CN103172681A - 合成和纯化寡聚物的新方法 - Google Patents
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Abstract
用于寡核苷酸合成或纯化的试剂，其中所述试剂具有结构：X-C-L-H(式A)其中X是亚磷酰胺基、H-膦酸酯基、缩醛基、或异氰酸酯；C-是直接的键或者由-Ca-Cb-表示的可裂解的接头；L是烃基链；并且H为端基炔或活化的环辛炔。式(A)的试剂可以用于合成和纯化寡核苷酸。
Description
发明背景
发明领域
本发明总体上涉及寡核苷酸的试剂、合成和纯化领域。
背景技术
寡核苷酸是短链核酸聚合物，典型地含有几个至几百个核苷酸。它们是基因组研究和生物技术的重要工具。虽然寡核苷酸可以通过较长前体的分裂产生，但是现在它们更通常是由单体以序列特异性的方式合成。它们典型地是在固体载体上使用亚磷酰胺化学或磷酸酯化学合成。
图1A显示了一个使用亚磷酰胺的固相寡核苷酸合成的典型合成循环。四个主要步骤包括：1)脱三苯甲基化；2)偶联；3)封端；和4)氧化。如图1中所示，第一核苷酸被化学键合到固体载体(例如，可控孔度玻璃珠(controlled pore glass bead))上。这些可以以预键合到固体载体上的第一核苷酸的形式从商业来源购买。
要启动合成，使用温和的酸(例如，惰性溶剂如二氯甲烷或甲苯中2％或3％的三氯乙酸)将第一核苷酸的5′-羟基的保护基团(常用的5′-羟基的保护基团是三苯甲基(即，-C(Ph)3)或4，4′-二甲氧基三苯甲基，其可以缩写为DMT，DMTr)除去。然后，将具有3’-亚磷酰胺基团(例如，3′-O-(2-氰乙基-N-N-二异丙基)亚磷酰胺)的5′-DMTr保护的第二核苷酸偶联到固体载体上的第一核苷酸上游离的5′-羟基基团上。该偶联可以通过使用酸性唑催化剂(例如，1H-四唑)在乙腈中活化亚磷酰胺而实现。然后将活化的亚磷酰胺与游离的5′-羟基反应，以形成亚磷酸三酯链接(linkage)。
因为偶联反应的效率永远不会是100％，所以一些游离的5′-羟基将会保留。使用乙酸酐和酰化催化剂(例如N-甲基咪唑)将任何未反应的5′-羟基封端，以防止失败序列(failure sequence)在下一个循环中反应。封端之后，将亚磷酸三酯氧化，从而将它转化成磷酸酯链接。氧化可以用碘在弱碱(例如吡啶)的存在下完成。这些步骤完成了第一偶联循环。所述方法可以重复多个循环直到合成了期望的寡核苷酸。
类似的方法在图1B中示出，其使用了H-膦酸酯单体代替亚磷酰胺。除了仅需要一个氧化步骤并且是在合成结束时进行之外，大部分步骤是类似的。
在链延长完成时，寡核苷酸仍附着在固体载体上并且完全被保护。为了提供功能性的寡核苷酸，需要除去保护基团并且需要将寡核苷酸产物从固体载体上释放。这些可以使用碱溶液(例如氢氧化铵或甲胺水溶液)以及可能的其它预处理步骤(例如2-氰乙基保护基团的脱保护)完成。
上述合成步骤可用于DNA或RNA寡聚物的合成。然而，对于RNA的合成，2’-羟基需要用耐受反应条件的基团进行保护。典型的2’-羟基的保护基团包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)。
通常，偶和步骤不会100％完成。未完成的反应导致短链体(short-mer)的形成。如上提到的，短链体典型地使用试剂例如乙酸酐进行封端，以防止它们在反复的固相合成中生长。这通常导致产生寡聚物池，所述寡聚物池由短链体(n-1、n-2、n-3等聚体)和期望的全长产物组成。图2的(A)和(B)分别显示了HPLC色谱和PAGE分析，以证明产物是含有一些失败序列的混合物的事实。
来自寡核苷酸合成的产物总是含有失败序列(较短的寡核苷酸，大部分是n-1聚体)。传统上使用HPLC或硅胶电泳例如PAGE纯化这些粗产物。虽然这些方法对于纯化短寡核苷酸是可以接受的，但是对于纯化较长的寡核苷酸(例如50-300聚体)却是不能接受的。另外，这些方法可能是昂贵并且耗时的，可能消耗大量的溶剂并且可能仅限于熟练的的专业人员使用。
为了促进寡核苷酸的合成和纯化，已经发明了替代的方法，例如使用合成纯化处理以绕过HPLC或PAGE的使用。这些替代方法的例子包括亲氟萃取(Belier，C.；Bannwarth，W.，Noncovalent Attachment of Nucleotides byFluorous-Fluorous Interactions：Application to a simple Purification Principlefor Synthetic DNA Fragments，Helv.Chim.Acfa2005，88，第171-179页；WO2006/081035A2)，生物素-抗生物素蛋白实现的亲和萃取(Fang，S.；Bergstrom，D.E.，Reversible Biotinylation of the 5′-Terminus ofOIigodeoxyribonucleotides and its Application in Affinity Purification，CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，John Wiley & Sons，Inc.2001；Fang，S.；Bergstrom，D.E.，Reversible5′-endBiotinylation and Affinity Purification ofSynthetic RNA，Tetrahedron Letters2004，45(43)，7987-7990)，以及通过Diels-Alder(WO2003/062452A2)和聚合(美国专利公布No.2008/0081902AI)的基于反应的萃取方法。
基于亲和的方法(即，氟亲和萃取和生物素-抗生物素蛋白方法)需要复杂的合成以产生带标记的寡核苷酸把手(handle)，这可能是昂贵的。在氟亲和萃取的情况下，含氟磷酸化试剂偶联得太慢而不用作长链寡核苷酸合成的封端试剂。对于作为最后单体的用途来说，5’-DMTr氟修饰的亚磷酰胺单体微溶于乙腈，偶联得慢且低效。它们还需要最终的酸性处理，这可能会导致脱嘌呤化并且影响长链寡核苷酸的完整性。这种方法还需要氟相亲和柱，其增加了复杂性和成本，并且可能不适于高通量或大规模纯化。
生物素-抗生物素蛋白实现的亲和萃取还没有广泛地使用，并且从未用作封端试剂来诱捕失败序列。因为生物素本身的成本，制造生物素磷酸化试剂或者5’修饰的亚磷酰胺单体是昂贵的。此外，生物素亚磷酰胺(磷酸化试剂和单体)不是特别溶于乙腈并且推荐的偶联时间较慢(即约15分钟)。因此，它们不适于作为封端试剂。另外，这些方法还没有显示出适用于长链寡核苷酸。同时，这些方法依赖于生物素对链霉亲和素珠子的亲和力，这在高通量或大规模平台上是昂贵的。
由于基于亲和的方法的成本和其它问题，人们已经试验了代替的方法，例如基于反应的方法。这些方法包括使用Diels-Alder和聚合的那些方法。在Diels-Alder方法中，使用二烯磷酸化试剂封端截短的序列，所述序列然后可能通过与含顺丁烯二酰亚胺的固体载体的4+2环加成而被拉出产物混合物。在实践中，这种方法仅限于纯化短链寡核苷酸(小于20聚体)并且由于低效的反应最终产率和纯度较低。
试剂封端截断的(失败的)序列。在完成合成之后，引发自由基聚合以形成聚合物，其然后可以与全长产物分离。丙烯酰胺亚磷酰胺单体也已经被用作链中的最后的核苷酸，并且全长产物可以通过自由基聚合而被诱捕，由此将它们与短链聚体分离，所述短链聚体中不含有丙烯酰胺部分。再一次地，这种方法对于(例如小于20聚体的)短链寡核苷酸是可行的，但是担心自由基聚合可能由于侧链反应的原因改变期望的寡核苷酸的完整性。此外，对期望的全长产物的总体纯化和回收也低于最佳水平。因此，这种方法可能不适于高通量纯化或大规模生产。
虽然这些现有技术的方法适用于一些情况，但是仍然需要更好的用于合成和纯化寡核苷酸的方法。
发明概述
本发明的一个方面涉及用于寡核苷酸合成或纯化的试剂，其中所述试剂具有如下结构：
X-C-L-H(式A)
其中，
X是能够与核苷、核苷酸、寡核苷酸等上的5’-羟基反应以形成稳定键合的官能团，所述键合能够耐受寡核苷酸合成中反复的核苷酸偶联循环、脱保护和裂解反应；适宜的X官能团可以包括亚磷酰胺、H-膦酸酯、缩醛、异氰酸酯等。
C是直接的键(direct bond)或者可裂解的接头，其中所述可裂解的接头由-Ca-Cb-表示，其中Ca与X连接并且是直接的键、烃基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、核苷，其各自任选地被一至两个取代基所取代，所述取代基选自卤素、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的键、硅烷基、三苯基或邻位(vicinyl)醇基。优选的Ca是直接的键、(C1-C12)烃基、(C6-C12)芳基、5至12元杂芳基、(C3-C12)环烷基、4至12元杂环基、核苷；
L是烃基链，其可以任选地被一至四个取代基所取代，所述取代基独立地选自由以下组成的组：5至9元杂芳基、4至9元杂环基、氨基、醚基、羧基、氨基甲酰基、(C6-C12)芳基、-O-R”、-O-CO-R”、-NR’-R”、-NR’-CO-R”、-CO-NR’-R”、-CO-R”、-CN、卤素或它们的组合，其中R’和R”独立地为H或(C1-C6)烃基；优选地L为烃基例如(C1-C12)烷基、(C2-C12)烯基或(C2-C12)炔基，其各自可以任选地被一至两个取代基所取代，所述取代基选自氨基、醚基、羧基、氨基甲酰基或卤素。
或者L可以为其中插入了其它原子的烃基链，如-(CHR’)a-Wb-(CHR’)c-Vd-(CHR’)e-所示，其中W和V独立地为-O-、-S-或-NR’-；R’为H或(C1-C6)烷基；并且a、b、c、d和e独立地为0至10的整数，优选为0至6，或者优选为0至3，并且a、b、c、d和e的和优选为2至6的整数。
并且H是“点击把手(click handle)”，其如上所定义并且可以包括端基炔或活化的环辛炔。
本发明的一个方面涉及活化的环辛炔化合物。根据本发明的一个实施方式，活化的环辛炔化合物具有式(I)所示结构。
其中Y是连接官能团，选自-O-、-S-、-NR’-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-NH-CO-NH-，其中R’是氢或低级烷基(例如，(C1-C3)烷基或(C1-C6)烷基)；X、C和L如上文定义。
本发明的一个方面涉及式(I)的化合物，其中X包括亚磷酰胺。这些化合物具有如下式(II)的一般结构：
式II
其中连接基(linker)L、C和Y如上所定义并且R是(C1-C6)烷基或氰乙基。亚磷酰胺基团可以与羟基反应以形成磷酸酯链接，其在寡核苷酸的合成和脱保护条件下是稳定的。
本发明的一个方面涉及式(I)的化合物，其中X包括H-膦酸酯。这些化合物具有式(III)所示的一般结构：
式III
其中连接基L、Y、C和R如上所定义。H-膦酸酯基团可以与羟基反应以形成磷酸酯链接，其在寡核苷酸的合成和脱保护条件下是稳定的。
本发明的一个方面涉及式(I)的化合物，其中X包括异氰酸酯基。这些化合物具有式(IV)所示的一般结构：
其中连接基L、Y和C如上所定义。所述氰酸酯基团可以与羟基反应以形成氨基甲酸酯连接基，其在寡核苷酸的合成和脱保护条件下是稳定的。
本发明的一个方面涉及具有如下结构的式(II)化合物：
(化合物1)
(化合物3)
本发明的一个方面涉及合成多核苷酸的方法。根据本发明一个实施方式的方法可以包括如下步骤：
(a)对固体载体上的寡核苷酸的5’-羟基保护基团脱保护，以产生固体载体上的寡核苷酸的游离的5’-羟基；
(b)将含有5’-羟基保护基团的核苷酸单体通过核苷酸单体上的3’-含磷基团(3’-phosporuous containing group)偶联到固体载体上寡核苷酸的游离5’-羟基上；
(c)使用式(A)的试剂封端固体载体上寡核苷酸的未反应的5’-羟基；和
(d)将步骤(a)-(c)重复选定的次数以制备固体载体上的中间体多核苷酸。
本发明的一些实施方式可以进一步包括步骤：
(e)对中间体多核苷酸上的5’-羟基保护基团脱保护；和
(f)将最终的核苷酸单体偶联到中间体多核苷酸上以制备最终的多核苷酸。
本发明的一些实施方式可以进一步包含如下步骤：
(g)将最终的多核苷酸脱保护并且从固体载体上裂解，以制备产物混合物；
(h)将产物混合物的溶液与含叠氮化物的固体载体或含硝酮的固体载体反应；和
(i)将含多核苷酸的溶液与含叠氮化物或含硝酮的固体载体分离。
根据本发明的另一个实施方式的多核苷酸合成方法可以包括如下步骤：
(a)对固体载体上的寡核苷酸的5’-羟基保护基团脱保护以产生固体载体上的寡核苷酸的游离的5’-羟基；
(b)将含有5’-羟基保护基团的核苷酸单体通过核苷酸单体上的3’-含磷基团偶联到固体载体上寡核苷酸的游离5’-羟基上；
(c)使用封端试剂封端固体载体上寡核苷酸的未反应的5’-羟基；和
(d)将步骤(a)-(c)重复选定的次数以制备固体载体上的中间体多核苷酸；
(e)对中间体多核苷酸上的5’-羟基保护基团脱保护；和
(f)将最终的核苷酸单体偶联到中间体多核苷酸上以制备最终的多核苷酸，其中所述最终的核苷酸单体含有式(A)的试剂。
本发明的一些实施方式可以进一步包括步骤：
(g)将最终的多核苷酸脱保护并且从固体载体上裂解，以制备产物混合物；
(h)将产物混合物的溶液与含叠氮化物的固体载体或含硝酮的固体载体反应，以制备键合在固体载体上的全长多核苷酸；和
(i)将键合到含叠氮化物或含硝酮的固体载体上的全长多核苷酸分离。
所述方法可以进一步包括从含叠氮化物或含硝酮的固体载体上释放全长多核苷酸。本发明的一些实施方式可以进一步包括纯化所释放的全长多核苷酸。
本发明的其它方面和优点在如下说明书和所附权利要求书中阐明。
附图简述
图1A显示了在固体载体上合成多核苷酸的常规亚磷酰胺方法。所述方法包括四个步骤：脱保护；偶联；封端和氧化。图1B显示了在固体载体上合成多核苷酸的常规的H-膦酸酯方法。
图2的(A)显示了根据本发明一个实施方式的活化的环辛炔试剂；图2的(B)显示了一个示意图，说明了使用图2的(A)中试剂的合成和纯化多核苷酸的本发明的方法。
图3的(A)显示了根据本发明一些实施方式的两种活化的环辛炔试剂；图3的(B)显示了一个示意图，说明了使用图3的(A)中试剂的合成和纯化多核苷酸的本发明的方法。
图4显示了一个示意图，说明了根据本发明一个实施方式的使用端基炔或活化的环辛炔试剂作为封端试剂的寡核苷酸合成循环。
图5显示了一个示意图，说明了根据本发明一个实施方式的使用端基炔或活化的环辛炔试剂作为最后的核苷酸或者作为末端5’-羟基的保护试剂的寡核苷酸合成循环。
图6显示了三幅图，其显示了三种寡核苷酸对采集时间的响应。
发明详述
本发明的实施方式涉及新型端基炔或活化的环辛炔试剂以及用于合成和纯化寡核苷酸的方法。新型端基炔或活化的环辛炔试剂可以包括如下官能团，所述官能团与羟基反应形成在合成和脱保护多核苷酸的条件下稳定的键。官能团可以包括亚磷酰胺基团、H-膦酸酯基团、缩醛基团或异氰酸酯基团。本发明的方法使用新型端基炔或活化的环辛炔试剂和“点击”化学(“click”chemistry)以促进寡核苷酸产物的纯化。虽然本发明的实施方式对相对长的寡核苷酸(例如50聚体或更长的)是最有利的，但是本领域技术人员明白，本发明实施方式的有益效果可以通过任何寡核苷酸实现，包括短链寡核苷酸。
“多核苷酸”、“寡核苷酸”或“核酸”是指含有通过核苷酸间键(internucleotide bond)连接的多个核苷片段亚单元或核苷残基的化合物。同样它也是指含有多个核苷酸片段亚单元或核苷酸残基的化合物。
“核苷单体”是不属于多核苷酸部分的核苷。核苷单体也可以含有核苷单体预计用途所需的基团。核苷单体可以是游离的或者附着于固体载体上。例如，具有杂环碱基保护基团和一个或多个羟基保护基团的核苷单体可以是核苷酸单体合成中的合成中间体。例如，核苷单体可以附着于用于合成多核苷酸的固体载体。
术语“核苷”和“核苷酸”意图包括下述部分，所述部分不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，而且包括经修饰的其它杂环碱基或核碱基(nucleobases)。这样的修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰基化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖或其它杂环。这样的修饰包括，例如，二氨基嘌呤及其衍生物、肌苷及其衍生物、烷基化的嘌呤或嘧啶、酰基化的嘌呤或嘧啶、硫醇化的嘌呤或嘧啶等等，或者保护基团例如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、9-芴基甲氧基羰基、苯氧基乙酰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒、N，N-二苯基氨基甲酸酯、取代的硫脲等等的添加。嘌呤或嘧啶碱基也可以为以上的类似物；适宜的类似物是本领域技术人员已知的并且描述在相关的正文和文献中。通常的类似物包括但不限于：1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫代-N6-异戊基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴代腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、8-溴代鸟嘌呤、8-氯代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫代鸟嘌呤、5-氟代尿嘧啶、5-溴代尿嘧啶、5-氯代尿嘧啶、5-碘代尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨基乙基)尿嘧啶、5-(羧基甲基氨基甲基)尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(2-溴代乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、辫苷(queosine)、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫代嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。
此外，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有常规核糖和脱氧核糖和常规立体异构体而且也含有其它糖的片段，所述其它糖包括L对映异构体和α端基异构体。经修饰的核苷或核苷酸还包括在糖片段上的修饰，例如，其中一个或多个羟基被替换为卤素原子或脂肪基团，或者被官能化为醚、胺等。“类似物”是指具有下述结构特征的分子，所述结构特征在文献中被认作是类似体(mimetics)、衍生物、具有类似的结构或其它类似的术语，并且包括，例如，引入非天然(自然中不常见的)核苷酸的多核苷酸或寡核苷酸，非天然核苷酸类似体例如2’-修饰的核苷，包括但不限于2’-氟代、2’-O-烷基、O-烷基氨基、O-烷基烷氧基、受保护的O-烷基氨基、O-烷基氨基烷基、O-烷基咪唑以及式(O-烷基)m的聚醚例如直链和环状聚乙二醇(PEGs)和含(PEG)的基团，锁定的核酸(LNA)，肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、寡核苷膦酸酯以及具有增加的取代基团例如保护基团或连接基团的任意多核苷酸。
术语“亚磷酰胺基团”是指包含结构-P(OR13)(NR14R15)的基团，其中R13、R14和R15各自独立地为烃基、取代的烃基、杂环、取代的杂环、芳基或取代的芳基。在一些实施方式中，R13、R14和R15可以选自低级烷基、低级芳基、以及取代的低级烷基和低级芳基(优选被含有至多18、16、14、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碳的结构取代)。在一些实施方式中，R13是2-氰乙基或甲基，并且R14和R15中的一个或两个为异丙基。R14和R15可以任选地环状连接在一起。
术语“H-磷酸酯”是指包含结构-P(O)(H)(OR16)的基团，其中R16是H、酰基、取代的酰基、烃基、取代的烃基、杂环、取代的杂环、芳基或取代的芳基。在一些实施方式中，R16可以选自低级烷基、低级芳基和取代的低级烷基和低级芳基(优选被含有至多18、16、14、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碳的结构取代)。在一些实施方式中，R16是三甲基乙酰基(pivaloyl)或金刚烷酰基(adamantoyl)。
除了另有指明以外，本文所使用的术语“烷基”是指1-24(即，(C1-C24)烷基)，典型地为1-12(即，(C1-C12)烷基)个碳原子，更典型地为1-6个碳原子(即，(C1-C6)烷基)的饱和的直链、支链或环状烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。术语“低级烷基”意指一至六个碳原子的烷基，并且包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。术语“环烷基”是指环烷基基团例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。
“亚烷基”和“亚烷基链”是指直链或支链的二价烃链，其将分子的剩余部分连接到原子团(radical group)上，仅由碳和氢组成，不含有不饱和的部分并且具有一至十二个碳原子，优选具有一至八个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基等。亚烷基链可以通过链中的一个碳或者通过链中的任意两个碳连接到原子团上和附着于分子的剩余部分上。
而且，术语“烷基”包括“经修饰的烷基”，其是指具有一至二十四个碳原子的烷基，并且进一步具有额外的基团，例如一个或多个选自醚-、硫代-、氨基-、磷酸基-、氧代-、酯-、和胺基-的连接基，和/或被一个或多个额外的基团取代，所述额外的基团包括低级烷基、芳基、烷氧基、硫代烷基、羟基、氨基、磺酰基、硫代基、巯基、亚氨基、卤素、氰基、硝基、亚硝基、叠氮化物、羧基、硫化物、砜、硫氧基、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基和硼基。
类似地，术语“低级烷基”包括“经修饰的低级烷基”，其是指下述基团，所述基团具有一至八个碳原子，并且进一步具有额外基团例如一个或多个选自醚-、硫代-、氨基-、磷酸基-、酮-、酯-、和胺基-的连接基，和/或被一个或多个基团取代，所述基团包括低级烷基、芳基、烷氧基、硫代烷基、羟基、氨基、磺酰基、硫代基、巯基、亚氨基、卤素、氰基、硝基、亚硝基、叠氮化物、羧基、硫化物、砜、硫氧基、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基和硼基。本文使用的术语“烷氧基”是指取代基-O-R，其中R是如上所定义的烷基。术语“低级烷氧基”是指其中R是低级烷基的基团。本文所使用的术语“硫代烷基”是指取代基-S-R，其中R为如上所述的烷基。
除了另有指明之外，本文所使用的术语“烯基”是指含有至少一个双键的、2-24(即，(C2-C24)烯基)，典型地为2-12(即，(C2-C12)烯基)个碳原子，更典型地为2-6个碳原子(即，(C2-C6)烯基)的支链、非支链或环状(例如，在C5和C6的情况下)烃基，例如乙烯基、乙烯基、烯丙基、辛烯基、癸烯基等。术语“低级烯基”意指两到八个碳原子的烯基，并且特别包括乙烯基和烯丙基。术语“环烯基”是指环状烯基。
“亚烯基”和“亚烯基链”是指直连或支链二价烃基链，其将分子的剩余部分连接到原子团上，仅由碳和氢组成，含有至少一个双键并且具有二至十二个碳原子，例如，亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚烯基链通过单键连接到分子的剩余部分并且通过双键或单键连接到原子团。亚烯基链与分子剩余部分和与原子团的连接点可以通过链中的一个碳或任意两个碳。
除了另有指明之外，本文所使用的术语“炔基”是指2至24个，典型地2至12个碳原子的含有至少一个三键的支链或非支链烃基，例如乙炔基(acetylenyl)、乙炔基、正丙炔基、异丙炔基、正丁炔基、异丁炔基、叔丁炔基、辛炔基、癸炔基等。术语“低级”炔基意指二至八个碳原子的炔基基团，并且包括，例如，乙炔基和丙炔基，术语“环炔基”是指环状炔基基团。
术语“烃基”是指烷基、亚烷基、烯基、亚烯基或炔基。烃基基团中的碳原子数目可以标注为例如“(C1-C12)烃基”，其表示含有1至12个碳原子的烃基。具有不同碳原子数的烃基可以由类似的形式所指示。术语“取代的烃基”是指具有下述取代基的烃基片段，所述取代基替换烃基主链的一个或多个碳上的氢。这样的取代基可包括，例如，烃基、卤素、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫代酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、膦酸酯基、亚膦酸酯基、氨基、酰胺基、脒基、亚胺基、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基、或芳香或杂芳基片段。本领域技术人员将会理解，如果合适的话，烃链上被取代的片段自身可以被取代。例如，被取代的烷基的取代基可以包括被取代和未取代形式的氨基、叠氮基、亚氨基、酰胺基、磷酰基(包括膦酸酯基和亚膦酸酯基)、磺酰基(包括硫酸酯基、磺酰胺基、氨磺酰基和磺酸酯基)和甲硅烷基、以及醚、烷硫基、羰基(包括酮基、醛基、羧酸基和酯基)、-CN等。环烷基可以进一步被烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CN等取代。
术语“烷氧基”意思是与氧连接的烷基并且可以由式R-O-所表示，其中R表示如上所定义的烷基。例子是甲氧基CH3O-。术语“(C1-C6)烷氧基”是指如上所定义的含有一至六个碳原子的烷氧基。含有不同碳原子数目的烷氧基将以类似的形式表示，例如，(C1-C3)烷氧基、(C1-C12)烷氧基、(C3-C12)烷氧基等。
“芳基”是指芳香族的单环或多环(其中一些可以稠合在一起)的烃环系统，其仅由氢和碳组成，并且含有6至19个碳原子(由(C6-C19)芳基表示)，优选6至10个碳原子(由(C6-C10)芳基表示)，其中环系统可以部分或完全饱和。芳基包括但不限于如下基团，例如，芴基、苯基和萘基。除非说明书中另有指明，术语“芳基”意图包括任选地被一个或多个取代基取代的芳基，所述取代基选自(C1-C12)烃基、-O-R″、-O-CO-R″、-CO-O-R″、-NR′-R″、-NR′-CO-R″、-CO-NR′-R″、-CO-R″、-R-O-R″、-R-O-CO-R″、-R-CO-O-R″、-R-NR′-R″、-R-NR′-CO-R″、-R-CO-NR′-R″、-R-CO-R″、-CN、卤素或其组合，其中R′和R″独立地为H或(C1-C12)烃基，并且R是(C1-C12)烃基。
“杂芳基”是指5-至18-元的单环或双环或稠合的多环系统，其是由碳原子和一至五个选自氮、氧和硫的杂原子组成。优选的杂芳基是5-至12-或5-至9-元环系统。为了本发明的目的，杂芳基基团可以是单环的、双环的、三环的或四环的系统，其可以包括稠环或桥环系统；杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地为季铵化的。例子包括但不限于吖庚因基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并噻二唑基、苯并萘呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二氧杂环基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并三唑基、苯并[4，6]咪唑并[1，2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、吲嗪基、异噁唑基、二氮杂萘基、噁二唑基、2-氧代吖庚因基、噁唑基、环氧乙烷基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、二氮杂萘基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和苯硫基。除非说明书中另有指明之外，术语“杂芳基”意图包括如上所定义的杂环基团，其任选地被一个或多个取代基取代，，所述取代基选自(C1-C12)烃基、-OR″、-O-CO-R″、-CO-O-R″、-NR′-R″、-NR′-CO-R″、-CO-NR′-R″、-CO-R″、-R-O-R″、-R-O-CO-R″、-R-CO-O-R″、-R-NR′-R″、-R-NR′-CO-R″、-R-CO-NR′-R″、-R-CO-R″、-CN、卤素或其组合，其中R′和R″独立地为H或(C1-C12)烃基，并且R是(C1-C12)烃基。
术语“杂芳基”还指其中杂芳环稠合到一个或多个芳基、脂环族或杂环基环上的基团，其中基团或附着的点是在杂芳环上的。非限制性例子包括但不限于1-，2-，3-，5-，6-，7-或8-吲嗪基、1-，3-，4-，5-，6-或7-异吲哚基、2-，3-，4-，5-，6-或7-吲哚基、2-，3-，4-，5-，6-或7-吲唑基、2-，4-，5-，6-，7-或8-嘌呤基、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-或9-喹嗪基、2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-喹啉基、1，3-，4-，5-，6-，7-或8-异喹啉基、1-，4-，5-，6-，7-或8-二氮杂萘基、2-，3-，4-，5-或6-萘啶基、2-，3-，5-，6-，7-或8-喹唑啉基、3-，4-，5-，6-，7-或8-噌啉基、2-，4-，6-或7-蝶啶基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-4aH咔唑基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-咔唑基、1-，3-，4-，5-，6-，7-，8-或9-咔啉基、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-，9-或10-菲啶基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-或9-吖啶基、1-，2-，4-，5-，6-，7-，8-或9-嘧啶基(perimidinyl)、2-，3-，4-，5-，6-，8-，9-或10-菲啰啉基(phenathrolinyl)、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-或9-吩嗪基，1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-，9-或10-吩噻嗪基、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-，9-，或10-吩噁嗪基、2-，3-，4-，5-，6-或1-，3-，4-，5-，6-，7-，8-，9-或10-苯并异喹啉基(benzisoqinolinyl)、2-，3-，4-或噻吩并[2，3-b]呋喃基、2-，3-，5-，6-，7-，8-，9-，10-或11-7H-吡嗪并[2，3-c]咔唑基、2-，3-，5-，6-或7-2H-呋喃并[3，2-b]-吡喃基、2-，3-，4-，5-，7-或8-5H-吡啶并[2，3-d]-邻-噁嗪基、1-，3-或5-1H-吡唑并[4，3-d]-噁唑基、2-，4-，或54H-咪唑并[4，5-d]噻唑基、3-，5-或8-吡嗪并[2，3-d]哒嗪基、2-，3-，5-或6-咪唑并[2，1-b]噻唑基、1-，3-，6-，7-，8-或9-呋喃并[3，4-c]噌啉基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，8-，9-，10或11-4H-吡啶并[2，3-c]咔唑基、2-，3-，6-或7-咪唑并[1，2-b][1，2，4]三嗪基，7-苯并[b]噻吩基、2-，4-，5-，6-或7-苯并噁唑基、2-，4-，5-，6-或7-苯并咪唑基、2-，4-，4-，5-，6-或7-苯并噻唑基、1-，2-，4-，5-，6-，7-，8-或9-苯并噁嗪基(benzoxapinyl)、2-，4-，5-，6-，7-或8-苯并噁嗪基，1-，2-，3-，5-，6-，7-，8-，9-，10-或11-1H-吡咯并[1，2-b][2]苯并吖庚因基(benzazapinyl)。典型的稠合杂芳基团包括，但不限于2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-喹啉基、1-，3-，4-，5-，6-，7-或8-异喹啉基、2-，3-，4-，5-，6-或7-吲哚基、2-，3-，4-，5-，6-或7-苯并[b]噻吩基、2-，4-，5-，6-或7-苯并噁唑基、2-，4-，5-，6-或7-苯并咪唑基、2-，4-，5-，6-或7-苯并噻唑基。
“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳香族单环或双环烃基，其具有三至十五个碳原子，优选具有三至十二个碳原子，(C3-C12)环烷基，并且其是包含或未饱和的，并且通过单键附着于分子的剩余部分，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、十氢化萘基(decalinyl)等。除非说明书中另有指明，术语“环烷基”意图包括环烷基基团，其任选地被一个或多个取代基所取代，所述取代基选自-O-R″、-O-CO-R″、-CO-O-R″、-NR′-R″、-NR′-CO-R″、-CO-NR′-R″、-CO-R″、-CN、卤素或其组合，其中R′和R″独立地为H或(C1-C12)烃基。
“杂环基”或“杂环”是指任选地被取代的、饱和或部分不饱和的、非芳香环基，例如，其是4-至7-元单环、7-至12-元双环或10-至15-元三环系统，其在至少一个含碳原子环上具有至少一个杂原子。杂环基团含有杂原子的每个环可以具有1、2、3或4个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，其中氮和硫杂原子也可以任选地被氧化。杂环基团可以在杂原子或碳原子上连接。如果所产生的化合物是稳定的，则本文所述的杂环可以在碳或氮原子上被取代。如果具体指明，杂环中的氮可以任选地被季铵化。优选的，当杂环中S和O原子的总数超过1时，这些杂原子不是彼此相邻的。双环和三环的杂环基团可以是稠环或螺环(spiro rings)或是环基(ring groups)。优选杂环是4-至12-元环系统。同时，优选的杂环是4-至9-元环系统。
示例性的单环杂环基团包括氧杂环丁基(oxetanyl)、硫杂环丁烷基(thiatanyl)、氮杂环丁烷基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢噻吩基、四氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡唑基、四氢吡唑基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、二氢硫代吡喃基、四氢硫代吡喃基、吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、噻喃基、二氢噻喃基、四氢噻喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吖庚因基、二氢吖庚因基、四氢吖庚因基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代吖庚因基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基；二氢硫杂环庚烷基(dihydrothiepinyl)、四氢硫杂环庚烷基(tetrahydrothiepinyl)、二氢二苯噁庚英基(dihydrooxepinyl)、四氢二苯噁庚英基、1，4-二噁烷基、1，4-氧硫杂环己基、吗啉基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑啉基、A-哌啶酮基、异噁唑啉基、异噁唑基、1，4-氮硫杂环己烷基(azathianyl)、1，4-噁噻喃基、1，4-噁吖庚因基、1，4-二噻喃基、1，4-thieaxepanyl、1，4-吖庚因基、托烷基、3，4-二氢-2H-吡喃基、5，6-二氢-2H-吡喃基、噻唑烷基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、1，3-二氧戊环和四氢-1，1-二氧代噻吩基、1，1，4-三氧代-1，2，5-噻二唑烷-2-基、吡唑啉基等。
示例性的双环杂环基团包括但不限于，二氢吲哚基、奎宁环基(quinuctidinyl)、四氢喹啉基、十氢喹啉基、2-氧杂-6-氮杂螺[3，3]庚烷-6-基、四氢异喹啉基、十氢异喹啉基、二氢异吲哚基、吲哚基、降冰片烷基、金刚烷基等。
除非说明书另有指明之外，术语“杂环基”意图包括如上所定义的杂环基团，其任选地被一个或多个取代基所取代，所述取代基选自-O-R″、-O-CO-R″、-CO-O-R″、-NR′-R″、-NR′-CO-R″、-CO-NR′-R″、-CO-R″、-CN、卤素或其组合，其中R′和R″独立地为H或(C1-C12)烃基。
术语“卤素”和“卤”是指氟、氯、溴或碘片段。
术语“缩醛”具有其化学中的通常含义并且具有如下结构式：R-CH(OR’)2，其中R’是烷基。缩醛的例子包括R-CH(OCH3)2和R-CH(OCH2CH3)2。
术语“三苯甲基”是指-C(Ph)3或4，4-二甲氧基三苯甲基，其可以缩写为DMT或DMTr，或者在一个或多个芳环上具有一个或多个取代基的类似的C(Ph)3或DMT。
术语“异氰酸酯”以其通常意思使用。异氰酸酯具有通式：R-N＝C＝O，其中R是分子剩余部分的残基。异氰酸酯可以与醇反应形成氨基甲酸酯，其对寡核苷酸合成中重复的偶联和脱保护条件是稳定的。
术语“直接的键”意思是通过所述“直接的键”连接的两个实体彼此之间直接相连。
术语“RNA”或“核糖核酸”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的多核苷酸或寡核苷酸。
如本文所使用的，“点击化学”或“点击反应”是指一类反应，所述反应非常高效和有选择性，并且可以用于以高产率将分子连接在一起，如最开始由Sharpless和其同事在2001年所述(参见以下描述)。“点击反应”典型地涉及端基炔或活化的炔类似物(例如活化的环辛炔)和叠氮化物或硝酮。
如本文所使用的，“点击把手”是指能够参与“点击反应”的基团。“点击把手”是端基炔(-C≡CH)或活化的环辛炔，其可以任选地含有与分子其它部分的短链接，并且可以任选地被取代基团所取代。所述短链接可以是亚烷基(例如，(C1-C6)亚烷基)、亚烯基(例如，(C2-C6)亚烯基)、亚炔基(例如，(C2-C6)亚炔基)、-O-、-S-、-NR′-、-CO-NR′-、-NR′-CO-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-或其组合，其中R′为H或(C1-C6)烷基。所述任选的取代基团可以是-O-R″、-O-CO-R″、-NR′-R″、-NR′-CO-R″、-CO-NR′-R″、-CO-R″、-CN、卤素或其组合，其中R′和R″独立地为H或(C1-C6)烷基。
术语“活化的环辛炔”是指通过具有一个或多个相邻的芳香环、具有一个或多个氟取代基(例如二氟代环辛炔)、或者具有一个或多个在环辛炔环上导致应力的环稠合物而被活化的环辛炔。所述能够在环辛炔环上导致应力的环稠合物典型地涉及小环，例如环丙基或环丁基环。这些不同的被活化的环辛炔是本领域已知的，如下所描述。
如本文所使用的，“连接基”桥连分子中的两个片段。“连接基”可以是烃基链(例如，(C1-C12)亚烷基，(C2-C12)亚烯基)，任选地被取代基团所取代，或者连接基可以是被其它原子插入的烃基链，由-(CHR’)a-Wb-(CHR’)c-Vd-(CHR’)e-所表示，其中W和V独立地为-O-、-S-或-NR’-；R’为H或(C1-C6)烷基；并且a、b、c、d和e独立地为0至10、优选0至6、或优选0至3的整数，并且a、b、c、d和e的和优选为2至6的整数。所述任选的取代基团可以是-O-R″、-O-CO-R″、-NR′-R″、-NR′-CO-R″、-CO-NR′-R″、-CO-R″、-CN、卤素或其组合，其中R′和R″独立地为H或(C1-C6)烃基。
如本文所用，“可裂解接头”是包含下述官能团的片段，所述官能团能用于分离式(A)：X-C-L-H中的“X”和“H”片段。“可裂解接头”包含可裂解基团，其选自硅烷基、三苯甲基、邻位醇、所述可裂解基团连接至烃基(例如，(C1-C12)烃基)、芳基(例如，(C6-C18)芳基)、杂芳基、环烷基(例如，(C3-C12)环烷基)或它们的组合。
此类“可裂解接头”的实例包括下文描述的化合物2中的5’-硅烷基-O-核苷基团，化合物4中的5’-三苯甲基-O-核苷基团，以及化合物3中的含邻位醇的降冰片酰亚胺基团(norboranyl imide group)。如化合物2中所示的硅烷基可用弱酸或氟化物裂解，这在本领域是熟知的。三苯甲基可用弱酸裂解，这在本领域是熟知的。如化合物3中所示的降冰片烷中的邻位醇(去除TBS保护基团后)将经历分子内转酯化/水解，以水解相邻的磷酸酯基。需要注意的是，“可裂解接头”可包括裂解后留在寡核苷酸上的核苷片段或类似片段。这些“可裂解接头”的实例示于化合物2和化合物4中。
“任选”或“任选地”意指随后描述的情况可能发生或不发生，使得所述描述包括所述情况发生的例子和所述情况不发生的例子。例如，短语“任选地被取代的”意指非氢取代基可以存在或不存在，由此所述描述包括其中存在非氢取代基的结构和其中不存在非氢取代基的结构。
K.Barry Charpless和其同事在2001年提出术语“点击化学”，用以指一类高效且选择性的反应，其能够用于容易地以高产率将分子连接在一起。(Kolb等人，“Click Cheistry：Diverse Chemical Function from a Few GoodReaction，”Ang.Chemie，Int’l Ed.，40，第2004-21页)。术语“点击”表示易于将分子断片接合在一起，就像将两片搭扣“咔嗒”地扣在一起一样。
在2002年，Sharpless和Meldal小组独立地证明了使用有机叠氮化合物和末端乙炔的铜催化的叠氮化物-炔环加成。(Rostovtsev等人，(2002)“A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process：Copper(I)-CatalyzedRegioselective‘Ligation’of Azides and Terminal Alkynes，”Ang.Chemie，Int’l Ed.，41，第2596-99页；Tornoe等人(2002)，“Peptidotriazoles onSolid Phase：[1，2，3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed1，3-DipolarCycloadditions if Terminal Alkynes ti Azides，”J.Organic Chem.，67，第3057-64页)。环状产物是1，4-取代的三唑。铜催化剂允许反应在室温下进行并且赋予区域选择性。然而，铜是细胞毒性的。因此，该反应不能用于许多情况中。据此，已经开发了不需要铜作催化剂的其它类型的叠氮化物-炔环加成。一种方法是通过引入环应力如环辛炔来增加炔的反应性。
Bertozzi是第一个描述在叠氮化物-炔环加成中使用环辛炔的人(Jewett和Bertozzi，“Cu-free click cycloaddition reactions in chemicalbiology”，Chem.Soc.Rev.，2010，39，1272-1279；并且将其引作本文的参考文献)。然而，相较于铜催化的反应，有机叠氮化合物和环辛炔之间的反应是缓慢的。为了解决这一问题，Bertozzi在固有乙炔的邻位添加了两个氟。新的二氟化的环辛炔(DIFO)与叠氮化合物以与标准的铜催化的环加成相当的速率进行反应。
另一种增加环辛炔的反应性的方法是在环辛炔环内部建立应力。例如，设计了侧翼是两个苯环的环辛炔，其中苯的芳香性增加了环应力。在另一种方法中，通过使环辛炔环与小环稠合而使环辛炔环活化。所有这些环辛炔通常将被称为“活化的”环辛炔，不论它们是被芳香环、氟活化或是被环应力活化。
根据本发明的实施方式，Cu(I)催化的和无Cu(I)的“点击”反应两者均可使用。这些反应的条件对本领域技术人员来说是熟知的，参见例如上文中所讨论的。
根据本发明的实施方式，可参与“点击”反应的试剂可用于寡核苷酸合成中，以利于多核苷酸产品的纯化。此类试剂包括端基炔或活化的环辛炔片段。活化的环辛炔片段可以包括通过具有侧翼芳香环、具有与三键相邻的氟取代或具有环应力(例如与环辛炔稠合的环丙烷环)而被活化的那些。
根据本发明的实施方式，可以使用端基炔和活化的环辛炔二者。端基炔和活化的环辛炔通常在本文中被称为“点击把手”。因此，本发明试剂的通式可如下表示：
X-C-L-H式(A)
其中
X为官能基团，其能够与核苷、核苷酸、寡核苷酸等上的5’-羟基反应；适合的X官能团可包括亚磷酰胺、H-磷酸酯、缩醛、异氰酸酯等，
C是直接的键或可裂解接头，其中可裂解接头由-Ca-Cb-表示，其中Ca与X连接并且是直接的键、烃基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、核苷，其中的每一个任选被一至两个取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的键、硅烷基、三苯甲基、或邻位醇基。优选Ca是直接的键、(C1-C12)烃基、(C6-C12)芳基、5-至12-元杂芳基、(C3-C12)环烷基、4-至12-元杂环基或核苷；
L是烃基链，其任选被一至四个取代基取代，所述取代基独立地选自由5-至9-元杂芳基、4-至9-元杂环基、氨基、醚、羧基、氨甲酰基、(C6-C12)芳基、-O-R″、-O-CO-R″、-NR′-R″、-NR′-CO-R″、-CO-NR′-R″、-CO-R″、-CN、卤素或它们的组合组成的组，其中R′和R″独立地为H或(C1-C6)烃基；优选地L为烃基，例如(C1-C12)烷基、(C2-C12)烯基或(C2-C12)炔基，其每一个任选地被一至两个取代基取代，所述取代基选自氨基、醚、羧基、氨甲酰基或卤素；
或者L可以是其中插入了其它原子的烃链，如-(CHR′)a-Wb-(CHR′)c-Vd-(CHR′)e-所表示的，其中W和V独立地为-O-、-S-或-NR′-；R′是H或(C1-C6)烷基；并且a，b，c，d和e独立地为0至10的整数，优选0至6，或优选0至3，并且a，b，c，d和e的和优选为2至6的整数。
H是如上所定义的“点击把手”，并且可包括端基炔或活化的环辛炔。
具有亚磷酰胺、连接基和“点击把手”的化合物的具体实例如下所示。在该实例中，式(A)中的“C”是直接的键。
在上式中，“点击把手”可为端基炔或活化的环辛炔。端基炔试剂的实例以及一般“活化的环辛炔”试剂如下所示。如上所述，“活化的环辛炔”可被芳香环、氟或稠合环应力活化。
尽管可以使用含有端基炔和活化的环辛炔二者的试剂，但是为清楚起见，以下描述可使用活化的环辛炔作为实例。特别地，以下描述将使用稠合环环辛炔(即应力化的环辛炔)作为实例。这些“应力化”的环辛炔在以下描述中可被通称为“活化的”环辛炔。然而，本领域技术人员应当理解，所述描述也可以应用于含端基炔的试剂或其它活化的环辛炔试剂。
本发明的具有活化的环辛炔的试剂可如式(B)的一般结构表示：
其中，m，n各自独立地为选自0至10的整数；R1-R8各自独立地选自H、卤素、硝基、酯、羧酸、醛、醚或氰基醚、吸电子基团、给电子基团、N(R′)(R″)、烷基、烯基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、双环基、CO-NR′R″、O-羟基烷基、O-羟基烯基、CO-烷氧基烯基，其中R′和R″各自为H或低级烷基(例如(C1-C6)烷基)；X、C和L如式(A)中定义并且Y是选自-O-、-S-、-NR′-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-NH-CO-NH-的链接官能团，其中R’为氢或低级烷基(例如，(C1-C3)烷基或(C1-C6)烷基)。
具有应力化的环辛炔的式(B)化合物的示例性试剂如式(I)所示：
其中虚线圈入的部分对应于式(A)中的H，其中Y是链接官能团，其选自-O-、-S-、-NR′-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-NH-CO-NH-，其中R′是氢或低级烷基(例如，(C1-C3)烷基或(C1-C6)烷基)；X、C和L如式(A)中定义。
根据本发明的一些实施方式，X可包括亚磷酰胺基、H-磷酸酯、缩醛基或异氰酸酯基。X的具体实例可包括缩醛(例如-CH(OR)2)、异氰酸酯(-N＝C＝O)、(2-氰乙基)-二异丙基亚磷酰胺(NC-(CH2)2-O-PO-N(iPr)2)和甲基-二异丙基亚磷酰胺、H-磷酸烷基酯等。
根据本发明的一些实施方式，C是-Ca-Cb-表示的可裂解接头，其中Ca连接至X并且是直接的键、(C1-C12)烃基、(C6-C12)芳基、5-至12-元杂芳基、(C3-C12)环烷基、4-至12-元杂环基、核苷，其各自任选地被一至两个取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的键、硅烷基、三苯甲基或邻位醇基。优选Ca是直接的键、(C1-C6)烃基、4-至12-元杂环基或核苷；Cb是直接的键、硅烷基或三苯甲基。
根据本发明的一些实施方式，L可由通式-(CH2)a-Wb-(CH2)c-Vd-(CH2)e-表示，其中W和V独立地为-O-、-S-或-NR’-，其中R’为氢或低级烷基(例如，(C1-C3)烷基或(C1-C6)烷基)；并且a，b，c，d和e独立地为0至10、优选0至6、或优选0至3的整数，并且a，b，c，d和e的和优选为2至6的整数。
根据本发明的一些实施方式，L是烃基，例如(C1-C12)烷基、(C2-C12)烯基或(C2-C12)炔基，其各自可任选地被选自氨基、醚、羧基、氨甲酰基或卤素的取代基取代。根据本发明的一些实施方式，L连接基优选为(C1-C12)烷基，更优选为(C1-C6)烷基。
根据本发明的一些实施方式，式(I)中的X是亚磷酰胺。这些化合物的实例具有式(II)的一般结构：
其中C、L和Y如上所定义并且R是(C1-C6)烷基或氰乙基。在本发明优选的实施方式中，L为(C1-C12)烷基，或更优选为(C1-C6)烷基，并且Y为-NH-CO-O-，C为-Ca-Cb-表示的可裂解接头，其中Ca连接至X并且是直接的键、(C1-C6)烃基、4-至12-元杂环基或核苷；Cb是直接的键、硅烷基或三苯甲基，并且R是氰乙基。
根据本发明的一些实施方式，式(I)中的X为H-膦酸酯。此类化合物的实例具有式(III)的一般结构：
其中C、L、Y和R如上所定义。在本发明优选的实施方式中，L为(C1-C12)烷基，或更优选为(C1-C6)烷基，Y为-NH-CO-O-，C为-Ca-Cb-表示的可裂解接头，其中Ca连接至X并且是直接的键、(C1-C6)烃基、4-至12-元杂环基或核苷；Cb是直接的键、硅烷基或三苯甲基，并且R是氰乙基。
根据本发明的一些实施方式，式(I)中的X为异氰酸酯基。此类化合物的实例具有式(IV)的一般结构：
其中L、Y和C如上所定义。在本发明优选的实施方式中，L为(C1-C12)烷基，或更优选为(C1-C6)烷基，Y为-NH-CO-O-，并且C为-Ca-Cb-表示的可裂解接头，其中Ca连接至X并且是直接的键、(C1-C6)烃基、4-至12-元杂环基或核苷；Cb是直接的键、硅烷基或三苯甲基。
式(II)化合物的一些代表性实例如下所示。本领域技术人员将能够理解，这些具体化合物仅用于阐述，这些化合物的其它改变和变形在不脱离本发明的范围的情况下也是可能的。
(化合物4)
化合物1是亚磷酰胺，其与羟基反应以形成亚磷酸酯。所述亚磷酸酯基团可被氧化为磷酸酯基团，例如在典型的寡核苷酸合成中的氧化步骤中被氧化。磷酸酯基团对于寡核苷酸合成中所用的重复偶合和脱保护是稳定的。此外，磷酸酯基团对于最终脱保护和从固体载体上裂解核苷酸是稳定的。因此，具有如化合物1结构的活化的环辛炔试剂可被用作封端试剂以标记失败序列，从而利于合成后多核苷酸的纯化，如下文所述。
虽然没有示出，但是H-膦酸酯(代替亚磷酰胺)也可以使用。H-膦酸酯可以与羟基基团反应以合成磷酸酯基团。膦酸酯基团对于寡核苷酸合成中所用的重复偶合和脱保护是稳定的。膦酸酯基团可以氧化为磷酸酯基团，例如，在典型寡核苷酸合成的氧化步骤中被氧化。磷酸酯基团对最终的脱保护和多核苷酸从固体载体上裂解是稳定的。因此，具有与化合物1结构相像但具有H-膦酸酯来代替亚磷酰胺的活化的环辛炔试剂，可以用作封端试剂以封端失败序列，以便于在合成后多核苷酸的纯化，如下文所述。
化合物2是具有连接至5’-羟基基团的活化的环辛炔部分的核苷3’-亚磷酰胺。在该试剂上的3’-亚磷酰胺基团可以与5’-羟基基团反应以形成亚磷酸酯基团。所述亚磷酸酯可以氧化为磷酸酯基团，例如，在典型寡核苷酸合成的氧化步骤中。磷酸酯基团对于寡核苷酸合成中所用的重复偶合和脱保护是稳定的。另外，磷酸酯基团对最终的脱保护和多核苷酸从固体载体上裂解是稳定的。
化合物2中的活化的环辛炔部分经由硅烷基连接至核苷，其可以用温和的酸溶液或氟离子(例如NaF，四-N-丁基氟化铵((Bu)4NF))，HF-吡啶或者HF-NEt3)处理而切断。因此，活化的环辛炔部分可以在利用它们的功能后从多核苷酸产物中释放出来以促进最后多核苷酸的纯化。因此，具有像化合物2的结构的试剂可以用作最后的核苷以偶联至期望序列的生长的链。
合成后，所述全长序列可以经由“点击”反应从失败序列中分离以捕获在含有叠氮或硝酮的固体载体上的所述全长序列，如下文所述。在纯化全长序列后，活化的环辛炔部分可以通过用温和的酸溶液或氟离子(例如NaF，四-N-丁基氟化铵((Bu)4NF))，HF-吡啶或者HF-NEt3)处理而切断，并且所需的全长序列可以被分离。
化合物3类似于化合物1，因为活化的环辛炔排列于亚磷酰胺。然而，化合物3的连接部分包括具有邻位醇的降冰片基，其中一个连接至亚磷酰胺并且另一个醇基被TBS(叔-丁基二甲基甲硅烷基)基保护。其可以用作通用类型的“点击”把手(即，用于封端失败序列或用于偶合至合成循环中的最后核苷酸)。TBS保护基可通过用弱酸溶液或氟离子(例如，NaF，四-N-丁基氟化铵((Bu)4NF)，HF-吡啶或HF-NEt3)处理而除去。一旦羟基成为自由的，在热或碱处理例如铵下，其可进攻相邻的磷酸酯基。因此，化合物3中的活化环辛炔基可用作可释放的“点击”把手，所述把手可在其发挥其功能以利于所需序列的纯化时释放。
如在化合物1中，化合物3中的亚磷酰胺基能够与羟基反应以形成亚磷酸酯基。亚磷酸酯基可被氧化磷酸酯基，例如在典型的寡核苷酸合成中的氧化步骤过程中。磷酸酯基团对于用于合成寡核苷酸的重复偶合和脱保护是稳定的。此外，磷酸酯基团对于最终脱保护和从固体载体上裂解核苷酸是稳定的。因此，具有如化合物1结构的活化的环辛炔试剂可被用作封端试剂以标记失败序列从而利于合成后多核苷酸的纯化，如下文所述。
此外，因为“点击”把手是可释放的，化合物3还可以用作加入最后核苷酸后的临时封端剂，而不是将化合物3用作失败序列的封端剂。
除了可裂解硅烷基外，三苯甲基也可用作可裂解连接基。三苯甲基连接基可通过用弱酸如二氯乙酸或三氟乙酸处理而除去。使用三苯甲基连接基的化合物的实例如化合物4所示。虽然硅烷基和三苯甲基两者均以一个实例示出，但是本领域技术人员将理解各种改变和变形在不脱离本发明范围的情况下也是可能的。
如上所述，根据本发明的实施方式的活化环辛炔试剂可在寡核苷酸的合成和纯化中用作“点击”化学把手。这些试剂可用于两种方法：(i)作为“封端”剂以阻挡失败序列进一步在随后的反应中反应，和(ii)作为最后的核苷酸模拟物以标记较容易纯化的最终产品。
在根据本发明实施方式的第一方法中，短聚物(截断的寡核苷酸)，其作为重复寡核苷酸合成中不完全偶合的结果产生，是用新的活化的环辛炔磷酸化试剂“削顶的”。在根据本发明的方法的寡核苷酸合成和纯化中使用应力化环辛炔试剂的示例性过程示于图2和4中。
参照图2和4，在每个合成循环中，可改变封端步骤以使用本发明的应力化的环辛炔试剂(例如如上所示的化合物1或化合物3)。也就是说，在图4的步骤3中乙酸酐(即Ac2O)可替换为本发明的试剂，即X-C-L-H(即化合物1或化合物3)。作为这些封端反应的结果，从固体载体上裂解后的最终产物混合物除了全序列外还将包括各种失败序列，其每个均具有连接至5’-端的活化的环辛炔部分(见图2)。
产物混合物可与含叠氮化合物或含硝酮固体载体(例如珠子)反应。硝酮是亚胺(immines)的N-氧化物。叠氮化物和硝酮可容易地与炔反应以形成稳定的5-元环产物。环加成后，失败序列将共价附着至固体载体，而全长序列将保持在溶液中。因此，所需的全长序列可容易地从失败序列中分离，例如通过过滤。
在第二方法中，新的可裂解活化-环辛炔磷酸化试剂可作为最终全长产品自身的纯化把手被添加至寡核苷酸的5’-端(在迭代合成的最后步骤过程中)。替代性地，将被偶合的最终单体可包括可裂解活化环辛炔部分。可裂解活化-环辛炔磷酸化试剂的实例可包括化合物2、化合物3或化合物4(如上所示)。
根据该过程的方法示例于图3和5中。如图3和5中所示，最终产物混合物包含各种失败序列，所述失败序列未标记有活化的环辛炔试剂，反之全长产品共价连接至活化的环辛炔基团。
产物混合物可与含叠氮化物或含硝酮的固体载体(例如珠子)反应，以与全长寡核苷酸产品形成共价键合。失败序列，其保留在溶液中，可从固体载体中分离。连接至固体载体的纯化全长产品可接着通过从珠子上裂解寡核苷酸而被释放，例如使用弱酸溶液或氟离子(例如，NaF，四-N-丁基氟化铵((Bu)4NF)，HF-吡啶或HF-NEt3)。
在寡核苷酸循环末端的用以封端和捕获失败序列的活化环辛炔磷酸化试剂的使用或活化环辛炔亚磷酰胺单体或类似试剂的使用将大大改善合成并使纯化容易。这些方法将允许用于寡核苷酸的快速纯化在高通量和大批量设置两者下进行。这些直接方法还将降低寡核苷酸合成/纯化的成本。其还将增加所需全长产品的产率和回收率。其在所有传统方法失败的长寡核苷酸(即300+-聚合物)的纯化中最有效。然而，这些方法相对于用于较短寡核苷酸的现有技术方法也是有利的。
本发明还将用以下实施例进一步示例。应当注意的是，这些实施例仅是示例性的，并不意味着对本发明范围的限制。
实施例
本发明的实施方式将通过如下实施例来说明。这些实施例仅用于举例说明，而不意味着限制本发明的范围。另外，本领域技术人员将会清楚在不脱离本发明范围的情况下获得这些是实施例的各种变形和改变都是可能的。例如，所使用的连接基可以被具有更长或更短链接的另一连接基取代，或者被不同类型的连接基取代。类似地，虽然这些实施例使用亚磷酰胺官能团，但本领域技术人员将会清楚类似的试剂可以通过H-膦酸酯片段使用本领域已知的程序制备。
如下所示，方案1举例说明了合成如上所述化合物1的类似物的一个合成方案。大体上，将1，5-环辛二烯与重氮乙酸酯反应以形成稠合的环丙基-环辛烯结构3476-31，将其中的酯官能团还原成相应的醇。然后，将环辛烯片段溴化并且脱氢溴化以制备相应的稠合的环丙基-环辛炔醇3476-39。
将稠合的环丙基-环辛炔醇3476-39中的醇官能团转化成含有对硝基苯酚基团的碳酸酯。碳酸酯中的对硝基苯酚基团可以用亲核试剂例如胺来取代。继而，含有氨基的期望的连接基可以与碳酸酯化合物反应以制备通过氨基甲酸酯官能团(-O-C(O)-NH-)偶联到连接基上的活化的环辛炔，例如3476-105。最后，连接基的另一端可以被转换成亚磷酰胺或H-膦酸酯，其可以用在寡核苷酸合成程序中。
方案1：活化的环辛炔亚磷酰胺片段的合成
在方案1中，化合物3476-31的两个立体异构体中仅有一个显示在接下来的步骤中。这是为了显示清楚。人们可以使用外消旋混合物或其它异构体代替。
而且，方案1举例说明了通过氨基甲酸酯官能团，即-O-C(O)-NH(CH2)6-O-将连接基偶联到活化的环辛炔基团上。本领域技术人员将会清楚在不脱离本发明范围的情况下，其它类型的链接官能团(例如，醚、酯等)也可以使用。这样的其它链接官能团的制备将会涉及普通的有机反应并且本领域技术人员合成这些化合物中不存在任何困难。作为一个例子，例如，醚链接可以根据如下反应方案制备：
根据本发明的实施方式，连接基的长度可以改变。例如，在-(CH2)n-中，n可以是2至10的整数。另外，化合物3476-39中的醇基团可以被转换成氨基或者离去基团(例如，甲苯磺酸酯基)，其然后可以进一步反应以提供不同类型的连接官能团。
根据本发明的实施方式，可以使用多种连接官能团和多种连接基。这些例子中的一些如Y和L基团所描述，参考以上式I。
人们可以归纳出分子中的“-Y-L-”部分作为“连接基盒子”，如以下式(V)中所示。
这样的“连接基盒子”(参见式(V))非穷尽的例子包括：-NH-(CH2)2-、-NH-(CH2)3-、-NH-(CH2)4-、-NH-(CH2)5-、-NH-(CH2)6-、-O-(CH2)2-、-O-(CH2)3-、-O-(CH2)4-、-O-(CH2)5-、-O-(CH2)6-、-NH-(CH2)2-、-NH-(CH2)3-、-NH-(CH2)4-、-NH-(CH2)5-、-NH-(CH2)6-、-NH-CO-(CH2)2-、-NH-CO-(CH2)3-、-NH-CO-(CH2)4-、-NH-CO-(CH2)5-、-NH-CO-(CH2)6-、-NH-CO-O-(CH2)2-、-NH-CO-O-(CH2)3-、-NH-CO-O-(CH2)4-、-NH-CO-O-(CH2)5-、-NH-CO-O-(CH2)6-、-O-(CH2)2-O-(CH2)2-、-O-(CH2)3-O-(CH2)2-、-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-、-NH-(CH2)3-O-(CH2)2-、-NH-CO-(CH2)2-O-(CH2)2-、-NH-CO-(CH2)3-O-(CH2)2-等。
如方案1中所示，涉及的反应是普通的有机反应。本领域技术人员在不付出创造性劳动的情况下即可进行这些反应。作为一个例子，合成示例性活化的环辛炔亚磷酰胺片段3476-31的详细合成过程和条件将会在以下描述。
化合物3476-31的合成
于0℃，在3小时内向1，5-环辛二烯(51.57mL，0.420mol)和Rh2(OAc)4(1g，0.0026mol)的DCM(30mL)溶液中滴加82％的叠氮乙酸乙酯溶液(7.32mL在DCM中，0.0605mol)。将该溶液搅拌48小时。然后蒸干。通过硅胶垫使用1∶200的EtOAc/己烷(1L)过滤除去过量的环辛二烯。真空浓缩滤液并且使用硅胶柱色谱(1∶20的EtOAc/己烷)纯化残余物，以给出无色透明油状物。该内化合物具有比外化合物高的Rf值。化合物的确认如Dommerholdt，Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，9422所述。
化合物3476-39的合成
将LiAlH4(334mg，88mmol)的乙醚(100mL)悬浮液冷却至0℃。接着滴加醚(50mL)中的3476-31(1.7g，88mol)。然后将混合物在室温下搅拌30分钟，然后冷却至0℃，缓慢加入水直到灰色固体变白。然后加入硫酸钠并且将固体滤出，用醚洗涤，真空浓缩滤液。然后将其溶于DCM(200mL)并且冷却至0℃。然后滴加DCM(20mL)中的溴(0.5mL，97mmol)溶液直到微黄色持续出现。然后将反应混合物继续搅拌30分钟。此时，用10％硫代硫酸钠的水溶液(50mL)淬灭反应并且用DCM萃取。有机层通过硫酸钠干燥，过滤，并且真空浓缩，以获得微黄色油状二溴化物。然后将该材料溶于THF(50mL)，接着在0℃下加入叔丁醇钾(3g，264mmol)的THF(15mL)溶液。然后将溶液回流3小时。冷却至室温以后，用DCM(200mL)稀释反应混合物，并且用饱和氯化铵溶液(50mL)淬灭反应。有机层通过硫酸钠干燥，过滤，并且蒸发，真空过滤。然后通过柱色谱使用7∶3的己烷/EtOAc纯化微黄色的残余物，以给出白色固体。化合物的确认如Dommerholdt，Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，9422所述。
化合物3476-103的合成
在氮气下，将化合物3476-39(1.84g，0.0122mol)溶于DCM(25mL)。接着加入吡啶(5mL)和
的分子筛。然后将溶液在室温下搅拌15分钟。接着加入对硝基苯氯代甲酸酯(3.2g，0.0159mol)。搅拌反应物直到反应完成(2小时)，通过TLC(使用7/3己烷∶EtOAc)判断。反应完成之后，用DCM稀释反应物并且用5％的氯化铵水溶液整理。有机层通过硫酸钠干燥，过滤，并且真空蒸发。然后通过柱色谱使用7∶3的己烷/EtOAc纯化所产生的材料，以给出白色固体。化合物的确认如Dommerholdt，Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，9422所述。
化合物3476-105的合成
在氮气下，将化合物3476-103(2.47g，0.00784mol)溶于DMF(25mL)。接着加入三乙胺(3.3mL，0.0235mol)和氨基己醇(1.84g，0.157mol)。1小时后反应完成。此时，将其蒸干并且将其溶于DCM(200mL)。用1N的NaOH(2×50mL)然后用饱和的氯化铵洗涤有机层。然后，有机层通过硫酸钠干燥，过滤，并且真空蒸发。然后通过柱色谱使用梯度直到5％MeOH的DCM溶液纯化所产生的材料，以给出白色固体，产率为94％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ4.72(1H)，3.94(2H，d)，3.60(2H，t)，3.14-3.15(2H，m)，2.37(2H，d)，2.23-2.28(2H，m)，2.10-2.14(2H，m)，1.80(IH，s)，1.45-1.57(4H，m)，1.33-1.34(6H，m)，0.71-0.73(2H，s)，0.63-0.66(1H，m)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ156.84，98.77，68.90，62.60，40.75，33.27，32.54，29.97，26.35，25.29，23.75，22.79，21.36；ESI-QQQ C17H27NO3的计算值为293.2(+H+)；实测值为294.2。
化合物3476-111的合成
在干燥的氮气下，将化合物3476-105(500mg，17mmol)和二异丙基四唑(586mg，0.00241mmol)加入到含有的分子筛。接着加入DCM(5mL)。然后将该材料在室温下搅拌30分钟，此时将溶于DCM(5mL)中的亚磷酸化试剂(388mg，13mmol)导入圆底烧瓶中。进行反应直到通过TLC(DCM中3％的MeOH)判断反应完成。然后用5％的碳酸氢钠淬灭反应并且用DCM萃取。有机层通过硫酸钠干燥，过滤，并且真空蒸发。然后通过柱色谱使用具有1％TEA的3∶7的己烷/EtOAc纯化剩余的材料以给出无色透明的油状物，产率为85％。31P NMR(202MHz，CD3CN)δ146.84；ESI-QQQ C26H44N3O3P计算值为494.6(+H+)；实测值为494.4。
方案2举例说明了制备具有可裂解连接基的5’-活化的环辛炔核苷亚磷酰胺的合成方案，其可以在寡核苷酸合成中用作最终的核苷以提供点击反应的把手从而促进完全序列的纯化。虽然此方案使用胸苷碱基作为例子，其它碱基(带有适当的保护)可以以类似的方式合成。
方案2：具有可裂解连接基的5’-活化的环辛炔核苷亚磷酰胺的合成
如方案2中所示，所需亚磷酰胺的合成使用常规有机反应。本领域技术人员将能够无困难地实施这些反应。作为示例，下文将描述合成化合物3476-117的详细过程和反应条件。
化合物3476-112的合成
在N2和冷却至-42℃下将二异丙基甲硅烷基二(三氟甲磺酸酯)(1.04mL，0.00352mol)溶解于DMF(15mL)中。其接着滴入DMF(10mL)中的3′-OAc-dT(1g，0.00352mol)。其接着添入于DMF(5mL)中的咪唑(0.480g，0.00704mol)。允许反应继续进行直至所有的二异丙基甲硅烷基二(三氟甲磺酸酯)材料均被消耗，如TLC所判断的(1h)。接着将其升温至室温，滴加入DMF(5mL)中的3476-105。接着搅拌反应直至通过TLC判断反应完成(30min)。一旦反应完成，在减压条件下除去溶剂并将残余物放入DCM中，用饱和碳酸氢钠洗涤。萃取有机层，用硫酸钠干燥，过滤并在真空中蒸发。接着使用梯度直至3％的DCM中的MeOH通过柱色谱纯化残余物。以定量产率获得的最终化合物为白色泡沫。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ9.03(1H，s)，7.53(1H，s)，6.36(1H，t)，5.32(1H，d)，4.80(1H，d)，3.94-4.05(5H，m)，3.74(2H，t)，3.12-3.17(2H，m)，2.36-2.42(3H，m)，2.16-2.29(2H，m)，2.09-2.14(6H，m)，1.90(s，3H)，1.47-1.57(4H，m)，1.32-1.38(6H，m)，1.01-1.05(14H，m)，0.65-0.72(3H，m)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ209.1，207.9，162.5，156.84，135.14，130.48，110.00，98.77，68.90，67.63，62.59，45.13，41.56，40.75，39.16，33.26，32.54，30.04，29.97，26.35，25.38，25.28，23.74，23.50，22.78，22.39，21.80，21.57，21.36，20.56；ESI-QQQ-C35H55N3O9Si的计算值为690.4(+H+)；实测值为690.4。
化合物3476-115的合成
将化合物3476-112(1g)溶解于乙醇(10mL)中。接着1∶1混合氨/甲胺(2mL)。然后将溶液加热到55℃并允许搅拌30min。一旦完成，在高真空下除去蒸发物并将残余材料放入DCM中。接着用水洗涤。有机层用硫酸钠干燥、过滤并在真空中蒸发以获得浅黄色油。接着将该材料使用梯度50/50EtOAc∶己烷→EtOAc通过柱色谱纯化并以定量产率获得白色固体。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.20(1H，s)，7.52(1H，s)，6.35(1H，t)，4.84(1H，s)，4.50(1H，s)，3.94-4.04(5H，m)，3.73-3.75(2H，t)，3.48(1H，s)，3.12-3.17(1H，m)，2.36-2.40(2H，m)，2.23-2.29(2H，m)，2.09-2.14(2H，m)，1.90(3H，s)，1.46-1.56(4H，m)，1.32-1.35(4H，m)，1.03-1.05(14H，m)，0.65-0.73(3H，m)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ163.92，157.00，150.44，135.58，110.86，98.78，87.18，84.92，87.18，84.92，71.88，69.09，63.06，40.99，40.72，33.26，32.48，29.91，26.26，25.28，23.68，22.81，21.37，17.39，17.33，17.30，17.24，12.47，12.00，11.84；C33H53N3O8Si648.4(+H+)；实测值为648.4。
化合物3476-117的合成
将化合物3476-115(0.8g，0.00116mol)在干燥氮气下溶解于THF(10mL)中。接着加入DIPEA(0.85mL，0.00487mol)并滴加二异丙基磷酰氯试剂(0.3mL，0.00128mol)。接着将该反应混合物搅拌2h直至完成。然后将其用5％碳酸氢钠水溶液(5mL)淬灭并用DCM(200mL)稀释。然后将该混合物转移至分液漏斗并加入更多的5％碳酸氢钠水溶液(50mL)。用DCM(100mL)洗涤含水层并将有机层汇集，用硫酸钠干燥、过滤并在真空中蒸发。接着将剩余材料使用具有2％TEA的3∶2EtOAc/己烷通过柱色谱纯化并以95％产率获得白色泡沫。31P NMR(202MHz，CD3CN)δ148.03，147.98；ESI-QQQ C42H70N5O9PSi的计算值为848.5(+H+)；实测值为848.5。
如上所述，根据本发明的实施方式，含有叠氮化物或氮酮的固体载体(例如珠子或基底)可被用于“点击”和捕获活化含环辛炔的寡核苷酸，因此有利于所需序列的纯化。含有叠氮化物或氮酮的固体载体能够使用商业可获得的固体载体容易地制备，如方案3中所示：
方案3.含叠氮化物的可控孔度玻璃(CPG)的合成
虽然方案3中使用可控孔度玻璃作为固体载体。可使用不脱离本发明范围的任何其它适合的固体载体，例如聚合物或塑料珠、玻璃板、或聚合物或塑料板。将具有叠氮化合物的连接物偶合至含有氨基连接基的CPG。也可使用固体载体上的其它类型的反应性官能基团，例如-OH、-SH、-COOH等。作为例子，试剂3476-98合成的详细方法和条件如下所示。
化合物3476-98的合成
将
CPG(19.2g，负载＝103umol/g，(批次PSI0021624，购自Chemgenes，Wilmington，MA)悬浮于DMF(50mL)中。接着加入三乙胺(1.8mL，129mol)和叠氮基-Peg-NHS-酯。接着摇晃反应16h。一旦完成，将其通过玻璃料(glass frit)过滤并用DCM、MeOH、和最终用醚洗涤。然后将材料在高真空下干燥。接着将其用CAP A和CAP B(各20mL)处理15min。再次如上所述过滤和洗涤。接着在高真空下干燥所述材料。
本发明的优点可以包括以下的一个或多个。环辛炔片段自身可以大批量(例如Kg)制备并且可便宜地合成。此外，其使用少得多的耗材，例如HPLC、聚合反应等情况中的溶剂，并且因此绿色环保得多。环辛炔片段能够自由地溶解于有机溶剂(例如乙腈)中并且作为封端剂或核苷酸单体允许快速偶合。当寡核苷酸由固体载体裂解时，含环辛炔的封端失败或含环辛炔的全长产品将经历与含叠氮化物或氮酮的固体载体的快速“点击”反应，将它们从混合物中共价地分离。这是对现有方法的一个主要改善，其中纯化步骤将以分钟而不是小时数量级进行，大大增加了高通量能力。此外，因为已知点击反应是接近定量的，所以这将大大增加与现有方法相比的产率和纯度，这对小规模或大规模都是重要的。此外，该平台对大量的溶剂和反应条件都是适宜的，并且与亲和力纯化的情况不同，其不会受限于某些条件。还已知点击反应是非常特异性的，因此不会存在寡核苷酸的变体，最后，该方法将特别可用于长的寡核苷酸的纯化，而不像现有技术一样受限于较短的寡核苷酸。
含叠氮化物的琼脂糖珠的合成
将氨基衍生的琼脂糖珠过滤并冻干。接着将它们悬浮于DMF中并在三乙胺的存在下在室温下与叠氮-PEG4-NHS酯(购自Click化学工具)反应16h。一旦完成，将材料过滤，用DMF、MeOH和醚洗涤。接着将材料在高真空下干燥。接着将其用CAP A和CAP B(各20mL)处理15min。再次如上所述的过滤和洗涤。接着在高真空下干燥所述材料。
寡核苷酸的合成
将用3476-117合成的dT-25-聚合寡核苷酸(1)使用标准DNA合成条件(图6B)作为最后的碱加入。合成无3476-117的dT-25-聚合控制子(2)用作比较(图6A)。接着用氢氧化铵处理这些寡聚物，55℃，16h，然后冻干。化合物(1)进一步用含叠氮化物的琼脂糖珠在水中处理过夜。然后过滤珠子，用水洗涤并干燥。接着将它们用1M TBAF处理8h。过滤珠子，滤液用水稀释并经过G-25sephadex柱。然后将该材料用HLPC-MS分析(图6C)。显然，在用含叠氮化物珠子处理接着用氟离子释放后，相对于没有使用3476-117(1)合成的寡聚物来说，用3476-117(1)合成的寡聚物非常纯。
虽然本发明通过有限数量的实施方式进行了描述，但本领域技术人员在受益于本公开的情况下将了解，在不脱离本文公开的本发明范围的情况下可以设计出其它实施方式。因此本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
Claims (10)
1.用于寡核苷酸合成或纯化的试剂，其中所述试剂具有如下结构：
X-C-L-H(式A)
其中，
X是亚磷酰胺基、H-膦酸酯基、缩醛基、或异氰酸酯；
C是直接的键或者可裂解的接头，其中所述可裂解的接头由-Ca-Cb-表示，其中Ca与X连接并且是直接的键、烃基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、核苷，其各自任选地被一至两个取代基所取代，所述取代基选自卤素、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的键、硅烷基、三苯甲基或邻位醇基；
L是烃基链，其可以任选地被一至四个取代基所取代，所述取代基独立地选自由5至9元杂芳基、4至9元杂环基、氨基、醚、羧基、氨基甲酰基、(C6-C12)芳基、-O-R”、-O-CO-R”、-NR’-R”、-NR’-CO-R”、-CO-NR’-R”、-CO-R”、-CN、卤素或它们的组合所组成的组，其中R’和R”独立地为H或(C1-C6)烃基；或者
L是其中插入了其它原子的烃基链，如-(CHR’)a-Wb-(CHR’)c-Vd-(CHR’)e-所示，其中W和V独立地为-O-、-S-或-NR’-；R’为H或(C1-C6)烷基；并且a、b、c、d和e独立地为0至10的整数；并且
H为端基炔或活化的环辛炔。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中H为活化的环辛炔基。
3.根据权利要求1所述的试剂，其中C由-Ca-Cb-表示，其中Ca与X连接并且是直接的键、(C1-C12)烃基、(C6-C12)芳基、5至12元杂芳基、(C3-C12)环烷基、4-12元杂环基、核苷，其各自任选地被一至两个取代基所取代，所述取代基选自卤素、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的键，硅烷基、三苯甲基或邻位醇基。
4.根据权利要求1所述的试剂，其中(1)L为烃基，选自(C1-C12)烷基、(C2-C12)烯基或(C2-C12)炔基，其各自可以任选地被取代基所取代，所述取代基选自氨基、醚、羧基、氨基甲酰基或卤素；或(2)L由通式-(CH2)a-Wb-(CH2)c-Vd-(CH2)e-表示，其中W和V独立地为-O-、-S-或-NR’-，其中R’为氢或低级烷基(例如，(C1-C3)烷基或(C1-C6)烷基)；并且a、b、c、d和e独立地为0至10的整数。
5.根据权利要求2至4任一项所述的试剂，其具有式(I)所示结构：
其中Y是链接官能团，选自-O-、-S-、-NR’-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-或者-NH-CO-NH-，其中R’是氢或(C1-C6)烃基。
6.根据权利要求2至5任一项所述的试剂，其中
A)X是亚磷酰胺基团并且所述试剂具有如下式(II)所表示的结构：
其中R是(C1-C6)烷基或氰乙基；
B)X是H-膦酸酯基团并且所述试剂具有式(III)所表示的结构：
式(III)
其中R是(C1-C6)烷基或氰乙基；或
C)其中X为异氰酸酯基并且所述试剂具有式(IV)表示的结构：
式(IV)。
7.一种合成多核苷酸的方法，其包括：
(a)对固体载体上的寡核苷酸的5’-羟基保护基团脱保护以产生固体载体上的寡核苷酸的游离的5’-羟基；
(b)将含有5’-羟基保护基团的核苷酸单体通过所述核苷酸单体上的3’-含磷基团偶联到固体载体上寡核苷酸的游离5’-羟基上；
(c)使用封端试剂封端固体载体上寡核苷酸的未反应的5’-羟基，其中所述封端试剂为权利要求1-9所述的试剂；和
(d)将步骤(a)-(c)重复选定的次数以制备固体载体上的多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述封端试剂由式(I)表示。
9.根据权利要求8所述的方法，其中式(I)的X为由-P(OR13)(NR14R15)表示的亚磷酰胺基团，其中R13为氰乙基，并且R14和R15各自独立地为(C1-C6)烷基。
10.根据权利要求7所述的方法，其还进一步包括：
(e)对多核苷酸脱保护并从固体载体上裂解以产生产物混合物；
(f)使产物混合物的溶液与含叠氮化物的固体载体或含氮酮的固体载体反应；和
(g)从固体载体上分离含多核苷酸的溶液。
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