CN104693333B - 多孔树脂珠和通过使用它制备核酸的方法 - Google Patents

多孔树脂珠和通过使用它制备核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了共聚物的多孔树脂珠，所述共聚物包含单乙烯基单体单元和交联乙烯基单体单元，所述多孔树脂珠具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的18.5‑55mol％，和所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为60–300nm。

Description

多孔树脂珠和通过使用它制备核酸的方法
技术领域
本发明涉及多孔树脂珠。本发明的多孔树脂珠可用于制备核酸(尤其是不少于40个链节的多核苷酸)。
背景技术
使用亚磷酰胺法的固相合成方法广泛用于核酸(如DNA寡核苷酸或多核苷酸和RNA寡核苷酸或多核苷酸)的化学合成。在这种方法中，例如，作为待合成核酸的3’-末端的核苷预先由固相合成载体经由可切割(cleavable)连接基(如琥珀酰基团等)进行负载，且将该载体置于合成柱中，所述合成柱放置在核酸自动合成仪上。此后，通过核酸自动合成仪使合成试剂流入反应柱中，并且例如，实施以下合成工序：
(1)用三氯乙酸/二氯甲烷溶液或二氯乙酸/甲苯溶液等使核苷5’-OH基团脱保护；
(2)通过核苷亚磷酰胺(nucleoside phosphoramidite)(核酸单体)/乙腈溶液和活化剂(四唑等)/乙腈溶液使亚酰胺(amidite)与所述5’-OH基团进行偶联反应；
(3)用乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等对未反应的5’-OH基团封端；
(4)通过碘/水/吡啶等氧化亚磷酸酯。
重复前述合成工序的循环，由此合成具有目标序列的核酸。通过用氨、甲胺等水解可切割连接基(见非专利文献1)，来从固相合成载体中切割出最终合成的核酸。
无机颗粒(如CPG(可控孔度玻璃))和硅胶已经被用作用于合成核酸的固相合成载体。然而，近年来，树脂珠以低成本日益频繁地用于大规模合成中，这是因为它们能够基于每重量的固相合成载体增加核酸的合成量。已知低交联的高溶胀多孔聚苯乙烯珠是这种树脂珠(见专利文献1)。低交联的高溶胀树脂珠的特征在于可以结合作为核酸合成起点的许多连接基。另一方面，由于对各合成试剂的溶胀度高，因此可以填充在用于核酸合成的柱中的树脂珠的量变小。
而且，通过使用丙烯腈抑制多孔树脂珠在各种有机溶剂中的溶胀率的变化(见专利文献2)，来尝试改进核酸的合成能力。在该文献中的多孔树脂珠显示出小的在各种有机溶剂中的溶胀率变化；然而，需要对核酸合成能力作进一步地改进。
通常，成问题的是，待合成的寡核苷酸或多核苷酸的较长链长与合成能力(合成纯度和合成量)的降低相关联。为了解决该问题，需要降低作为合成固相合成载体的起点的核苷连接基的载量。例如，当需合成具有高纯度的20个链节的DNA寡核苷酸时，可商购的用于固相合成的多孔树脂珠载体的核苷连接基载量为约200μmol/g。当它是不少于40个链节的DNA多核苷酸时，其载量不超过80μmol/g。因此，不能利用低交联且高度溶胀的树脂珠的特性，所述特性是作为核酸合成起点的许多连接基可以与其结合，并且可以填充在用于核酸合成的柱中的树脂珠的数量下降，这继而降低了每单次合成所得到的合成核酸的量并且降低了生产效率。在本说明书中，寡核苷酸意为具有20个或更少链节的核苷酸聚合物，多核苷酸意为具有超过20个链节的核苷酸聚合物。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1：JP-A-2005-325272
专利文献2：JP-A-2008-074979
[非专利文献]
非专利文献1：Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(2000)3.6.1-3.6.13
发明内容
本发明旨在提供多孔树脂珠，所述多孔树脂珠可以大量地填充在合成柱中，这是因为它对合成试剂溶胀较少，且可以改进每个合成柱的目标产物产量。
本发明人已经进行了深入的研究，并且发现可以通过使用具有大的孔尺寸的中度交联的多孔树脂珠来实现上述目的。基于该发现的本发明如下所述。
[1]一种共聚物的多孔树脂珠，所述共聚物包含单乙烯基单体单元和交联乙烯基单体单元，所述多孔树脂珠具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，
其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的18.5-55mol％，和
所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为60-300nm。
[2]前述[1]的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的18.5-45mol％。
[3]前述[1]的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的18.5-40mol％。
[4]前述[1]的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的18.5-30mol％。
[5]前述[1]-[4]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为65-250nm。
[6]前述[1]-[4]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为70-200nm。
[7]前述[1]-[6]中任一项的多孔树脂珠，其中所述单乙烯基单体包括芳族乙烯基单体。
[8]前述[1]-[6]中任一项的多孔树脂珠，其中所述单乙烯基单体包括基于苯乙烯的单体。
[9]前述[1]-[6]中任一项的多孔树脂珠，其中所述单乙烯基单体是基于苯乙烯的单体。
[10]前述[1]-[6]中任一项的多孔树脂珠，其中所述单乙烯基单体包括苯乙烯和对羟基苯乙烯。
[11]前述[1]-[10]中任一项的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体包括多乙烯基芳族化合物。
[12]前述[1]-[10]中任一项的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体包括二乙烯基苯。
[13]前述[1]-[10]中任一项的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体包括对二乙烯基苯和间二乙烯基苯。
[14]前述[1]-[13]中任一项的多孔树脂珠，其中所述能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团是氨基和/或羟基。
[15]前述[1]-[13]中任一项的多孔树脂珠，其中所述能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团是羟基。
[16]前述[1]-[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述能够与羧基结合的基团的量为1-1000μmol/g每1g的多孔树脂珠。
[17]前述[1]-[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述能够与羧基结合的基团的量为5-500μmol/g每1g的多孔树脂珠。
[18]前述[1]-[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的粒度中值为1-1000μm。
[19]前述[1]-[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的粒度中值为10-500μm。
[20]前述[1]-[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的粒度中值为20-300μm。
[21]一种生产核酸的方法，其包括按顺序将核苷或核苷酸与前述[1]-[20]中任一项的多孔树脂珠经可切割的连接基结合，从而得到寡核苷酸或多核苷酸。
[22][21]的生产方法，其中所述可切割连接基的载量为1-80μmol/g每1g的多孔树脂珠。
[23][21]的生产方法，其中所述可切割连接基的载量为5-80μmol/g每1g的多孔树脂珠。
[24][21]的生产方法，其中所述可切割连接基的载量为10-80μmol/g每1g的多孔树脂珠。
[25][21]-[24]中任一项的生产方法，其产生具有不小于40个链节的多核苷酸。
发明效果
由于本发明的多孔树脂珠在合成试剂中溶胀较少且大量地填充在合成柱中，所以它能够增加每个合成柱的目标产物的产量。因此，使用本发明的多孔树脂珠能够有效地合成核酸(尤其是具有长碱基序列的DNA多核苷酸)。
具体实施方式
本发明的多孔树脂珠是包含单乙烯基单体单元和交联乙烯基单体单元的共聚物。对单乙烯基单体没有特别的限制，只要它是具有一个乙烯基的单体即可。单乙烯基单体的实例包括芳族乙烯基单体、(甲基)丙烯酸烷基酯、乙酸乙烯酯、(甲基)丙烯腈、乙烯基吡啶、乙烯基吡咯烷酮等。可以使用仅一种单乙烯基单体，或者可以组合使用它们中的两种或更多种。优选作为单乙烯基单体的是芳族乙烯基单体或(甲基)丙烯酸烷基酯，更优选的是芳族乙烯基单体。
芳族乙烯基单体的实例包括具有一个乙烯基且任选地具有杂原子(如氮原子等)作为环原子的5元或6元芳环化合物。芳环任选地具有一个或多个取代基，如甲基、乙酰氧基等。优选作为芳族乙烯基单体的是基于苯乙烯的单体。
基于苯乙烯的单体的实例包括苯乙烯；烷基苯乙烯如乙基苯乙烯、甲基苯乙烯、二甲基苯乙烯、三甲基苯乙烯、丁基苯乙烯等；卤代苯乙烯如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙烯、溴苯乙烯等；卤代烷基苯乙烯如氯甲基苯乙烯、氟甲基苯乙烯等；氨基苯乙烯；氰基苯乙烯；烷氧基苯乙烯如甲氧基苯乙烯、乙氧基苯乙烯、丁氧基苯乙烯等；酰氧基苯乙烯如乙酰氧基苯乙烯等；硝基苯乙烯；等等。在具有取代基(例如，烷基)的苯乙烯(例如，烷基苯乙烯)中，取代基的位置可以是邻位、间位和对位中的任一种，且优选对位。
(甲基)丙烯酸烷基酯的实例包括得自其中烷基的碳数为1-10的直链或支链一元醇和(甲基)丙烯酸的酯等。其具体实例包括丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己基酯、丙烯酸甲氧基乙酯、丙烯酸甲氧基乙二醇酯、丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸十八烷基酯、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸甲氧基乙二醇酯、甲基丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯、甲基丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸苄基酯、甲基丙烯酸三氟乙酯、甲基丙烯酸八氟戊酯等。
交联乙烯基单体用作交联剂且对其没有特别的限制，只要它具有两个或更多个乙烯基即可。在交联乙烯基单体中的乙烯基的数目优选为2-3。交联乙烯基单体的实例包括多乙烯基芳族化合物如二乙烯基苯(邻二乙烯基苯、间二乙烯基苯、对二乙烯基苯)、三乙烯基苯(例如，1,3,5-三乙烯基苯)等；三乙烯基环己烷；二(甲基)丙烯酸酯化合物如二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸一缩二乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸二缩三乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸二亚丙基乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸二缩三丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸聚丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸己二醇酯、二(甲基)丙烯酸壬二醇酯等；等等。可以使用仅一种交联乙烯基单体或可以组合使用它们中的两种或更多种。优选作为交联乙烯基单体的是多乙烯基芳族化合物，更优选二乙烯基苯，进一步优选对二乙烯基苯、间二乙烯基苯，以及对二乙烯基苯和间二乙烯基苯的混合物。
本发明的多孔树脂珠具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团。当合成核酸时，将核苷与多孔树脂珠连接。在这种情况下，当连接基具有羧基时，连接基的羧基和多孔树脂珠可以容易地结合。能够与羧基结合的基团的实例包括氨基(伯氨基、仲氨基)和羟基，优选羟基。
将能够与羧基结合的基团引入本发明的多孔树脂珠的方法没有特别的限制。例如，当能够与羧基结合的基团是羟基时，将例如丙烯酸2-羟基乙基酯、甲基丙烯酸2-羟基乙基酯、丙烯酸2-羟基丙基酯、甲基丙烯酸2-羟基丙基酯、丙烯酸4-羟基丁基酯、甲基丙烯酸4-羟基丁基酯、羟基苯乙烯等作为单乙烯基单体进行共聚。当能够与羧基结合的基团是氨基时，将例如氨基苯乙烯、氨基甲基苯乙烯等作为单乙烯基单体进行共聚。
可以通过如下方法来制备具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的多孔树脂珠：制备具有其它官能团的多孔树脂珠，并且将该官能团转化为能够与羧基结合的基团。
能够通过将例如酰氨基苯乙烯(如乙酰氨基苯乙烯等)；酰氧基苯乙烯如乙酸基苯乙烯(acetoxystyrene)、乙酰氧基苯乙烯(ethanoyloxystyrene)、苯甲酰氧基苯乙烯等；和卤代烷基苯乙烯如氯甲基苯乙烯等作为单乙烯基单体进行共聚，来制备具有其它官能团的多孔树脂珠。
可以将具有酰氧基或酰氨基作为其它官能团的多孔树脂珠通过水解转化成具有羟基或氨基的多孔树脂珠。可以将具有卤代烷基作为其它官能团的多孔树脂珠通过与邻苯二甲酰亚胺和肼、氨或氢氧化钠等的反应转化成具有氨基或羟基的多孔树脂珠。
能够与羧基结合的基团的量优选为1-1000μmol/g每1g的多孔树脂珠，更优选5-500μmol/g每1g的多孔树脂珠。当该量少于1μmol/g时，所合成的核酸的量变小，这是因为当该珠用作固相合成中的载体时，作为合成起点的可切割连接基的载量变小。当该量超过1000μmol/g时，在多孔树脂珠中的可切割连接基的负载会出现偏差，且当相邻的可切割连接基之间的距离不足时，会彼此抑制相邻发生的化学反应。因此，当该珠用作固相合成中的载体时，所获得的核酸倾向于具有低纯度。
在本发明的多孔树脂珠中，交联乙烯基单体的量为总单体的18.5-55mol％，优选总单体的18.5-45mol％，更优选总单体的18.5-40mol％，进一步优选总单体的18.5-30mol％。当该量小于18.5mol％时，所获得的珠在合成试剂中溶胀较多。当该量超过55mol％时，所合成的核酸的量下降，这是因为可切割连接基的负载效率降低，且其载量变小。
本发明的多孔树脂珠的孔尺寸中值为60-300nm，优选65-250nm，更优选70-200nm。当该孔尺寸中值小于60nm时，核酸的纯度趋向于是低的。当该孔尺寸中值超过300nm时，多孔树脂珠的孔隙率变高且干体积变大。因此，填充在用于合成的柱中的多孔树脂珠的量变小，每单次合成的合成核酸的量变小，且生产效率降低。孔尺寸中值是通过汞渗法测量的值。具体地，将0.2g的多孔树脂珠流延在压汞仪PoreMaster60-GT(由QuantaChrome制造)中，且通过汞渗法在汞接触角为140°且汞表面张力为480dyn/cm的条件下测量孔尺寸中值。
本发明的多孔树脂珠的形状不必为精确的球形，但至少为颗粒形状。然而，本发明的多孔树脂珠优选为球形，这是因为它能够提高进入固相合成用反应柱的填充效率并且抵抗断裂。
尽管本发明的多孔树脂珠的粒度中值没有特别的限制，但是它优选1-1000μm，更优选10-500μm，进一步优选20-300μm。粒度中值是通过激光衍射散射法测量的值。具体地，可以通过激光衍射散射粒度分布分析仪LA-950(由Horiba,Ltd.制造)并且使用50v/v％乙醇水溶液作为分散介质，来测量粒度中值。
当通过悬浮聚合制备多孔树脂珠时，能够通过调节聚合开始之前的搅拌条件和分散稳定剂的浓度来控制该多孔树脂珠的粒度中值，使其落在期望的范围之内。
本发明的多孔树脂珠的制备方法没有特别的限制，其实例包括：
(1)一种方法，包括搅拌在水(其中所述水含有分散或溶解于其中的分散稳定剂)中的单乙烯基单体、交联乙烯基单体、具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的乙烯基单体、造孔剂和聚合引发剂，并且进行悬浮共聚，
(2)一种方法，包括搅拌在水(其中所述水含有分散或溶解于其中的分散稳定剂)中的单乙烯基单体、交联乙烯基单体、具有其它官能团的乙烯基单体、造孔剂和聚合引发剂，进行悬浮共聚以得到具有其它官能团的多孔树脂珠，并且通过水解等将所述其它官能团转化成能够通过脱水缩合反应等与羧基结合的基团。
含有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团或具有前述其它官能团的乙烯基单体的量优选为总单体的1-15mol％，更优选为总单体的1-10mol％。
通过乳化前述分别的单体、造孔剂和聚合引发剂的混合溶液，来实施悬浮共聚，通过在含有分散或溶解于其中的分散稳定剂的水中搅拌它们来进行所述乳化。
前述造孔剂意为在悬浮共聚体系中除水之外的溶剂，优选烃或醇。所述烃是饱和的或不饱和的脂族烃或芳族烃，优选具有5-12个碳原子的脂族烃，更优选正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、十一烷、十二烷等。为了增加所获得的多孔树脂珠的孔隙率，期望组合使用烃和醇。醇的实例包括优选具有5-9个碳原子的脂族醇。这种醇的具体实例包括2-乙基己醇、叔戊醇、壬醇、2-辛醇、环己醇等。
用作造孔剂的烃和醇的重量比适当地根据其具体组合而进行变化，基于该重量比可以增加由此获得的用于固相合成的载体的比表面积。优选的烃和醇的重量比为1:9-6:4。
在悬浮共聚中造孔剂的重量优选为上述各自单体的总重量的0.5倍-2.5倍，更优选0.8倍-2.3倍，进一步优选1.0倍至2.2倍。当该重量在0.5倍-2.5倍的范围之外时，所获得的多孔树脂珠具有较小的孔尺寸和较小的比表面积，且通过化学反应合成的反应产物的量变小。
悬浮共聚的方法没有特别的限制，且可以使用已知的方法。
分散稳定剂没有特别的限制，且使用已知的亲水性保护胶体剂如聚乙烯醇、聚丙烯酸、凝胶、淀粉、羧甲基纤维素等；溶解性差的粉末如碳酸钙、碳酸镁、磷酸钙、硫酸钡、硫酸钙、膨润土等；等等。分散稳定剂的添加量没有特别的限制，优选在悬浮聚合体系中相对于100重量份的水为0.01-10重量份。当分散稳定剂的量小时，会削弱悬浮聚合的分散稳定性，并且形成许多团聚体。当分散稳定剂的量高时，会形成许多细珠。
聚合引发剂没有特别的限制，且使用已知的过氧化物如过氧化二苯甲酰、过氧化二月桂酰、过氧化二硬脂酰、1,1-二(叔丁基过氧)-2-甲基环己烷、1,1-二(叔己基过氧)-3,3,5-三甲基环己烷、1,1-二(叔己基过氧)环己烷、1,1-二(叔丁基过氧)环己烷、过氧化二叔己基、叔丁基过氧异丙苯、过氧化二叔丁基、2-乙基过氧化己酸1,1,3,3-四甲基丁酯(1,1,3,3-tetramethylbutylperoxy-2-ethyl hexanoate)、2-乙基过氧化己酸叔己酯(t-hexylperoxy-2-ethyl hexanoate)、2-乙基过氧化己酸叔丁酯(t-butylperoxy-2-ethylhexanoate)、叔丁基过氧化异丙基单碳酸酯(t-butylperoxyisopropyl monocarbonate)等；偶氮化合物如2,2’-偶氮二异丁腈、2,2’-偶氮二-2-甲基丁腈、2,2’-偶氮二-2,4-二甲基戊腈等。聚合引发剂的添加量没有特别的限制，那些本领域普通技术人员可以确定其合适的量。
可以适当地确定悬浮共聚的反应条件。悬浮共聚的温度为例如60-90℃，且其时间为例如30分钟-48小时。悬浮共聚通常在搅拌下进行。搅拌速率为例如100rpm-1000rpm，优选200rpm-800rpm。
通过悬浮共聚获得的多孔树脂珠可经受适当的处理，如洗涤、干燥、分级等。
可以通过上述处理来获得本发明的多孔树脂珠。多孔树脂珠可以用作化学合成中的固相载体。尤其是本发明的多孔树脂珠可以有效地用作核酸合成中的固相载体。
常规的已知方法可以应用于使用本发明的多孔树脂珠进行的核酸合成。例如，将以下核苷琥珀酰连接基作为可切割连接基与本发明的多孔树脂珠(固相载体)结合。
与核苷琥珀酰连接基结合的固相载体
核苷琥珀酰连接基的实例除了以上之外包括对应于RNA或改性核苷酸的连接基、通用连接基等。
然后，一个接一个地结合核苷亚磷酰胺，以使得预定的碱基序列得自核苷的5’-末端。该合成反应可以通过使用自动合成仪实施。例如，将5’-OH脱保护剂溶液、核苷亚磷酰胺溶液、亚酰胺活化剂溶液、氧化剂溶液、封端剂溶液、作为洗涤溶液的乙腈等接连地运送至填充有与核苷琥珀酰连接基结合的多孔树脂珠的设备的反应柱中，并且重复反应。最后，通过用碱溶液进行的水解等切割琥珀酰连接基部分，由此可以获得目标核酸。
在本发明的核酸的制备方法中，所述可切割连接基的用量优选1-80μmol/g每1g的多孔树脂珠，更优选5-80μmol/g每1g的多孔树脂珠，进一步优选10-80μmol/g每1g的多孔树脂珠。当所述可切割连接基的用量小于1μmol/g时，合成的核酸的量下降。当可切割连接基的载量超过80μmol/g时，可切割连接基在多孔树脂珠中的载量有所偏差，且当相邻的可切割连接基之间的距离不足时，会彼此抑制相邻发生的化学反应。因此，当该基团用作固相合成中的载体时，所获得的核酸倾向于具有低纯度。
通过使用本发明的多孔树脂珠制备核酸的方法尤其可用于合成具有不少于40个链节的多核苷酸。
实施例
通过参照以下实施例和对比例更为详尽地具体解释了本发明。
实施例1
(1)多孔树脂珠的制备
将具有冷却器、搅拌器和氮气入口管的500mL可分离烧瓶放置在恒温水浴上，加入聚乙烯醇(由KURARAY CO.,LTD.制造，2.6g)和蒸馏水(260g)，并且在300rpm搅拌该混合物以溶解聚乙烯醇。向其中加入通过混合苯乙烯(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造，34.36g，在总单体中的71.6mol％)、对乙酰氧基苯乙烯(由Aldrich制造，3.82g，在总单体中的5.1mol％)、二乙烯基苯(间二乙烯基苯和对二乙烯基苯的混合物，含量55wt％，由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造，25.45g，在总单体中的23.3mol％)、2-乙基己醇(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造，53.45g)、异辛烷(由Wako PureChemical Industries,Ltd.制造，22.91g)和过氧化苯甲酰(含有25wt％水，由NOFCORPORATION制造，1.27g)获得的溶液。在室温于氮气流下搅拌(500rpm)该混合物并且加热至80℃，实施悬浮共聚10小时。
聚合产物通过用蒸馏水和丙酮(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)过滤来进行洗涤，并使其分散在丙酮中达到约1L的总量。静置该分散体，直至沉淀变得静止(即便是在倾斜该分散体时也是如此)，并且舍弃在上清液中的丙酮。再次将丙酮添加到沉淀中，达到约1L的总量，通过重复静置和舍弃丙酮的操作来分离该混合物。将该分散体在减压下进行过滤和干燥，从而得到苯乙烯-二乙烯基苯-对乙酰氧基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠。
然后，向装配有冷却器、搅拌器和氮气入口管的500mL烧瓶中装入上述多孔树脂珠(20g)、乙醇(80g)、蒸馏水(20g)和氢氧化钠(0.8g)，在80.5℃通过搅拌使该混合物反应5小时。将该分散体用盐酸中和，通过用蒸馏水和丙酮过滤洗涤，并且在减压下干燥，从而得到苯乙烯-二乙烯基苯-对羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠(每1g的多孔树脂珠中羟基的量，由单体量计算得到：459μmol/g)。
(2)孔尺寸中值的测量
将所获得的多孔树脂珠(0.2g)流延在压汞仪PoreMaster60-GT(由QuantaChrome制造)，并且通过汞渗法在汞接触角为140°且汞表面张力为480dyn/cm的条件下测量多孔树脂珠的孔尺寸中值。结果示于表1中。
(3)粒度中值的测量
通过超声作用使所获得的多孔树脂珠分散在50v/v％乙醇水溶液中。将该分散体用作样品，并且通过激光衍射/散射型粒度分布测量设备LA-920(由Horiba,Ltd.制造)使用50v/v％乙醇水溶液作为分散介质来测量多孔树脂珠的粒度中值。结果示于表1中。
(4)甲苯中溶胀体积的测量
称重所获得的多孔树脂珠(1g)，并将其流延在10mL量筒中。之后，加入甲苯，将该混合物静置过夜，并且在量筒的量度下读取溶胀体积。在表1中示出了要填充在0.2mL柱中的珠的溶胀体积和最大量(其由所述体积计算得到)。
(5)将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到多孔树脂珠上
根据表2中示出的制剂，在室温通过搅拌使实施例1中获得的多孔树脂珠、DMT-dT-3’-琥珀酸酯(由Beijing OM Chemicals制造)、O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，由Novabiochem制造)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，由Aldrich制造)和乙腈(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)混合和反应12小时。然后，在通过用乙腈过滤进行洗涤之后，在减压下干燥所获得的多孔树脂珠。
将在减压下干燥后的多孔树脂珠与CapA(20wt％乙酸酐/80wt％乙腈，112.5mL)、CapB(20wt％N-甲基咪唑/30wt％吡啶/50wt％乙腈，12.5mL)、4-二甲基氨基吡啶(由Aldrich制造，63mg)和乙腈(12.5mL)混合，并且在室温通过搅拌使该混合物反应12小时，通过用乙腈过滤进行洗涤，并且在减压下干燥，从而得到与DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的多孔树脂珠。通过测量用对甲苯磺酸/乙腈溶液脱保护的DMT基团在412nm处的吸收，来确定每1g多孔树脂珠的DMT-dT-3’-琥珀酸酯载量。该载量示于表2中。
(6)60个链节的DNA多核苷酸的合成
将所获得的与DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的多孔树脂珠置于合成规模达到1μmol的合成柱(体积0.2mL)中，所述合成柱放置在ABI3400DNA/RNA合成仪(由Applied Biosystems制造)上，并且在核苷亚磷酰胺浓度为4eq/合成规模，DMT-on的条件下合成具有60个链节的混合序列的DNA多核苷酸。在合成之后，从干燥的多孔树脂珠中切割出DNA多核苷酸，并且使碱氨基脱保护。核酸的OD产量(对应于核酸合成量)根据在通过过滤器过滤对多孔树脂珠进行分离之后滤液的UV吸收测量值(测量波长：260nm)确定。然后，使滤液经受HPLC测量(使用由Waters Corporation制造的HPLC设备)，并且确定合成纯度(全长度(面积％))和具有目标序列长度的DNA多核苷酸的比例。结果示于表3中。
实施例2
以与实施例1中相同的方式，不同之处在于使用了苯乙烯(20.16g，在总单体中的44.8mol％)、对乙酰氧基苯乙烯(3.82g，在总单体中的5.5mol％)、二乙烯基苯(含量55wt％，50.9g，在总单体中的49.8mol％)、2-乙基己醇(55.39g)、异辛烷(23.74g)和过氧化苯甲酰(1.22g)，获得苯乙烯-二乙烯基苯-对羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠(由单体量计算得到的每1g多孔树脂珠的羟基量：466μmol/g)。
表1中示出了多孔树脂珠在0.2mL柱中的最大的珠填充量、孔尺寸中值、粒度中值和在甲苯中的溶胀体积，它们以与实施例1中相同的方式进行测量和计算。
以与实施例1中相同的方式并且使用表2中所示的共混比例，来制备与DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的多孔树脂珠，并且测量每1g多孔树脂珠的DMT-dT-3’-琥珀酸酯载量。载量示于表2中。
以与实施例1中相同的方式，合成具有60个链节的混合序列的DNA多核苷酸，并且确定核酸的OD产量和全长度(面积％)。结果示于表3中。
对比例1
以与实施例1中相同的方式，不同之处在于使用了苯乙烯(45.02g，在总单体中的85.4mol％)、对乙酰氧基苯乙烯(3.65g，在总单体中的4.4mol％)、二乙烯基苯(含量55wt％，12.2g，在总单体中的10.2mol％)、2-乙基己醇(55.39g)、异辛烷(23.74g)和过氧化苯甲酰(1.22g)，获得苯乙烯-二乙烯基苯-对羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠(由单体量计算得到的每1g多孔树脂珠的羟基量：409μmol/g)。
表1中示出了多孔树脂珠在0.2mL柱中的最大的珠填充量、孔尺寸中值、粒度中值和在甲苯中的溶胀体积，它们以与实施例1中相同的方式进行测量和计算。
以与实施例1中相同的方式并且使用表2中所示的共混比例，来制备与DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的多孔树脂珠，并且测量每1g多孔树脂珠的DMT-dT-3’-琥珀酸酯载量。载量示于表2中。
以与实施例1中相同的方式，合成具有60个链节的混合序列的DNA多核苷酸，并且确定核酸的OD产量和全长度(面积％)。结果示于表3中。
对比例2
以与实施例1中相同的方式，不同之处在于使用了对乙酰氧基苯乙烯(3.2g，在总单体中的8.4mol％)、二乙烯基苯(含量55wt％，50.62g，在总单体中的91.6mol％)、2-乙基己醇(60.31g)和异辛烷(25.85g)，获得二乙烯基苯-对羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠(由单体量计算得到的每1g多孔树脂珠的羟基量：649μmol/g)。
表1中示出了多孔树脂珠在0.2mL柱中的最大的珠填充量、孔尺寸中值、粒度中值和在甲苯中的溶胀体积，它们以与实施例1中相同的方式进行测量和计算。
以与实施例1中相同的方式并且使用表2中所示的共混比例，来制备与DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的多孔树脂珠，并且测量每1g多孔树脂珠的DMT-dT-3’-琥珀酸酯载量。载量示于表2中。
以与实施例1中相同的方式，合成具有60个链节的混合序列的DNA多核苷酸，并且确定核酸的OD产量和全长度(面积％)。结果示于表3中。
对比例3
以与实施例1中相同的方式，不同之处在于使用了苯乙烯(32.27g，在总单体中的61.5mol％)、对乙酰氧基苯乙烯(3.9g，在总单体中的4.8mol％)、二乙烯基苯(含量55wt％，11.1g，在总单体中的9.3mol％)、甲基丙烯腈(8.24g，在总单体中的24.4mol％)、2-乙基己醇(59.57g)、异辛烷(25.53g)和过氧化苯甲酰(1.10g)，获得苯乙烯-二乙烯基苯-对羟基苯乙烯-甲基丙烯腈共聚物的多孔树脂珠(由单体量计算得到的每1g多孔树脂珠的羟基量：488μmol/g)。
表1中示出了多孔树脂珠在0.2mL柱中的最大的珠填充量、孔尺寸中值、粒度中值和在甲苯中的溶胀体积，它们以与实施例1中相同的方式进行测量和计算。
以与实施例1中相同的方式并且使用表2中所示的共混比例，来制备与DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的多孔树脂珠，并且测量每1g多孔树脂珠的DMT-dT-3’-琥珀酸酯载量。载量示于表2中。
以与实施例1中相同的方式，合成具有60个链节的混合序列的DNA多核苷酸，并且确定核酸的OD产量和全长度(面积％)。结果示于表3中。
表1
表2
表3
表3还描述了计算的0.2mL柱的最大核酸合成规模(μmol)(＝柱体积(0.2mL)xDMT-dT-3’琥珀酸酯载量(μmol/g)/在甲苯中的溶胀体积(mL/g))和计算的每0.2mL柱的目标产物产量(＝在0.2mL柱中的最大核酸合成规模(μmol)xOD产量(OD/μmol)x全长度(面积％)/100)，使用上述值计算得到。如表3中所示，与没有满足本发明要求的对比例1-3的多孔树脂珠相比，本发明的实施例1和2(尤其是实施例1)的多孔树脂珠满足交联单体量和孔尺寸中值的要求，显示出较高的计算的每0.2mL柱的目标产物产量。结果表明，能够通过使用本发明的多孔树脂珠有效地合成核酸(尤其是具有长碱基序列的DNA多核苷酸)。
工业实用性
本发明提供了可用作核酸的固相合成中的载体的多孔树脂珠。本发明的多孔树脂珠能够有效地合成核酸(尤其是具有长碱基序列的DNA多核苷酸)。
本申请是基于在日本提交的专利申请No.2013-251022，将其内容全部并入本申请中。

Claims (5)

1.一种共聚物的多孔树脂珠，所述共聚物由芳族乙烯基单体单元和交联乙烯基单体单元构成，所述多孔树脂珠具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，
其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的18.5-55mol％，和
所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为60-300nm。
2.根据权利要求1的多孔树脂珠，其中所述芳族乙烯基单体包括基于苯乙烯的单体。
3.根据权利要求1的多孔树脂珠，其中所述能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团是氨基和/或羟基。
4.一种生产核酸的方法，其包括按顺序将核苷或核苷酸与根据权利要求1至3中任一项的多孔树脂珠经可切割的连接基结合，从而得到寡核苷酸或多核苷酸。
5.根据权利要求4的生产方法，其产生具有不小于40个链节的多核苷酸。
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