CN116606336A - 高稳定性和亲和力的2′-o-取代核苷及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种式I化合物，其中，R1选自氢、C1～C8的烷基或卤素；R2选自取代或未取代的C1～C8的烷基、C1～C8的烷氧基、C3～C6的环烷基、芳环或杂环基团；所述式I化合物的制备方法包括以下步骤：式II化合物与式III化合物置于溶剂中，在硼催化剂和碱存在条件下进行反应，制得式I化合物，本发明方法操作简单、成本低、收率高、产物纯度高、环保安全，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及高稳定性和亲和力的2′-O-取代核苷及其制备方法和其应用。
背景技术
反义寡核苷酸药物是指与靶基因pre-mRNA或mRNA特定序列互补的寡核苷酸分子，主要根据碱基互补配对原则和核酸杂交原理，从基因复制、转录、剪接、翻译等水平上调节靶基因的表达，调节遗传信息从核酸向蛋白质的传递，从而达到调节靶基因的目的。反义寡核苷酸药物一般由十几到几十个核苷，通过3',5'-磷酸二酯键连接而成。一般情况下，未经修饰的反义寡核苷酸被细胞吸收的效率较低，且容易被细胞内普遍存在的核酸酶降解，为了克服这两个缺点、提高成药性，科学家对其骨架：磷酸基、糖基和碱基进行了不同的化学修饰。对糖基的化学修饰主要是为了增加稳定性和亲和力。其中，糖基2'位修饰一直是核酸化学修饰中的研究热点。已有较多研究表明，2'-O-烷氧基修饰的核苷可增强与RNA的亲和力，增强寡核苷酸对核酸酶的抗性。例如，2'位被乙二醇单甲醚(2'-O-MOE)修饰的核苷合成的反义寡核苷酸对于RNA的亲和力较高，核酸酶抗性更好，毒性和免疫刺激更小等优点，被广泛应用于临床反义寡核苷酸药物中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种式I化合物，具有如下结构：
其中，R1选自氢、C1～C8的烷基或卤素；
R2选自取代或未取代的C1～C8的烷基、C1～C8的烷氧基、C3～C6的环烷基、芳环或杂环基团。
本发明优选的技术方案中，R1选自氢、甲基、溴或氯。
本发明优选的技术方案中，所述R2选自
本发明优选的技术方案中，所述式I化合物选自
本发明的目的在于提供一种式I化合物的制备方法，包括如下步骤：
将式II化合物与式III化合物置于溶剂中，在硼催化剂和碱存在条件下进行反应，制得式I化合物，合成路线如下：
其中，R1选自氢、C1～C8的烷基或卤素；
R2选自取代或未取代的C1～C8的烷基、C1～C8的烷氧基、C3～C6的环烷基、芳环或杂环基团。
本发明优选的技术方案中，R1选自氢、甲基、溴或氯。
本发明优选的技术方案中，所述R2选自
本发明优选的技术方案中，所述硼催化剂选自硼酸、三氧化二硼、硼酸三甲酯、硼酸三乙酯中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述碱选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述式III化合物选自
本发明优选的技术方案中，所述溶剂选自可与水共沸的有机溶剂。
本发明优选的技术方案中，所述可与水共沸的有机溶剂选自苯类溶剂、酯类溶剂中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述苯类溶剂选自甲苯和/或二甲苯。
本发明优选的技术方案中，所述酯类溶剂选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述式II化合物和式III化合物的摩尔比为1:3-20，优选为1:5-15，更优选为1:6-13。
本发明优选的技术方案中，所述式II化合物与溶剂的质量体积比为1:1-5g/ml，优选为1:1.5-3g/ml。
本发明优选的技术方案中，所述式II化合物与硼催化剂的摩尔比为1:0.1-0.5，优选摩尔比为1:0.1-0.2。
本发明优选的技术方案中，所述式II化合物与碱的摩尔比为1:0.1-0.5，优选摩尔比为1:0.1-0.2。
本发明优选的技术方案中，所述反应温度为120-200℃，优选为150-160℃。
本发明优选的技术方案中，所述反应时间为8-26h，优选为10-18h。
本发明优选的技术方案中，所述反应在分水器或者刺形精馏柱中进行。
本发明优选的技术方案中，所述式I化合物还可通过柱层析或重结晶进行纯化。
本发明优选的技术方案中，所述柱层析的洗脱剂为二氯甲烷:甲醇体积比为100:1～20:1。
本发明优选的技术方案中，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯、甲醇中的任一种或其组合。
本发明的另一目的在于提供5'-DMT-2'-O-取代核苷的制备方法，包括以下步骤：将式I化合物置于吡啶中，0-5℃温度下与DMTrCl反应，得到5'-DMT-2'-O-取代核苷。
本发明优选的技术方案中，所述反应时间为1-10h，优选为3-5h。
本发明优选的技术方案中，所述式I化合物与DMTrCl的摩尔比为1:1.05-1.2，优选为1:1.1。
本发明优选的技术方案中，所述反应后经过柱层析分离纯化。
本发明优选的技术方案中，所述柱层析的洗脱剂为二氯甲烷:甲醇体积比为100:1～20:1。
本发明的另一目的在于提供式I化合物用于制备临床反义寡核苷酸药物中的应用。
本文中，
MOE是指甲氧基乙基；
DMTrCl是指4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷；
DMT是指4,4'-二甲氧基三苯甲基。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的式I化合物稳定性好、亲和力高，核酸酶抗性更好，毒性和免疫刺激更小，可广泛应用于临床反义寡核苷酸药物中。
2、本发明的制备方法通过硼催化剂和碱的组合条件，可以一步实现2'-O-取代核苷的制备，无需先制备硼酸酯，避免了易燃易爆硼烷或易腐蚀三氯化硼的使用，使得本发明方法操作简单，成本低廉，可应用于工业化大生产。
3、本发明方法收率高、产品纯度高，收率高，同时本发明方法反应迅速且反应完全，较现有技术至少节约50％的反应时间，具有明显经济效益，适合进行工业化应用。价格廉价，且反应所用溶剂可以回收利用，符合绿色化学的理念。
4、本发明方法制得的2'-O-取代核苷可不经分离纯化即可用于反义寡核苷酸药物中间体5'-DMT-2'-O-取代核苷的制备中，两步收率高。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1 2'-O-取代-5-甲基尿苷(化合物c)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-甲基尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.168g，0.002mol，0.20equiv.)，10mL式III化合物7，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热21h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物c。
将制得的化合物c通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物c(2.89g，收率84％，纯度>95％)。
化合物c的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.98(1H,s),7.31(1H,d,J＝1.3Hz),5.54(1H,d,J＝5.8Hz),5.30(1H,s),4.45(1H,dd,J＝5.8,4.9Hz),4.37(1H,dd,J＝5.0,3.0Hz),4.24(1H,s),4.15(1H,q,J＝2.4Hz),4.03–3.89(2H,m),3.82–3.73(1H,m),3.77–3.47(3H,m),3.45–3.38(1H,m),1.92(3H,d,J＝1.3Hz),1.30–1.14(6H,m).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ163.7,150.5,139.1,111.0,92.5,85.9,80.5,72.5,70.2,69.6,67.0,62.5,21.9,21.8,12.4。
MS(ESI)345.1[M+H]+。
实施例2 2'-O-取代-5-甲基尿苷(化合物d)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-甲基尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物6，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热13h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物d。
将制得的化合物d通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物d(2.75g收率80％,纯度>95％)。
化合物d的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.62(1H,s),7.44–7.39(1H,m),5.61(1H,d,J＝4.5Hz),5.31(1H,s),4.37(2H,q,J＝3.9,2.9Hz),4.12(2H,t,J＝6.1Hz),4.03–3.85(2H,m),3.79(1H,d,J＝12.5Hz),3.76–3.48(2H,m),3.46(2H,td,J＝6.8,1.9Hz),1.91(3H,s),1.63(2H,dt,J＝14.3,7.1Hz),1.22(1H,dt,J＝11.0,6.9Hz),0.92(3H,t,J＝7.4Hz)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.2,150.7,138.6,110.9,91.6,85.6,80.9,73.2,70.0,69.6,69.4,62.1,22.7,12.4,10.4。
MS(ESI)345.2[M+H]+。.
实施例3 2'-O-取代-5-甲基尿苷(化合物g)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-甲基尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物3，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热13h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物g。
将制得的化合物g通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1。
经柱层析分离纯化得到化合物g(2.94g，收率79％，纯度>95％)。
化合物g的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.85(s,1H),7.50(d,J＝1.3Hz,1H),5.67(d,J＝4.7Hz,1H),4.31(dt,J＝19.9,5.3Hz,2H),4.10(dt,J＝4.4,2.2Hz,1H),4.00–3.89(m,3H),3.83–3.47(m,10H),1.89(d,J＝1.3Hz,3H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.3,150.7,138.3,110.8,90.9,85.4,81.3,70.5,70.2,70.1,69.5,69.2,66.7,61.8,15.1,12.4。
MS(ESI)374.3[M+H]+。
实施例4 2'-O-取代-5-甲基尿苷(化合物i)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-甲基尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物10，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热14h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物i。
将制得的化合物i通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物i(2.2g,收率65％,纯度>95％)。
化合物i的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.35–7.29(m,2H),6.33(d,J＝3.2Hz,1H),6.25(dd,J＝3.3,1.9Hz,1H),5.80(d,J＝6.6Hz,1H),4.61(d,J＝13.7Hz,1H),4.49–4.37(m,1H),4.22(dd,J＝5.6,3.3Hz,1H),4.12(dd,J＝6.6,5.6Hz,1H),4.02(q,J＝3.5Hz,1H),3.77–3.63(m,2H),1.81–1.70(m,3H)。
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MS(ESI)339.2[M+H]+。
实施例5 2'-O-取代-5-甲基尿苷(化合物j)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-甲基尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物11，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热12h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物j。
将制得的化合物j通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物j(3.47g,收率98％,纯度>95％)。
化合物j的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(1H,s),7.64–7.59(1H,m),7.47(1H,dd,J＝5.0,1.3Hz),7.06(1H,ddd,J＝11.9,3.4,1.2Hz),6.96(1H,ddd,J＝6.6,5.1,3.4Hz),5.90(1H,d,J＝5.7Hz),5.24(1H,d,J＝5.6Hz),5.17(1H,t,J＝5.0Hz),4.83(1H,d,J＝12.7Hz),4.70(1H,d,J＝12.7Hz),4.15(1H,td,J＝5.4,3.9Hz),4.08–3.51(4H,m),1.71(3H,d,J＝1.2Hz)。
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.2,151.1,141.0,136.3,127.5,109.8,86.0,85.7,80.0,75.7,68.8,66.1,61.2,13.4,12.7。
MS(ESI)355.2[M+H]+。
实施例6 2'-O-取代-5-甲基尿苷(化合物k)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-甲基尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.924g，0.011mol，1.10equiv.)，10mL式III化合物9，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热15h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物k。
将制得的化合物k通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1。
经柱层析分离纯化得到化合物k(2.80g,收率79％,纯度>95％)。
化合物k的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.62(s,1H),7.46(d,J＝1.4Hz,1H),7.14–7.01(m,2H),6.95–6.84(m,2H),5.92(d,J＝4.9Hz,1H),4.88(t,J＝5.0Hz,1H),4.40(t,J＝4.6Hz,1H),4.22(dt,J＝4.3,2.2Hz,1H),3.97(dd,J＝12.5,2.2Hz,1H),3.84(s,3H),3.81(dd,J＝12.5,2.3Hz,1H),3.56(s,1H),1.89(d,J＝1.4Hz,3H),1.26(s,1H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.1,150.6,146.8,138.5,125.0,121.7,120.8,112.2,111.0,91.6,85.4,83.9,69.5,61.8,55.8,12.4。
MS(ESI)365.1[M+H]+。
实施例7 2'-O-取代-5-甲基尿苷(化合物l)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-甲基尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物12，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热26h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物l。
将制得的化合物l通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物l(0.98g,收率30％,纯度>95％)。
化合物l的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.70(d,J＝1.3Hz,1H),5.87(d,J＝3.7Hz,1H),4.46(ddt,J＝5.9,4.3,2.1Hz,1H),4.23(dd,J＝6.3,5.4Hz,1H),4.14(dd,J＝5.4,3.8Hz,1H),4.04(ddd,J＝6.6,4.1,2.8Hz,1H),3.92–3.66(m,6H),2.03(td,J＝7.9,4.4Hz,2H),1.82(d,J＝1.3Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,D2O)δ166.4,151.4,137.0,111.3,87.8,84.0,79.7,79.4,72.5,68.0,66.7,60.1,31.7,11.5。
MS(ESI)329.2[M+H]+。
实施例8 2'-O-取代尿苷(化合物o)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物3，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热14h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物o。
将制得的化合物o通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物o(2.70g,收率75％,纯度>95％)。
化合物o的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.07(s,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,1H),5.77(d,J＝4.2Hz,1H),5.75–5.71(m,1H),4.30(q,J＝4.6Hz,1H),4.17(t,J＝4.6Hz,1H),4.08(dd,J＝4.8,2.8Hz,1H),4.02–3.90(m,2H),3.84–3.56(m,8H),3.51(q,J＝7.0Hz,2H),2.17(s,1H),1.19(t,J＝7.0Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.1,150.6,142.0,102.3,89.9,85.1,81.9,70.4,70.2,69.5,68.9,66.7,61.3,31.0,15.0。
MS(ESI)361.1[M+H]+。
实施例9 2'-O-取代尿苷(化合物p)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物4，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热10h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物p。
将制得的化合物p通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物p(3.31g,收率85％,纯度>95％)。
化合物p的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.78(dd,J＝8.1,1.4Hz,1H),5.85(dd,J＝4.3,1.6Hz,1H),5.76(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),4.18(td,J＝5.7,1.6Hz,1H),4.10–4.04(m,1H),4.00(qd,J＝4.2,1.9Hz,1H),3.82–3.64(m,5H),3.62–3.46(m,11H),3.24(d,J＝2.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,D2O)δ166.2,151.4,141.7,102.1,87.8,84.2,81.4,70.9,69.7,69.6,69.5,69.4,68.3,60.4,58.0。
MS(ESI)391.2[M+H]+。
实施例10 2'-O-取代尿苷(化合物q)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物5，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热12h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物q。
将制得的化合物q通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物q(2.54g,收率80％,纯度>95％)。
化合物q的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.32(s,1H),7.65(d,J＝8.1Hz,1H),5.74(d,J＝8.0Hz,1H),5.67(d,J＝4.7Hz,1H),4.37–4.27(m,2H),4.14(dt,J＝4.2,2.3Hz,1H),4.04–3.92(m,2H),3.81(d,J＝12.3Hz,1H),3.74–3.60(m,2H),3.60–3.49(m,3H),3.30(s,1H),1.23(t,J＝7.0Hz,4H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.4,150.4,142.4,102.5,91.3,85.5,81.3,70.1,69.5,69.2,66.8,61.9,14.9。
MS(ESI)317.1[M+H]+。
实施例11 2'-O-取代尿苷(化合物r)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物6，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热12h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物r。
将制得的化合物r通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物r(2.61g,收率79％,纯度>95％)。
化合物r的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.54(s,1H),7.67(d,J＝8.1Hz,1H),5.74(d,J＝8.1Hz,1H),5.68(d,J＝4.9Hz,1H),4.32(dq,J＝9.7,4.7Hz,2H),4.14(dt,J＝4.1,2.2Hz,1H),4.04–3.91(m,2H),3.80(d,J＝13.6Hz,1H),3.74–3.58(m,3H),3.58–3.49(m,1H),3.43(s,1H),1.19(t,J＝6.1Hz,6H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.6,150.5,142.5,102.4,91.3,85.6,81.3,72.5,70.3,69.2,67.0,61.9,21.9,21.8。
MS(ESI)331.2[M+H]+。
实施例12 2'-O-取代-5-溴-尿苷(化合物s)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-溴尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物1，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热14h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物s。
将制得的化合物d通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
经柱层析分离纯化得到化合物s(2.85g,收率75％，纯度>95％)。
化合物s的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O)δ8.27(d,J＝1.8Hz,1H),5.80(t,J＝2.6Hz,1H),4.17(ddd,J＝6.6,5.0,1.8Hz,1H),4.00(ddt,J＝8.9,6.3,2.6Hz,2H),3.82(dt,J＝13.0,2.3Hz,1H),3.79–3.64(m,4H),3.55–3.46(m,3H),3.23(d,J＝2.7Hz,2H),1.04(td,J＝7.4,2.0Hz,1H)。
13C NMR(101MHz,D2O)δ161.8,150.7,141.0,96.3,87.9,84.0,81.7,71.1,69.5,67.8,59.7,58.0。
MS(ESI)403.1[M+Na]+。
实施例13 2'-O-取代-5-氯-尿苷(化合物t)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入式II化合物2,2'-脱水-5-氯尿苷(2.4g，0.010mol，1.0equiv.)，硼酸(0.124g，0.002mol，0.20equiv.)，碳酸氢钠(0.084g，0.001mol，0.10equiv.)，10mL式III化合物1，4～5mL甲苯，装刺形精馏柱，150℃加热10h，TLC监测至反应完全。置于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，得化合物t。
将制得的化合物d通过柱层析纯化，柱层析洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1。
经柱层析分离纯化得到化合物t(2.45g,收率73％,纯度>95％)。
化合物t的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O)δ8.18(s,1H),5.86(d,J＝3.5Hz,1H),4.21(dd,J＝6.5,5.2Hz,1H),4.10–4.00(m,2H),3.86(dd,J＝12.9,2.8Hz,1H),3.84–3.69(m,4H),3.56(t,J＝4.4Hz,2H),3.27(d,J＝10.0Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,D2O)δ161.8,150.5,138.4,108.7,87.9,84.1,81.7,71.2,69.5,67.9,59.9,58.0。
MS(ESI)337.1[M+H]+。
实施例14 5'-DMT-2'-O-丙氧基乙基-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的制备
将化合物d(600mg，1.74mmol)溶解在吡啶(30mL)溶液中，0℃下加入DMTrCl(884mg，2.16mmol)，将反应升温至50℃搅拌16小时。TLC监测至反应结束后，将反应液用饱和NaHCO3溶液(50mL)稀释，然后使用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤并用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(DCM：MeOH＝100：1)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-丙氧基乙基-5-甲基尿苷(460mg，收率41％)。
将5'-DMT-2'-O-丙氧基乙基-5-甲基尿苷(350mg，0.54mmol)溶解在乙腈(15mL)中，加入四氮唑(45.5mg，0.65mmol)，反应液在N2保护下室温搅拌10分钟。然后向反应液中加入2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(325mg，1.08mmol)，反应在30℃搅拌16小时。反应结束后，将反应液过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(PE/TEA(1000:1):EA/TEA(1000:1)＝50：50)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-丙氧基乙基-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体(130mg，收率29％)。
5'-DMT-2'-O-丙氧基乙基-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.42(s,1H),7.52(s,1H),7.39(d,J＝7.2Hz,2H),7.27(m,8H),6.88(m,4H),5.86(d,1H),4.03(m,3H),3.73(d,6H),3.72–3.67(m,2H),3.52–3.47(m,2H),3.30(d,4H),2.78(s,1H),1.99(s,4H),1.41(m,5H),1.17(m,4H),1.12(m,4H),0.96(d,3H),0.87–0.73(m,4H).
实施例15 5'-DMT-2'-O-(噻吩-2-甲基)-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的制备
将化合物j(900mg，2.54mmol)溶解在吡啶(30mL)中，然后加入DMTrCl(1033mg，3.04mmol)，将反应升温至50℃搅拌16小时。TLC检测反应结束后，将反应液用饱和NaHCO3(50mL)稀释，然后使用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。有机层用饱和NaCl(30mL)洗涤并用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(DCM：MeOH＝98：2)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-(噻吩-2-甲基)-5-甲基尿苷(600mg，收率36％)。
将5'-DMT-2'-O-(噻吩-2-甲基)-5-甲基尿苷(400mg，0.609mmol)溶解在乙腈(15mL)中，加入四氮唑(52mg，0.73mmol)，反应液在N2保护下室温搅拌10分钟。然后向反应液中加入2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(365.4mg，1.21mmol)，反应在30℃搅拌16小时。反应结束后，将反应液过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(PE/TEA(1000:1):EA/TEA(1000:1)＝50：50)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-(噻吩-2-甲基)-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体(200mg，收率39％)。
5'-DMT-2'-O-(噻吩-2-甲基)-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.42(s,1H),7.52(s,1H),7.39(d,2H),7.27(m,8H),6.88(m,4H),5.86(d,1H),4.03(m,3H),3.73(d,6H),3.72–3.67(m,2H),3.52–3.47(m,2H),3.30(d,4H),2.78(s,1H),1.99(s,4H),1.41(m,5H),1.17(m,4H),1.12(m,4H),0.96(m,3H),0.87–0.73(m,4H).
实施例16 5'-DMT-2'-O-(邻甲氧苯基)-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的制备
将化合物k(800mg，2.20mmol)溶解在吡啶(30mL)中，然后加入DMTrCl(1.12g，3.30mmol)，将反应升温至50℃搅拌16小时。反应结束后，将反应液用饱和NaHCO3(50mL)稀释，然后使用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。有机层用饱和NaCl(30mL)洗涤并用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(DCM：MeOH＝98：2)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-(邻甲氧苯基)-5-甲基尿苷(450mg，收率31％)。
将5'-DMT-2'-O-(邻甲氧苯基)-5-甲基尿苷(450mg，0.68mmol)溶解在乙腈(40mL)中，加入四氮唑(61mg，0.88mmol)，反应液在N2保护下室温搅拌10分钟。然后向反应液中加入2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(594mg，1.35mmol)，反应在30℃搅拌16小时。反应结束后，将反应液过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(PE/TEA(1000:1):EA/TEA(1000:1)＝50：50)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-(邻甲氧苯基)-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体(204mg，收率23％)。
实施例17 5'-DMT-2'-O-乙氧乙氧基乙基-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的制备
将化合物g(700mg，1.94mmol)溶解在吡啶(30mL)溶液中，然后加入DMTrCl(789mg，2.32mmol)，将反应升温至50℃搅拌16小时。反应结束后，将反应液用饱和NaHCO3(50mL)稀释，然后使用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。有机层用饱和NaCl(30mL)洗涤并用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(DCM：MeOH＝98：2)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-乙氧乙氧基乙基-5-甲基尿苷(500mg，收率39％)。
将5'-DMT-2'-O-乙氧乙氧基乙基-5-甲基尿苷(500mg，0.755mmol)溶解在乙腈(30mL)中，加入四氮唑(63mg，0.906mmol)，反应液在N2保护下室温搅拌10分钟。然后向反应液中加入2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(453mg，1.51mmol)，反应在30℃搅拌16小时。反应结束后，将反应液过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(PE/TEA(1000:1):EA/TEA(1000:1)＝50：50)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-乙氧乙氧基乙基-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体(200mg，收率16％)。
5'-DMT-2'-O-乙氧乙氧基乙基-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.42(s,1H),7.52(s,1H),7.39(d,2H),7.27(m,8H),6.88(m,4H),5.86(d,1H),4.03(m,3H),3.73(d,6H),3.72–3.67(m,2H),3.52–3.47(m,4H),3.30(d,1H),2.78(s,1H),1.99(s,4H),1.41(m,5H),1.17(m,4H),1.12(m,4H),0.96(d,3H),0.87–0.73(m,7H).
实施例18 5'-DMT-2'-O-(3”-S-四氢呋喃基)-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的制备
将化合物l(600mg，1.83mmol)溶解在吡啶(30mL)溶液中，然后加入DMTrCl(743mg，2.19mmol)，将反应升温至50℃搅拌16小时。反应结束后，将反应液用饱和NaHCO3(50mL)稀释，然后使用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。有机层用饱和NaCl(30mL)洗涤并用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(DCM：MeOH＝98：2)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-(3”-S-四氢呋喃基)-5-甲基尿苷(600mg)。
将5'-DMT-2'-O-(3”-S-四氢呋喃基)-5-甲基尿苷(600mg，0.807mmol)溶解在乙腈(30mL)中，加入四氮唑(68mg，0.969mmol)，反应液在N2保护下室温搅拌10分钟。然后向反应液中加入2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(461mg，1.61mmol)，反应在30℃搅拌16小时。反应结束后，将反应液过滤浓缩，得到粗品。通过柱层析(PE/TEA(1000:1):EA/TEA(1000:1)＝50：50)纯化粗品，得到5'-DMT-2'-O-(3”-S-四氢呋喃基)-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体(330mg，收率49％)。
5'-DMT-2'-O-(3”-S-四氢呋喃基)-5-甲基尿苷亚磷酰胺单体的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),7.42(s,1H),7.39(d,2H),7.28(m,7H),6.89(m,4H),5.86(d,1H),4.03(m,3H),4.00–3.85(m,2H),3.82–3.70(m,2H),3.72–3.67(m,3H),,3.30(d,1H),2.78(s,1H),2.10–1.85(m,2H),1.99(s,4H),1.41(m,5H),1.17(m,4H),1.12(m,4H),0.96(d,3H),0.87–0.73(m,4H).
实施例19用于通过固相技术制备寡核苷酸序列的一般方法
(SEQ 1-4的制备)
除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用无水乙腈溶解标准的亚磷酰胺单体，所述亚磷酰胺单体包括例如dT、dA、dG和dC以及指定的本专利所述的亚磷酰胺单体。亚磷酰胺单体在无水乙腈中的溶液使用浓度0.06M。
在LK-48E(1-2μmol规模)上装填Universal CPG固体载体做成的2umol合成柱，并使用亚磷酰胺偶联方法来进行指定序列合成。对于偶联步骤，以超过固体载体上的负载量4倍的量递送亚磷酰胺单体并且持续10min进行亚磷酰胺缩合。所有其它步骤均按照制造商供应的标准方案。使用3％三氯乙酸在二氯甲烷中的溶液来从核苷酸的5’-羟基上去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的BTT(0.35M)用作偶联步骤过程中的活化剂。通过用I2在THF/Pyridine中的0.05M溶液氧化2分钟的接触时间来引入亚磷酸酯键。
在合成完指定的序列之后。将固体载体结合的指定序列悬浮在氨水(25wt％-30wt％)中并且在85℃下加热2h。然后过滤掉固相载体并且将氨煮沸掉。残余物通过高压液相色谱法纯化.
制备的寡核苷酸序列：5’-d(GCGTTTTTTGCT)-3’，T为DNA或修饰的RNA单体，其它位点均为DNA单体。
| 序列号 | T位点修饰 | 计算分子量 | 观察分子量 |
| SEQ 1 | 化合物d的对应单体 | 3719.5 | 3719.6 |
| SEQ 2 | 化合物l的对应单体 | 3747.5 | 3747.4 |
| SEQ 3 | 化合物j的对应单体 | 3729.5 | 3729.2 |
| SEQ 4 | 化合物g的对应单体 | 3749.5 | 3749.4 |
实施例20寡核苷酸序列的Tm测试
测试寡核酸序列(5’-d(GCGTTTTTTGCT)-3’，T为DNA或修饰的RNA单体，其它位点均为DNA单体；4uM的PBS溶液)与互补RNA序列(5’-r(AGCAAAAAACGC)-3’；4uM的PBS溶液)按1:1混合(样品总体积3mL)，加入比色杯。比色杯装入紫外-可见分光光度计(ThermoScientific Evolution One，配置Peltier 8联样品池)，95℃加热5分钟后，以2℃/min的速度慢慢冷却至25℃。通过加热样品(25-85℃，0.5℃/min)测定260nm吸收得到熔解曲线。Tm值由Insight Pro软件计算得出。来自于化合物的修饰，展现出了更强的互补RNA序列结合能力，可以作为药物优化的方向。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
Claims (10)
1.一种式I化合物，具有如下结构：
其中，R1选自氢、C1～C8的烷基或卤素；
R2选自取代或未取代的C1～C8的烷基、C1～C8的烷氧基、C3～C6的环烷基、芳环或杂环基团；
优选的，R1选自氢、甲基、溴或氯；
优选的，所述R2选自
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，具体选自如下化合物：
3.一种如权利要求1-2任一项所述的式I化合物的制备方法，包括如下步骤：将式II化合物与式III化合物置于溶剂中，在硼催化剂和碱存在条件下进行反应，制得式I化合物，合成路线如下：
其中，R1选自氢、C1～C8的烷基或卤素；
R2选自取代或未取代的C1～C8的烷基、C1～C8的烷氧基、C3～C6的环烷基、芳环或杂环基团；
优选的，R1选自氢、甲基、溴或氯；
优选的，所述R2选自
所述硼催化剂选自硼酸、三氧化二硼、硼酸三甲酯、硼酸三乙酯中的任一种或其组合；
所述碱选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾中的任一种或其组合。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述式III化合物选自以下任一种：
5.根据权利要求3-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自可与水共沸的有机溶剂；
优选的，所述可与水共沸的有机溶剂选自苯类溶剂、酯类溶剂中的任一种或其组合；
进一步优选的，所述苯类溶剂选自甲苯和/或二甲苯；
进一步优选的，所述酯类溶剂选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯中的任一种或其组合。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述式II化合物和式III化合物的摩尔比为1:3-20，优选为1:5-15，更优选为1:6-13。
7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述式II化合物与溶剂的质量体积比为1:1-5g/ml，优选为1:1.5-3g/ml。
8.根据权利要求3-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述式II化合物与硼催化剂的摩尔比为1:0.1-0.5，优选为1:0.1-0.2；式II化合物与碱的摩尔比为1:0.1-0.5，优选为1:0.1-0.2。
9.一种5'-DMT-2'-O-取代核苷的制备方法，包括以下步骤：将根据权利要求3-9任一项所述制备方法制得的式I化合物置于吡啶中，与DMTrCl反应，再经分离纯化得到5'-DMT-2'-O-取代核苷。
10.如权利要求1-3任一项所述的式I化合物或如权利要求3-9任一项所述的制备方法制备得到的式I化合物用于制备临床反义寡核苷酸药物中的应用。
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