JP2002540231A - アミノ基含有担体マトリックス、その使用および製造 - Google Patents
アミノ基含有担体マトリックス、その使用および製造Info
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Abstract
Description
いるポリマー炭化水素骨格[(−CH2CH2)n]を含む担体マトリックスに関する
。この骨格は以下では「ポリビニル骨格」または単に「骨格」と呼ぶことにする
。
元のアミノ基の窒素が連結構造に結合したままで残っている基に化学的に変換さ
れていることを意味する。
とを含む基はポリビニル骨格にある水素を置換したものであった。水素は、たと
えばアルキル(メチル、エチル、など)、様々な形のアリール(たとえば、フェニ
ル、ビニルフェニル、エチルフェニル、などのようなもの)、アシルオキシ、ア
リールオキシ、アルコキシ、などのようなその他の基によっても置換されている
。これらの基は時にはさらに誘導化されている。
分配工程における固相として、および固相有機合成において、および細胞培養に
おける担体として、およびたとえば酵素のような触媒のために、使用することが
できる。
ポリ−ビニル化合物とを共重合させることによって製造されていた。これらモノ
マーの少なくとも1種は、重合反応後にアミノ基に変換できる官能基を含むもの
である。別法の一つでは、クロロメチルスチレンとジビニルベンゼンとを共重合
させ、続いてアンモニアで処理していた。他の別法は残留したビニル基をアミン
官能基が含まれる基に変換するものであった。
ンモニアガスプラズマによる処理によっても製造できることも示唆されている。
例えば米国特許第5369012号参照。気相プラスマ処理ではこの骨格および
/または結合基にある炭素原子に官能基が多少なりとも不規則に導入される。
のニトロ化と、それに続くニトロ基のアミノ基への還元である。ニトロ化は一般
に酸化のような副反応多数を伴う非常に激しい条件下に行われる。それに続く、
還元段階は比較的低い収率によって特徴付けられ、ポリスチレン上にニトロ基が
未反応のまま残る。高度に交差結合した原料ではこれらの反応を満足に使用する
ことが著しく困難である。副反応によってポリビニル骨格に直接付着する望まし
くないニトロ基が得られる。
必要な余分な工程のために、および副反応が起きるために、製造が比較的厄介で
あった。
基の可用性が変動することが多いことをわれわれは発見した。この変動は例えば
オリゴヌクレオチド固相合成および吸着工程などへの応用のためには最適である
とは考えられない。
購入できる担体マトリックスはマトリックスに付着する第一モノマーと共に販売
されている。仕込量はマトリックス1g当り第一のヌクレオチド約90マイクロ
モルである(Primer Support High Load 30; Amersham Pharmacia Biotech AB、
ウプサラ、スウェーデン)。
DNA、RNA、オリゴ/ポリペプチドの各用語は、たとえばDNAについての
PNA(WO9220703)およびLNAのように、それら各々の合成類似体を
含む。
の研究は次の報告に記載されている:Imoto et al., Bull. Chem. Soc. Jap., 4
9(5): (1976) 1342-1345; Donya et al., Russ. J. Appl. Chem., 71(1): (1998
) 132-137 (Zhurnal Prikladnoi Khimii 71(1): (1998) 127-132 から翻訳); Ru
ss. J. Appl. Chem., 67(3:2): (1994) 400-404 (Zhurnal Prikladnoi Khimii 6
7(3): (1994) 450-454 から翻訳); Donya et al., Vysokomol Soedin Ser A Ser
B, 36(12): (1994) 2068-2073; Donya et al., Vysokomol Soedin Ser A Ser B
, 37 (5): (1995) 752-757; Donya et al., Vysokomol Soedin Ser B, 34(8): (
1992) 3-8;およびDonya et al., Vysokomol Soedin Ser A, 34(12): (1992) 206
8-2073。これらの文献のどれにも特異的な官能基を保持すると予想される交差結
合ポリマー(担体マトリックス)の製造は記載されていない。
うという報告がある。Donya et al., Ukr. Khim. Zh. (ロシア語版) 56(9): (19
90) 984-990 参照。
レンとのラジカル重合反応における溶媒効果について報告した。
.04.99に出願された英国特許出願第990881630号に記載がある。
ビニルモノマーを記載しているが、このモノマーではビニル基がシリコン基を介
して芳香族基に連結していてもよい。この芳香族基はアミノ基で官能化されてい
てもよい。これらのモノマーはビニル芳香族物質ではない。
または誘導アミノ基を有する担体マトリックスを製造するための単純化された方
法を提供することにある。
ックスを提供することにある。
た担体マトリックスを提供することにある。ここに該マトリックスは、第一およ
び第二の目的に従って改善され、所望のオリゴヌクレオチド/オリゴペプチドの
収率改善を導く。
された担体マトリックスを提供することにあり、その改良点は乾燥マトリックス
グラム当り、≧100マイクロモル、例えば≧150マイクロモル、さらに≧2
00マイクロモルの有機試薬負荷量(共有結合による付着)である。これらの数字
は特にその有機試薬がヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはその類似体で
ある場合の担体マトリックスについて示す。
リアルライブラリー、の固相合成のための改善された担体マトリックスを提供す
ることにある。
素ビニル芳香族モノマー1種またはそれ以上を、他種のビニルモノマーと共重合
させる場合にこれらの目的が達成できることが認識された。言い換えれば、重合
反応後に得られるマトリックス内の実質的にすべてのアミノ基が同じ形、すなわ
ち純粋なアミノ基であるかまたはそのアシル化型である。
ている担体マトリックスを製造する方法を含む。この方法はモノビニルモノマー
(単量体I)1種またはそれ以上をジ−、トリ−またはポリビニルモノマー(単量
体II)とともに共重合させる工程を含む。この方法はビニルモノマーの一部がア
ミノ−(C0-10)炭化水素基または対応するアミド基(アシル化されたアミノ−(C 0-10 )炭化水素基)が付着する芳香族環(モノマーIII)を有することによって特徴
付けられる。重合反応の後に形成された重合体物質を集めて、さらに処理しても
よい。このアミノ基および/またはそのアシル化体は、続いて所望の官能基に変
換してもよい。例えば、アシル化されたアミノ基は加水分解によって対応するア
ミノ基に変換してもよい。このアミノ基は1級、2級または3級であってもよい
。
ンゼン(例えばアミノスチレンなど)およびアミノビニルナフタレンのように、す
なわち炭化水素基が存在しない純粋なアミノ基であってもよい。このアミノ基は
、たとえばアミド基におけるように誘導体化されていてもよい。このビニル基は
芳香環に直接的に付着している。
環状であってもよい。これはおのおの芳香族基でも非芳香族基でもよい。また、
好ましくは、たとえばフェニレンまたは純アルキレン基のような、すなわちアミ
ノ基を芳香環に連結する炭素鎖はヘテロ原子を含まないものである。
ノ−(C0-10)炭化水素−ビニル−芳香族化合物であって、そのビニル基とアミノ
−(C0-10)炭化水素基とが互いにオルト−、メタ−またはパラ位に存在するアイ
ソフォームであってもよい。単量体IIIはまたビニル基またはアミノ−(C0-10)
炭化水素のいずれかを1位または2位に含むアミノ−(C0-10)炭化水素−ビニル
−ナフタレン化合物であってもよい。
ればヒドロキシ、アルコキシまたはアミノ基1個またはそれ以上で置換されてい
てもよく、および鎖中の位置1ケ所またはそれ以上にある炭素原子を置換するこ
とになる窒素(アミノ窒素)原子、酸素(エーテル酸素)原子または硫黄(チオエー
テル硫黄)原子を含んでいてもよい。
およびアリールを含み、このアリールはたとえば窒素または酸素のようなヘテロ
原子がないか、1個またはそれ以上を含む置換または非置換フェニルを含む。ア
ルコキシは好ましくはC1〜7−アルコキシである。R1またはR2に存在するかも
しれないアミノ基の窒素は、たとえばC1〜7−アルキルのような炭化水素基1個
または2個を有していてもよい。
、アクリルアミド/メタクリルアミド、アクリロニトリル/メタクリロニトリル
、たとえばその非置換または置換(メタ、オルトおよびパラ異性体)モノビニルベ
ンゼンようなビニル芳香族化合物、その他である。また、単量体Iは、たとえば
エチルのような例えばC1-10−アルキル置換基を有するアルキルビニルベンゼン
であってもよい。ビニルエーテル、スチリルエーテル(炭素に付着するエーテル
酸素を有する)などは別の例である。ビニル基1個を有する単量体IIIのモノビニ
ル体は単量体Iの一部である。
メタクリレートおよびアクリルアミド/メタクリルアミド、ジビニルベンゼン(
例えばメタ、オルトおよびパラ体)などの様々な型のジビニル芳香族化合物であ
る。ビニル基を2個よりも多く有する対応する型も基本的には使用されるであろ
う。単量体IIは交差結合剤としても作用する。単量体IIはアルキル化された型で
あってもよく、また前記ジビニルモノマーのエーテル型であってもよい。ビニル
基2個またはそれ以上を有する単量体IIIの型は、単量体IIの一部である。
膨潤する性能が低下する。
めには典型的な百分率%は次の通りである: 単量体I:≧95%、例えば≧98%および≦99.5%; 単量体II:≧0.5%および≦5%、例えば≦2%; 単量体III:≧5%、例えば≧15%および≦80%、例えば≦50%。 得られるマトリックスは、核酸合成を除いて、殆どの種類の有機化合物の固相
段階的合成のために特に重要である。
に≦20%。
液流を通過させる適用のためには特に重要である。典型的な使用はクロマトグラ
フィーへの応用および核酸の固相合成である。
ルモノマーの全量に基づいて算出される。
ことになろう。使用するビニルポリマーに依存して、この重合反応はアニオン性
、カチオン性または遊離ラジカル性の重合反応として行ってもよい。
体I、IIおよびIII)を選択するのは好適である。
のシステムを利用する。反応開始システムは電子照射、γ線照射、ラジカル反応
開始剤、その他である。典型的な反応開始剤は化学的、熱的および照射的な反応
開始剤である。熱的反応開始剤はしばしば好適である。これは30℃−90℃の
範囲で最善な効率を示す。単量体IIIにおける遊離アミノ基の存在は選択した重
合反応条件下に遊離アミノ基とかなり反応する反応開始剤を選択しない点で有利
である。
チルバレロニトリル)、アゾイソニトリル、ペルオキシド(例えばベンゾイルペル
オキシド)、ペルスルフェートである。
造を持つか、またはベンゾイル誘導体である。必要であれば、選択した反応開始
システムを適切な反応加速剤と組み合わせる。
族化合物(特にアミノビニル芳香族化合物)が関与する効率的な遊離ラジカル重合
反応が、これらモノマーがラジカル重合反応中に連鎖移動試薬としておよび/ま
たは阻害剤として作用するかもしれないという事実によって妨害されるかもしれ
ないことはよく知られている。
反応系から酸素を除去することによる。
、特にアミノビニル芳香族化合物、の欠陥を克服する重合反応エフェクター物質
を添加することである。適切なエフェクター物質は連鎖移動試薬としておよび/
または使用するアミノ含有ビニル芳香族化合物の自己阻害性を中和する試薬とし
て作用するものでもよい。この種類のエフェクターの効率はエフェクター物質の
間およびラジカル重合反応系の間で変動するであろう。エフェクターの量と種類
は重合反応が進行して本発明の内容に定義するようなアミノ基含有担体マトリッ
クスを与えることができるように選択すべきである。このエフェクターは選択さ
れた溶媒成分、別の連鎖移動試薬、その他であってもよい。またある種の反応開
始剤が反応開始剤としておよび/または連鎖移動試薬としておよび/またはアミ
ノ置換ビニル芳香族化合物の自己阻害性を中和する試薬として作用する点に関し
て二重または三重の官能性を有してもよいことを予想することもできる。連鎖移
動試薬および反応開始剤の定義および例示についてはOdian, George G., "Princ
iples of Polymerization", 3版, A Wiley-Interscience Publication, (1991)
, pp 211-267を参照。適当な重合反応エフェクター物質を選択すれば、重合反応
混合物内でのビニル化合物(たとえばビニル芳香族化合物など)の適切な重合反応
様式を促進することができる。関連する混合物は前記定義のI型およびII型モノ
マーの双方を、重合可能なアミノ含有ビニル芳香族化合物(たとえばアミノビニ
ル芳香族化合物)と共に含有する。
モノマーを使用するものである。こうすると遊離アミノ基の欠陥が減少して重合
反応の阻害がなくなるかまたは非常に低下することになる。重合反応にアシル化
型を使用した時には重合反応後、例えば加水分解による脱保護によって遊離アミ
ノ基が形成される。
ルベンゼンおよびその他のスチレンについて実験の部(Aの部)に概説したように
個別に反応開始剤、モノマーの種類、連鎖移動試薬、などに関して最適化しなけ
ればならない。例えば前記した特許文献および文献報告に定義されているような
背景技術も参照。
反応促進剤系を適切に選択することによって、または当技術分野で知られている
ような電子照射を利用することによって適宜対応することができる。水素および
/またはC−C二重結合に結合するsp3−混成炭素のみを有するアリル基およ
びその他のアルケン基は反応の遅いビニル基の例である。
知られているような適切な条件を適用して多少なりとも球状の粒子を得てもよい
。同様にしてバルク重合反応を利用してもよく、それに続いておそらく適当なら
ばブロックを粒子に崩壊させてもよい。
も本発明に使用できる。よく知られている乳化剤および安定化剤はドデシル硫酸
ナトリウム、アルキル化オリゴエチレングリコール、セルロース誘導体、などで
ある。
る、開いた球腔を有する多孔性の網状組織に分散させる(水はポローゲンとして
作用する)ように条件を選択することを想定することもできる。例えば欧州特許
第60138号および米国特許第5200433号を参照。これは内側のw/o
乳濁液がHIPEを形成する液滴の形をなす、所謂w/o/w乳濁液に拡大できる
。WO9531485を参照。この種の乳濁液は高内相乳濁液(high internal p
hase emulsions;HIPE)とも呼ばれる。
孔性物質およびモノリス的プラグ物質が得られる。典型的にはポローゲンはポリ
マーが形成される時に析出してチャネル/ポアを形成する化合物である。ポロー
ゲンは液体、固体または気体のいずれでもよく、重合反応後に除去できなければ
ならない。液体のポローゲンは典型的には使用するモノマーを完全に溶解できる
が、形成されたポリマー鎖は溶解できない。これは、ポリマー鎖が析出してポロ
ーゲンで満たされたポア系を含むポリマー物質を形成することになることを意味
する。このポア系の特性はポローゲンの量および型に依存することになる。一般
にポリマーの溶解度パラメータ値に近い溶解度パラメータ値を持つポローゲンは
小さなポアの割合が比較的に多い弾性あるゲル様多孔性物質が得られる。たとえ
ばトルエン、キシレン、メジチレン、などのような芳香族溶媒にはビニル芳香族
化合物が重合する場合にこの効果を示す可能性がある。
の使用は小さなポアの割合が小さな剛性の多孔性物質ができることが多い。ビニ
ル芳香族化合物については、例えばアルカノールおよび脂肪族炭化水素をポロー
ゲンとして使用するとこの効果が得られる。よく使用されてきたこの型のポロー
ゲンはたとえばヘプタンのようなアルカン、たとえばデカノールのようなアルカ
ノールであった。液体化合物の混合物もポローゲンとして使用されてきた。
族溶媒を含むポローゲンは混合可能な他の液体との組合せでもよいがポローゲン
として好適である。
マーに基づくポリマーにも適用できる。
サイズ、ポア容積およびポア表面積を有するかもしれない。そこでポアサイズ直
径は10Åと1000μmの範囲内にある。ポアサイズ直径の最適な選択は典型
的には意図する使用に依存し、たとえば当技術分野で知られている原則に従って
選択することができる。
または一定範囲内にあることが重要である。多孔性固相、特にオリゴヌクレオチ
ドとその類似体のために担体マトリックスのポア容積の10%またはそれ以上、
たとえば30%またはそれ以上について最適なポアサイズ直径は10〜2000
Å、例えば100〜1000Åの範囲内でなければならないことが見出された。
ビニル芳香族モノマーに基づくマトリックスでこのポア特性を得るために今まで
に見出された最良のポローゲンはトルエン、キシレンおよびメジチレンである。
ビニル芳香族モノマーを溶解することおよびそれから得られるポリマーによって
吸着されることに関する特性が同様な溶媒も使用できるであろうと信じられる。
多いことを意味する。前記および実験の部に記載したポアサイズおよびポアサイ
ズ分布の数字はテトラヒドロフラン中でポリスチレンのサイズ排除クロマトグラ
フィー(SEC)で得た値を示し、ポリスチレンの分子量とポアサイズとを次式に
よって関連付ける: φ(Å)=0.62(Mw)0.59 [式中、 φ(Å)はÅを単位とするポア直径であり; Mwはポリスチレンの平均分子量である] この方法は不規則な形のポアを円柱形のポアに近似するもので、Halasz et al,
Angew. Chem. Int. Engl., 17: (1978) 901-908およびHalasz et al, Angew. Ch
em. Int. Engl., 19: (1980) 24-28に記載されている。
00μm、好ましくは3〜1000μmまたは3〜500μmの範囲内にあり、
すなわち粒子サイズは乳濁液重合反応では通常得られないものである。この粒子
は、たとえばバルク重合反応から得られるブロックを崩壊させることによって得
られるような不規則な形または懸濁液での重合反応で得られる球状(ビーズ)を持
っている。この粒子は単分散または多分散であってもよく、単分散粒子集団では
その粒子の95%またはそれ以上はその平均直径±5%の範囲内のサイズを有す
る。
せる第一工程および次に重合反応の前にモノマーを取り込む第二工程を含む、い
わゆる種粒子を利用することによるものである。例えばここに参考のために引用
する米国特許第4336173号参照。米国特許第4336173号に記載され
ているように、本方法は次を意味する:
および分子量<5000および水溶解度<10-2g/Lを有し、実質的に該種粒
子によって吸着される物質1種またはそれ以上を含む物質Iを含む分散液または
乳濁液を提供すること;および (B)工程(A)の分散液または乳濁液に次のものを添加すること: a)物質IIであって、物質Iよりも少なくとも10倍高い水溶性を示す部分的に
水溶性の物質1種またはそれ以上を含み、その際、物質IIが物質Iを含む種粒子
に浸透し、物質IIは該種粒子から物質Iが脱出する速度よりも実質的に大きい速
度で該粒子に浸透し、物質Iを含む該粒子に浸透する該物質IIの量は容積で工程
(A)で使用した種粒子の少なくとも20倍であるもの;および b)必要な乳化剤および重合反応開始剤; 該物質Iおよび物質IIであって、(a)添加した反応開始剤によって重合反応可能
なモノマー1種またはそれ以上であり、また(b)モノマーと同じ条件では重合反
応をしない液体、を含有する物質を含むもの;
によって基: −N(+)R1'R2'R3' に変換してもよい。
在する時(アンモニウム型)には、この窒素が陽電荷を持つことを意味し、R3'が
不在の時には、この窒素には電荷がないことを意味する。
他に、式:−A−Xを有する基から選択してもよい。ここに (a)Aは有機架橋構造である;および (b)Xは次を含む構造である: (i)求核性基または求電子性基を持つ物質または遊離ラジカルと反応して該物質
またはその一部と共有結合的に該担体マトリックスに付着することのできる反応
性基1種またはそれ以上; (ii)そのような反応性基に変換できる基1個またはそれ以上;または (iii)そのペアの別員の親和性結合を媒介する親和性ペアの一員。
陽電荷を有する。R1'、R2'およびR3'は窒素にアミン/アンモニウム官能性を
提供する基である。これらはR1'およびR2'の中から選択されるが、これは−N (+) R1'R2'R3'窒素に直接的なsp3混成炭素または芳香族炭素を提供する。
む直線状、分枝状または環状の炭化水素鎖、(b)エーテル、(c)チオエーテル、
(d)アミド構造、(e)エステル、(f)アゾ、(g)2級または3級アミン構造、な
どから選択された有機構造要素を1個またはそれ以上が存在する。好適な構造は
典型的には、たとえばアセトアミドに匹敵するか、それよりも高い加水分解安定
性を有する。ある種の応用では、一定位置での選択的切断を可能にするために安
定性の低い構造を含めるのが有利なこともある。例えばポリマーの固相合成に関
する以下の記載を参照。
の担体マトリックスに存在するいかなる基ともまたはその使用の間に適用される
条件下に反応しないことを意図するものである。
で、構造Aは−N(+)R1'R2'R3'の窒素とともに−N=N−、−N=C<、−
N+≡N、などを形成する末端基を有していてもよい。−N+≡Nでは、−A−X
は ≡Nであって、ここではAとXが同じである。
シ、アミノ、チオール、カルボキシなどおよびその活性化型は典型例である。
A、オリゴヌクレオチド、およびたとえばPNAおよびLNAのような類似体)
であってもよく、これはその3'−位(オリゴヌクレオチドの一末端)でAを介し
て担体マトリックスに連結し、および5'−位(オリゴヌクレオチドの一末端)は
保護されているか保護されていない。もし存在するなら、アミノ基、燐酸基およ
びヒドロキシ基は好ましくは保護された形にある。Xがヌクレオチドである場合
には2'−位は好ましくは保護される。
シド/ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド/デオキシヌクレオシドまたは核酸
に依存する。典型的なアミノ保護基はデオキシ体のためには:アデノシン−ベン
ゾイル/フェノキシアセチル、シトシン−ベンゾイル/イソブチリル/アセチル
、グアニン−イソブチリル/イソプロピルフェノキシアセチル、チミジン−なし
;およびヌクレオシド/ヌクレオチドのためには:アデノシン−フェノキシアセ
チル、シトシン−アセチル、グアノシン−イソプロピルフェノキシアセチル、ウ
ラシル−なし;である。
スフェート酸素は硫黄で置換してもよい。すなわちオリゴヌクレオチド鎖中では
ホスフェート基は−P(S-)(=O)−[−P(=S)(−O-)−]であってもよい。
る。
ゴヌクレオチド固相合成の反応サイクルが行える、すなわち構造Aが最終切断工
程までの様々な工程下に安定である、ように選択される。
ヌクレオチド鎖の第一ヌクレオチドの3'−位にエステル官能基を提供するが、
Aの他の構造要素はさらに安定である。Aの他の構造要素はそこでアミド、純粋
な炭化水素鎖、エーテル、チオエーテル、などであってもよい。別の例にはこの
エステル基は単一なまたは反復したシリルエーテル構造で置換してもよい。たと
えばここに参考のために引用するWO9209615およびWO9808857
号参照。しかしながら当技術分野の熟練者にとっては構造Aの変化多数がこの発
明の範囲内に入ることは明白である。
連結したオリゴペプチドであってもよい。たとえばα−アミノ基などのアミノ基
は当技術分野で知られているように保護されていても、非保護であってもよい。
もし存在するなら、当技術分野で知られている様式で他のカルボキシ基および他
のアミノ基およびチオール基は保護されていてもよい。この場合、架橋構造Aの
安定性要件はオリゴヌクレオチド固相合成のために有用なものとは相違するが、
当技術分野の者によく知られている。
ックスに親和性結合(「親和性吸着」)するために使用してもよい。よく知られて
いる親和性ペアは: (a)陽荷電または陰荷電のもの(イオン交換;担体マトリックスに共有結合的に
結合した1級、2級、3級および4級アンモニウム、スルフォネート、スルフェ
ート、ホスホネート、ホスフェートおよびカルボキシから選択した基)、 (b)抗体および抗原/ハプテン、 (c)レクチンと炭化水素構造、および (d)IgG結合蛋白質とIgG である。水性溶液中で使用されることが多く、結合に選択性および特異性のある
Xの種類は水性媒体と固相との間の接触表面が疎水性である場合には妨害するで
あろうことが多い。そこで、本発明のこの態様では、例えばAとしてヒドロキシ
基含有物を付着させることによって、表面を親水性にすることが重要なことが多
く、次にX、すなわち親和性ペアのメンバーを示す。親水性化操作および固相に
親和性結合剤を共有結合的に連結する操作法は当技術分野でよく知られている。
ミノ基の窒素が保持されているもの。これらの基はアリーレン基を含む連結構造
を介して該骨格に結合する。この構造は骨格の水素を置換することによって骨格
に結合する; を含む担体マトリックスである。
よい。連結構造は前記R1およびR2について定義した炭素鎖と同じ種類から選択
する。
導される基の各々が直接的にその窒素を介してアリーレン基に付着することによ
って特徴付けられる。
。(+)は前記と同意義を有する]
、好ましくは0.1〜4ミリモル/gの間の−NR1'R2'R3'基含有率を有する
。これらの数字は特に重合反応で得られる担体マトリックス、すなわち、アミノ
基はNR1R2である、に適用される。
交差結合は当技術分野で知られているようにして重合反応工程でビニル基を2個
またはそれ以上有するモノマーを含めること、または重合反応の後に求電子的交
差結合剤/求核的交差結合剤を使用する別個な交差結合反応のいずれかによって
達成される。
い。すなわち、−N(+)R1”R2”R3”基の必須部分は、好ましくはアリーレン
基を含む、連結構造を介して骨格に連結する。好適な変化体にあっては本質的に
ニトロ基またはニトロ化および後続するニトロ基のアミノ基への還元の結果とし
て作製される形成された副反応に由来する基は存在しない。
気体類似体)によって導入された窒素含有基に由来する−N(+)R1”R2”R3”
は本発明のこの側面の好適な変化体からは排除される。
第二側面におけるマトリックスは本発明の第一側面に従って製造されたマトリッ
クスについて記載した前記特性のいずれをも有していてもよい。
な分野で使用するための方法である。原理的に各々の使用のための様々な段階は
それ自体が知られており、将来の発展を排除するものではない。
循環的である。この有機化合物は様々な類似二官能性モノマー1種またはそれ以
上からなるポリマーであってもよい。用語「二官能性」はモノマー内の官能基1
個が第二の機能との求核的/求電子的置換反応に関与することを意味する。ある
循環の反応生成物を次の循環の出発物質として使用するように、この型の反応を
循環的態様で行う時は、配列内に様々なモノマーを含むポリマー鎖が形成される
ことになる。各循環について、モノマー単位1個が担体マトリックスに一端で結
合して成長しつつあるポリマー鎖に付加される。典型的なプロトコルは次項を含
む:
されたモノマーの一つを含むXを持つ前記定義の担体マトリックスを提供する; 2.適用できるならば第二官能基を脱保護する; 3.該第二官能基をその第一の官能基を活性化し、および第二官能基を保護し
たモノマーと反応させる; 4.工程2〜3を同一または相異なるモノマーを用いて予定した回数だけ反復
する;および 5.要すれば形成されたポリマーを担体から脱保護し、放出させる。 使用したモノマーがさらに反応に関与できる官能基を含む場合には適宜保護する
。 典型的には洗浄段階を段階1〜5の間に含める。
NA、PNA(WO9220703)、LNA、など)およびオリゴペプチドの固
相合成のために殊に有用である。
遊離の求核的基があってはならない。禁忌されるべき典型的な基はHO−または
アミノ基である。
ドおよび類似体)の合成は当技術分野で知られている。そこで保護されたヌクレ
シド/デオキシヌクレオシドに等しいXを有する担体マトリックスから出発する
典型的なプロトコルは次のものを含む:
クレオチドを脱保護する; 2.5'−脱保護デオキシヌクレオシドを所望の5'−保護デオキシヌクレオシ
ドの活性化されたアミダイトと反応させる; 3.工程1で脱保護されたデオキシヌクレオシドを工程2で導入されたデオキ
シヌクレオシドに結合するホスファイト基を酸化してホスフェートまたはチオホ
スフェートとする; 4.未反応5'−脱保護デオキシヌクレオシドをキャッピングする; 5.各サイクル内で同一または相異なるデオキシヌクレオシドを用いて1〜4
工程を所定の回数反復する;および 6.脱保護して生成したDNA(オリゴヌクレオチド)をマトリックスから放出
する。
全工程は典型的にはアセトニトリル(工程1、工程2および工程4)中で無水の条
件下に行う。RNA合成のための操作はデオキシヌクレオシドの代わりにヌクレ
オシドを用いるほかは類似している。工程2では反応条件を完全に無水に保持す
るが、添加するアミダイトの量はマトリックスに付着している第一モノマーの1
.5当量まで下げてもよい。
ッドができるまで充填したカラム/反応容器内で行われる。試薬と洗浄液を好ま
しくは押出流としてカラムに通す。好ましくはこの粒子は多孔性であって、前記
のように単分散または多分散であってもよい。適当なポアサイズ直径については
前記を参照。
al., "Chemical Synthesis and Purification of Phosphothioate Antisense O
ligonucleotides", in "Manual of Antisense Methodology", G. Hartman and S
. Endres (編) Kluwer Academic Publishers (1998), pages 1-19を参照。また
、OligoPilot User Manual, Amersham Pharmacia Biotech AB, 特に第4章を参
照。
ロトコルと類似である。そこで、例えばα−アミノ基などアミノ基が保護された
アミノ酸残基と等しいXを有する担体マトリックスから出発して行う、典型的な
プロトコルは次項からなる:
導体とを反応させる; 3.同一または相異なるアミノ酸を用いて工程1〜2を所定の回数反復する;
および 4.脱保護し、担体マトリックスから形成したオリゴペプチドを放出する。 さらにPeptidsynthese: Miklos Bodanszky Peptide Chemistry, Springer Verla
g 1988 を参照。
和性ペアの一員である。この使用は担体マトリックスと親和性ペアの他の一員を
含む液体、典型的には水性液体、とを互いに接触させることからなる。条件は親
和性結合を促進するように選択され、基本的にそれ自体当技術分野で知られてい
る。続いて担体マトリックスを液体から分離し、望むならば親和性吸着したメン
バーを放出させ、さらに処理する。
造Bを介してその3'−位(オリゴヌクレオチドの末端)に付着するヌクレオシド
/ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド/デオキシヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチド、またはこれらの化合物の類似体からなる。付着したものは好ましくは2
'−、アミノ−およびホスフェート位置を保護し、5'−位(オリゴヌクレオチド
の末端)は保護されるか、または非保護である。本発明のこの側面からは、担体
マトリックスはポア容積の10%またはそれ以上、たとえば30%以上について
ポアサイズ直径が10〜2000Å、例えば100〜1000Åの範囲内である
ことによって特徴付けられる。前記参照。好適な変化体では粒子は5〜100μ
m、特に10〜50μmの範囲の平均直径を有する前記の通り単分散である。リ
ンカー構造Bは本発明の第二側面について前記したものと同様にして3'−位に
結合する基を提供する。構造Bに加えるにヌクレオシド/ヌクレオチド、デオキ
シヌクレオシド/デオキシヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ポリビニ
ル骨格にアリーレンを介して連結する基−N(+)R1”R2”R3” の部分であっ
ても部分でなくてもよい。
0%(w/w)および主としてメタおよびパラ−エチルビニルベンゼン20%(w/w)含
有。スチレン(工業級)。アミノビニルベンゼン(アミノスチレン、ビニルアニリ
ン)はOakwood社(米国)から入手。 単量体I:メタおよびパラ−エチルベンゼン+アミノビニルベンゼン(単量体III
)+場合によってはスチレン。 単量体II:メタおよびパラ−ジビニルベンゼン。
バレロニトリル)(V−65、Wako)(0.526g、2.12ミリモル)をトルエン(
23.34g)(ポローゲン)に溶解した。その後、モノマーであるジビニルベンゼ
ン(3.001g、23.1ミリモル)、スチレン(6.013g、57.6ミリモル)
およびアミノスチレン(1.000g、8.39ミリモル)を添加した。混合物をガ
ラス棒で撹拌して均質な溶液を得た。次に反応フラスコに凝縮器を取付け、室温
の油浴に入れた。パスツールピペットを付けたチューブを通して混合物に窒素ガ
スを通した。30分間反応混合物表面下に窒素ガスをゆっくりと通した。この間
、窒素ガス流は冷水凝縮器を通して導出した。その後、パスツールピペットを反
応混合物の表面上に上げて、その後、実験中はその位置に維持してゆっくりとし
た窒素ガス流を継続した。次に油浴を70℃に加温し、反応物をそのまま一夜放
置した。21時間後、反応フラスコを油浴から取出し、徐々に室温まで戻した。
そこで反応混合物は湿った軟らかなゴム状ポリマープラグとなった。このプラグ
をスパーテルで小さな断片に分割し、ガラスフィルター漏斗に入れた。この断片
を次にトルエン(10×50mL)で洗浄した。トルエンがポリマープラグを非常
によく膨張させたので洗浄操作は非常に遅かった。濾過操作の中間で断片を結晶
化容器に移し、スパーテルを用いて小さな切片に切断して洗浄効果を高めた。洗
浄操作後、ポリマー断片に残ったトルエンを真空オーブン(25℃、約1ミリバ
ール、24時間)で蒸発させた。蒸発の間にポリマー断片はさらに細かい粒子に
粉砕するのに十分なまで硬化した。最後にこの粒子をさらに細かい粒子まで粉砕
した。
GC−MSおよびニンヒドリン呈色試験によって証明された。
ンおよびアミノスチレンのラジカル重合反応 試験管4本の中で、反応開始剤2,2'−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニト
リル)(V−65)および連鎖移動試薬、四臭化炭素(CBr4)をトルエン(ポロー
ゲンでもある)に溶解した。次にジビニルベンゼン、スチレンおよびアミノスチ
レンを添加した。表1−3に記載の量を使用した。次に試験管を数秒間激しく振
りまぜて均質な混合物とした。次に各試験管の反応混合物表面下に窒素ガスを5
〜10分間通して酸素を除き、次にセプタムを装着した。さらに、各試験管にシ
リンジを取付けたバルーンに窒素を充填した。シリンジの針をセプタムに通して
酸素が試験管に入らないことを確実にした。重合反応は全試験管を温度60℃の
油浴に入れて開始させ、そのまま一夜放置した。翌日にスパーテルを使用して生
成したポリマープラグを断片化した。最後にポリマー断片をメタノール(4×1
0mL)およびトルエン(10×10mL)で洗浄し、真空オーブン(25℃、約1
ミリバール、24時間)で乾燥した。
開始剤と組合せた最少量のCBr4を用いた試料のみで粘度が僅かに増した。表1 −重合反応2における仕込量
時間後には全ての試験管には軟らかなポリマープラグを含んでいた。そこでこの
ポリマープラグを分析して重合反応の間に実際にポリマーマトリックスの中に取
込まれたアミノスチレンの量を決定した。FTIR、元素分析およびニンヒドリ
ン呈色試験はアミノスチレンが生成したポリマー中に取り込まれたことを示した
。表2 −重合反応2における仕込量
試験管によって結果が変動した。CBr4を最大量使用した試料2本では外見上
良好なポリマープラグを形成した。最少量のCBr4を最少量のV−65と組合
せて使用した試料では、重合反応は兆候も示さなかった。最少量のCBr4を多
量のV−65と組合せて使用した試料では重合反応が見られたが、いくらかの相
分離が起きたように思われた。この実験の試料についてはこれ以上の分析はしな
かった。表3 −重合反応2における仕込量
IFT)を用いてPerkin Elmer 16 PC FITRで記録した。
た方法はMK2006とラベルした。
いて行った。このGC−MS装置はFinnigan Trace GCQであり、熱分解装置はPy
rola 2000であった。熱分解は700℃で行った。
Press (1998) 214頁)が記載した操作に従った。ストック溶液3種を用意した。
A−ニンヒドリン(500mg、2.81ミリモル)のエタノール(10mL)溶液
; B−フェノール(40g、425ミリモル)のエタノール(10mL)溶液;および
C−KCN溶液(2mL、0.001M)のピリジン(全容100mLまで)希釈液
。 ポリマー断片約20mgを秤量して試験管に入れた。次にストック溶液(A、
BおよびC)各2〜3滴をポリマー断片に加え、試験管を温度約100℃に維持
した油浴で時々ふりまぜながら5分間加熱した。このように処理するとアミノ基
を有する物質は暗青色に変色する。アミノ基を含まない材料は変色しない。
マー鎖を得て直径約0.5μmの種粒子を製造した。この種粒子をポローゲンと
してのトルエンとモノマー(工業級のジビニルベンゼン、アミノビニルベンゼン
、スチレン)とアゾ反応開始剤との添加および重合反応による2工程操作法によ
って膨潤させた。前記の適当な安定化剤、反応開始剤、などを含めた。このシス
テムを選択して、サイズ30μmの単分散系最終粒子を得た。この操作は米国特
許第4336173号に略記されたものである。
工業級スチレンを意味する。 ** =モノマー全量1g当り添加アミノ基のミリモル数。 ***=元素分析に基づく、生成粒子に含まれる窒素(アミノ基)のミリモル数。 %w/w値はモノマーの全量に基づく。 多孔率値は重合反応混合物中に含まれるトルエンの百分率に基づく。
って、ロット1〜7のポア容積の48〜61%は115〜880Åの範囲内のポ
アサイズ直径を持つポア内にあって、ポア容積の30%以上を構成することが見
出された。
Tr−保護し、存在するならアミノ基を適当に保護しておく)でサクシニル化す
ることによって行った。得られたコハク酸のモノエステルをイソブチリルクロロ
ホルメートで活性化し、アミノ基を含む担体マトリックスに結合させた。この結
合率はDMTr化合物の放出およびこの化合物のUV/VISによる測定で決定
した。最初はロット1(70%ポローゲン)の担体マトリックス(粒子)は粒子1g
当り0.344ミリモルのヌクレオチドを結合することが見出された。残りのア
ミノ基は多分おそらく小さ過ぎるポア内に存在するためか、またはポリマー材料
内に埋込まれているために、接近不能なので結合できないのであろう。
ーデン)で自動的に行った。DMTr−保護ヌクレオチド担体から出発してこの
合成は次の工程を含んでいる: 1.3%(v/v)ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液によるジメトキシトリチ
の加水分解; 2.アセトニトリル洗浄; 3.0.45M−テトラゾールのアセトニトリル溶液およびアミダイトのアセト
ニトリル溶液(担体に結合した出発ヌクレオチドに対して1.5当量)の添加; 4.アセトニトリル洗浄; 5.50mM−I2の10%水および90%ピリジン(v/v%)溶液によるホス
ファイトの酸化; 6.アセトニトリル洗浄; 7.アミダイトと反応しなかった未反応ヒドロキシ基のキャッピング。溶液A(
20%N−メチルイミダゾールのアセトニトリル溶液)と溶液B(20%無水酢酸
、30%2,6−ジメチルピリジンおよび50%アセトニトリル)との等量;およ
び 8.アセトニトリル洗浄。 20量体を合成するためには工程1〜8を19サイクル行った後、次にオリゴヌ
クレオチドを完全に脱保護し、担体マトリックスから放出させる。
率、価格、など)を全て斟酌すると、優先権出願日にはロット6の担体マトリッ
クスが最適であると考えられ、これを最初のプロトタイプとして使用した。さら
にポローゲン(トルエン)を増量することによって、なお改善された粒子を得るこ
とができる兆候があった。
Claims (23)
- 【請求項1】 モノビニルモノマー(単量体I)1種またはそれ以上をジ−、
トリ−またはポリ−ビニルモノマー(単量体II)1種またはそれ以上と共に重合反
応に付す工程(但し該単量体の少なくとも1種は好ましくはたとえばビニルベン
ゼンのようなビニル芳香族モノマーであるものとする)を含む、要すればアシル
化型であってもよいアミノ基を含有する担体マトリックスの製法において、重合
反応を要すればアシル化型であってもよいアミノ−(C0-10)炭化水素ビニル芳香
族モノマー(単量体III)1種またはそれ以上の存在下に行い;その後、要すれば
アシル化型であってもよい該アミノ基を、要すれば所望の官能性を示すように変
換してもよい;ことを特徴とする担体マトリックスの製造方法。 - 【請求項2】 単量体IIIがアミノビニル芳香族モノマー1種またはそれ以
上、好ましくはアミノ−モノビニル−ベンゼン1種またはそれ以上であることを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 各モノマーの量が重合反応混合物中にある重合可能なビニル
モノマーの全量の 単量体I:≧0.5%および≦99.5%; 単量体II:≧0.5%および≦99.5%;および 単量体III:≧0.5〜80% であることを特徴とする請求項1〜2に記載のいずれかの方法。 - 【請求項4】 該重合反応がポローゲンの存在下に行われることを特徴とす
る請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 該重合反応が使用したモノマーを完全に溶解するが、作製さ
れたポリマー鎖は完全には溶解しない液体ポローゲンの存在下に行われることを
特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 該モノマーがビニル芳香族化合物であって、該ポローゲンが
たとえばトルエン、キシレンおよびメシチレンのような芳香族溶媒を含むことを
特徴とする請求項4〜5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 該重合反応がバルク重合反応によって行われることを特徴と
する請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 該モノマーが液滴/粒子中に存在する水性乳濁液、懸濁液ま
たは分散液中で該重合反応が行われることを特徴とする請求項1〜6のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項9】 さらに次の工程: i)単量体Iおよび単量体IIを含む重合反応に必要な成分を含む単分散種粒子を
含む水性乳濁液または分散液を製造する工程;および ii)重合反応を行う工程 を含むことを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 - 【請求項10】 該単量体IIIの要すればアシル化型であってもよいアミノ
基が式: −NR1R2 [式中、 R1およびR2は: a)水素; b)直線状、分枝状および環状の炭化水素基またはおよび直線状、分枝状および
環状のアシル基 から構成される群から選択される; ただし、ここに 該各基は1〜20炭素原子の炭化水素鎖を含み; その炭化水素鎖は要すればヒドロキシ、アルコシキシまたはアミノ基1個または
それ以上で置換されていてもよく;および 要すれば炭素原子を置換する窒素、酸素または硫黄原子を含んでいてもよいもの
とする] で示されることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 - 【請求項11】 該基の各々が直接的にその窒素を介して該アリーレン基に
付着していることを特徴とする、 ポリビニル骨格[(−CH2CH2)n]およびアミノ基または該アミノ基から誘導さ
れる基を含み、 該アミノ基の窒素が保存されており、 該基のおのおのが該骨格にアリーレン基を含む連結構造を介して付着している担
体マトリックス。 - 【請求項12】 該アミノ基がポリビニル骨格内の水素を置換するアミノア
リール基、好ましくはアミノフェニル基、であることを特徴とする請求項11に
記載の担体マトリックス。 - 【請求項13】 該アミノ基または該アミノ基から誘導される基が、乾燥担
体マトリックス1g当り、0.01〜6ミリモルの量で存在することを特徴とす
る請求項11〜13のいずれかに記載の担体マトリックス。 - 【請求項14】 該担体マトリックスが多孔性であることを特徴とする請求
項11〜13のいずれかに記載の担体マトリックス。 - 【請求項15】 該マトリックスが単分散または多分散粒子、好ましくは球
形または長球形であるか、またはモノリスプラグの形にあり、該粒子が3〜10
00μm、好ましくは5〜500μmの範囲内の平均サイズを有することを特徴
とする請求項11〜14のいずれかに記載の担体マトリックス。 - 【請求項16】 該担体マトリックスが多孔性であって、ポア容積の10%
またはそれ以上、たとえば30%またはそれ以上についてポアサイズ直径が10
〜2000Å、たとえば100〜1000Åの範囲内にあることを特徴とする請
求項11〜15のいずれかに記載の担体マトリックス。 - 【請求項17】 該アミノ基または該アミノ基から誘導される基の複数が基
: −A−X [式中、 Aは該窒素に結合する有機架橋であり、 Xは (i)求核基または求電子基を有する物質とまたは遊離ラジカルと反応して、該
物質またはその部分を該担体マトリックスに共有結合的に付着させることができ
る反応性基1種またはそれ以上; (ii)そのような反応性基に変換されることができる基1個またはそれ以上;ま
たは (iii)他のメンバーの親和性結合を媒介する親和性ペアのメンバー; を含む構造である] を含むことを特徴とする請求項10〜16に記載の担体マトリックス。 - 【請求項18】 Xが付着可能な3'位でAに付着し、保護可能な5'位が保
護されているかまたは非保護であり、存在するなら残りのヒドロキシ基またはア
ミノ基が保護されたヌクレオシド、デオキシヌクレオシドまたはオリゴヌクレオ
チドであることを特徴とする請求項17に記載の担体マトリックス。 - 【請求項19】 該担体マトリックスが多孔性であって、ポア容積の10%
またはそれ以上、例えば30%またはそれ以上についてポアサイズ直径が10〜
2000Å、例えば100〜1000Åの範囲内にあることを特徴とする、ヌク
レオシド/ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド/デオキシヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチドが付着可能な3'−位を介して付着しており、一方保護可能
な5'−位が保護されているか非保護であって、もし存在するなら残りのヒドロ
キシ基またはアミノ基が保護されているポリビニル骨格[(−CH2CH2)n]を有
する担体マトリックス。 - 【請求項20】 該マトリックスが単分散粒子集団の形にあることを特徴と
する請求項19に記載の担体マトリックス。 - 【請求項21】 該マトリックスが乾燥マトリックス1グラム当り、例えば
ヌクレオチド/ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオチド/デオキシヌクレオシ
ドをポリマーの単一モノマー単位の>100マイクロモル、たとえば≧150マ
イクロモル、さらに≧200マイクロモルの負荷を有することを特徴とする請求
項19〜20に記載のいずれかの担体マトリックス。 - 【請求項22】 例えばオリゴ/ポリ−ヌクレオチドまたはオリゴ/ポリ−
ペプチドなどの固相合成のための、請求項1〜17のいずれかに定義された担体
マトリックスの使用。 - 【請求項23】 担体マトリックスが請求項1〜17のいずれかに定義され
たものであることを特徴とする固相としてアミノ基含有担体マトリックスを利用
するオリゴ/ポリヌクレオチドまたはオリゴ/ポリペプチドの固相合成法。
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