JPS59502025A

JPS59502025A - オリゴヌクレオシドホスホネ−トの製造法

Info

Publication number: JPS59502025A
Application number: JP83503577A
Authority: JP
Inventors: ケスタ−・ヒユ−ベルト
Original assignee: バイオシンテック（バイオケミッシェ・シンセテクニック・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング）
Priority date: 1982-10-28
Filing date: 1983-10-27
Publication date: 1984-12-06
Also published as: DE3378829D1; WO1984001778A1; EP0124561B1; ATE39698T1; DE3239888A1; EP0124561A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオシドホスホネートの製造法本発明は、オリゴヌクレオシドホスホネートの製造法に関する。本発明で得られる化合物は対応するオリゴデオキシヌクレオシドホスホネートも含み、親油性ハイブリダイゼーションアナログとして有用である。

すなわち、それらは親水性オリゴヌクレオチドに組み込まれ、細胞膜をより容易に透過でき、細胞内で塩基−相補性核酸配列と交互反応する（ハイブリダイゼーション）。

糖部分またはヌクレオチド内結合のいずれかｌこ修飾を有する核酸アナログは知られており、例えば、ヌクレオシドホスファイト、ヌクレオシドホスホネートおよびヌクレオシドチオホスホネートの形で知られている。デオキシヌクレオシドメチルホスホネートジエステル類もすでに合成され、研究されている。そのデオキシヌクレオシドのフェニルおよびメチルホスホノ−ジエステル類は均一相にてトリエステル変法を用いて得られているが、比較的長時間の網金時間を要し、純粋な製品を得るためには煩雑な精製手段が要求される。

迅速で高収率を与えるオリゴヌクレオチドの合成も知られており、その方法では、いくつかの反応剤はポリマー担体、例えば制御された孔径のガラス、に化合的に結合する。本発明の方法でもポリマー結合反応剤を用い、きわめて短時間に行なうことができ、目的とするヌクレオシドホスホネートを高収率、で得る。

本発明により製造されるオリゴヌクレオチドホスボネートはつぎの一般式Ｉで示される。

式Ｉ中、Ｂはヌクレオ塩基、例えばＡ、Ｃ，ＧまたはＴまたはその類縁体を意味する。

ｋｌは炭素数１〜１０の分枝していることもあるアルキル基を意味し、それは４個までの塩素原子またはシアノ基で置換ｄれていてもよい。これらの基はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、５ｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２，２．２−）リクロロエチルまたはシアノエチルを含む。この基ｍｌはさらにγリールまたはアラルキル基、とくにフェニルマタはベンジル基であってもよく、それは低級アルキル、低級アルコキシ、シアノ、ハロゲン、とくに塩素マタハ臭素、またはニトロで適宜置換されていてもよい。

基に２は水素原子であり得る：本発明の化合物はしたがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホネートであり得る。基に２はまたヒドロキシ、またはヌクレオチド化学において慣用の保護基で適当に保護されたヒドロキシであってもよい。そのような保護基の例は、トリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチル；アシル、例えばアセチルまたはベンゾイル；テトラヒドロピラニル、メトキシテトラヒドロピラニル、Ｏ−ニトロベンジルおよびシリルエーテル類、例えばｔ−ブチルジフェニルシリルエーテルなどである。

一般式Ｉにおけるｎは２Ｓ５０の整数を意味する。

本発明の方法は下記反応工程：ａ）一般式■ 式中、Ａは、例えばＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ｌ　９８１　、３６３〜３６９頁、Ｌｉｅｂｉｇ’ｓ　Ａｎｎ、　Ｃｈｅｍ−１９７８＋　８３９−８５０頁およびＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｓｙｍｐｏ−ｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、７．１９８０　、３９〜５９頁に記載されるようなヌクレオチド化学において慣用の保護基である。

Ｂ１は、上記文献に同様に記載されているようなヌクレオチド化学において慣用の保護基で適宜保護されているヌクレオ塩基Ｂである。Ｒ１は前記と同意義であるで示されるヌクレオシドと、一般式■ 式中、Ｘは塩素または臭素、Ｚは塩素または臭素、−Ｎｑ（ｉｌは前記に同じ）、または反応性複素環基（反応性複素環基としてはトリアゾリル、テトラゾリル、３−ニトロ−１，２，４−）リアゾリルなどがあり、Ｎ原子を介してＰ原子に結合している）、およびに１は前記と同じであるで示されるハロゲノホスフィンとを、有機塩基、例えばピリジン、ルチジンまたはコリジンの存在下に反応させ、ｂ）工程１で得られる一般式■ 式中、Ａ、Ｂｌ、ｍｌ、Ｒ２およびＺは前記と同じで示されるホスホノ−ヌクレオシド誘導体を、一般式式中、ｍｌおよびに２は前記に同じ、Ｔはポリマー担体であり、使用可能な可溶性または不溶性（架橋〕ポリマー担体の例は変性シリカゲル、ポリエステル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリシロキサン、ポリスチレン、ガラスなど：エステル結合（レボリニルマタハβ−ベンゾイルプロピオニル基から導かれるものも含む）は担体とヌクレオシド間でアンカー機能を有するため好ましいで示されるポリマー担体に結合したヌクレオシドと反Ｃ）工程すで得られる一般式ＶＩ式中、Ｒ，Ｂ”、ｋｌ、−およびＴは前記に同じで示される担体結合ヌクレオチドヌクレオシドを酸化し、該ホスホネートへの酸化は、例えば、ヨウ素にて行なわれ得るが、この酸化は一般に０、ＳまたはＳｅの導入と理解されるべきである ψ工程すの反応で反応されなかった遊離の５’−ＯＨ基を永久保護基により、例えば、無水酢酸と反応させることにより、マスクし、ｅ）その保護基Ａを、例えばプロトン酸またはルイス酸（Ｚｎ　Ｂｒ２など）、またはＡがトリチル基またはそのメトキシ誘導体の場合はジアルキルアルミニウムクロライド、を用いて離脱させ、り必要なら、ａ　、−ｅの反応によりさらにヌクレオシドホスホネートまたはオリゴヌクレオシドホスホネート単位を導入させ、 ρそのヌクレオシド−担体結合を塩基、例えばアンモニアまたはヒドラジンにてＰＨ７で処理して開裂させ、所望により、オリゴヌクレオシドホスホネート中、とくにヌクレオ塩基中に残存する全保護基を離脱させることを特徴とする。

一般式ＩＶ　の中間体は新規化合物である。それらは反応の遅い亜ホスホン酸モノエステル類とは異なり数倍も反応速度が大きいが、なお一定の選択性を有する。

このように、式■のポリマー結合反応剤を用いれば、化合物Ｉを驚くほど短時間にかつ予期し得ないほど高収率で製造することができる。

デオキシヌクレオシドメチルホスホノジエステル類ｄ（ＡＣ）、ｄ（ＡＴ）、ｄ（ＡＴＧ）　およびｄ（ＡＴＴ）　の製造の場合を例にとって、以下に、本発明をさらに詳細擾こ説明する。反応および製造されたオリゴヌクレオシドホスホネート類の物理的パラメータの詳細を下記反応式および表に示す。

実施例均一孔径のガラス（ｃｐｃ）に結合したＮ−保護ヌクレオシドを、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　ｌ　９８１　、４１７７に記載と同様にして調製する。

Ｎ−７シルー５／　Ｏ）、リチルデオキシヌクレオシドｌ　ｒｒｍｏｌ　を乾燥ＴＨＦ１−にとかし、これを２．６−ルチジン５　ｒｒｍｏｌ　およびメチルクロロホスフィン１ｍｍｏｌ　のＴＨＦＩ−混合液］こ、−７８℃ｌｃテ、保護ガス雰囲気下、所要時間１５〜２０分にて添加する。

３０分後、この混合物を室温にまでゆっくり放湿する。

ルチジン塩酸塩を戸去し、ｐ液を減圧濃縮する。その残液をトルエン／ＴＨＦ　（１０ｎ／、１：１〕にて泡が発生するまで２回蒸発させ、その混合物を２，６ −ルチン７５　ｍｍｏｌ　を含むＴＨＦ５．ｎｌにとかし、０．２Ｍ溶液を得る。この活性ヌクレオシドメチルホスホノモノクロリダイト溶液（１ｒｎｌ）を、ＣＰＧビーズ（１００〜２００■）に結合したヌクレオシド（１０〜２０μｍｏｌ）を含有する、隔膜で蓋をしだカラムに注射器で入れる。１５分間反応させたのち、保護ガス圧により反応１０分間に再度入れる。縮合収率をトリチルカチオン濃度を測定することにより確認した。９５％以上縮合が進行したのち、ホスファイトジエステルをＴＨＦ／ＨＦ／ビリジン４０：２０：１）中で０，１Ｍヨウ素にて酸化する。この酸化は３〜５、分間で終了した。過剰のヨウ素をピリジン（５〜１０−）にて色が消えるまで洗浄して除く。この混合物をついてＴＨＦ　（２０〜３０−）で洗浄する。Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｐ　／　Ｔ　ＨＦ　／　Ａ　Ｃ２０／ルチジンＣ０，６９，１０−１１，１ｐ　）の混合物２−をカラムに通し、その後、カラムをピリジン５ｒｎ１１ついでＴＨＦ３０〜５０−にて洗浄し、残存するピリジンおよびルチジンを除去する。このカラムを高真空下に１０分間乾燥する。Ｚｎ　Ｂｒ２１：Ｄ　ＣＨ２ＣＪ２／　ＭｅＯＨ（７：３）中またはニトロメタン／水（１００：１）中飽和溶液を、トリチルの離脱が完了するまで、ビーズに通す。このビーズをｎ　−ＢｕＯＨ／　／ｌ／チジ７／ＴＨＦ（４／１：５）（５ｎ／）にて洗浄し、最後にＴＨＦ　３０〜５０ｒｎｌにてそのまま再度洗浄する。ついて、適当なヌクレオシドメチルホスホノモノクロリダイトを用いて上記方法を繰返してつぎのヌクレオシド単位を導入する。

反応サイクルが完了する時間は４５〜６０分てあり、それはホスホノモノエステルおよび縮合剤のＭＳＮＴを用いる場合の４〜６時間とは対照的である。

ヌクレオシドメチルホスホノジエステル鎖を、アンモニア（２５％、２−）にて３５℃で１５時間処理スることにより担体からはずす。上清液を除き、そのビーズを２回蒸留した水（２，３ｍ１）で洗浄する。その液を合せ、減圧下に濃縮し、薄層クロマトグラフィによリシリカゲルプレート（アセトニトリル／水：８０＝２０）上にて非ヌクレオチド物質を除去する。プレート上のヌクレオチドバンドをＣＨＣｊ’３／ＭｅＯＨ（？　’　３）で溶出する。その生成物を濃縮し、２回蒸留した水を用いて凍結乾燥する。

プリンおよびピリミジンデオキシヌクレオシドメチルホスホノモノクロリダイトの両方をＣＰＧ結合プリン−およびピリミジン−デオキシヌクレオシドとの縮合に同様にして用いることができる。この方法によりｄ（ＡＣ）、ｄ（ＡＴ）、ｄ（ＡＴＧ）およびｄ（ＡＴＴＴ）メチルホスホノジエステル類を製造した。全収率、ＵＶ吸収値およびＲ１値を表に示す。

ｄ（ＡＴ）　９４　２６４　２３４　０．２６す０．０５ｃ）ｄ（ＡＴＧ）　８５　２７１　２４３　０．２１０ｄ（ＡＴＴＴ）　７６　２６８　２４３　０．３２０中で測定した。

田際謀杏磐告

Claims

【特許請求の範囲】一般式■ 式中、Ｂはヌクレオ塩基、Ｒ１は炭素数１〜１ｏの分枝していることもあるアルキル基（４個までの塩素原子またはシアノ基で置換されていてもよい）、またはアリールまたはアルキル部分が炭素数１〜２個のアラルキル基（低級アルキル、低級アルコキシ、シアノ、ハロゲンまたはニトロで適宜置換されていてもよい）、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ、またはヌクレオチド化学において慣用の保護基で適当に保護されたヒドロキシ、およびｎは２〜５ｏの整数を意味するで示されるオリゴヌクレオシドホスホネートの製造法であって、下記反応工程：ａ〕一般式■ 式中、Ａはヌクレオチド化学において慣用の保護基、Ｂ１はヌクレオチド化学において慣用の保護基で適宜保護されているヌクレオ塩基、ｋｌは前記と同意義であるで示されるヌクレオシドを、一般式■ 式中、Ｘは塩素または臭素、Ｚは塩素または臭素、−Ｎ　Ｒ２、または反応性複素環基、およびに１は前記と同じであるで示されるハロゲノホスフィンと有機塩基の存在下ニ反応させ、ｂ）工程１で得られる一般式■ 式中、Ａ、Ｂｌ、ｋｌ、ｋ２およびＺは前記と同じで示されるホスホノ−ヌクレオシド誘導体を、一般式■ 式中、Ｂ１およびに２は前記に同じ、Ｔはポリマー担体であるで示されるポリマー担体に結合したヌクレオシドと反式中、ｋ％Ｂ１、ｋｌ、ｋ２およびＴは前記に同じで示される担体結合ヌクレオチドヌクレオシドを酸化し、ｄ）工程すの反応で反応されなかった遊離の５’−ＯＨ基を永久保護基によりマスクし、ｅ）その保護基Ａを離脱させ、り必要なら、ａ　ｘ　ｅの反応によりさらにヌクレオシドホスホネートまたはオリゴヌクレオシドホスホネート単位を導入させ、Ｖそのヌクレオシド−担体結合を開裂させ、所望により、得られたオリゴヌクレオシドホスホネート中の全保護基を離脱させることを特徴とする方法。