであって、
架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中18.5〜55mol%であり、
多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が、60〜300nmであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。 - 脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基が、アミノ基および/またはヒドロキシ基である請求項1に記載の多孔質樹脂ビーズ。
- 請求項1または2に記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性リンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得ることを特徴とする核酸の製造方法。
- 40mer以上のポリヌクレオチドを得る請求項3に記載の製造方法。
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