CN115403703B - 固定化4,5-二氰基咪唑、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种固定化4,5‑二氰基咪唑、其制备方法及应用。其中，该固定化4,5‑二氰基咪唑由第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体通过自由基共聚反应获得，第一共聚单体为二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯，第二共聚单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯，第三共聚单体为2‑乙烯基‑4,5‑二氰基咪唑。能够解决现有技术中4,5‑二氰基咪唑在活化偶联反应后难以从反应体系中分离的问题，适用于4,5‑二氰基咪唑固定化领域。

Description

固定化4,5-二氰基咪唑、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及4,5-二氰基咪唑固定化领域，具体而言，涉及一种固定化4,5-二氰基咪唑、其制备方法及应用。
背景技术
小核酸是指包括小干扰核酸(siRNA)、反义核酸(ASO)、微小RNA(miRNA)和核酸适配体(Aptamer)的寡核苷酸分子。小核酸药物由核苷酸组成，是与小分子药物、抗体药物完全不同的全新药物类别。相比传统的化学药物分子，小核酸药物具有靶向特异性强、高效性、药物作用长效、药物设计简便、候选靶点丰富等优点。主要的小核酸药物是siRNA药物和反义核酸药物，二者主要作用于细胞质的mRNA，通过碱基互补识别和抑制靶mRNA，实现对蛋白表达的调控，达到治疗疾病的目的。
近年来，人们对小核酸药物的需求正在逐步增加。1998年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了第一种小核酸(寡核苷酸)药物Vitravene的上市，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎。随着临床项目的日益成功和对基于寡核苷酸的药物的潜在市场需求，开发安全、环境清洁且具有成本效益的这些分子的合成方法非常重要。在寡核苷酸的合成中，一个关键的步骤是核糖、脱氧核糖部分与亚磷酰胺类化合物的偶联。在实验室中，科研人员经常使用的磷酰化试剂为2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(如式A所示)，它较为活泼，不需要额外的活化试剂即可与糖基呋喃环上的羟基反应而偶联。在实验室中，该反应可直接使用自动化固相合成仪进行。
但是，2-氰基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺价格昂贵，在室温下不稳定，且加热时容易爆炸。这种原料的使用，增加了工业生产的成本，并且带来了潜在的风险。一种价格便宜，且更安全的2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(如式B所示)可以作为上述原料的替代品，但该原料反应活性较低，需要使用具有两性的活化试剂，例如1H-四氮唑、4,5-二氰基咪唑(4,5-DCI)进行活化。其中，1H-四氮唑成本高，毒性强，而且也是一种具有潜在爆炸性的物质，在工业生产中难以放大应用。4,5-DCI作为一种较为安全的活化剂，在诸多磷酰化反应中有着广泛的应用，但其主要缺点是难溶于水，在反应后不容易除去(相反，1H-四氮唑具有水溶性，可通过水洗除去)，需要过硅胶柱。因此，对体系放大有不利影响。出于4,5-DCI的安全性、廉价易得性和良好的反应活性方面的考虑，现阶段它仍然难以被完全取代。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种固定化4,5-二氰基咪唑、其制备方法及应用，以解决现有技术中4,5-二氰基咪唑在活化偶联反应后难以从反应体系中分离的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种固定化4,5-二氰基咪唑，该固定化4,5-二氰基咪唑由第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体通过自由基共聚反应获得，第一共聚单体为二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯，第二共聚单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯，第三共聚单体为2-乙烯基-4,5-二氰基咪唑。
进一步地，固定化4,5-二氰基咪唑中，第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体的质量比为(10～50)：(10～50)：(10～80)；第一共聚单体与第二共聚单体的总质量与第三共聚单体的质量比≤9:1；优选地，第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体的质量比为(20～30)：(20～30)：(40～60)；更优选地，第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体的质量比为1：1：2。
进一步地，固定化4,5-二氰基咪唑在N，N-二甲基甲酰胺、醚、乙腈、醇、酯和氯代烷烃中的溶解度均小于1g/L；优选地，固定化4,5-二氰基咪唑的红外光谱中有如下特征吸收：3149-2488多重峰、2242、1911、1728、1644、1574、1510和1370cm-1，固定化4,5-二氰基咪唑的红外检测样品的制备方法为溴化钾压片法。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种固定化4,5-二氰基咪唑的制备方法，该制备方法包括：利用第一共聚单体和第二共聚单体，对2-乙烯基-4,5-二氰基咪唑进行自由基共聚反应；第一共聚单体为二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯，第二共聚单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯。
进一步地，在自由基共聚反应中，第一共聚单体的投料质量为10～50份、第二共聚单体的投料质量为10～50份，但第一共聚单体和第二共聚单体的投料质量之和不超过90份；2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料质量为10～80份；优选地，第一共聚单体的投料质量为20～30份、第二共聚单体的投料质量为20～30份；2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料质量为40～60份；更优选地，第一共聚单体的投料质量为25份、第二共聚单体的投料质量为25份，2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料质量为50份。
进一步地，将第一共聚单体、第二共聚单体以及2-乙烯基4,5-二氰基咪唑置于反应溶剂中进行自由基共聚反应，其中，反应溶剂包括甲基叔丁基醚、乙腈或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种；优选地，在氮气或稀有气体的气氛中进行自由基共聚反应。
进一步地，自由基共聚反应的自由基引发剂包括偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或过氧化苯甲酰中的一种或多种；优选地，自由基共聚反应的反应温度为65℃～90℃；优选地，自由基共聚反应的反应时间为10h～20h。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种偶联方法，该偶联方法包括：利用权上述固定化4,5-二氰基咪唑、或上述固定化4,5-二氰基咪唑制备方法制备的固定化4,5-二氰基咪唑，活化磷酰胺与羟基进行偶联。
进一步地，利用固定化4,5-二氰基咪唑，活化磷酰胺与羟基进行偶联反应，偶联反应的转化率为90％～94％；优选地，带有羟基的化合物包括二甲氧基三苯甲基保护的核苷或二甲氧基三苯甲基保护的脱氧核苷；优选地，带有磷酰胺的化合物包括亚磷酰胺类化合物；优选地，磷酰化试剂包括2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺。
进一步地，偶联方法包括：利用固定化4,5-二氰基咪唑，进行连续化偶联反应。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种上述固定化4,5-二氰基咪唑、或制备方法、或偶联方法，在磷酰胺与羟基的偶联反应和/或寡核苷酸合成中的应用。
应用本发明的技术方案，将4,5-二氰基咪唑制备为固定化4,5-二氰基咪唑，固定化4,5-二氰基咪唑具有高度交联的特性，不溶于常见的有机溶剂，在活化偶联反应后通过简单的过滤手段，从反应体系中除去。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，4,5-DCI作为一种较为安全的活化剂，在诸多磷酰化反应中有着广泛的应用，但其主要缺点是易溶于有机溶剂，且难溶于水，在反应后不容易除去，因此在体系放大的反应中难以利用。因而，在本申请中发明人尝试制备固定化4,5-二氰基咪唑，利用自由基共聚反应，将2-乙烯基4,5-二氰基咪唑制备为固定化4,5-二氰基咪唑，利于在磷酰化反应中的应用。因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种固定化4,5-二氰基咪唑，该固定化4,5-二氰基咪唑由第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体通过自由基共聚反应获得，第一共聚单体为二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯，第二共聚单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯，第三共聚单体为2-乙烯基-4,5-二氰基咪唑。
在一种优选的实施例中，固定化4,5-二氰基咪唑中，第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体的质量比为(10～50)：(10～50)：(10～80)；第一共聚单体与第二共聚单体的总质量与第三共聚单体的质量比≤9:1；优选地，第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体的质量比为(20～30)：(20～30)：(40～60)；更优选地，第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体的质量比为1：1：2。
在一种优选的实施例中，固定化4,5-二氰基咪唑在N，N-二甲基甲酰胺、醚、乙腈、醇、酯和氯代烷烃中的溶解度均小于1g/L；优选地，固定化4,5-二氰基咪唑的红外光谱中有如下特征吸收：3149-2488(多重峰)、2242、1911、1728、1644、1574、1510和1370cm-1，固定化4,5-二氰基咪唑的红外检测样品的制备方法为溴化钾压片法，上述溴化钾压片法即为现有技术中常见的红外样品制备方法。
上述固定化4,5-二氰基咪唑，为自由基共聚反应获得的无规共聚体。此种固定化4,5-二氰基咪唑在上述有机溶剂、以及其他常用有机溶剂的单体或混合中的溶解度，均小于1g/L，乃至小于0.1g/L、0.01g/L，因此在利用此种固定化4,5-二氰基咪唑活化后续的反应后，能够利用简单的过滤除去固定化4,5-二氰基咪唑，并在反应中循环利用。对于固定化4,5-二氰基咪唑中第三共聚单体的质量，可以用现有技术中的测定氮元素的方法进行表征。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种固定化4,5-二氰基咪唑的制备方法，该制备方法包括：利用第一共聚单体和第二共聚单体，对2-乙烯基-4,5-二氰基咪唑进行自由基共聚反应；第一共聚单体为二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯，第二共聚单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯。
发明人对多种现有技术中常用的交联剂进行筛选，发现利用二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯，和苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯作为交联剂，对2-乙烯基4,5-二氰基咪唑进行自由基共聚反应，能够获得性能较好的固定化4,5-二氰基咪唑。此种固定化4,5-二氰基咪唑在有机溶剂中的溶解度均较差，不能溶于常见的任何有机溶剂及有机溶剂的混合物。因此在利用固定化4,5-二氰基咪唑活化后续的反应后，能够利用简单的过滤除去固定化4,5-二氰基咪唑，并在反应中循环利用。
在一种优选的实施例中，在自由基共聚反应中，第一共聚单体的投料质量为10～50份、第二共聚单体的投料质量为10～50份，但第一共聚单体和第二共聚单体的投料质量之和不超过90份；2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料质量为10～80份；优选地，第一共聚单体的投料质量为20～30份、第二共聚单体的投料质量为20～30份；2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料质量为40～60份；更优选地，第一共聚单体的投料质量为25份、第二共聚单体的投料质量为25份，2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料质量为50份。
在该自由基共聚反应中，通过调节第一共聚单体和第二共聚单体的投料量，能够获得物理性质优异的制备产物固定化4,5-二氰基咪唑。第一共聚单体的用量能够影响聚合物产物的交联度，在上述投料量下，有助于提高交联度，更重要的是能够降低制备获得的聚合物产物在有机溶剂中的溶解度，便于后续通过简单的过滤等方式去除，并实现循环利用。若第一共聚单体的添加量过少，则产物的交联度可能也会相应变小，且制备获得的聚合物产物在有机溶剂中的溶解度增加，难以实现上述简单除去、循环利用的效果。若第一共聚单体的添加量过多，则可能导致终产物中的4,5-二氰基咪唑活性成分占比下降，影响催化活性。且第一共聚单体的添加量过多，也容易导致聚合物产物在后续的使用中，在有机溶剂中难以溶胀，影响催化活性。在自由基共聚反应中，第二共聚单体的添加量有助于调节聚合物产物的成型性，若第二共聚单体的加入量过少，则聚合物不易成型。2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料量多少也影响聚合物的性能，若投料量过少则产物的催化活性下降，若投料量过多，则产物的交联度下降，在有机溶剂中的溶解度上升，难以满足循环使用的要求。
在一种优选的实施例中，将第一共聚单体、第二共聚单体以及2-乙烯基4,5-二氰基咪唑置于反应溶剂中进行自由基共聚反应，其中，反应溶剂包括但不限于甲基叔丁基醚、乙腈或N，N-二甲基甲酰胺中的一种或多种；优选地，在氮气或稀有气体的气氛中进行自由基共聚反应。
上述自由基共聚反应，可以在上述有机溶剂或其他常用的有机溶剂中发生反应，第一共聚单体、第二共聚单体以及2-乙烯基4,5-二氰基咪唑均能够溶于有机溶剂，而发生自由基共聚反应后生成的固定化4,5-二氰基咪唑，则在上述反应溶剂中溶解度低，反应生成不溶的聚合物，在促进反应向正方向进行的同时，也便于产物的分离和纯化。
在一种优选的实施例中，自由基共聚反应的自由基引发剂包括偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或过氧化苯甲酰中的一种或多种；优选地，自由基共聚反应的反应温度为65℃～90℃；优选地，自由基共聚反应的反应时间为10h～20h。
利用上述自由基引发剂，能够在受热后分解产生自由基，从而引发自由基共聚反应。在上述自由基共聚反应中，反应温度为65～90℃，反应时间为10～20h。自由基引发剂如偶氮二异丁腈的分解开始温度为64℃左右，超过85℃则分解速度太快容易导致暴聚，因此上述温度范围内进行自由基共聚反应，自由基共聚反应的转化率较高，反应较快，且不易生成副产物。
由于未添加水相及分散剂等成分，上述共聚反应属于沉淀共聚，共聚获得的产物为微细粉末状，粒径为数十微米级别。本反应以固定的时间进行，反应时间到，即过滤生成的产物，无需判断反应是否结束。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种偶联方法，该偶联方法包括：利用上述固定化4,5-二氰基咪唑制备方法制备的固定化4,5-二氰基咪唑、或上述固定化4,5-二氰基咪唑，活化磷酰胺与羟基进行偶联。
在一种优选的实施例中，利用固定化4,5-二氰基咪唑，活化磷酰胺与羟基进行偶联反应，偶联反应的转化率为90％～94％；优选地，带有羟基的化合物包括二甲氧基三苯甲基(DMTr基)保护的核苷或DMTr基保护的脱氧核苷；优选地，带有磷酰胺的化合物包括亚磷酰胺类化合物；优选地，磷酰化试剂包括2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺。
利用上述固定化4,5-二氰基咪唑，能够活化磷酰胺与羟基的偶联反应，完成如寡核苷酸等具有较大商业价值的产物的关键合成步骤。利用该固定化4,5-二氰基咪唑，能够催化廉价的反应原料发生偶联反应，并达到大于90％的偶联反应率。该固定化4,5-二氰基咪唑不溶于常见有机溶剂的性质，也降低了偶联反应的后处理成本，利用过滤等物理方法即能够将固定化4,5-二氰基咪唑从反应体系中分离，在降低分离成本的同时，也能够将固定化4,5-二氰基咪唑重复利用，进一步降低生产成本。
在一种优选的实施例中，偶联方法包括：利用固定化4,5-二氰基咪唑，进行连续化偶联反应。
利用固定化4,5-二氰基咪唑不溶于有机溶剂的特性，可以将固定化4,5-二氰基咪唑固定于连续化反应装置中，反应底物溶于反应溶剂，在流经连续化反应装置的同时与固定化4,5-二氰基咪唑接触并完成反应，能够实现连续化的工业化大批量生产，也无需进行过滤等分离，进一步减少产物的纯化成本。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了上述固定化4,5-二氰基咪唑、或制备方法、或偶联方法，在磷酰胺与羟基的偶联反应和/或寡核苷酸合成中的应用。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1
固定化4,5-二氰基咪唑的制备。
在氮气氛围下，将0.5g二乙烯基苯、0.5g苯乙烯和1g的2-乙烯基4,5-二氰基咪唑(2-乙烯基-4,5-DCI)投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.47g产物，所得产物命名为C-1。该产物在红外光谱中有如下特征吸收：3149-2488cm-1多重峰、2242、1911、1728、1644、1574、1510和1370cm-1。该产物是交联的，不溶于常见的溶剂，包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二氯甲烷、乙醚、DMF、DMSO和乙酸乙酯等，0.1g产物在1mL上述溶剂中分别放置10min，放置前后均洗涤、烘干、称重，肉眼观察无变化，放置前后的质量差占质量的比例(即失重率)均小于1％。
固定化4,5-二氰基咪唑活化的偶联反应如下：
1.固定化4,5-二氰基咪唑(固定化4,5-DCI，C-1)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为94％。
2.固定化4,5-DCI(C-1)活化的5-甲基尿苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取62mg 5-甲基尿苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL DMF中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基尿苷衍生物的磷酸化产物转化率为91％。
3.固定化4,5-DCI(C-1)活化的腺苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取73mg腺苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL DMF中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该腺苷衍生物的磷酸化产物转化率为90％。
4.固定化4,5-DCI(C-1)活化的鸟苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取70mg鸟苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL DMF中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该鸟苷衍生物的磷酸化产物转化率为93％。
实施例2
在氮气氛围下，将0.4g二乙烯基苯、0.4g苯乙烯和1.2g的2-乙烯基-4,5-DCI投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.71g产物，所得产物命名为C-2。
固定化4,5-DCI(C-2)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应：
取上述固定化的4,5-DCI树脂(C-2)100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为86％。
实施例3
在氮气氛围下，将0.6g二乙烯基苯、0.6g苯乙烯和0.8g的2-乙烯基-4,5-DCI投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.71g产物，所得产物命名为C-3。
固定化4,5-DCI(C-3)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应：
取上述固定化的4,5-DCI树脂(C-3)100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为85％。
实施例4
在氮气氛围下，将1.0g二乙烯基苯、0.5g苯乙烯和0.5g的2-乙烯基-4,5-DCI投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.63g产物，所得产物命名为C-4。
固定化4,5-DCI(C-4)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应：
取上述固定化的4,5-DCI树脂(C-4)100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为42％。
实施例5
在氮气氛围下，将0.5g二乙烯基苯、1.0g苯乙烯和0.5g的2-乙烯基-4,5-DCI投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.59g产物，所得产物命名为C-5。
固定化4,5-DCI(C-5)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂(C-5)100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为35％。
实施例6
在氮气氛围下，将0.75g二乙烯基苯、0.75g苯乙烯和0.5g的2-乙烯基-4,5-DCI投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.53g产物，所得产物命名为C-6。
固定化4,5-DCI(C-6)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂(C-6)100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为38％。
对比例1
在氮气氛围下，将1.0g二乙烯基苯和1.0g的2-乙烯基-4,5-DCI投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的偶氮二异丁腈(AIBN)。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。在该对比例中，由于未添加苯乙烯，聚合所得的产物难以成型。
实施例7
在氮气氛围下，将0.5g二乙烯基苯、0.5g甲基丙烯酸甲酯和1g的2-乙烯基-4,5-DCI投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.32g产物，所得产物命名为C-7。
固定化4,5-DCI(C-7)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂(C-7)100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为76％。
实施例8
在氮气氛围下，将0.5g二甲基丙烯酸乙二醇酯、0.5g苯乙烯和1g的2-乙烯基4,5-二氰基咪唑(2-乙烯基-4,5-DCI)投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.35g产物，所得产物命名为C-8。
固定化4,5-DCI(C-8)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂(C-8)100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为81％。
实施例9
在氮气氛围下，将0.5g二甲基丙烯酸乙二醇酯、0.5g甲基丙烯酸甲酯和1g的2-乙烯基-4,5-DCI投入25mL两口烧瓶中，添加10mL的DMF作为溶剂，最后加入25mg的AIBN。加热至70℃，体系反应16h。过夜后，停止加热。过滤产物，用乙醇洗涤，烘干，得1.29g产物，所得产物命名为C-9。
固定化4,5-DCI(C-9)活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取上述固定化的4,5-DCI树脂(C-9)100mg加入2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞嘧啶核苷衍生物的磷酸化产物转化率为75％。
对比例2：游离4,5-DCI活化的偶联反应
1.游离4,5-DCI活化的5-甲基胞苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取4,5-DCI 13mg(0.11mmol)溶于2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取72mg 5-甲基胞苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL DMF中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基胞苷衍生物的磷酸化产物转化率为97％。
2.游离4,5-DCI活化的5-甲基尿苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取4,5-DCI 13mg(0.11mmol)溶于2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取62mg 5-甲基尿苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL DMF中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该5-甲基尿苷衍生物的磷酸化产物转化率为95％。
3.游离4,5-DCI活化的腺苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取4,5-DCI 13mg(0.11mmol)溶于2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取73mg腺苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL DMF中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该腺苷衍生物的磷酸化产物转化率为95％。
4.游离4,5-DCI活化的鸟苷衍生物与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺的偶联反应。
取4,5-DCI 13mg(0.11mmol)溶于2mL乙腈，滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(36μL，0.12mmol)。取70mg鸟苷衍生物(0.10mmol)，溶于100μL DMF中，滴加入上述体系，室温下反应过夜。反应完成后，以HPLC分析，该鸟苷衍生物的磷酸化产物转化率为96％。
由于4,5-DCI、底物和磷试剂等均易溶于乙腈、DMF，难溶于水，反应后难以通过水洗、萃取等方式除去，需要过纳滤膜过滤除杂比较麻烦。
如使用固定化的4,5-DCI树脂，则底物转化率与小分子4,5-DCI基本相当，而仅需要通过离心或过滤等方式分离树脂，除杂过程大大简化。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：利用第一共聚单体和第二共聚单体，对2-乙烯基4,5-二氰基咪唑进行自由基共聚反应，制备获得固定化4,5-二氰基咪唑。该固定化4,5-二氰基咪唑能够催化磷酰胺和羟基发生偶联反应，底物转化率相较于利用4,5-DCI活化无明显下降。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种固定化4,5-二氰基咪唑，其特征在于，所述固定化4,5-二氰基咪唑由第一共聚单体、第二共聚单体和第三共聚单体通过自由基共聚反应获得，
所述第一共聚单体为二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯，所述第二共聚单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯，所述第三共聚单体为2-乙烯基-4,5-二氰基咪唑；
所述第一共聚单体、所述第二共聚单体和所述第三共聚单体的质量比为（20~30）：（20~30）：（40~60）。
2.根据权利要求1所述的固定化4,5-二氰基咪唑，其特征在于，所述第一共聚单体、所述第二共聚单体和所述第三共聚单体的质量比为1：1：2。
3.根据权利要求1或2所述的固定化4,5-二氰基咪唑，其特征在于，所述固定化4,5-二氰基咪唑在N，N-二甲基甲酰胺、醚、乙腈、醇、酯和氯代烷烃中的溶解度均小于1 g/L。
4.根据权利要求3所述的固定化4,5-二氰基咪唑，其特征在于，所述固定化4,5-二氰基咪唑的红外光谱中有如下特征吸收：3149-2488 cm-1多重峰、2242、1911、1728、1644、1574、1510和1370 cm-1，所述固定化4,5-二氰基咪唑的红外检测样品的制备方法为溴化钾压片法。
5.一种固定化4,5-二氰基咪唑的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
利用第一共聚单体和第二共聚单体，对2-乙烯基-4,5-二氰基咪唑进行自由基共聚反应；
所述第一共聚单体为二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯，所述第二共聚单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯；
所述第一共聚单体的投料质量为20~30份、所述第二共聚单体的投料质量为20~30份；所述2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料质量为40~60份。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一共聚单体的投料质量为25份、所述第二共聚单体的投料质量为25份，所述2-乙烯基4,5-二氰基咪唑的投料质量为50份。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将所述第一共聚单体、所述第二共聚单体以及所述2-乙烯基4,5-二氰基咪唑置于反应溶剂中进行所述自由基共聚反应，其中，所述反应溶剂为甲基叔丁基醚、乙腈或N,N-二甲基甲酰胺。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在氮气或稀有气体的气氛中进行所述自由基共聚反应。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述自由基共聚反应的自由基引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或过氧化苯甲酰。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述自由基共聚反应的反应温度为65 ℃~90 ℃。
11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述自由基共聚反应的反应时间为10 h~20 h。
12.一种偶联方法，其特征在于，所述偶联方法为：利用权利要求1至4中任一项所述的固定化4,5-二氰基咪唑、或权利要求5至11中任一项所述的固定化4,5-二氰基咪唑制备方法制备的所述固定化4,5-二氰基咪唑，活化磷酰胺与羟基进行偶联。
13.根据权利要求12所述的偶联方法，其特征在于，利用所述固定化4,5-二氰基咪唑，活化磷酰胺与羟基进行偶联反应，所述偶联反应的转化率为90%~94%。
14.根据权利要求12所述的偶联方法，其特征在于，带有所述羟基的化合物为二甲氧基三苯甲基保护的核苷或二甲氧基三苯甲基保护的脱氧核苷。
15.根据权利要求12所述的偶联方法，其特征在于，带有所述磷酰胺的化合物为亚磷酰胺化合物。
16.根据权利要求15所述的偶联方法，其特征在于，所述亚磷酰胺化合物为2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的偶联方法，其特征在于，所述偶联方法为：利用所述固定化4,5-二氰基咪唑进行连续化偶联反应。
18.权利要求1至4中任一项所述的固定化4,5-二氰基咪唑、或权利要求5至11中任一项所述的制备方法制备获得的固定化4,5-二氰基咪唑、或权利要求12至17中任一项所述的偶联方法，在磷酰胺与羟基的偶联反应和寡核苷酸合成中的应用。
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