JP5276367B2 - 多孔質樹脂ビーズおよびそれを用いる核酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体を含む多孔質樹脂ビーズ、及びそれを用いた核酸の製造方法に関する。

ＤＮＡ及びＲＮＡといった核酸の化学合成には、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。この方法では、先ず、合成する核酸の３’末端になるヌクレオシドを、開裂性リンカー（例、スクシニル基など）を介してあらかじめ担持させた固相合成用担体を反応カラムに充填して核酸自動合成装置に供する。次いで合成プログラムに準じ、（１）該ヌクレオシドの５’−ＯＨ基の脱保護；（２）５’−ＯＨ基ヘのヌクレオシドホスホロアミダイトのカップリング；（３）未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング；及び（４）生成したホスファイトの酸化、といった合成サイクルを繰り返すことで、所望の配列を持った核酸が合成される。合成された核酸は、最終的にはアンモニア等で開裂性リンカーを加水分解することにより固相合成用担体から切り出される（例えば非特許文献１）。

核酸の合成に使用される固相合成用担体としては、従来からＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）やシリカゲルといった無機粒子が広く用いられてきた。又、これに代え、化学的安定性をより向上させた高架橋・非膨潤性の多孔質ポリスチレン粒子（例えば特許文献１）や、核酸医薬品の製造等にあたって核酸を大量合成することができる低架橋・膨潤性の多孔質ポリスチレン系粒子（例えば特許文献２）が開発されている。

ところで、ＤＮＡを合成する場合と比較して、ＲＮＡを合成する場合は、２’−ＯＨ基に保護基が結合したホスホロアミダイトを用いて合成する必要がある為、アミダイトのカップリング効率が低下し、これにより、得られるＲＮＡの純度が低下するという問題がある。純度を可能な限り低下させることなくＲＮＡを合成するためには、固相合成用担体の合成の起点となるヌクレオシド−リンカーの結合量を少なくする必要があるが、これにより固相合成用担体当たりの合成量が低下するという問題が新たに招来する。
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００） 特開平３−６８５９３ 特開２００５−３２５２７２

本発明は、ＤＮＡのみならず、上述のように化学合成が困難なＲＮＡを合成するにあたっても、その合成量の減少、及び合成純度の低下を回避し得る固相合成用担体として有用な多孔質樹脂ビーズを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、所定の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを固相合成用担体として用いて、ＲＮＡの化学合成を行った場合に、純度の高いＲＮＡを、合成量の減少を伴わずに化学合成し得ることを見出し、かかる知見に基づき、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、以下の［１］〜［８］に関する。
［１］第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体を含む多孔質樹脂ビーズ。
［２］該共重合体が、カルボキシル基と脱水縮合反応により結合し得る官能基を有する第二の芳香族モノビニル化合物を構造単位として更に含む、［１］記載の多孔質樹脂ビーズ。
［３］該共重合体中の（メタ）アクリルアミド誘導体単位の含有量が０．３〜４ｍｍｏｌ／ｇである、［１］記載の多孔質樹脂ビーズ。
［４］第二の芳香族モノビニル化合物単位が有する官能基がアミノ基又は水酸基である、［２］記載の多孔質樹脂ビーズ。
［５］該共重合体中のアミノ基又は水酸基の含有量が０．０５〜１ｍｍｏｌ／ｇである、［４］記載の多孔質樹脂ビーズ。
［６］（メタ）アクリルアミド誘導体が、Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アルコキシ（メタ）アクリルアミド、２−（メタ）アクリルアミドアルカンスルホン酸、Ｎ−アルキロール（メタ）アクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及びアクロイルモルホリンからなる群より選択される、［１］に記載の多孔質樹脂ビーズ。
［７］ジビニル化合物がジビニルベンゼンである、［１］に記載の多孔質樹脂ビーズ。
［８］［１］〜［７］いずれかに記載の多孔質樹脂ビーズに開裂性のリンカーを介して結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドにヌクレオチドを結合させ、伸長したポリヌクレオチドを得ることを特徴とする、核酸の製造方法。

本発明は、核酸合成において固相合成用担体として使用した場合に、多量の核酸を合成し得、且つその合成純度を低下させることのない多孔質樹脂ビーズを提供する。本発明の多孔質樹脂ビーズを用いれば、ＲＮＡのように化学合成が困難な核酸についても、その合成量の減少、及び合成純度の低下を回避し得る。

本発明は、芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体を含む多孔質樹脂ビーズを提供する。本明細書中において、「芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体」とは、その構造単位として芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリルアミド誘導体を含む共重合体を意味する。該共重合体は芳香族モノビニル化合物単量体、ジビニル化合物単量体及び（メタ）アクリルアミド誘導体単量体を共重合することにより得られる。

本発明の多孔質樹脂ビーズに含まれる芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体の含有量は、通常８０重量％以上、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、最も好ましくは実質的に１００重量％である。すなわち、最も好ましい態様において、本発明の多孔質樹脂ビーズは、芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体からなる。

「共重合体が構造単位として化合物Ｘを含む」とは、共重合体が化合物Ｘの単量体に由来する構造単位を含むことを意味する。

本発明の多孔質樹脂ビーズに用いることの出来る、第一の芳香族モノビニル化合物としては、特に限定されないが、例えば、スチレン；ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、エチルスチレン、トリメチルスチレン、及びｐ−ｔ−ブチルスチレン等の核アルキル置換スチレン；α−メチルスチレン、及びα−メチル−ｐ−メチルスチレン等といったα−アルキル置換スチレン；クロロスチレン、ジクロロスチレン、フルオロスチレン、ペンタフルオロスチレン、及びブロモスチレン等の核ハロゲン化スチレン；クロロメチルスチレン、及びフルオロメチルスチレン等のハロゲン化アルキルスチレン；ヒドロキシスチレン；ヒドロキシメチルスチレン；安息香酸ビニル；スチレンスルホン酸ナトリウム；シアノスチレン；メトキシスチレン；エトキシスチレン；ブトキシスチレン；ニトロスチレン；アセトキシスチレン、及びベンゾキシスチレン等のアシルオキシスチレン等を挙げることが出来る。第一の芳香族モノビニル化合物は、好ましくはスチレンである。

ここで、第一の芳香族モノビニル化合物は、カルボキシル基と脱水縮合反応により結合し得る官能基を有しない点において、下記の第二の芳香族モノビニル化合物と区別される。

典型的な第一の芳香族モノビニル化合物単量体由来の構造単位としては、下記構造単位（Ａ）を挙げることが出来る。

本発明の多孔質樹脂ビーズを構成する共重合体中の、第一の芳香族モノビニル化合物単量体由来の構造単位の含有量は、特に限定されないが、好ましくは１〜９．５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは２〜９ｍｍｏｌ／ｇ、更に好ましくは３〜８ｍｍｏｌ／ｇである。

本発明の多孔質樹脂ビーズに用いることの出来るジビニル化合物としては、特に限定されないが、例えば、ジビニルベンゼン、メチルジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、及びジビニルナフタレン等の芳香族ジビニル化合物；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、及びテトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の、一価及び多価のエチレングリコールジ（メタ）アクリレート；プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、及びジプロピレンエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の、一価及び多価のプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート；１，２−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５−ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０−デカンジオールジ（メタ）アクリレート、２−メチル−１，８−オクタンジオール（メタ）アクリレート、及び１，４−シクロヘキサンジオールジメタクリレート等のジ（メタ）アクリレート系化合物等を挙げることが出来る。ジビニル化合物は、好ましくはジビニルベンゼンである。

尚、ジビニルベンゼンには、ｏ−、ｍ−又はｐ−ジビニルベンゼンやこれらの混合物が含まれる。

典型的なジビニル化合物単量体由来の構造単位としては、下記構造単位（Ｃ）を挙げることが出来る。

本発明の多孔質樹脂ビーズを構成する共重合体中の、ジビニル化合物単量体由来の構造単位の含有量（ｍｍｏｌ）は、特に限定されないが、通常０．１〜２ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．２〜１ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．３〜０．８ｍｍｏｌ／ｇである。ジビニル化合物の含有量が少な過ぎる場合は、多孔質樹脂ビーズの耐溶剤性、熱安定性、及び多孔度が十分に得られない為、核酸の固相合成において所望の効果を期待し難くなる場合があり、一方、ジビニル化合物の含有量が多過ぎる場合は、有機溶剤中での膨潤度が低下する為、核酸の固相合成において得られる核酸の合成量が減少し、且つその合成純度も低下する場合がある。

本発明の多孔質樹脂ビーズに用いることの出来る（メタ）アクリルアミド誘導体としては、特に限られないが、例えば、Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド；Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド；Ｎ−アルコキシアルキル（メタ）アクリルアミド；２−（メタ）アクリルアミドアルカンスルホン酸；Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド等のＮ−アルキロール（メタ）アクリルアミド；アクリルアミド；メタクリルアミド；ダイアセトンアクリルアミド；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド；アクロイルモルホリン；Ｎ−フェノキシメチル（メタ）アクリルアミド等を挙げることが出来る。

Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミドに含まれるアルキルは、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルキルである。Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミドとしては、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、及びＮ−ラウリル（メタ）アクリルアミド等を挙げることが出来る。

Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミドに含まれる２つのアルキルは、それぞれ、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルキルである。Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミドとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジラウリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ−ｔｅｒｔ−オクチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジラウリル（メタ）アクリルアミド、及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル（メタ）アクリルアミド等を挙げることが出来る。

Ｎ−アルコキシアルキル（メタ）アクリルアミドに含まれるアルコキシは、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルコキシである。Ｎ−アルコキシアルキル（メタ）アクリルアミドに含まれるアルキルは、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルキルである。Ｎ−アルコキシアルキル（メタ）アクリルアミドとしては、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロポキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メトキシプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシプロピル（メタ）アクリルアミド、及びＮ−イソプロポキシエチル（メタ）アクリルアミド等を挙げることが出来る。

２−（メタ）アクリルアミドアルカンスルホン酸に含まれるアルカンは通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルカンである。２−（メタ）アクリルアミドアルカンスルホン酸としては、２−アクリルアミドプロパンスルホン酸、２−アクリルアミド−ｎ−ブタンスルホン酸、２−アクリルアミド−ｎ−ヘキサンスルホン酸、及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等を挙げることが出来る。

（メタ）アクリルアミド誘導体は、好ましくは、ダイアセトンアクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミド又はＮ，Ｎ，−ジメチル（メタ）アクリルアミドである。

典型的な（メタ）アクリルアミド誘導体単量体由来の構造単位としては、下記構造単位を挙げることが出来る。

本発明の多孔質樹脂ビーズにおいて（メタ）アクリルアミド誘導体を用いることにより、多孔質樹脂ビーズを固相担体として用いて核酸を合成した際の核酸の合成量の減少、及び合成純度の低下を回避することが可能となる。

本発明の多孔質樹脂ビーズを構成する共重合体中の、（メタ）アクリルアミド誘導体単量体に由来する構造単位の含有量は、通常０．３〜４ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．４〜３．５ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．６〜３ｍｍｏｌ／ｇである。（メタ）アクリルアミド誘導体の含有量が少な過ぎる場合は、核酸の合成量の減少及び合成純度の低下を回避し得るという効果が得られず、（メタ）アクリルアミド誘導体の含有量が多過ぎる場合は多孔質樹脂ビーズを形成し難い。

好ましい態様において、本発明に係る多孔質樹脂ビーズにおける共重合体は、その構造単位として、第一の芳香族モノビニル化合物に加え、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を有する第二の芳香族モノビニル化合物を更に含む。このような官能基を用いると、核酸合成に用いるリンカーがカルボキシル基を有している場合に、該カルボキシル基と容易に結合することができる為、ヌクレオシドと多孔質樹脂ビーズとを連結するのに有利である。このような官能基の例としては、アミノ基、及びヒドロキシル基等が挙げられるが、これらに限定されない。

第二の芳香族モノビニル化合物としては、特に限定されないが、上述の第一の芳香族モノビニル化合物の１以上の水素原子が脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基で置換された化合物を挙げることができる。具体的には、第二の芳香族モノビニル化合物としては、ヒドロキシスチレン等のヒドロキシスチレン系単量体又はその置換体；ヒドロキシメチルスチレン等のヒドロキシアルキルスチレン系単量体又はその置換体；アセトキシスチレン、エタノイルオキシスチレン、及びベンゾイルオキシスチレン等のアシルオキシスチレン類のアシルオキシ基を加水分解によりヒドロキシル基に変換したもの；アミノスチレン等のアミノスチレン系単量体又はその置換体；アミノメチルスチレン等のアミノアルキルスチレン系単量体又はその置換体；及びこれらのアシル化単量体等を挙げることが出来る。

ヒドロキシスチレン系単量体の置換体及びアミノスチレン系単量体の置換体の例としては、該単量体に含まれる１以上の水素原子（ヒドロキシル基又はアミノ基に含まれる水素原子を除く）が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、メトキシ基、及び／又はニトロ基等で置換された化合物が挙げられる。ヒドロキシル基又はアミノ基はビニル基に対するパラ位に配置することが好ましいが、オルト位又はメタ位であってもよい。

第二の芳香族モノビニル化合物は、好ましくは、無置換のｐ−ヒドロキシスチレン、ｐ−アミノスチレン又はｐ−アセトキシスチレンである。

典型的な第二の芳香族モノビニル化合物単量体由来の構造単位としては、下記構造単位（Ｂ）を挙げることが出来る。

本発明の多孔質樹脂ビーズを構成する共重合体中の、第二の芳香族モノビニル化合物単量体由来の構造単位の含有量は、通常０．０５〜１ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．１〜０．８ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．２〜０．７ｍｍｏｌ／ｇである。第二の芳香族モノビニル化合物が少な過ぎる場合は、核酸の合成量の減少及び合成純度の低下を回避し得るという効果が得られず、第二の芳香族モノビニル化合物が多過ぎる場合は多孔質樹脂ビーズを形成し難い傾向がある。

本発明の多孔質樹脂ビーズを構成する共重合体中の、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基の含有量は、好ましくは０．０５〜１ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１〜０．８ｍｍｏｌ／ｇであり、更に好ましくは０．２〜０．７ｍｍｏｌ／ｇである。該官能基が少な過ぎる場合は、核酸の合成量が減少する傾向にあり、多過ぎる場合は、核酸の純度が低下する傾向がある。

脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基がアミノ基又は水酸基である場合、本発明の多孔質樹脂ビーズのアミノ基又は水酸基量は、ＪＩＳ Ｋ００７０に準じた滴定により測定される。即ち、測定対象の固相合成用担体の水酸基を所定量のアセチル化試薬（無水酢酸／ピリジン）によりアセチル化し、該アセチル化において消費されなかった無水酢酸量を、水酸化カリウムによる滴定により測定し、アミノ基量又は水酸基量を算出する。具体的な手順は以下の通りである。

無水酢酸２５ｇに全量が１００ｍｌになるまでピリジンを加えてアセチル化試薬を得る。測定試料（乾燥した多孔質樹脂ビーズ）０．５〜２ｇをフラスコに量り取り、上記アセチル化試薬０．５ｍｌとピリジン４．５ｍｌとを正確に加える。フラスコ中の混合物を９５〜１００℃で２時間維持した後、室温にまで放冷してから蒸留水を１ｍｌ加える。１０分間加熱することでアセチル化に消費されなかった無水酢酸を分解する。フラスコの中身を全てビーカーに移し、蒸留水で全量が１５０ｍｌになるまで希釈した後、０．５ｍｏｌ／ｌの水酸化カリウム水溶液で滴定する。
これとは別に、測定試料を入れずに上記と同様の操作により、ブランクの測定を行う。
測定試料の水酸基量は以下の式（１）により算出される。但し、Ａ（μｍｏｌ／ｇ）は測定試料の水酸基量であり、Ｂ（ｍｌ）はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、Ｃ（ｍｌ）は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、ｆは水酸化カリウム水溶液のファクターであり、Ｍ（ｇ）は量り取った測定試料の重量である。
Ａ＝（Ｂ−Ｃ）×０．５（ｍｏｌ／ｌ）×ｆ×１０００÷Ｍ …（１）

本発明の多孔質樹脂ビーズにおける「ビーズ」とは、厳密な球状を呈することを意味するのではなく、一定形状（例えば、楕円球状などの略球状、多面体形状、円柱形状、金平糖形状などの異型形状など）を有していればよいことを意味するものである。当該多孔質樹脂ビーズは、合成用担体に用いる場合に合成反応容器への充填効率を高くすることができ、また、該反応容器が破損し難いという点から、好ましくは略球状（最も好ましくは球状）である。また、本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは１０〜５００μｍ、更に好ましくは２０〜３００μｍである。

本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径は、レーザー回折散乱法により測定される。具体的には、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液を分散媒に用いて、１０分間超音波装置にて分散させ、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置ＬＡ−９２０（堀場製作所製）により測定し、メジアン粒子径を算出する。

本発明の多孔質樹脂ビーズの孔の大きさ、個数等は特に限定されない。孔の大きさは、メジアン細孔径によって定量化することができる。本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは５〜５００ｎｍ、更に好ましくは１０〜２００ｎｍである。多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が小さすぎる場合、本発明の多孔質樹脂ビーズを化学反応の担体として用いる場合に反応場が小さくなって所望の反応が起こり難くなったり、核酸の合成における塩基配列数が所望の数よりも少なくなりがちになるということが懸念される。逆に、多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が大きすぎる場合、上記反応場であるビーズ表面の水酸基と反応に関わる物質との接触機会が少なくなり担体として不利になることが懸念される。

多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径は水銀圧入法により測定される。具体的には、約０．２ｇの測定試料を水銀ポロシメータ ＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ Ｃｏ．製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀注入圧法により測定する。

本発明の多孔質樹脂ビーズの製造方法は、特に限定されない。以下、各単量体を懸濁共重合して得られる共重合体を加水分解に供することによる製造方法について説明する。当該製造方法では、まず、第一の芳香族モノビニル化合物単量体と、ジビニル化合物系単量体と、（メタ）アクリルアミド誘導体単量体と、必要に応じて保護されたカルボキシル基と脱水縮合反応により結合し得る官能基を有する第二の芳香族モノビニル化合物単量体とを、有機溶媒及び水を用いて懸濁共重合させて芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体を得る。次いで、これを加水分解し、必要に応じて、含有するカルボキシル基と脱水縮合反応により結合し得る官能基を有する第二の芳香族モノビニル化合物を脱保護することにより、多孔質樹脂ビーズを得ることが出来る。

上記懸濁共重合において用いる、第一の芳香族モノビニル化合物単量体、ジビニル化合物系単量体、（メタ）アクリルアミド誘導体単量体、及び第二の芳香族モノビニル化合物系単量体としては、本発明の多孔質樹脂ビーズを構成する共重合体の構造単位として含まれる化合物として列挙した化合物を、各々挙げることが出来る。

第二の芳香族モノビニル化合物単量体に含まれるカルボキシル基と脱水縮合反応により結合し得る官能基は保護することが好ましい。保護基の種類は、官能基の種類に応じて適宜選択される。例えば官能基が水酸基である場合、アシルオキシ基が保護基として好ましく用いられる。アシルオキシ基とは、Ｘ−ＣＯ−Ｏ−（式中、Ｘはアルキル基）の一般式で表される基であり、Ｘで示されるアルキル基の部分の炭素数が１〜５のアシルオキシ基が好ましく、アセトキシ基がより好ましい。上記懸濁共重合において用いる第二の芳香族モノビニル化合物系単量体の好ましい具体例としては、ｐ−アセトキシスチレン、ｐ−ベンゾキシスチレン等を挙げることが出来る。

第二の芳香族モノビニル化合物を保護することなく、本発明に係る多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を製造することも可能である。しかし、保護されないカルボキシル基と脱水縮合反応によって結合し得る官能基を有する第二の芳香族モノビニル化合物（例、ヒドロキシスチレン等）は不安定な単量体である為、取り扱いや保管が容易ではない。
それ故、上述のような、保護されたカルボキシル基と脱水縮合反応によって結合し得る官能基を有する第二の芳香族モノビニル化合物を懸濁共重合し、これにより得られる共重合体を加水分解する方法が好ましい。

懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物単量体、ジビニル化合物単量体及び（メタ）アクリルアミド誘導体単量体（必要に応じて更に第二の芳香族モノビニル化合物単量体）の合計量に対する第一の芳香族モノビニル化合物単量体の仕込み量は、通常１〜９．５ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは２〜９ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは３〜８ｍｍｏｌ／ｇ、更に好ましくは４〜７ｍｍｏｌ／ｇである。

懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物単量体、ジビニル化合物単量体及び（メタ）アクリルアミド誘導体単量体（必要に応じて更に第二の芳香族モノビニル化合物単量体）の合計量に対するジビニル化合物単量体の仕込み量は、通常０．１〜２ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．２〜１ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．３〜０．８ｍｍｏｌ／ｇである。

懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物単量体、ジビニル化合物単量体及び（メタ）アクリルアミド誘導体単量体（必要に応じて更に第二の芳香族モノビニル化合物単量体）の合計量に対する（メタ）アクリルアミド誘導体単量体の仕込み量は、通常０．３〜４ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．４〜３．５ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．６〜３ｍｍｏｌ／ｇである。

第二の芳香族モノビニル化合物単量体を用いる場合、懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物単量体、ジビニル化合物単量体、（メタ）アクリルアミド誘導体単量体及び第二の芳香族モノビニル化合物単量体の合計量に対する第二の芳香族モノビニル化合物単量体の仕込み量は、通常０．０５〜１ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．１〜０．８ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．２〜０．７ｍｍｏｌ／ｇである。

上記懸濁共重合は、上述の各単量体と有機溶媒との混合物を水中で撹拌、乳化することにより行われる。本明細書において、「有機溶媒」とは、懸濁共重合系における水以外の溶媒を意味する。本発明では、上記有機溶媒は炭化水素とアルコールとを含む。炭化水素としては、脂肪族の飽和または不飽和炭化水素、あるいは芳香族炭化水素を用いることができ、好ましくは炭素数５〜１２の脂肪族炭化水素であり、より好ましくは、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ウンデカン、ドデカン等が挙げられる。懸濁共重合の際にアルコールを共存させることにより、得られるビーズが多孔質になる。アルコールとしては、例えば脂肪族アルコールを挙げることができ、そのアルキル基の炭素数は、好ましくは５〜１２であり、より好ましいアルコールとしては、２−エチルヘキシルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、ノニルアルコール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。

上記の炭化水素とアルコールの重量比は、用いる炭化水素及びアルコールの種類によって適宜変更する。該重量比により、得られる多孔質樹脂ビーズの比表面積が変化し得る。

懸濁共重合において、単量体の全重量に対し有機溶媒の重量は、好ましくは０．５〜２．５倍であり、より好ましくは０．８〜２．０倍である。この値が過大又は過少となった場合、得られる多孔質樹脂ビーズの比表面積が縮小し、これにより化学反応による合成反応物の量が減少する。

本発明において、懸濁共重合は、自体公知の方法を用いて行ってもよい。即ち、懸濁共重合の際に、公知の分散安定剤や、過酸化ベンゾイルなどといった過酸化物（重合開始剤）を用いることができる。

上記分散安定剤のその他の例としては、特に限定されず、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ゼラチン、デンプン、及びカルボキシルメチルセルロース等の親水性保護コロイド剤、又は炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、及びベントナイト等の難溶性粉末等が挙げられる。
該分散安定剤の添加量は、特に限定されないが、好ましくは懸濁重合系の水の重量に対して０．０１〜１０重量％である。この値が過少となった場合は、懸濁重合の分散安定性が低下し得、多量の凝集物が生成する場合がある。この値が過大となった場合は、微小ビーズが多数生成する場合がある。

上記重合開始剤の例としては、特に限定されず、当業者に公知の、ジベンゾイルパーオキサイド、ジラウロイルパーオキサイド、ジステアロイルパーオキサイド、１，１−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）−２−メチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔｅｒｔ−ヘキシルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔｅｒｔ−ヘキシルペルオキシ）シクロヘキサン、１，１−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジ−ｔｅｒｔ−ヘキシルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルクミルパーオキサイド、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド、１，１，３，３−テトラメチルブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔｅｒｔ−ヘキシルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、及びｔｅｒｔ−ブチルペルオキシイソプロピルモノカルボネート等の過酸化物、又は２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、及び２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物等が挙げられる。

懸濁共重合の反応条件は、適宜に設定し得、例えば、６０〜９０℃における３０分間〜４８時間の撹拌が挙げられる。

以上のような懸濁共重合反応により、芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体共重合体を得ることができる。得られた共重合体を、適宜、洗浄、分級等した後、以下に記載する加水分解処理に供する。

該共重合体において、脱保護基のために行われる加水分解は、当業者に公知の手段、条件によって行うことができる。例えば、アシルオキシ基は酸触媒又はアルカリ触媒を用いて加水分解することにより水酸基に変換することが出来る。尚、該加水分解処理において、全ての保護基を除く必要はない。

以上のような処理を経て、本発明に係る多孔質樹脂ビーズを得ることができる。その際、更に適宜、乾燥、分級等の処理を施してもよい。

本発明に係る多孔質樹脂ビーズは、各種の化学合成反応の担体として用いることができるが、特に、核酸合成において効果的に使用することができる。

本明細書中、核酸は、ヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の化合物（オリゴヌクレオチド）を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。核酸は１本鎖、２本鎖のいずれであってもよい。核酸合成機による効率的な合成が可能であることから、核酸は好ましくは１本鎖である。

本発明に係る多孔質樹脂ビーズは核酸の中でもとりわけＲＮＡの合成用の固相担体として優れており、本発明に係る多孔質樹脂ビーズを固相担体として用いることにより、極めて高い収量及び純度で所望のＲＮＡを合成することができる。本発明に係る多孔質樹脂ビーズがＲＮＡ合成に適している正確な理由は不明であるが、（メタ）アクリルアミド誘導体の親水性が関係している可能性がある。

核酸のヌクレオチド長は特に限定されないが、好ましくは２〜２００ヌクレオチドである。核酸が長すぎると、得られる核酸の収量や純度が低下するためである。

本明細書において、核酸合成反応は特に核酸の伸長反応を意味する。即ち、本発明の多孔質樹脂ビーズに開裂性のリンカーを介して結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドにヌクレオチドを結合させ、伸長したポリヌクレオチドを得る。

リンカーとは、共有結合を介して２つの分子を連結する分子をいう。リンカーとしては、固相核酸合成において、担体と核酸とを連結するために使用される自体公知のものを用いることが出来る。好適なリンカーとしては、下式で表されるヌクレオシド−スクシニルリンカーを挙げることができる。

本発明の多孔質樹脂ビーズを固相担体として用いる核酸合成においては、当業者に公知の方法により行うことができる。核酸合成反応としては、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト（phosphoramidite）法などが挙げられる。なかでも、固相ホスホロアミダイト法が、核酸の合成能力が高く、高純度の核酸が得られるという理由で好ましい。これは、「ポリヌクレオチドを準備するための方法」と題するカルザースらの米国特許第4,458,066号に記載されている。例えば、以下の４工程を含む、ヌクレオチドを結合するための合成サイクルが本発明の多孔質樹脂ビーズ上で行われる：
（１）ジクロロ酢酸等により、ビーズに結合したヌクレオシドスクシニルリンカーの５’−ＯＨの保護基であるＤＭＴをはずす脱トリチル化；
（２）テトラゾール等により活性化したヌクレオシドホスホロアミダイトを前記の５’−ＯＨに結合するカップリング；
（３）アミダイトが結合しなかった５’−ＯＨを無水酢酸等により保護するキャッピング；及び
（４）ヨウ素等により酸化して、リン酸トリエステルの形にする酸化。

本発明の多孔質樹脂ビーズが充填された反応容器（カラム等）を、核酸合成反応の工程がプログラムされた核酸自動合成装置に連結することにより、核酸の製造を自動化することが出来る。例えば、装置のコントローラまたはコンピュータからの指示にしたがって、本発明の多孔質樹脂ビーズが充填された反応容器に、上記（１）〜（４）を１サイクルとして、あらかじめ決められた順序で試薬を分配する試薬分配システムにより、それぞれの工程が進められる。このサイクルを目的物生成に必要な回数繰り返した後、合成された核酸（オリゴヌクレオチド）が結合したビーズを反応容器から取り出し、バイアルに回収する。そこに濃アンモニア等を加え５５℃、８時間放置する。これにより、スクシニルリンカーが切断され、ビーズよりオリゴヌクレオチドを切り出すとともに、シアノエチル基を外してリン酸ジエステルの形にし、さらに塩基部分のアミノ基の保護基を外し、切り出しと脱保護の工程を行う。その後、フィルターを用いてオリゴヌクレオチドを単離することで、目的となる核酸が得られる。

以下、実施例及び比較例を示して、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。

実施例１
（懸濁共重合）
５００ｍＬのセパラブルフラスコを、冷却機、撹拌機、窒素導入管を備えた恒温水槽に設置し、これにポリビニルアルコール（クラレ製）２．５ｇ及び蒸留水２５０ｇを入れ、３００ｒｐｍにて撹拌した。冷却水と窒素ガスを流して恒温水槽の温度を５５℃に保ち、撹拌を継続してポリビニルアルコールを溶解した（溶液Ａ）。一方、これとは別に、スチレン（和光純薬製）３７ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）４ｇ（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）７ｇ（０．４９ｍｍｏｌ／ｇ）、ダイアセトンアクリルアミド（和光純薬製）１２ｇ（１．１８ｍｍｏｌ／ｇ）、２−エチルヘキサノール（和光純薬製）５５ｇ、イソオクタン（和光純薬製）２５ｇ、及び過酸化ベンゾイル（日本油脂製、２５％含水）１ｇを混合し、これらを溶解した（溶液Ｂ）。得られた溶液Ｂを、溶液Ａの入ったセパラブルフラスコに入れ、窒素雰囲気下、室温で、周速度２．０ｍ／ｓで撹拌した後、８０℃に昇温して２４時間、懸濁共重合化を行った。

（洗浄）
重合生成物を、蒸留水及びアセトン（和光純薬製）を用いて濾過洗浄を行い、全量約２Ｌになるようにアセトン中に分散させた。これを、超音波ホモジナザーにより分散した後、蒸留水及びアセトンを用いて濾過洗浄を行い、全量約１Ｌになるようにアセトン中に分散させた。

（分級）
この分散液を静置して、ビーズ状の共重合体を沈澱させ、液を傾けても沈澱が乱れない程度になるまで静置した後、上清のアセトンを廃棄した。かかる沈澱に再びアセトンを加えて全量約１Ｌにして、再び静置した後、上清アセトンを廃棄する、という操作を１２回繰返すことにより分級を行った。この分散液を濾過し、減圧乾燥することにより、粉末状のｐ−アセトキシスチレン−スチレン−ジビニルベンゼン−ダイアセトンアクリルアミド共重合体ビーズを得た。

（加水分解）
５００ｍＬのセパラブルフラスコを、冷却機、撹拌機、及び窒素導入管を備えた恒温水槽に設置し、これにｐ−アセトキシスチレン−スチレン−ジビニルベンゼン−ダイアセトンアクリルアミド共重合体ビーズの粉末２０ｇ及びエタノール１００ｇを入れて、撹拌し、分散させた。次いで、水酸化ナトリウム１ｇを蒸留水５０ｇに溶解して得られた水溶液をこれに添加した後、７５℃に昇温し、６時間、加水分解反応を行った。反応終了後、得られた反応混合物を塩酸で中和した後、蒸留水及びアセトンを用いて濾過洗浄を行った。この分散液を濾過し、減圧乾燥することにより、ｐ−ヒドロキシスチレン−スチレン−ジビニルベンゼン−ダイアセトンアクリルアミド共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を得た。

実施例２
単量体として、スチレン（和光純薬製）４０ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）４ｇ（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）７ｇ（０．４９ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（和光純薬製）９ｇ（１．５１ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた点、及び有機溶媒として、２−エチルヘキサノール（和光純薬製）６５ｇ、イソオクタン（和光純薬製）２５ｇを用いた点を除いては、実施例１と同様にして、ｐ−ヒドロキシスチレン−スチレン−ジビニルベンゼン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を得た。

実施例３
単量体として、スチレン（和光純薬製）３１ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）４ｇ（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）７ｇ（０．４９ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（和光純薬製）１８ｇ（２．６５ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた点、及び有機溶媒として、１−デカノール（和光純薬製）７８ｇを用いた点を除いては、実施例１と同様にして、ｐ−ヒドロキシスチレン−スチレン−ジビニルベンゼン−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を得た。

実施例４
単量体として、スチレン（和光純薬製）３７ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）４ｇ（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）７ｇ（０．４９ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｎ−メトキシメチルメタクリルアミド（ワコーケミカル製）１２ｇ（１．５５ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた点、及び有機溶媒として、２−エチルヘキサノール（和光純薬製）５５ｇ、イソオクタン（和光純薬製）２５ｇを用いた点を除いては、実施例１と同様にして、ｐ−ヒドロキシスチレン−スチレン−ジビニルベンゼン−Ｎ−メトキシメチルメタクリルアミド共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を得た。

実施例５
単量体として、スチレン（和光純薬製）２５ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）４ｇ（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）７ｇ（０．４９ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（和光純薬製）１２ｇ（１．７７ｍｍｏｌ／ｇ）、メタクリロニトリル（和光純薬）１２ｇを用いた点、及び１−デカノール（和光純薬製）７２ｇを用いた点を除いては、実施例１と同様にして、ｐ−ヒドロキシスチレン−スチレン−ジビニルベンゼン−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メタクリロニトリル共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を得た。

実施例６
単量体として、スチレン（和光純薬製）４０ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）６ｇ（０．６２ｍｍｏｌ／ｇ）、ジメタクリル酸トリエチレングリコール（新中村化学工業製、商品名ＮＫエステル３Ｇ）９ｇ（０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（和光純薬製）５ｇ（０．８４ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた点、及び有機溶媒として、１−デカノール（和光純薬製）８４ｇを用いた点を除いては、実施例１と同様にして、ｐ−ヒドロキシスチレン−スチレン−ジメタクリル酸トリエチレングリコール−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を得た。

比較例１
単量体として、スチレン（和光純薬製）４９ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）４ｇ（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）７ｇ（０．４９ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた点、及び２−エチルヘキサノール（和光純薬製）５２ｇ、イソオクタン（和光純薬製）２３ｇを用いた点を除いては、実施例１と同様にして、ｐ−ヒドロキシスチレン−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を得た。

試験例
（固相合成用担体の物性測定）
実施例１〜６、及び比較例１で得られた多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体について以下の物性測定を行った。
（１）メジアン粒子径
測定試料を５０ｖ／ｖ％エタノール液中で超音波分散した。この分散液を、５０ｖ／ｖ％エタノール液を分散媒に用いたレーザー回折／散乱式粒度分布装置ＬＡ−９２０（堀場製作所製）により測定した。
（２）メジアン細孔径
測定試料０．２ｇを水銀ポロシメーターＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ Ｃｏ．製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件下、水銀圧入法により測定した。
（３）水酸基量
測定試料０．５〜２ｇをフラスコに量り取り、アセチル化試薬（無水酢酸２５ｇとピリジンを加えて全量１００ｍＬにしたもの）０．５ｍＬ及びピリジン４．５ｍＬを正確に添加した。フラスコ中の混合物を９５〜１００℃にて２時間保持した後、室温まで放冷してから蒸留水１ｍＬを加えた。次いで、アセチル化において消費されなかった無水酢酸を１０分間加熱して分解して、フラスコ中の全量をビーカーに移し、蒸留水で全量１５０ｍＬに希釈した後、０．５Ｎの水酸化カリウム水溶液にて滴定を行った。又、これとは別に、かかる測定試料を加えずに上記と同様の操作で滴定を行った（ブランク測定）。測定試料の水酸基量（ｍｍｏｌ／ｇ）は以下の式（１）により算出した。Ａ（ｍｍｏｌ／ｇ）は測定試料の水酸基量であり、Ｂ（ｍＬ）はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、Ｃ（ｍＬ）は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、ｆは水酸化カリウム水溶液のファクターであり、Ｍ（ｇ）は量り取った測定試料の重量である。
Ａ（ｍｍｏｌ／ｇ）＝（Ｂ−Ｃ）×０．５（ｍｏｌ／Ｌ）×ｆ÷Ｍ ・・・（１）
（４）アクリルアミド誘導体構造単位の含有量
測定試料２〜３ｍｇを白金パンに入れてミクロ天秤で秤量したものについて、全窒素分析装置ＴＮ−１１０（三菱化学製）にてアクリルアミド誘導体構造単位の含有量の測定を行った。得られたＮ濃度（重量％）から以下の式（２）により、アクリルアミド誘導体構造単位Ｄの含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出した。
Ｄの含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝（Ｎ濃度（重量％）×１０）／（Ｎ分子量×Ｄ中のＮ数）・・（２）

（ＲＮＡ合成及び評価）
実施例１〜６、及び比較例１で得られた多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体を用いて、以下のようにしてＲＮＡの合成、及び合成したＲＮＡの評価を行った。
固相合成用担体１ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＯＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）０．０９５ｇ、ＨＢＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）０．０４５ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（アルドリッチ製）０．０３８ｍｌ、及びアセトニトリル（和光純薬製）１０ｍｌを混合し、撹拌下、室温にて１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。これにＣａｐＡ（２０％無水酢酸／８０％アセトニトリル）２．５ｍｌ、ＣａｐＢ（２０％Ｎ−メチルイミダゾール／３０％ピリジン／５０％アセトニトリル）２．５ｍｌ、４−ジメチルアミノピリジン（アルドリッチ製）０．０２５ｇ、アセトニトリル（和光純薬製）５ｍｌを混合し、撹拌下、室温にて１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、減圧乾燥させてＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相合成用担体を得た。ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅの結合量は、ｐ−トルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて脱保護したＤＭＴ基の吸光度測定（４１２ｎｍ）により算出した。
上記の方法により得られた、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相合成用担体１０ｍｇを合成カラムに供し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３４００ ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ製）に供して合成スケール１μｍｏｌ、ＤＭＴ−ｏｆｆの条件にて核酸（ｄＴ×１ｍｅｒ）＋ｒＡ、ｒＧ、ｒＣ、ｒＵの混合配列×２１ｍｅｒ）の合成を行った。合成後、カラムを乾燥させた後、固相合成用担体から核酸を切り出して塩基アミノ基の脱保護を行い、固相合成用担体をフィルター濾過により分離した後、濾液をＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）を行い、核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相等）を決定した。次に、濾液を乾燥した後、得られたＲＮＡの２’水酸基の脱保護を行い、ＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製）によりＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％（目的の配列長をもつＲＮＡの割合）を算出した。結果を表１に示す。

表１から明らかなように、本発明に係る多孔質樹脂ビーズの固相合成用担体はいずれも比較例に比べて、ＯＤ収量（ＲＮＡ合成量）、及びＦｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ％（合成純度）が高値を示した。

本発明は、核酸合成において固相合成用担体として使用した場合に、多量の核酸を合成し得、且つその合成純度を低下させることのない多孔質樹脂ビーズを提供する。本発明の多孔質樹脂ビーズを用いれば、ＲＮＡのように化学合成が困難な核酸についても、その合成量の減少、及び合成純度の低下を回避し得る。

Claims (8)

1. 第一の芳香族モノビニル化合物−水酸基を有する第二の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体を含む多孔質樹脂ビーズからなる核酸を合成するための固相合成用担体。
2. 該共重合体中の（メタ）アクリルアミド誘導体単位の含有量が０．３〜４ｍｍｏｌ／ｇである、請求項１記載の固相合成用担体。
3. 該共重合体中の水酸基の含有量が０．０５〜１ｍｍｏｌ／ｇである、請求項１又は２記載の固相合成用担体。
4. （メタ）アクリルアミド誘導体が、Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アルコキシ（メタ）アクリルアミド、２−（メタ）アクリルアミドアルカンスルホン酸、Ｎ−アルキロール（メタ）アクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及びアクロイルモルホリンからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相合成用担体。
5. ジビニル化合物がジビニルベンゼンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の固相合成用担体。
6. 第一の芳香族モノビニル化合物が、スチレンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の固相合成用担体。
7. 第二の芳香族モノビニル化合物が、ヒドロキシスチレンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の固相合成用担体。
8. 請求項１〜７いずれかに記載の固相合成用担体に開裂性のリンカーを介して結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドにヌクレオチドを結合させ、伸長したポリヌクレオチドを得ることを特徴とする、核酸の製造方法。