JP5479007B2 - 多孔質樹脂ビーズおよびそれを用いる核酸の製造方法 - Google Patents
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Description
この合成サイクルを繰り返し、目的の配列を持った核酸が合成される。最終的に合成された核酸は、アンモニアやメチルアミン等により開裂性リンカーを加水分解させることによって、固相合成用担体から切り出される(非特許文献1参照)。
(1)第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ
(2)乾燥体積が2〜3mL/gである
ことを特徴とする多孔質樹脂ビーズを、固相合成用担体として核酸合成に用いた場合、驚くべきことに得られる核酸の合成量が増大し、かつその純度が向上することを初めて見いだした。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
[1]第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−(メタ)アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズであって、第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ乾燥体積が2〜3mL/gであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ;
[2]脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基が、アミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基、およびヒドロキシアルキル基から選択される基である、[1]に記載の多孔質樹脂ビーズ;
[3](メタ)アクリロニトリル構造単位の量が1〜4mmol/gであることを特徴とする、[1]または[2]に記載の多孔質樹脂ビーズ;
[4]単量体合計量に対するジビニル化合物の仕込み量が、2〜10mol%であることを特徴とする、[1]〜[3]のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズ;
[5]ジビニル化合物がジビニルベンゼンである、[1]〜[4]のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズ;および
[6][1]〜[5]のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性のリンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドを得ることを特徴とする、核酸の製造方法;
などに関する。
ヒドロキシスチレン系単量体またはアミノスチレン系単量体の「置換体」としては、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」以外の1つ以上の水素原子が、炭素数1〜5のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基等で置換された化合物が挙げられる。
第一のモノビニル化合物の構造単位の量がこれよりも少ない場合は、多孔質樹脂ビーズの耐溶剤性、熱安定性、および、多孔度が十分でなく、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は、有機溶剤中での膨潤度が低くなるために核酸の固相合成に用いたときに得られる核酸の合成量が少なくなり、さらに核酸の純度も低下してしまう。
ジビニル化合物構造単位の量がこれよりも少ない場合は、多孔質樹脂ビーズの耐溶剤性、熱安定性、および、多孔度が十分でなく、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は、有機溶剤中での膨潤度が低くなるために、核酸の固相合成に用いたときに得られる核酸の合成量が少なくなり、さらに核酸の純度も低下してしまう。
本発明の多孔質樹脂ビーズ体の構造単位の合計量に対する(メタ)アクリロニトリル構造単位の量は1〜4mmol/gであり、好ましくは1.5〜3.5mmol/g、さらに好ましくは1.8〜3.0mmol/gである。
(メタ)アクリロニトリル構造単位の量がこれよりも少ない場合は望ましい乾燥重量をの多孔質樹脂ビーズが得られず、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は多孔質樹脂ビーズそのものが形成し難い。本発明の多孔質樹脂ビーズ中における(メタ)アクリロニトリル構造単位の量は、全窒素分析により測定される。具体的には、試料を白金パンに入れ、ミクロ天秤で秤量した後、微量全窒素分析装置TN−110(三菱化学)により窒素量を測定し、(メタ)アクリロニトリル構造単位の分子量から計算して求める。
第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位の量がこれよりも少ない場合は効果が得られないからであり、その量がこれよりも多い場合は多孔質樹脂ビーズそのものを形成し難いからである。
「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」の量がこれよりも少ない場合は、核酸の固相合成用担体として用いた場合、核酸の合成量が少なくなる傾向にある。またその量がこれよりも多い場合は、核酸の固相合成用担体として用いた場合、核酸の純度が低下する傾向にある。
(1)第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、(メタ)アクリロニトリルおよび脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を含有する第二の芳香族モノビニル化合物を、有機溶媒および水を用いて懸濁共重合させて、多孔質樹脂ビーズを製造する方法
が挙げられる。あるいは、
(2)懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位に、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を導入して、多孔質樹脂ビーズを製造する方法
などが挙げられる。
本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径は、水銀圧入法により測定される。具体的には、0.2gの多孔質樹脂ビーズを水銀ポロシメーターPoreMaster60−GT(QuantaChrome社製)に投入し、水銀接触角140°、水銀表面張力480dyn/cmの条件における水銀圧入法により測定する。
乾燥体積が上記乾燥体積の下限よりも小さい場合は核酸の合成量と合成純度が低下する。一方、乾燥体積が上記乾燥体積の上限よりも大きい場合は、樹脂分が少ないので核酸の合成起点の数が少なくなり、結果的に反応容器あたりの核酸の合成量が低下する。通常、乾燥体積が小さい場合、核酸合成の場が小さくなり、核酸合成にとって不利になることが考えられる。しかしながら本発明の多孔質樹脂ビーズは意外なことに通常の固相合成用樹脂ビーズに比べて小さい体積であるにも関らず、通常の固相合成用樹脂ビーズよりも核酸の合成量や合成純度を高くすることができる。
冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた、500mLセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、ポリビニルアルコール(クラレ製)2.5gおよび蒸留水250gを入れ、300rpmで撹拌してポリビニルアルコールを溶解した。ここにスチレン(和光純薬製)35g、p−アセトキシスチレン(アルドリッチ製)4.5g(4.8mol%)、ジビニルベンゼン(含有量55%、和光純薬製)5.5g(4.0mol%)、メタクリロニトリル(和光純薬製)11.5g(29.7mol%)、2−エチルヘキサノール(和光純薬製)60g、イソオクタン(和光純薬製)30gおよびベンゾイルパーオキサイド(25%含水、日本油脂製)1gを混合して溶解した溶液を添加して、窒素気流下、室温にて撹拌(300rpm)した後、80℃に昇温して24時間、懸濁共重合を行った。
実施例1において、単量体として、スチレン34g、p−アセトキシスチレン(アルドリッチ製)6g(5.7mol%)、ジビニルベンゼン(含有量55%、和光純薬製)8.5g(5.5mol%)、アクリロニトリル12g(34.6mol%)を用いた以外は実施例1と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−アクリロニトリル−4−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
実施例1において、ポリビニルアルコール2.6g、蒸留水260g、スチレン29g、p−アセトキシスチレン5g(5.9mol%)、ジビニルベンゼン7.5g(6.1mol%)、メタクリロニトリル10.5g(29.9mol%)、2−エチルヘキサノール58g、イソオクタン25g、撹拌速度350rpmにした以外は実施例1と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−4−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
実施例1において、単量体として、スチレン49g、p−アセトキシスチレン4g(4.5mol%)、ジビニルベンゼン7g(5.4mol%)、(メタクリロニトリル0g)を用いるとともに、2−エチルヘキサノールを52gに、イソオクタンを23gにした以外は実施例1と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−4−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
実施例1において、ポリビニルアルコールを2.6gに、蒸留水を260gに、スチレンを33gに、p−アセトキシスチレンを4g(5.3mol%)に、ジビニルベンゼンを7g(6.3mol%)に、メタクリロニトリルを5g(15.9mol%)に、2−エチルヘキサノールを61gに、イソオクタンを26gに、撹拌速度を400rpmにした以外は実施例1と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−4−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
実施例1において、ポリビニルアルコールを2.6gに、蒸留水を260gに、スチレンを42gに、p−アセトキシスチレンを7g(6.3mol%)に、ジビニルベンゼンを5.5g(3.4mol%)に、メタクリロニトリルを13.5g(29.2mol%)に、イソオクタンを20gに、ベンゾイルパーオキサイドを1.5gにし、2−エチルヘキサノール60gの代わりに1−デカノール48gを用い、かつ撹拌速度を450rpmにした以外は実施例1と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−4−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
実施例1〜3および比較例1〜3で得られた多孔質樹脂ビーズについて以下の物性測定を行った。
測定試料を50v/v%エタノール液中で超音波分散した。この分散液を、50v/v%エタノール液を分散媒に用いたレーザー回折/散乱式粒度分布装置LA−920(堀場製作所製)により測定した。
測定試料0.2gを水銀ポロシメーターPoreMaster60−GT(QuantaChrome社製)に投入し、水銀接触角140°、水銀表面張力480dyn/cmの条件における水銀圧入法により測定した。
測定試料0.5〜2gをフラスコに量り取り、アセチル化試薬(無水酢酸25gとピリジンを加えて全量100mLにしたもの)0.5mLとピリジン4.5mLとを正確に加えた。フラスコ中の混合物を95〜100℃にして2時間経過後、室温まで放冷してから蒸留水1mLを加えた。10分間加熱してアセチル化に消費されなかった無水酢酸を分解した。フラスコの全量をビーカーに移し、蒸留水で全量150mLに希釈した後、0.5Nの水酸化カリウム水溶液で滴定した。これとは別に、測定試料を入れずに上記と同様の操作により、ブランク測定を行った。測定試料の官能基量(水酸基量)は、以下の式(1)により算出した。ただし、A(mmol/g)は測定試料の水酸基量であり、B(mL)はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、C(mL)は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、fは水酸化カリウム水溶液のファクターであり、M(g)は量り取った測定試料の重量である。
測定試料2〜3mgを白金パンに入れてミクロ天秤で秤量したものについて、全窒素分析装置TN−110(三菱化学製)にて測定した。得られたN濃度(重量%)から以下の式(2)により、(メタ)アクリロニトリル構造単位Dの含有量を算出した。
測定試料1.00gを10mL−メスシリンダーに容れ、振動を加えて試料を十分に充填させた後、見掛けの体積を測定した。
実施例1〜2および比較例1〜2で得られた多孔質樹脂ビーズを用いて、以下のようにして20塩基長のDNAオリゴヌクレオチドを合成し、その評価を行った。
Claims (5)
- 第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−(メタ)アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズであって、第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、
多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計重量に対する(メタ)アクリロニトリル構造単位の量が、1.8〜3.0mmol/gであり、
多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計重量に対するジビニル化合物構造単位の量が、0.2〜1.0mmol/gであり、
脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基の量が、多孔質樹脂ビーズ重量当り0.05〜1.5mmol/gであり、
水銀圧入法により測定したメジアン細孔径が、10〜300nmであり、かつ
乾燥体積が2〜3mL/gであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。 - 脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基が、アミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基、およびヒドロキシアルキル基から選択される基である、請求項1に記載の多孔質樹脂ビーズ。
- 単量体合計量に対するジビニル化合物の仕込み量が、2〜10mol%であることを特徴とする、請求項1または2に記載の多孔質樹脂ビーズ。
- ジビニル化合物がジビニルベンゼンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズ。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性のリンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドを得ることを特徴とする、核酸の製造方法。
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