JP5438922B2 - 核酸の製造方法 - Google Patents
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-
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Description
すなわち本発明は、以下に関する。
[2]固相担体混合物中、第一の固相担体1乾燥重量部に対して、第二の固相担体が1〜50乾燥重量部含まれる、[1]記載の製造方法。
[3]第一の固相担体が、ポリスチレン系固相担体およびガラス系多孔質固相担体からなる群より選ばれるいずれかであり、且つ核酸合成に寄与する官能基を有する、[1]記載の製造方法。
[4]第二の固相担体が、ポリスチレン系固相担体およびガラス系多孔質固相担体からなる群より選ばれるいずれかであり、且つ核酸合成に寄与する官能基を実質的に有しない、[1]記載の製造方法。
[5]核酸合成反応が、固相ホスホロアミダイト法により行われる、[1]記載の製造方法。
[6]核酸合成反応が容器中で行われ、且つ膨潤時の固相担体混合物の見かけ体積が、該容器の内体積の25〜100体積%である、[1]記載の製造方法。
これとは別に、測定試料を入れずに上記と同様の操作により、ブランクの測定を行う。
測定試料の水酸基量は以下の式(1)により算出される。但し、A(μmol/g)は測定試料の水酸基量であり、B(ml)はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、C(ml)は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、fは水酸化カリウム水溶液のファクターであり、M(g)は量り取った測定試料の重量である。
A=(B−C)×0.5(mol/l)×f×1000÷M …(1)
BET法における吸着ガスとして窒素ガスを用い、測定装置として比表面積測定装置NOVA 1200(QuantaChrome Co.製)を用いる。測定試料をこの装置内に投入して、室温、真空下で120分間脱気した後に、BET多点法によって測定試料の比表面積を求める。
(1)ジクロロ酢酸等により、ビーズに結合したヌクレオシドスクシニルリンカーの5’−OHの保護基であるDMTをはずす脱トリチル化;
(2)テトラゾール等により活性化したヌクレオシドホスホロアミダイトを前記の5’−OHに結合するカップリング;
(3)アミダイトが結合しなかった5’−OHを無水酢酸等により保護するキャッピング;及び
(4)ヨウ素等により酸化して、リン酸トリエステルの形にする酸化。
核酸合成を支持し得る第一の固相担体(スチレン/ヒドロキシスチレン/ジビニルベンゼン共重合体の多孔質粒子:固相担体A)の製造
(懸濁共重合)
冷却管、撹拌機、窒素導入管を備え付けた、500mLのセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、精製水(大和薬品製)240gおよびポリビニルアルコール(クラレ製、平均重合度約2000、けん化度79モル%)2.4gを入れて、恒温水槽の温度を28℃にして撹拌しながらポリビニルアルコールを溶解した。
これとは別に、スチレン(和光純薬製)44g、p−アセトキシスチレン(東ソー有機化学製)3g、ジビニルベンゼン55%(和光純薬製)7gを混合し、これに、ジベンゾイルパーオキサイド(日本油脂製、25%含水)1gを加えて溶解し、さらに2−エチルヘキサノール(関東化学製)50g、イソオクタン(和光純薬製)20gを加えて混合し、この溶液を上記のセパラブルフラスコに入れた。窒素気流下、毎分480回転で40分間撹拌した後、撹拌回転数を毎分300回転にして、恒温水槽を28℃から80℃まで昇温して9時間、懸濁共重合反応を行った。
共重合反応後、恒温水槽を降温して重合液が28℃になるまで冷却した。
重合液は、ろ材(NRK製、ナイロンメッシュ、目開き45μm)用いて吸引ろ過を行い、多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得た。
多孔質ポリマービーズ集合物のケーキに精製水200mLを入れ、撹拌してケーキをよく分散した。これを再びろ過して多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得た。この操作を4回行った。
さらに、多孔質ポリマービーズ集合物のケーキにアセトン(和光純薬製)200mLを入れ、同様に洗浄、ろ過を行った。この操作を3回行った。
多孔質ポリマービーズ集合物のケーキにエタノール200mLを入れ、撹拌してケーキをよく分散した。これを再びろ過して多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得た。これにエタノール160mLおよび1mol/L水酸化ナトリウム溶液40mLを入れ、撹拌してケーキをよく分散し、76℃まで加温し3時間加水分解反応を行った。反応後、室温まで冷却し、1mol/L塩酸水溶液で中和した後、ろ過し、上記(洗浄)と同様に操作を行った。
洗浄後の多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを70℃の真空乾燥機中で48時間乾燥し、実施例1の多孔質ポリマービーズ集合物を得た。
実施例1の多孔質ポリマービーズ集合物のそれぞれのヒドロキシル基にDMT−dT−3’−succinate(ヌクレオシドリンカー)を0.2mmol/gの量になるように調整して結合した後、ヌクレオシドリンカーが結合しなかったヒドロキシル基をアセチル基でキャップした。
架橋度 :7%
形状 :球状
比表面積 :45m2/g
メジアン粒径:90μm
メジアン孔径:52nm
(懸濁共重合)
冷却管、撹拌機、窒素導入管を備え付けた、500mLのセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、精製水(大和薬品製)240gおよびポリビニルアルコール(クラレ製、平均重合度約2000、けん化度79モル%)2.4gを入れて、恒温水槽の温度を28℃にして撹拌しながらポリビニルアルコールを溶解した。
共重合反応後、恒温水槽を降温して重合液が28℃になるまで冷却した。
重合液は、ろ材(NRK製、ナイロンメッシュ、目開き45μm)用いて吸引ろ過を行い、多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得た。
多孔質ポリマービーズ集合物のケーキに精製水200mLを入れ、撹拌してケーキをよく分散した。これを再びろ過して多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得た。この操作を4回行った。
さらに、多孔質ポリマービーズ集合物のケーキにアセトン(和光純薬製)200mLを入れ、同様に洗浄、ろ過を行った。この操作を3回行った。
架橋度 :7%
形状 :球状
比表面積 :45m2/g
メジアン粒径:90μm
メジアン孔径:52nm
固相担体A:固相担体B=1:2(重量比)で均一に混合したビーズを用いて、核酸合成機ABI3400(Applied Bio System社製)にて、1μmol(固相混合物充填量15mg)、20塩基,DMT−onの条件で一本鎖DNAの合成を行い、それについてOD(optical density)、HPLC(高圧液体クロマトグラフィー)測定を行った。固相担体混合物のトルエン膨潤時の見かけ体積は、反応容器の内体積の71.1%であった。
結果は以下のとおりである。
固相担体A:固相担体B=1:3(重量比)で混合したほかは実施例1と同様に行った。固相担体混合物のトルエン膨潤時の見かけ体積は、反応容器の内体積の94.8%であった。
結果は以下のとおりである。
固相担体A:固相担体B=1:0(重量比)を用いて、1μmol(固相充填量5mg)、20塩基,DMT−onの条件で核酸合成を行い、それについてOD、HPLC測定を行った。
結果は以下のとおりである。
Claims (4)
- 核酸合成に寄与するヒドロキシル基及びアミノ基から選ばれる基を含有する、核酸合成を支持し得る第一のポリスチレン系固相担体、及び核酸合成に寄与するヒドロキシル基及びアミノ基から選ばれる基を実質的に含有しない、核酸合成を支持しない第二のポリスチレン系固相担体を含むポリスチレン系固相担体混合物に含まれる該第一のポリスチレン系固相担体上で核酸合成反応を行うことを特徴とする、核酸の製造方法であって、該第一のポリスチレン系固相担体における、核酸合成に寄与するヒドロキシル基及びアミノ基から選ばれる基の位置が、ベンゼン環上の主鎖に対してパラ位である、製造方法。
- ポリスチレン系固相担体混合物中、第一のポリスチレン系固相担体1乾燥重量部に対して、第二のポリスチレン系固相担体が1〜50乾燥重量部含まれる、請求項1記載の製造方法。
- 核酸合成反応が、固相ホスホロアミダイト法により行われる、請求項1記載の製造方法。
- 核酸合成反応が容器中で行われ、且つ膨潤時の固相担体混合物の見かけ体積が、該容器の内体積の25〜100体積%である、請求項1記載の製造方法。
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