CN116440819B - 一种用于核酸固相合成载体微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于核酸固相合成载体微球的制备方法，属于核酸载体技术领域。其包括以下步骤：（1）聚合物多孔树脂的制备；（2）羟基活化PS微球的制备；（3）羟基活化PS微球表面接枝DMT。合成完成后，将载体取出进行干燥。然后放入玻璃瓶中，加入适量的浓氨水，在55℃反应16h将寡核苷酸从载体上裂解下来，同时脱去碱基上的保护基团。通过过滤将载体和寡核苷酸分离，将滤液干燥，得到寡核苷酸粗粉，通过HPLC检测其纯度并计算寡核苷酸的收率。使用本发明中的寡核苷酸固相合成载体，可以提高寡核苷酸的收率和纯度，有利于降低寡核苷酸的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于核酸载体技术领域，具体地说，涉及一种用于核酸固相合成载体微球的制备方法。
背景技术
在寡核苷酸固相合成技术发展初期，常用的固相合成载体有孔径可控玻璃微球(CPG)、改性硅胶等无机颗粒符合上述要求，但其缺点也很明显，即取代度(Loading)低(一般小于100μmmol/g)，导致寡核苷酸单批次产量受限，设备利用率低，生产成本高。为提高载体的取代度，Nitto Denko公司和Ionis公司联合申请的发明专利WO2006029023以苯乙烯、对乙酰氧基苯乙烯、二乙烯基苯作为聚合单体，使用异辛烷、2-乙基己醇作为致孔剂制备出有机高分子聚合物作为寡核苷酸固相合成载体。该载体的取代度可以达到100-350μmmol/g，其缺点是载体较强的非极性导致使用鎓盐类缩合体系连接时反应效率较低，同时较强的非极性导致在合成或洗涤过程中使用甲苯和乙腈时树脂体积会发生较大变化，造成反应器中较大的死体积。随后，Nitto Denko公司在美国发明专利US8592542中，以苯乙烯、对乙酰氧基苯乙烯、二乙烯基苯、(甲基)丙烯酰胺衍生物作为聚合单体。在美国发明专利US8653152中，以苯乙烯、对乙酰氧基苯乙烯、二乙烯基苯、(甲基)丙烯腈作为聚合单体。通过在聚合过程中加入极性单体，制备出取代度更高(500μmmol/g以上)的寡核苷酸固相合成载体。同时，极性单体的加入，有利于调节载体在不同溶剂(甲苯、乙腈)中的溶胀波动。但随之而来的问题是(甲基)丙烯酰胺类单体、(甲基)丙烯腈较为亲水，使用无水溶剂(无水乙腈)洗涤时难以把氧化步骤中加入的水分去除，影响下一步寡核苷酸的合成效率。同时溶剂法致孔得到的载体孔径分布不均匀，传质效果差，也会影响水分的去除和下一步寡核苷酸的合成效率。南开大学申请的中国发明专利CN201210562165.9以交联聚丙烯腈或交联聚甲基丙烯腈作为载体基本骨架。活性位点的引入通过加入乙酸乙烯酯、丙烯酸酯类或甲基丙烯酸酯类单体，通过碱解或与含有两个伯胺基的化合物反应引入羟基或氨基。此专利使用大量极性单体，使树脂在不同溶剂中的溶胀差异问题得以解决，但由于大量亲水性单体的使用，造成载体极为亲水，使用无水溶剂(乙腈)洗涤更加难以把载体中的水分去除，极大的影响下一步寡核苷酸的合成效率。
由于近年来寡核苷酸药物的研究取得巨大进展，越来越多的寡核苷酸药物开始进入临床阶段。对寡核苷酸合成载体的需求量越来越多，同时上述寡核苷酸载体存在的传质、溶胀、极性问题导致寡核苷酸合成效率低，生产成本高。因此开发出一种多孔树脂使寡核苷酸药物可以大规模、低成本、高效率地合成，满足核苷酸药物市场需求是极有必要的。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种用于核酸固相合成载体微球的制备方法，使用本发明中的寡核苷酸固相合成载体，可以提高寡核苷酸的收率和纯度，有利于降低寡核苷酸的生产成本。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
包括以下步骤：
（1）在反应器中加入纯化水、聚乙烯醇、氯化钠，加热到50℃溶解备用，即为水相；称取苯乙烯、二乙烯基苯、对氯甲基苯乙烯、甲苯、正己醇、叔十二硫醇、液体石蜡、正十六烷、过氧化苯甲酰，混合均匀，即为油相；将油相加入反应器中，开动搅拌升温至80℃进行聚合6h后再迅速升温至95℃反应1h；反应结束后用热水洗涤树脂，再用冷水洗涤树脂，再用石油醚洗涤树脂，丙酮回流提取除去致孔剂，筛分并收集粒径为60μm的树脂，进行真空干燥，得到聚合物多孔树脂；
（2）取上述聚合物多孔树脂，加入水、乙醇、KOH，75℃下200rpm搅拌反应2h，抽滤真空干燥得到羟基活化PS微球；
（3）在反应器中依次称取羟基活化PS微球，加入乙腈溶胀10min后，加入DMT-dT-3’-丁二酸、HBTU，并在室温下反应12h；反应结束后用乙腈洗涤5次，然后加入组分A和组分B，在25℃下200rpm搅拌反应4h，同时利用搅拌控制策略进行搅拌反应优化；反应结束后用乙腈洗涤5次，真空干燥，得到负载有DMT-dT的载体；使用对甲苯磺酸/乙腈溶液将负载的DMT基团脱去，分光光度法在412nm波长下测定载体负载的DMT基团载量；
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（1）中纯化水、聚乙烯醇、氯化钠之间的质量体积比为2L：20g：60g；
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（1）中苯乙烯、二乙烯基苯、对氯甲基苯乙烯、甲苯、正己醇、叔十二硫醇、液体石蜡、正十六烷、过氧化苯甲酰之间的质量比为115：11：13：8：4：0.7：40：2：2.5；
其中二乙烯基苯的重量百分含量为80％；
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（2）中聚合物多孔树脂、水、乙醇、KOH之间的质量比为100：50：200：20；
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（3）中羟基活化PS微球、乙腈、DMT-dT-3’-丁二酸、HBTU之间的质量体积比为20g：50ml：25g：8g；
步骤（3）中组分A由20ml乙腈、7.5ml吡啶、5.0ml N-甲基咪唑组成；
步骤（3）中组分B由10ml乙腈、4ml乙酸酐组成；
其中对甲苯磺酸/乙腈溶液，其中对甲苯磺酸与乙腈溶液之间的质量比为1：3。
上述所述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，搅拌控制策略的具体步骤如下：
S1、使用搅拌设备对混合物进行200rpm搅拌反应，从事先设置的数据库中提取得到的成品反应生成物的透光率，每隔30min，停止搅拌，将反应容器移动至阵列光照板与阵列光接收板之间的位置，静置10min，提取阵列光照板的发射光强与阵列光接收板的接收光强，阵列光照板的发射光强由下至上依次标记为/>，阵列光接收板的接收光强由下至上依次标记为/>，其中n为阵列光照板和阵列光接收板的数量；
S2、求得发射光强和接收光强的平均值，/>，计算实际反应生成物的平均透光率，将平均透光率与提取的反应生成物透光率进行对比，计算相差值/>；
S3、计算竖向各个位置的透光率，i高度位置的透光率为，其中/>为i高度位置的接收光强，其中/>为i高度位置的发射光强，计算溶液的均匀度；
S4、将溶液的均匀度与设定的均匀度阈值进行比较，若同时存在均匀度小于均匀度阈值和相差值小于设定的相差值阈值，则停止搅拌，若不满足该条件，则需要继续搅拌。
上述所述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
在所述S3步骤中计算溶液的均匀度的计算方式为：。
与现有技术先比，本发明的有益效果是：
1.本发明合成载体微球完成后，将载体取出进行干燥，然后放入玻璃瓶中，加入适量的浓氨水，在55℃反应16h将寡核苷酸从载体上裂解下来，同时脱去碱基上的保护基团。通过过滤将载体和寡核苷酸分离，将滤液干燥，得到寡核苷酸粗粉，通过HPLC检测其纯度并计算寡核苷酸的收率。使用本发明中的寡核苷酸固相合成载体，可以提高寡核苷酸的收率和纯度，有利于降低寡核苷酸的生产成本。
2.本发明通过设置的搅拌控制策略在搅拌过程中对溶液均匀度进行定时检测，保证溶液的搅拌质量的同时，对搅拌时间进行准确把握，节约了搅拌时间。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细描述，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
制备实施例1
用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
包括以下步骤：
（1）在反应器中加入纯化水、聚乙烯醇、氯化钠，加热到50℃溶解备用，即为水相；称取苯乙烯、二乙烯基苯(重量百分含量80％)、对氯甲基苯乙烯、甲苯、正己醇、叔十二硫醇、液体石蜡、正十六烷、过氧化苯甲酰，混合均匀，即为油相；将油相加入反应器中，开动搅拌升温至80℃进行聚合6h后再迅速升温至95℃反应1h；反应结束后用热水洗涤树脂，再用冷水洗涤树脂，再用石油醚洗涤树脂，丙酮回流提取除去致孔剂，筛分并收集粒径为60μm的树脂，进行真空干燥，得到聚合物多孔树脂；
（2）取上述聚合物多孔树脂，加入水、乙醇、KOH，75℃下200rpm搅拌反应2h，抽滤真空干燥得到羟基活化PS微球；
（3）在反应器中依次称取羟基活化PS微球，加入乙腈溶胀10min后，加入DMT-dT-3’-丁二酸、HBTU，并在室温下反应12h；反应结束后用乙腈洗涤5次，然后加入组分A和组分B，在25℃下200rpm搅拌反应4h，同时利用搅拌控制策略进行搅拌反应优化；反应结束后用乙腈洗涤5次，真空干燥，得到负载有DMT-dT的载体；使用对甲苯磺酸/乙腈溶液将负载的DMT基团脱去，分光光度法在412nm波长下测定载体负载的DMT基团载量。
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（1）中纯化水、聚乙烯醇、氯化钠之间的质量体积比为2L：20g：60g。
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（1）中苯乙烯、二乙烯基苯、对氯甲基苯乙烯、甲苯、正己醇、叔十二硫醇、液体石蜡、正十六烷、过氧化苯甲酰之间的质量比为115：11：13：8：4：0.7：40：2：2.5；
其中二乙烯基苯的重量百分含量为80％。
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（2）中聚合物多孔树脂、水、乙醇、KOH之间的质量比为100：50：200：20。
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（3）中羟基活化PS微球、乙腈、DMT-dT-3’-丁二酸、HBTU之间的质量体积比为20g：50ml：25g：8g；
步骤（3）中组分A由20ml乙腈、7.5ml吡啶、5.0ml N-甲基咪唑组成；
步骤（3）中组分B由10ml乙腈、4ml乙酸酐组成；
其中对甲苯磺酸/乙腈溶液，其中对甲苯磺酸与乙腈溶液之间的质量比为1：3。
搅拌控制策略的具体步骤如下：
S1、使用搅拌设备对进行200rpm搅拌反应，从事先设置的数据库中提取得到的成品反应生成物的透光率67%，每隔30min，停止搅拌，将反应容器移动至阵列光照板与阵列光接收板之间的位置，静置10min，提取阵列光照板的发射光强与阵列光接收板的接收光强，阵列光照板的发射光强由下至上依次标记为/>，阵列光接收板的接收光强由下至上依次标记为/>，其中n为阵列光照板和阵列光接收板的数量；
在具体实施中，我们采用阵列光照板上有四个的发射光灯组，测得每个发射光灯组的发射光强为（102lx，103lx，104lx，103lx）,每个接收光灯组的接收光强为（72lx，86lx，54lx，45lx）；
S2、求得发射光强和接收光强的平均值，/>，计算实际反应生成物的平均透光率，将平均透光率与提取的反应生成物透光率67%进行对比，计算相差值/>；
在此步中将测得的值代入S2步骤中，发射光强的平均值为103lx，接收光强的平均值为64.25lx，得到平均透光率为0.624，这样计算得到的相差值为0.07；
S3、计算竖向各个位置的透光率，i高度位置的透光率为，其中/>为i高度位置的接收光强，其中/>为i高度位置的发射光强，计算溶液的均匀度，在S3步骤中计算溶液的均匀度的计算方式为：/>；
在此步中计算四个高度上的透光率，分别为（0.705，0.834，0.52，0.43），将数据代入均匀度计算公式中计算均匀度为0.234；
S4、将溶液的均匀度与设定的均匀度阈值进行比较，若同时存在均匀度小于均匀度阈值和相差值小于设定的相差值阈值，则停止搅拌，若不满足该条件，则需要继续搅拌。
在此步中我们设定均匀度阈值为0.10，相差值阈值为0.10，这样我们采集的数据不满足该条件，需要继续搅拌。
再进行搅拌30min后，静置10min，再次提取阵列光照板的发射光强与阵列光接收板的接收光强；
测得每个发射光灯组的发射光强为（102lx，103lx，104lx，103lx）,每个接收光灯组的接收光强为（72lx，76lx，68lx，64lx）；
这样我们测得的平均透光率为0.679，计算得到的平均透光率为0.09；
计算四个高度上的透光率，分别为（0.705，0.737，0.653，0.62），测得的均匀度为0.087，满足均匀度小于均匀度阈值和相差值小于设定的相差值阈值，停止搅拌。
应用实施例1：
使用制备实施例1的产品应用于合成寡核苷酸
称取负载有DMT-dT的载体填充于合成柱中(32ml)，并将合成柱安装在AKTAOligoPilot 100上，合成具有21个碱基长度的寡核苷酸，序列为d[ATCGATCGTATCGATCGATCG]。合成过程如下：1.使用二氯甲烷溶胀树脂；2.使用10％DCA/DCM脱除DMT基团；3.使用无水乙腈洗涤；4.加入亚磷酰胺单体和活化试剂进行缩合；5.使用无水乙腈洗涤；6.加入氧化剂进行氧化；7.使用无水乙腈洗涤；8.加入封端试剂进行封端；9.使用无水乙腈洗涤；10.重复步骤2开始进入下一个循环。
合成完成后，将载体取出进行干燥。然后放入玻璃瓶中，加入适量的浓氨水，在55℃反应16h将寡核苷酸从载体上裂解下来，同时脱去碱基上的保护基团。通过过滤将载体和寡核苷酸分离，将滤液干燥，得到寡核苷酸粗粉，通过HPLC检测其纯度（94.2%）并计算寡核苷酸的收率（85.4%）。需要说明的是，HPLC检测的参数条件及寡核苷酸的收率的计算方法参考日本专利（公开号：JP2009114270A）及中国专利（公告号：CN101429261B），以上述中国专利为例，其具体实施方式的实施例2展示了“将合成后的柱干燥，以及通过重量测量测定所得寡核苷酸的重量产率(mg/μmol)示出。通过HPLC测量法(由Waters Corp.(沃特世有限公司)制造的 Alliance UV System，由YMC制造的Hydrosphere C18)测定的所得核苷酸中dT20(全长)的比例示出。”。本申请的HPLC检测及寡核苷酸的收率的方式同上述日本专利及中国专利的技术方案。
使用本发明中的寡核苷酸固相合成载体，可以提高寡核苷酸的收率和纯度，有利于降低寡核苷酸的生产成本。
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种用于核酸固相合成载体微球的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
（1）在反应器中加入纯化水、聚乙烯醇、氯化钠，加热到50℃溶解备用，即为水相；称取苯乙烯、二乙烯基苯、对氯甲基苯乙烯、甲苯、正己醇、叔十二硫醇、液体石蜡、正十六烷、过氧化苯甲酰，混合均匀，即为油相；将油相加入反应器中，开动搅拌升温至80℃进行聚合6h后再迅速升温至95℃反应1h；反应结束后用热水洗涤树脂，再用冷水洗涤树脂，再用石油醚洗涤树脂，丙酮回流提取除去致孔剂，筛分并收集粒径为60μm的树脂，进行真空干燥，得到聚合物多孔树脂；
（2）取上述聚合物多孔树脂，加入水、乙醇、KOH，75℃下200rpm搅拌反应2h，抽滤真空干燥得到羟基活化PS微球；
（3）在反应器中依次称取羟基活化PS微球，加入乙腈溶胀10min后，加入DMT-dT-3’-丁二酸、HBTU，并在室温下反应12h；反应结束后用乙腈洗涤5次，然后加入组分A和组分B，在25℃下200rpm搅拌反应4h，同时利用搅拌控制策略进行搅拌反应优化；反应结束后用乙腈洗涤5次，真空干燥，得到负载有DMT-dT的载体；使用对甲苯磺酸/乙腈溶液将负载的DMT基团脱去，分光光度法在412nm波长下测定载体负载的DMT基团载量；
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（1）中纯化水、聚乙烯醇、氯化钠之间的质量体积比为2L：20g：60g；
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（1）中苯乙烯、二乙烯基苯、对氯甲基苯乙烯、甲苯、正己醇、叔十二硫醇、液体石蜡、正十六烷、过氧化苯甲酰之间的质量比为115：11：13：8：4：0.7：40：2：2.5；
其中二乙烯基苯的重量百分含量为80％；
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（2）中聚合物多孔树脂、水、乙醇、KOH之间的质量比为100：50：200：20；
上述的用于核酸固相合成载体微球的制备方法，
步骤（3）中羟基活化PS微球、乙腈、DMT-dT-3’-丁二酸、HBTU之间的质量体积比为20g：50ml：25g：8g；
步骤（3）中组分A由20ml乙腈、7.5ml吡啶、5.0ml N-甲基咪唑组成；
步骤（3）中组分B由10ml乙腈、4ml乙酸酐组成；
其中对甲苯磺酸/乙腈溶液，其中对甲苯磺酸与乙腈溶液之间的质量比为1：3；
所述搅拌控制策略的具体步骤如下：
S1、使用搅拌设备对混合物进行200rpm搅拌反应，从事先设置的数据库中提取得到的成品反应生成物的透光率，每隔30min，停止搅拌，将反应容器移动至阵列光照板与阵列光接收板之间的位置，静置10min，提取阵列光照板的发射光强与阵列光接收板的接收光强，阵列光照板的发射光强由下至上依次标记为/>，阵列光接收板的接收光强由下至上依次标记为/>，其中n为阵列光照板和阵列光接收板的数量；
S2、求得发射光强和接收光强的平均值，/>，计算实际反应生成物的平均透光率/>，将平均透光率与提取的反应生成物透光率进行对比，计算相差值/>；
S3、计算竖向各个位置的透光率，i高度位置的透光率为，其中/>为i高度位置的接收光强，其中/>为i高度位置的发射光强，计算溶液的均匀度；
S4、将溶液的均匀度与设定的均匀度阈值进行比较，若同时存在均匀度小于均匀度阈值和相差值小于设定的相差值阈值，则停止搅拌，若不满足该条件，则需要继续搅拌；
在所述S3步骤中计算溶液的均匀度的计算方式为：。
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