JP5210597B2

JP5210597B2 - 多孔質樹脂ビーズの製造方法

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Publication number: JP5210597B2
Application number: JP2007286835A
Authority: JP
Inventors: 健二郎森; 達也小西; 恵里前田
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2007-11-05
Filing date: 2007-11-05
Publication date: 2013-06-12
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Description

本発明は、例えば、固相合成用担体として好適に用いることができる多孔質樹脂ビーズの製造方法に関する。

従来、ポリスチレン系の多孔質樹脂ビーズとして、ヒドロキシスチレン−ポリエン共重合体が知られており（特許文献１及び２参照）、また、アルコキシスチレン類と芳香族ポリビニル類と芳香族ビニル化合物とを共重合してなる共重合体樹脂も知られている（特許文献３参照）。これらの多孔質樹脂ビーズは、主として、イオン交換樹脂や吸着剤等に用いられており、従って、このような用途においては、従来、多孔質樹脂ビーズにできるだけ多くの官能基を付与し、また、多孔質樹脂ビーズの比表面積をできるだけ大きくして、多孔質樹脂ビーズの単位体積あたりの物質の吸着能を高めることが重要な目標とされている。

他方、これらの多孔質樹脂ビーズは、近年、化学合成反応を効率よく進行させる反応場としての固相合成用担体としても用いられている。この場合、化学合成反応が開始される場所は、多孔質樹脂ビーズの架橋網目構造内に分布されている官能基であると考えられるので、化学合成する物質の種類や量に応じて、適度の大きさの架橋網目構造と官能基の分布をもつ多孔質樹脂が強く求められている。
特開昭５２−０２３１９３号公報特開昭５８−２１０９１４号公報特開平０５−０８６１３２号公報特開２００５−０９７５４５号公報

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、化学合成反応を効率よく進行させる固相合成用担体として、特に、高純度、高合成量にてオリゴヌクレオチドの固相合成を可能とする固相担体として好適に用いることができる多孔質樹脂ビーズを製造する方法を提供することを目的とする。

本発明によれば、芳香族ビニル化合物とアシルオキシスチレンとジ（メタ）アクリレート化合物からなる単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させ、これを分散安定剤の存在下に水中に懸濁させ、懸濁共重合させて、芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体を得、次に、この共重合体におけるアシルオキシスチレン単量体成分の有するアシルオキシ基を加水分解することからなる芳香族ビニル化合物−ヒドロキシスチレン−ジ (メタ）アクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの製造方法が提供される。

本発明においては、上記ジ（メタ）アクリレートは、好ましくは、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート及びアルカンジオールジ（メタ）アクリレートから選ばれる少なくとも１種である。

更に、本発明においては、単量体混合物がアシルオキシスチレンを８０〜８００μｍｏｌ／ｇの割合で含有し、ジ（メタ）アクリレート化合物を２００〜２０００μｍｏｌ／ｇｇの割合で含有することが好ましい。

また、本発明によれば、上記有機溶媒は、好ましくは、炭化水素及びアルコールから選ばれる少なくとも１種であると共に、上記有機溶媒は、単量体混合物に対する重量比０．５〜２．５にて用いられる。

本発明によれば、上述したように、芳香族ビニル化合物と共に、アシルオキシスチレンとジ（メタ）アクリレート化合物をそれぞれ所定の割合で含む単量体混合物の懸濁共重合によって、芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体を得、次に、この共重合体におけるアシルオキシスチレン単量体成分の有するアシルオキシ基を加水分解することによって、芳香族ビニル化合物−ヒドロキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得る。

従って、このような本発明の方法によって得られる多孔質樹脂ビーズは、適度の架橋密度と水酸基の分布を有するので、これを、例えば、オリゴヌクレオチドの固相合成用担体として用いるとき、担体上で行なわれる反応が相互に阻害されず、かくして、高純度、高合成量にてオリゴヌクレオチドを固相合成することができる。特に、本発明によれば、全長オリゴヌクレオチドの割合を高く維持しつつ、オリゴヌクレオチドを高い合成収量にて得ことができる。

本発明による芳香族ビニル化合物−ヒドロキシスチレン−ジ (メタ）アクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの製造方法は、芳香族ビニル化合物とアシルオキシスチレンとジ (メタ）アクリレート化合物からなる単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させ、これを分散安定剤の存在下に水中に懸濁させ、懸濁共重合させて、芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体を得、次に、この共重合体のアシルオキシスチレン単量体成分の有するアシルオキシ基を加水分解することからなる。

本発明において、芳香族ビニル化合物として、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、エチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン等の核アルキル置換スチレン、α−メチルスチレン、α−メチル−ｐ−メチルスチレン等のα−アルキル置換スチレン、クロロスチレン等の核ハロゲン化スチレン等を挙げることができるが、これら例示に限定されるものではない。しかし、なかでも、本発明によれば、芳香族ビニル化合物としてスチレンが好ましく用いられる。

本発明において、アシルオキシスチレンは、芳香核上、アシルオキシ基以外に、懸濁共重合や、また、得られる多孔質樹脂ビーズを固相合成用担体として用いるときに有害な影響を与えない限りは任意の置換基を１又は複数有していてもよい。そのような置換基として、例えば、炭素数１〜５のアルキル基やアルコキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基等を挙げることができる。

また、本発明において、芳香核上、アシルオキシスチレンのアシルオキシ基のビニル基に対する位置は特に限定されるものではないが、好ましくは、パラ位置である。即ち、本発明において、アシルオキシスチレンはｐ−アシルオキシスチレンであることが好ましい。更に、アシル基中のアルキル基は、炭素数１〜５を有することが好ましい。特に、本発明においては、アシルオキシスチレンとして、ｐ−アセトキシスチレンが好ましく用いられる。

本発明において、ジ (メタ）アクリレート化合物とは、ジメタアクリレート又はジアクリレートを意味し、好ましくは、（ポリ）エチレングリコールジ (メタ）アクリレート及びアルカンジオールジ (メタ）アクリレートから選ばれる少なくとも１種である。

上記（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレートの具体例として、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等を挙げることができる。

他方、本発明において、アルカンジオールジ（メタ）アクリレートにおけるアルカンは、炭素数が４〜１０の範囲にあることが好ましく、従って、アルカンジオールジ（メタ）アクリレートの具体例として、例えば、１，２−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５−ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０−デカンジオールジ（メタ）アクリレート、２−メチル−１，８−オクタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，４−シクロヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート等を挙げることができる。

本発明によれば、懸濁共重合に供する芳香族ビニル化合物とアシルオキシスチレンとジ（メタ）アクリレート化合物からなる単量体混合物において、アシルオキシスチレンは、好ましくは、８０〜８００μｍｏｌ／ｇの割合で含まれ、より好ましくは、２００〜５００μｍｏｌ／ｇの割合で含まれる。単量体混合物におけるアシルオキシスチレンの割合が８０μｍｏｌ／ｇよりも少ないときは、得られる多孔質樹脂ビーズの水酸基量が低いので、固相合成用担体として用いた場合、得られる合成反応物の量が少なくなる。他方、単量体混合物におけるアシルオキシスチレンの割合が８００μｍｏｌ／ｇよりも多いときは、得られる多孔質樹脂ビーズの水酸基の密度が高いので、担体上、隣接して起こる化学反応が互いに阻害されて、得られる合成反応物の純度が低くなる。

単量体混合物において、ジ（メタ）アクリレート化合物の割合は、好ましくは、２００〜２０００μｍｏｌ／ｇの割合で含まれ、より好ましくは、３００〜１５００μｍｏｌ／ｇの割合で含まれる。単量体混合物におけるジ（メタ）アクリレート化合物の割合が２００μｍｏｌ／ｇよりも少ないときは、得られる多孔質樹脂ビーズの比表面積が著しく小さいので、固相合成用担体として用いた場合、得られる合成反応物の量が少ない。他方、単量体混合物におけるジ（メタ）アクリレート化合物の割合が２０００μｍｏｌ／ｇよりも多いときは、得られる多孔質樹脂ビーズの有機溶媒中での膨潤度が低いので、得られる合成反応物の量が少ない。

本発明において、芳香族ビニル化合物とアシルオキシスチレンとジ（メタ）アクリレート化合物とからなる単量体混合物の懸濁共重合は、従来から知られている通常の方法によって行うことができる。従って、例えば、単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させ、別に、分散安定剤を水に溶解させ、次いで、これら２つの溶液を窒素気流下に混合、攪拌して、単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させた溶液を水中に微小な液滴として分散させた後、昇温して、攪拌下に共重合させればよい。懸濁共重合反応は、通常、攪拌下に反応温度６０〜９０℃で０．５〜４８時間にわたって行えばよいが、しかし、共重合の反応条件はこれに限定されるものではない。

本発明においては、上記有機溶媒としては、炭化水素及びアルコールから選ばれる少なくとも１種が用いられる。本発明において、炭化水素は、脂肪族炭化水素と芳香族炭化水素を含み、脂肪族炭化水素は、飽和、不飽和のいずれでもよいが、好ましくは、炭素数５〜１２の脂肪族飽和炭化水素又はアルキルベンゼンであり、炭素数５〜１２の脂肪族飽和炭化水素として、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ウンデカン、ドデカン等を挙げることができ、また、アルキルベンゼンとしてトルエン等を挙げることができ。

他方、アルコールとしては、脂肪族アルコールが好ましく用いられ、特に、炭素数５〜１２の脂肪族アルコールが好ましい。好ましい具体例として、例えば、２−エチルヘキシルアルコール、ｔ−アミルアルコール、ノニルアルコール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等を挙げることができる。本発明によれば、上記炭化水素とアルコールはそれぞれ単独で用いてもよく、また、上記炭化水素とアルコールを併用してもよい。

本発明において、上記有機溶媒は、通常、有機溶媒／単量体重量比にて０．５〜２．５の範囲で用いられ、好ましくは、１．０〜２．０の範囲で用いられる。有機溶媒／単量体重量比が上記範囲を外れるときは、いずれの場合においても、得られる多孔質樹脂粒子の比表面積が小さくなり、例えば、固相合成用担体として用いるときは、化学反応による合成反応物の量が少なくなる。

分散安定剤は、従来から、懸濁重合における分散安定剤として用いられているものであれば、特に限定されることなく、任意のものを用いることができる。そのような分散安定剤として、例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ゼラチン、デンプン、カルボキシルメチルセルロース等の親水性保護コロイド剤、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、ベントナイト等の難溶性無機粉末等を挙げることができる。用いる分散安定剤の量は、特に限定されないが、好ましくは、懸濁重合における水に対して０．０１〜１０重量％の範囲である。分散安定剤の量が懸濁重合において用いる水に対して０．０１重量％よりも少ないときは、懸濁重合の安定性が損なわれて、多量の凝集物が生成し、他方、分散安定剤の量が懸濁重合において用いる水に対して１０重量％よりも多いときは、例えば、固相合成用担体として用いるには微小にすぎる粒子が多数生成する。

更に、懸濁重合に用いる重合開始剤も、懸濁重合における分散安定剤として、従来から用いられているものであれば、特に限定されることなく、任意のものを用いることができる。そのような重合開始剤として、例えば、ジベンゾイルパーオキサイド、ジラウロイルパーオキサイド、ジステアロイルパーオキサイド、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ)−２−メチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ)−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）シクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジ−ｔ−ヘキシルパーオキサイド、ｔ−ブチルクミルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、１，１，３，３−テトラメチルブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ヘキシルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシイソプロピルモノカルボネート等の過酸化物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物を挙げることができる。

上述したようにして、単量体混合物と重合開始剤を溶解させた有機溶媒を水中に懸濁させ、懸濁共重合させ、共重合体を沈降させた後、共重合体を洗浄して、共重合体に残存する単量体のほか、有機溶媒や分散安定剤、重合開始剤等の不純物を除去し、精製する。先ず、洗浄用溶媒としては、上記不純物を除去するに有用である溶媒であれば、特に限定されるものではないが、通常、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、トルエン、ヘキサン、テトラヒドロフラン等が用いられる。得られた共重合体を洗浄するには、例えば、懸濁共重合後の共重合体の分散液を吸引濾過し、得られた共重合体を上記洗浄用溶媒中で攪拌、洗浄し、次いで、再度、共重合体を吸引濾過し、同様に、洗浄する操作を繰返せばよい。また、上記洗浄の過程において、必要に応じて、加熱して、共重合体中の揮発性の不純物を除去することもできる。

このようにして、本発明によれば、先ず、芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体を得、次に、この共重合体におけるアシルオキシスチレン単量体成分の有するアシルオキシ基を加水分解することによって、目的とする芳香族ビニル化合物−ヒドロキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得ることができる。

芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体におけるアシルオキシスチレン単量体成分のアシルオキシ基を加水分解するには、従来から知られている手段と条件によることができる。但し、本発明の方法においては、得られた芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体におけるすべてのアシルオキシスチレン単量体成分のアシルオキシ基を加水分解する必要はなく、通常、一部のアシルオキシ基を加水分解すればよい。

本発明において、芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体におけるアシルオキシスチレン単量体成分のアシルオキシ基の加水分解には、例えば、触媒として、塩酸、臭化水素酸等の酸触媒を用いてもよいし、ヒドラジン、水酸化ナトリウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、アンモニア水等のアルカリ触媒を用いてもよい。また、加水分解のための反応溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノール、ジオキサン、水等が好ましく用いられるが、しかし、これら例示に限定されるものではない。

本発明において、上記加水分解の反応条件は、適宜に設定することができる。例えば、エタノールを含む水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解する場合、水酸化ナトリウムの使用量は、芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体におけるアシルオキシスチレン単量体成分の１〜１０倍当量であり、エタノールの使用量は、使用する水に対して１〜１０倍重量であり、５０〜８０℃で１〜１２時間反応させる。好ましくは、水酸化ナトリウムの使用量は、アシルオキシスチレン単量体成分の１〜５倍当量であり、５０〜８０℃で１〜６時間反応させる。水酸化ナトリウムの使用量が多すぎたり、反応時間が長すぎる場合は、ジ（メタ）アクリレート化合物由来のエステルが加水分解され、多孔質樹脂ビーズの耐溶剤性が損なわれる。加水分解後の反応混合物は、酸又はアルカリを用いて中性付近にした後、前述と同じ方法によって、洗浄して、不純物を除去すればよい。

以上のように、本発明によれば、芳香族ビニル化合物とアシルオキシスチレンとジ（メタ）アクリレート化合物からなる単量体混合物の懸濁共重合によって、芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート化合物共重合体を得、この共重合体中のアシルオキシスチレン単量体成分の有するアシルオキシ基を加水分解することによって、芳香族ビニル化合物−ヒドロキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得ることができる。この後、必要に応じて、この多孔質樹脂ビーズに更に乾燥や分級等の処理を施してもよい。

このような多孔質樹脂粒子は、例えば、オリゴヌクレオチドを合成するための固相合成用担体として好適に用いることができる。因みに、本発明による多孔質樹脂粒子を固相合成用担体として用いるオリゴヌクレオチドの合成においては、従来から知られている方法によることができる。例えば、本発明による多孔質樹脂粒子の水酸基にリンカーを結合し、次に、このリンカーの末端から所定の塩基配列となるように、アミダイトを一段ずつ結合する。この合成反応は、自動合成装置を用いて行うことができる。例えば、リンカーを結合した多孔質樹脂粒子を装置内のフロー式反応器に充填し、これにアセトニトリル等の各種有機溶媒やアミダイト溶液を順次供給して、反応を繰返させる。最終的には、リンカー部分を加水分解等によって切断して、目的のオリゴヌクレオチドを得ることができる。上記リンカーには、従来から知られているものが適宜に用いられる。例えば、本発明による多孔質樹脂粒子に下記の構造を有するヌクレオシドリンカーを結合して、オリゴヌクレオチドを合成することができる。

ここに、○は本発明によって得られる芳香族ビニル化合物−ヒドロキシスチレン−ジ（メタ）アクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズ、ＤＭＴは５’ 位置の保護基ジメトキシトリチル基、Ｂ₁は塩基である。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。

実施例１
（懸濁重合）
冷却機、攪拌機及び窒素導入管を備えた５００ｍＬ容量のセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、これにポリビニルアルコール２．５ｇ及び蒸留水２５０ｇを入れて、３００ｒｐｍにて攪拌し、溶解させて、ポリビニルアルコール水溶液を調製した。

別に、スチレン５０ｇ、ｐ−アセトキシスチレン３．５ｇ（単量体混合物における割合３６９μｍｏｌ／ｇ）、エチレングリコールジメタクリレート５ｇ（単量体混合物における割合４３１μｍｏｌ／ｇ）、２−エチルヘキサノール８５ｇ、イソオクタン２５ｇ及び過酸化ベンゾイル（２５％含水物）１ｇを混合して溶液を調製した。この溶液を上記ポリビニルアルコール水溶液に加え、窒素気流下に室温で攪拌速度５００ｒｐｍで攪拌して、水中に懸濁させ、８０℃に昇温して、８時間、懸濁共重合を行った。

（洗浄)
得られた共重合体を蒸留水及びアセトンを用いて濾過、洗浄し、全量約１Ｌになるようにアセトン中に分散させた。

（分級)
得られた分散液を静置して、ビーズ状の共重合体が沈殿し、液を傾けても沈殿が乱れない程度になるまで放置した後、上澄のアセトンを廃棄した。この沈殿に再度、アセトンを加えて、全量約５００ｍＬにして、静置、アセトン廃棄の操作を１０回以上繰返すことによって分級を行った。このようにして得られた分散液を濾過し、減圧乾燥して、スチレン−ｐ−アセトキシスチレン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを粉末として得た。

（加水分解)
冷却機、攪拌機及び窒素導入管を備えた５００ｍＬ容量のセパラブルフラスコを恒温水槽に漬け、これに上記スチレン−ｐ−アセトキシスチレン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの粉末２０ｇとエタノール１００ｇを仕込んで、攪拌、分散させた。次いで、これに水酸化ナトリウム１ｇを蒸留水５０ｇに溶解させた水溶液を加えた後、７５℃に昇温し、３時間、加水分解反応を行った。反応終了後、得られた反応混合物を塩酸で中和した後、蒸留水とアセトンを用いて濾過、洗浄を行った。最後に得られた分散液を濾過し、減圧乾燥して、スチレン−ｐ−ヒドロキシスチレン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを粉末として得た。

（分析)
得られた多孔質樹脂ビーズについて以下の分析を行った。

（１）メジアン径
レーザー回折／散乱法(（株）堀場製作所製レーザー回折／散乱式粒度分布装置ＬＡ−９２０)にて測定した。

（２）平均細孔径
水銀圧入法（Quantachrome製水銀ポロシメータ PoreMaster 60GT）を用いて測定した。

（３）ヒドロキシ基量
ＪＩＳＫ００７０に基づいて、滴定法により測定した。即ち、測定対象の多孔質樹脂ビーズのヒドロキシ基を既知量のアセチル化試薬(無水酢酸／ピリジン)によってアセチル化し、上記アセチル化において消費されなかった無水酢酸量を水酸化カリウムによる滴定で求めることによって、試料のヒドロキシ基量を算出した。具体的には以下のとおりである。

無水酢酸２５ｇにピリジンを加えて、全量１００ｍＬとして、これをアセチル化試薬とした。測定試料（乾燥した多孔質樹脂ビーズ）０．５〜２ｇをフラスコに量り取り、上記アセチル化試薬０．５ｍＬとピリジン４．５ｍＬとを正確に加えた。フラスコ中の混合物を９５〜１００℃に２時間保持した後、室温まで放冷して、これに蒸留水１ｍＬを加えた。これを１０分間加熱して、アセチル化に消費されなかった無水酢酸を分解した。フラスコの全量をビーカーに移し、蒸留水で全量１５０ｍＬに希釈した後、０．５Ｎの水酸化カリウム水溶液で滴定した。

別に、測定試料を入れずに、上記と同様の操作によってブランク測定を行った。測定試料のヒドロキシ基量は下記式（１）から算出した。但し、Ａ(μｍｏｌ／ｇ）は測定試料の水酸基量であり、Ｂ（ｍＬ）はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、Ｃ（ｍＬ）は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、ｆは水酸化カリウム水溶液のファクターであり、Ｍ（ｇ）は量り取った測定試料の重量である。

Ａ＝（Ｂ−Ｃ）ｘ０．５（ｍｏｌ／Ｌ）ｘｆｘ１０００÷Ｍ … （１）

上記多孔質樹脂ビーズのメジアン直径は８０μｍ、平均細孔径は２９ｎｍ、ヒドロキシ基量は４９１μｍｏｌ／ｇであった。

実施例２
（多孔質樹脂ビーズの作製）
実施例１において、スチレン４０ｇ、ｐ−アセトキシスチレン３．５ｇ（単量体混合物における割合３６９μｍｏｌ／ｇ）、トリエチレングリコールジメタクリレート１５ｇ（単量体混合物における割合８９７μｍｏｌ／ｇ）、１−ウンデカノール８０ｇ及び過酸化ベンゾイル（２５％含水物）１ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、スチレン−ｐ−ヒドロキシスチレン−トリエチレングリコールジメタクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを粉末として得た。

得られた多孔質樹脂ビーズについて、実施例1と同様にして、分析を行った結果、メジアン直径７５μｍ、平均細孔径３４ｎｍ、ヒドロキシ基量３９３μｍｏｌ／ｇであった。

（多孔質樹脂ビーズヘのヌクレオシドリンカーの結合）
上記多孔質樹脂ビーズ１ｇ、DMT-dT-3'-succinate (Beijing OM Chemicals 製)０．１８ｇ、ＨＢＴＵ（Novabiochem 製) ０．０９ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．０８４ｍＬ及びアセトニトリル１０ｍＬを混合し、攪拌下、室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過、洗浄した後、乾燥させた。これにＣａｐＡ (２０％無水酢酸／８０％アセトニトリル) ２．５ｍＬ、ＣａｐＢ (２０％Ｎ−メチルイミダゾール／３０％ピリジン／５０％アセトニトリル) ２．５ｍＬ、４−ジメチルアミノピリジン０．０２５ｇ及びアセトニトリル５ｍＬを混合し、攪拌下、室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過、洗浄した後、減圧乾燥させ、DMT-dT-3'-succinate を結合した多孔質樹脂ビーズを得た。ｐ−トルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて脱保護したＤＭＴ基の吸光度測定 (４１２ｎｍ) から求めた DMT-dT-3'-succinate の結合量を表１に示す。

（オリゴヌクレオチドの合成）
上記 DMT-dT-3'-succinate を結合した多孔質樹脂ビーズをカラムに詰め、Applied Biosystems 3400 DNA 合成機 (アプライドバイオシステムズ製) にセットして、合成スケール１μｍｏｌ、DMT-off の条件にてオリゴヌクレオチド dT20 の合成を行った。合成後のカラムを乾燥させ、重量測定から得られたオリゴヌクレオチドの重量収量（ｍｇ／μｍｏｌ) を表１に示す。

多孔質樹脂ビーズからのオリゴヌクレオチドの切り出しと脱保護は、濃アンモニァ水を用いて、５５℃で１２時間反応させて行った。紫外線吸光度測定 (２６０ｎｍ) から得られたオリゴヌクレオチドのＯＤ収量を表１に示す。

得られたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ測定 (ウォーターズ製アライアンスＵＶシステム、ＹＭＣ製 Hydrosphere C18) から求めた dT20 (全長、Full-length) の割合を表１に示す。

実施例３
（多孔質樹脂ビーズの作製）
実施例１において、スチレン４０ｇ、ｐ−アセトキシスチレン３．５ｇ(単量体混合物における割合３６９μｍｏｌ／ｇ)、１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート１５ｇ(単量体混合物における割合１００８μｍｏｌ／ｇ) 、１−デカノール７５ｇ及び過酸化ベンゾイル (２５％含水物) １ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、スチレン−ｐ−ヒドロキシスチレン−１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを粉末として得た。

得られた多孔質樹脂ビーズについて、実施例１と同様にして、分析を行った結果、メジアン直径７２μｍ、平均細孔径２６ｎｍ、ヒドロキシ基量４４６μｍｏｌ／ｇであった。

実施例４
（多孔質樹脂ビーズの作製）
実施例１において、スチレン４８ｇ、ｐ−アセトキシスチレン２．５ｇ(単量体混合物における割合２６４μｍｏｌ／ｇ) 、１，９−ノナンジオールジアクリレート８ｇ (単量体混合物における割合５１０μｍｏｌ／ｇ) 、１−ノナノール９０ｇ及び過酸化ベンゾイル (２５％含水物) １ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、スチレン−ｐ−ヒドロキシスチレン−１，９−ノナンジオールアクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを粉末として得た。

（多孔質樹脂ビーズヘのヌクレオシドリンカーの結合及びオリゴヌクレオチドの合成）
実施例２と同様にして、DMT-dT-3'-succinate を結合した多孔質樹脂ビーズの作製及びオリゴヌクレオチド dT20 の合成を行った。DMT-dT-3'-succinate の結合量、オリゴヌクレオチドの重量収量、オリゴヌクレオチドのＯＤ収量及び dT20 (Full-length) の割合を表１に示す。

比較例１
（多孔質樹脂ビーズの作製）
実施例１において、スチレン４８ｇ、ｐ−アセトキシスチレン３．５ｇ (単量体混合物における割合３６９μｍｏｌ／ｇ) 、ジビニルベンゼン（５５％）７ｇ (単量体混合物における割合５０６μｍｏｌ／ｇ) 、２−エチルヘキサノール５２ｇ、イソオクタン２３ｇ及び過酸化ベンゾイル(２５％含水物)１ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、スチレン−ｐ−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを粉末として得た。

得られた多孔質樹脂ビーズについて、実施例１と同様にして、分析を行った結果、メジアン直径８６μｍ、平均細孔径３３ｎｍ、ヒドロキシ基量４２２μｍｏｌ／ｇであった。

比較例２
（多孔質樹脂ビーズの作製）
実施例１において、スチレン４８ｇ、ｐ−アセトキシスチレン３．５ｇ (単量体混合物における割合３６９μｍｏｌ／ｇ) 、ジビニルベンゼン（５５％）７ｇ (単量体混合物における割合５０６μｍｏｌ／ｇ) 、１−デカノール７５ｇ及び過酸化ベンゾイル (２５％含水物) １ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、スチレン−ｐ−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを粉末として得た。

得られた多孔質樹脂ビーズについて、実施例１と同様にして、分析を行った結果、メジアン直径１１６μｍ、平均細孔径６８ｎｍ、ヒドロキシ基量４３２μｍｏｌ／ｇであった。

表１に示す結果から明らかなように、実施例２及び４による本発明の多孔質樹脂ビーズを用いた場合、比較例１及び２の多孔質樹脂ビーズに比べて、高い Full-length％を維持しつつ、オリゴヌクレオチドの合成収量を増加することができる。

Claims

芳香族ビニル化合物とアシルオキシスチレンとジ (メタ) アクリレート化合物からなる単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させ、これを分散安定剤の存在下に水中に懸濁させ、懸濁共重合させて、芳香族ビニル化合物−アシルオキシスチレン−ジ（メタ) アクリレート化合物共重合体を得、次に、この共重合体におけるアシルオキシスチレン単量体成分の有するアシルオキシ基を加水分解することからなる芳香族ビニル化合物−ヒドロキシスチレン−ジ（メタ) アクリレート共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの製造方法。
ジ（メタ) アクリレートが（ポリ）エチレングリコールジ（メタ) アクリレート及びアルカンジオールジ（メタ) アクリレートから選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の多孔質樹脂ビーズの製造方法。
単量体混合物がアシルオキシスチレンを８０〜８００μｍｏｌ／ｇの割合で含有し、ジ（メタ) アクリレート化合物を２００〜２０００μｍｏｌ／ｇの割合で含有する請求項１に記載の多孔質樹脂ビーズの製造方法。
有機溶媒が炭化水素及びアルコールから選ばれる少なくとも１種であると共に、有機溶媒を単量体混合物に対する重量比０．５〜２．５にて用いる請求項１に記載の多孔質樹脂ビーズの製造方法。