CN117264004A - 一种化合物及核酸合成方法 - Google Patents

一种化合物及核酸合成方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117264004A
CN117264004A CN202210682346.9A CN202210682346A CN117264004A CN 117264004 A CN117264004 A CN 117264004A CN 202210682346 A CN202210682346 A CN 202210682346A CN 117264004 A CN117264004 A CN 117264004A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
solvent
formula
ext
base
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210682346.9A
Other languages
English (en)
Inventor
王育煌
滕波
章文蔚
徐讯
吴侠
冯伟
程雨晴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Priority to CN202210682346.9A priority Critical patent/CN117264004A/zh
Publication of CN117264004A publication Critical patent/CN117264004A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C319/00—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/22—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of hydropolysulfides or polysulfides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/56—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/173—Purine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种化合物及核酸合成方法。所述化合物如式A或B所示。所述核酸合成方法使用一种新的保护基团替代DMT保护基，该保护基可在碱性条件下完成脱保护反应；该脱保护反应能高效，定量完成以释放出5’‑OH用于下一步的偶联反应；该脱保护反应为不可逆反应；该保护基对酸不敏感；脱保护后的副产物为一稳定化合物，不与oligo上的各基团发生反应。

Description

一种化合物及核酸合成方法
技术领域
本发明属于生物合成领域，涉及一种化合物及核酸合成方法，具体涉及如式A所示的化合物或如B所示的化合物、其制备方法、如式C所示的化合物在合成核酸中的应用、含有起始核酸分子的固相载体(SSEB-2’-dN-CPG)的制备方法及核酸合成方法。
背景技术
在最近几十年里，随着分子生物学与基于DNA的体外诊断技术的蓬勃发展，寡核苷酸的应用也越来越广泛，例如，在基因组测序与PCR中，人工合成的寡核苷酸作为引物，引导模板互补链的合成；在荧光定量PCR中，合成的寡核苷酸可作为探针用于目标核酸的检测，分析与量化。近年来的寡核苷酸作为药物候选的研究也获得了较大的发展，例如，可通过靶向于特定的RNA以调控基因表达，也可应用于系统性疾病的治疗的反义寡核苷酸(ASOs)；可与小分子、蛋白、细菌、病毒、细胞和组织等靶标特异性结合的核酸适配体(aptamer)；用于基因沉默的小干扰RNA(siRNA)以及用于阻断蛋白基因表达的微小核糖核酸(miRNA)等。此外，DNA数据存储技术也需要应用寡核苷酸合成技术。随着以上这些技术的发展，对人工合成寡核苷酸的需求量也越来越大，从而极大的推动了寡核苷酸合成技术的发展。
经历了几十年的发展，多种寡核苷酸合成法被报道用于寡核苷酸的合成，包括H-膦酸合成法、磷酸二酯合成法、磷酸三酯合成法以及亚磷酰胺三酯合成法。目前广泛采用的寡核苷酸合成法为固相亚磷酰胺三酯合成技术(见Caruthers et al.U.S.Pat.Nos.4,415,732、4,458,066、4.500,707、4,668,777、4,973,679及5,132,418；Koster etal.U.S.Pat.No.Re.34,069；McBride et al.(1983)Tetrahedron Letters24:245-248；Sinha et al.(1983)Tetrahedron Letters 24:5843-5846)，该技术是以核苷亚磷酰胺为单体在固相载体上进行寡核苷酸的3’-5’的合成。该方法历经一个循环延长一个碱基，每一循环均包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四个步骤(图1)。
(1)脱保护。每一个循环开始前，CPG-寡核苷酸上的末端5’-位羟基由二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基保护，通常使用三氯乙酸(TCA)的二氯甲烷溶液脱除DMT，以裸露5’-位羟基。
(2)偶联。脱保护之后，往载体上加入相应的寡核苷酸单体以及活化剂以实现碱基的增加，该反应得到的产物为亚磷酸三酯。
(3)盖帽。使用盖帽试剂，如乙酸酐/N-甲基咪唑/吡啶/四氢呋喃体系，用于阻断偶联中一步中未反应的5’-OH。
(4)氧化。使用氧化试剂，如I2/吡啶/四氢呋喃/水体系将偶联得到的亚磷酸三酯氧化为相应的磷酸酯。
该方法使用的固相载体可用可控微孔玻璃珠(CPG，controlled pore glass)或多孔聚苯乙烯(MPPS,microporous polystyrene)，较常用的为CPG载体，通过一个连接臂(linker)与第一个碱基的3’-位连接，经历多个循环，实现oligo的3’-5’合成。完成目标oligo的合成后，通过氨水氨解将oligo从固相载体上切下，并同时脱除碱基与磷酸上的保护基，从而得到目标oligo。
上述方法已广泛应用于实验室的oligo合成研究以及商业上微量定制或大规模的寡核苷酸定制合成，例如，以1mol或更多的规模，用于合成寡核苷酸药物，引物，探针等。然而，该方法具有固有的缺点，这些缺点是DMT保护基作为5’-位羟基的保护基团固有的。
首先，DMT保护基是一个酸性敏感基团，在oligo合成中，需要加入酸来完成脱保护以裸露5’-位羟基，通常使用的是质子强酸，如三氯乙酸(TCA)。而在强酸性条件下，寡核苷酸可能会发生一些副反应，特别是脱嘌呤反应(图2)。脱嘌呤反应是指核酸在酸的作用下发生嘌呤碱基脱落而形成无嘌呤点位的现象。而使用DMT作为保护基，不可避免的是每一个循环都需要将寡核苷酸产物暴露在强酸性环境下，从而更容易造成脱嘌呤副反应而影响oligo的合成质量。可以预见的是，在越早合成的嘌呤碱基或者合成的oligo链长越长的情况下，嘌呤碱基暴露在酸性条件下的时间越长，脱嘌呤现象越严重。
此外，DMT保护基在酸性条件下脱除后，自身形成DMT正离子，而DMT+可以与羟基发生反应而导致羟基的再次保护。因此，酸性脱除DMT保护基团的反应是一个可逆反应(图3)，该可逆反应会导致不完全脱保护，而未脱保护的序列在随后的偶联反应中不发生链的延长，但可在后续循环的脱保护反应中发生脱保护以实现链的延长，因此将得到碱基缺失的序列。这些碱基缺失的序列将在合成完成后与目标序列一起从固相载体上切下，而又与目标序列具有相似的性质从而造成分离困难。
其三，偶联反应需要使用活化剂活化亚磷酰胺单体的亚磷酰胺基团，再与载体上裸露的5’-位羟基反应实现链的延长。而活化剂均为弱酸性，可能会导致偶联后的亚磷酸三酯上部分5’-位羟基脱除，后再与活化的亚磷酰胺单体反应，从而产生碱基插入的副产物。
此外，脱保护反应所使用的酸与二氯甲烷溶剂也会造成环境的污染。
发明内容
针对现有的固相亚磷酰胺三酯法的上述缺陷，本申请提供了一种新型核酸合成方法，所述合成方法中使用一种新的保护基团替代DMT保护基，该保护基可在碱性条件下完成脱保护反应；该脱保护反应能高效，定量完成以释放出5’-OH用于下一步的偶联反应；该脱保护反应为不可逆反应；该保护基对酸不敏感；脱保护后的副产物为一稳定化合物，不与oligo上的各基团发生反应。
本发明提供了如式A所示的化合物或如式B所示的化合物，
其中，Basepg指碱基或带有保护基的碱基；
R1和R2分别独立地为C16烷基；
或者R1和R2连接形成C2-20环烷基、被一个或多个C1-6烷基取代的C2-20环烷基或“杂原子选自N、O和S中的1种、2种或3种，杂原子数为1、2或3个的C2-20碳杂环”；
R3、R4、R5、R6分别独立地为氢、卤素、带有保护基的氨基、带有保护基的羟基或C1-6烷基；
或者，R3与R4、R4与R5或R5与R6连接形成C2-20环烷基、被一个或多个C1-6烷基取代的C2-20环烷基或“杂原子选自N、O和S中的1种、2种或3种，杂原子数为1、2或3个的C2-20碳杂环”；
R7为磷酸保护基团；
R8和R9分别独立地为C1-6烷基；
或者，R8和R9连接形成C2-20环烷基、被一个或多个C1-6烷基取代的C2-20环烷基或“杂原子选自N、O和S中的1种、2种或3种，杂原子数为1、2或3个的C2-20碳杂环”。
在一些实施方式中，所述带有保护基的碱基为带有苯丙酰基(Bz)的A碱基、带有乙酰基(Ac)的C碱基或带有异丁酰基(iBu)的G碱基。
在一些实施方式中，所述R1和R2分别独立地为甲基、乙基或异丙基，优选甲基。
在一些实施方式中，所述R3、R4、R5、R6为氢。
在一些实施方式中，所述R7为β-氰乙基、甲基、苄基、烯丙基、2-(对硝基苯基)-1-乙基、4-甲硫基-1-丁基、2-(N-乙酰基)-氨基-1-乙基或2-萘基氨基甲酰氧基-1-乙基，优选β-氰乙基基团。
在一些实施方式中，所述R8和R9分别独立地为甲基、乙基或异丙基，优选为异丙基。
在一些实施方式中，所述如式A所示的化合物为
本发明还提供了一种如式C所示的化合物在合成核酸中的应用；
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6的定义如前所述。
在一些实施方式中，所述如式C所示的化合物为(SSEB)。
本发明还提供了一种如式C所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，化合物D与三羟丙基膦进行如下所示的反应，得到化合物C，R为 R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Basepg的定义如前所述，
在一些实施方式中，所述溶剂为腈类溶剂、醇类溶剂和水中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述腈类溶剂为乙腈。
在一些实施方式中，所述醇类溶剂为甲醇。
本发明还提供了如式A所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，在碱存在下，化合物A-1与进行如下所示的反应，得到化合物A；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Basepg的定义如前所述。
在一些实施方式中，所述溶剂为卤代烷烃类溶剂，优选二氯甲烷。
在一些实施方式中，所述碱为N,N-二异丙基乙胺。
在一些实施方式中，所述与所述化合物A-1的摩尔比为2:1。
在一些实施方式中，所述碱与所述化合物A-1的摩尔比为4:1。
优选地，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，化合物A-2与Et3N·3HF进行如下所示的反应，得到化合物A-1；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、Basepg的定义如前所述。
在一些实施方式中，所述溶剂为醚类溶剂，优选四氢呋喃。
在一些实施方式中，所述Et3N·3HF与所述化合物A-2的摩尔比为10:1。
优选地，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，在碱和脱水剂存在下，化合物A-3与上述如式C所示的化合物进行如下所示的反应，得到化合物A-2；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、Basepg的定义如前所述。
在一些实施方式中，所述溶剂为卤代烷烃类溶剂，优选二氯甲烷。
在一些实施方式中，所述碱为4-二甲氨基吡啶。
在一些实施方式中，所述碱与所述化合物A-3的摩尔比为0.14:1。
在一些实施方式中，所述脱水剂为二环己基碳二亚胺。
在一些实施方式中，所述脱水剂与所述化合物A-3的摩尔比为1.1:1。
在一些实施方式中，所述如式C所示化合物与所述化合物A-3的摩尔比为1.1:1。
优选地，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，在酸存在下，所述化合物A-4进行如下所示反应，得到化合物A-3；
Basepg的定义如前所述。
在一些实施方式中，所述溶剂为卤代烷烃类溶剂，优选二氯甲烷。
在一些实施方式中，所述酸为三氯乙酸。
在一些实施方式中，所述酸与所述化合物A-4的摩尔比为10:1。
优选地，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，在咪唑存在下，化合物A-5与TBS-Cl进行如下所示的反应，得到化合物A-4；
Basepg的定义如前所述。
在一些实施方式中，所述溶剂为酰胺类溶剂，优选N,N-二甲基甲酰胺。
在一些实施方式中，所述咪唑与所述化合物A-5的摩尔比为2.5:1。
在一些实施方式中，所述TBS-Cl与所述化合物A-5的摩尔比为2:1。
优选地，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，化合物A-6与DMT-Cl进行如下所示的反应，得到化合物A-5；
Basepg的定义如前所述。
在一些实施方式中，所述溶剂为吡啶。
在一些实施方式中，所述DMT-Cl与所述化合物A-6的摩尔比为1.1:1。
本发明还提供了一种含有起始核酸分子的固相载体(SSEB-2’-dN-CPG)的制备方法，其包括如下步骤：
在脱水剂和碱存在下，CPG-linker-NH2与化合物E(SSEB-2’-dN)进行如下所示的反应，得到含有起始核酸分子的固相载体(SSEB-2’-dN-CPG)，R1、R2、R3、R4、R5、R6、Basepg的定义如前所述，dN代表dA、dC、dT和dG以及其它脱氧核苷酸的任一种，
在一些实施方式中，所述CPG-linker-NH2为
在一些实施方式中，所述化合物E为
在一些实施方式中，所述脱水剂为二环己基碳二亚胺(DCC)。
在一些实施方式中，所述碱为吡啶。
在一些实施方式中，所述反应还包括如下后处理步骤：洗涤和干燥。所述洗涤所用溶剂为吡啶、二氯甲烷和乙腈。
在一些实施方式中，所述含有起始核酸分子的固相载体的制备方法还包括盖帽步骤，例如使用盖帽试剂A和盖帽试剂B盖帽。
本发明还提供了一种核酸合成方法，其包括如下步骤：
(1)在溶剂中，将如上所述的方法所制备的SSEB-2’-dN-CPG与三羟丙基膦(THPP)进行脱保护反应，得到(dN-CPG)；
(2)在活化剂存在下，将所述dN-CPG与如式A所示的化合物反应，生成带有保护基的亚磷酸三酯；
(3)在氧化剂作用下，将带有保护基的亚磷酸三酯进行氧化反应，得到带有保护基的磷酸酯；
(4)在溶剂中，将带有保护基的磷酸酯与三羟丙基膦进行脱保护反应，得到第一延伸产物；
(5)任选地，重复步骤(2)、(3)、(4)，得到延伸产物；
(6)所述延伸产物或第一延伸产物与切除溶剂反应，以切除CPG-Linker-NH2。
在一些实施方式中，步骤(1)中，所述溶剂为腈类溶剂、醇类溶剂和水中的一种或多种。
在一些实施方式中，步骤(1)中，所述三羟丙基膦与所述SSEB-2’-dN-CPG的摩尔比为20:1。
在一些实施方式中，步骤(2)中，所述活化剂为5-乙巯基四氮唑，优选0.25mol/L的5-乙巯基四氮唑的乙腈溶液。
在一些实施方式中，步骤(3)中，所述氧化剂为I2/吡啶/四氢呋喃/水体系，优选0.02mol/L的I2的吡啶、四氢呋喃和水的混合溶液。
在一些实施方式中，步骤(4)中，所述溶剂为腈类溶剂、醇类溶剂和水中的一种或多种。
在一些实施方式中，步骤(4)中，所述三羟丙基膦与所述带有保护基的磷酸酯的摩尔比为20:1。
在一些实施方式中，步骤(6)中，所述切除溶剂为氨水，优选为1mL浓氨水。
在一些实施方式中，所述步骤(2)还包括盖帽步骤，例如使用盖帽试剂A和盖帽试剂B进行盖帽。
在一些实施方式中，还包括以下步骤：将步骤(6)所得体系进一步脱保护例如16h，并真空浓缩。优选所述脱保护与真空浓缩在例如60℃下进行。
本发明还提供了一种含有如式A所示化合物或如式B所示化合物的试剂盒。
在一些实施方式中，所述试剂盒还含有如上所述活化剂、氧化剂、三羟丙基膦、切除溶剂、盖帽试剂A和盖帽试剂B中的一种或多种。
本发明的积极进步效果：
本发明开发了一种新型的寡核苷酸合成方法，该方法使用甲基过硫乙基苯甲酰基(SSEB)保护基替代DMT保护基保护核苷的5’-OH，在寡核苷酸固相合成中使用三羟丙基磷(THPP)作为脱保护试剂对SSEB进行脱保护以裸露羟基，从而与下一分子亚磷酰胺单体偶联以实现寡核苷酸链的延长。本方法使用的THPP脱保护试剂为碱性试剂，可避免酸性试剂作为脱保护试剂导致的脱嘌呤、碱基缺失与碱基插入等错误，从而减少合成错误率，提高寡核苷酸合成质量，降低分离难度。
附图说明
图1为固相亚磷酰胺三酯法合成亚磷酰胺
图2为脱嘌呤反应路线
图3为酸性脱除DMT保护基团的可逆反应
图4为CPG-A与CPG-B为载体合成T15
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1 5’-DMT-2’-dT(2a)的合成：
取脱氧核苷1a(2.42g，10mmol)于100mL圆底烧瓶中，加吡啶旋蒸带水3次(3*20mL)，加入25mL干燥的吡啶溶解，然后加入DMTCl(3.72g,11mmol),室温下搅拌2小时。将体系旋干，加入20mL甲苯再旋干带出剩余吡啶，过柱，得到5’-DMT-2’-dT(2a)4.90g，产率90％。
实施例2 5’-DMT-3’-TBS-2’-dT(3a)的合成：
取醇2a(4.90g,9mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL干燥的DMF溶解，后加入咪唑(1.53g，22.5mmol),TBSCl(2.7g,18mmol)，加完后室温下搅拌过夜。加甲醇(5mL)淬灭反应，将吡啶旋干，加入二氯甲烷(50mL)溶解，溶液用饱和碳酸钠洗，饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过柱，得到5’-DMT-3’-TBS-2’-dT(3a)5.56g，产率94％。
实施例3 3’-TBS-2’-dT(4a)的合成
取化合物3a(5.26g,8mmol)与250mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷溶解，冰浴下搅拌下加入三氯乙酸(13.7g，80mmol)，加完后保持冰浴搅拌10分钟，用饱和碳酸钠调节体系pH至碱性，分液，二氯甲烷萃取水相，合并有机相，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱，得到3’-TBS-2’-dT(4a)2.74g,产率96％。
实施例4 5’-SSEB-3’-TBS-2’-dT(5a)的合成
取醇4a(2.13g,6mmol)与2-(1-甲基二硫基)乙基苯甲酸(1.5g，6.6mmol)于100mL圆底烧瓶，加入30mL二氯甲烷溶解，加入DCC(1.37g,6.6mmol)与DMAP(100mg)，加完后搅拌3h，过滤，有二氯甲烷洗涤滤渣，将滤液旋干，过柱，得到5’-SSEB-3’-TBS-2’-dT(5a)3.12g,产率92％.产物5a为两个差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.08(brs,0.5H),9.06(brs,0.5H),7.81-7.76(m,1H),7.65-7.59(m,1H),7.56-7.50(m,1H),7.32-7.28(m,1H),7.25-7.22(m,1H),6.33-6.26(m,1H),5.32-5.25(m,1H),4.60(dd,J＝12.3,4.0Hz,0.5H),4.51-4.41(m,2.5H),4.20-4.16(m,1H),2.40-2.28(m,1H),2.21-2.13(m,0.5H),2.11(s,1.5H),2.10-2.05(m,0.5H),2.03(s,1.5H),1.72-1.67(m,4.5H),1.60(s,1.5H),0.89(s,9H),0.11-0.08(m,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.2,167.1,163.8,163.8,150.3,144.5,144.4，135.2，135.2，132.6，132.6，129.9，129.8，129.3，129.1，128.1，128.1，127.2，111.3，111.3，85.2，85.185.0,84.6,72.1,71.8,64.1,64.0,43.7,43.5,41.1,41.1,34.0,25.8,25.8u,25.7,25.0.23.7,23.6,20.5,20.4,18.0,12.5,12.4,-4.5,-4.7,-4.7.MS(ESI)calcd.for C26H39N2O6S2Si(M+H)+:567.2,found:567.2.
实施例5 5’-SSEB-2’-dT(6a)的合成
取化合物5a(2.26g，4mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL THF溶解，加入Et3N·3HF(2.15g,40mmol HF),室温下搅拌过夜，用饱和碳酸钠调节体系pH至碱性，旋干THF，加DCM萃取水相，合并有机相，用饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱，得到5’-SSEB-2’-dT(6a)1.56g，产率86％；产物6a为差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.13(brs,0.5H),9.74(brs,0.5H),7.80-7.68(m,1H),7.62-7.40(m,2H),7.32-7.14(m,2H),6.37-6.25(m,1H),5.29-5.20(m,0.5H),5.14-4.88(m,0.5H),4.72-4.40(m,3H),4.32-4.22(m,1H),3.51(brs,1H),2.54-2.42(m,1H),2.41(s,1.5H),2.25-2.10(m,1H),2.08(s,0.75H),2.04(s,0.75H),1.70-1.40(s,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.4,164.4,164.2,164.1,151.0,150.9,150.8,150.7,144.4,144.2,135.8,135.4,132.6,130.0,129.9,129.2,129.1,128.1,127.2,127.2,111.6,111.4,85.3,85.1,84.6,84.4,71.7,71.5,64.3,43.9,43.6,40.5,40.5,23.7,23.6,22.3,21.4,21.3,21.1,20.5,20.412.4；MS(ESI)calcd.for C20H25N2O6S2(M+H)+:453.5,found:453.6.
实施例6 5’-SSEB-2’-dT-phosphoramidite(7a)的合成
取化合物6a(1.36g,3mmol)于100mL圆底烧瓶中，密封，抽换氩气，加入20mL干燥的二氯甲烷溶解，将体系用冰浴冷却，依次滴加DIPEA(1.98mL，12mmol)与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1.34mL,6mmol)，加完后保持冰浴下搅拌30min。用20mL二氯甲烷稀释反应体系，后依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，HEX/EA/TEA体系过柱。得到5’-SSEB-2’-dT-phosphoramidite(7a)1.50g,产率77％；产物为四个差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.50(brs,1H),7.82-7.78(m,1H),7.62-7.58(m,1H),7.54-7.49(m,1H),7.29(t,J＝7.6Hz,1H),7.24-7.19(m,1H),6.35-6.30(m,1H),5.30-5.24(m,1H),4.68-4.48(m,3H),4.38-4.27(m,1H),3.90-3.81(m,1H),3.76-3.69(m,1H),3.65-3.55(m,2H),2.66-2.60(m,2H),2.59-2.44(m,1H),2.25-2.15(m,1H),2.10-1.97(m,3H),1.69-1.65(m,4.5H),1.59-1.57(m,1.5H),1.19-1.15(m,12H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.1,167.0,166.9，166.9，163.9，150.5，150.4，144.3，144.3，144.3，135.1，135.1，135.1，132.5，129.9，129.8，129.8，129.2129.1,129.0,128.0,128.0,127.9,127.1,117.7,117.7,111.4,111.4,111.3,85.0,84.9,84.8,83.8,73.0,64.2,64.1,64.0,63.9,58.3,58.2,58.1,58.0,58.0,45.3,45.3,43.6,43.5,43.4,43.4,43.3,43.3,39.6,39.6,24.7,24.6,24.6,24.6,24.5,24.5,23.6,23.5,23.5,23.4,23,0,23.0,22.9,22.9,20.5,20.5,20.4,20.4,20.3,20.3,12.4,12.3,12.2；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ149.4,149.3,149.2,149.1；MS(ESI)calcd.for C29H42N4O7PS2(M+H)+:653.8,found:653.8.
实施例7 5’-DMT-2’-dA(Bz)(2b)的合成
取脱氧核苷1b(3.55g，10mmol)于100mL圆底烧瓶中，加吡啶旋蒸带水3次(3*20mL)，加入25mL干燥的吡啶溶解，然后加入DMTCl(3.72g,11mmol)，室温下搅拌2小时。将体系旋干，加入20mL甲苯再旋干带出剩余吡啶，过柱，得到5’-DMT-2’-dA(Bz)(2b)6.04g，产率92％。
实施例8 5’-DMT-3’-TBS-2’-dA(Bz)(3b)的合成
取醇2b(5.91g,9mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL干燥的DMF溶解，后加入咪唑(1.53g，22.5mmol)，TBSCl(2.7g,18mmol)，加完后室温下搅拌过夜。加甲醇(5mL)淬灭反应，将吡啶旋干，加入二氯甲烷(50mL)溶解，溶液用饱和碳酸钠洗，饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过柱，得到5’-DMT-3’-TBS-2’-dA(Bz)(3b)6.38g，产率92％。
实施例9 3’-TBS-2’-dA(Bz)(4b)的合成
取化合物3b(6.17g,8mmol)与250mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷溶解，冰浴下搅拌下加入三氯乙酸(13.7g，80mmol)，加完后保持冰浴搅拌10分钟，用饱和碳酸钠调节体系pH至碱性，分液，二氯甲烷萃取水相，合并有机相，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱，得到3’-TBS-2’-dA(Bz)(4b)3.28g，产率88％.
实施例10 5’-SSEB-3’-TBS-2’-dA(Bz)(5b)的合成
取醇4b(2.84g,6mmol)与2-(1-甲基二硫基)乙基苯甲酸(1.5g，6.6mmol)于100mL圆底烧瓶，加入30mL二氯甲烷溶解，加入DCC(1.37g,6.6mmol)与DMAP(100mg)，加完后搅拌3h，过滤，有二氯甲烷洗涤滤渣，将滤液旋干，过柱，得到5’-SSEB-3’-TBS-2’-dA(Bz)(5b)3.59g,产率88％.产物5b为两个差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.27(brs,1H),8.72(s,0.5H),8.71(s,0.5H),8.12(s,1H),8.02-7.96(m,2H),7.75-7.67(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.50-7.42(m,3H),7.28-7.20(m,1H),6.47-6.39(m,1H),5.29-5.21(m,1H),4.78-4.71(m,1H),4.58-4.45(m,2H),4.32-4.26(m,1H),3.03-2.93(m,1H),2.54-2.44(m,1H),2.00(s,1.5H),1.97(s,1.5H),1.64(d,J＝7.0Hz,1.5H),1.63(d,J＝7.0Hz,1.5H),0.91(s,9H),0.13-0.09(m,6H)；167.1,167.0,164.8,152.6,151.4,151.3,149.7,144.3,144,2,141.9,141.8,133.7,132.8,132.4,130.2,130.1,129.1,129.0,128.9,128.0,127.8,127.1,127.0,123.8,123.7,85.3,85.1,85.1,85.0,72.5,72.4,64.2,64.0,43.6,40.4,40.2,25.8,23.5,20.5,20.4,18.0,-4.6,-4.7,-4.7；MS(ESI)calcd.forC33H42N5O5S2Si(M+H)+:680.9,found:680.8.
实施例11 5’-SSEB-2’-dA(Bz)(6b)的合成
取化合物5b(2.76g，4mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL THF溶解，加入Et3N·3HF(2.15g,40mmol HF)，室温下搅拌过夜，用饱和碳酸钠调节体系pH至碱性，旋干THF，加DCM萃取水相，合并有机相，用饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱，得到5’-SSEB-2’-dA(Bz)(6b)1.99g，产率88％；产物6b为差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.45(brs,1H,),8.71(s,0.5H),8.69(s,0.5H),8.20-8.14(m,2H),8.03-7.96(m,2H),7.72-7.76(m,1H),7.58-7.50(m,2H),7.49-7.41(m,3H),7.25-7.18(m,1H),6.46(t,J＝6.4Hz,1H),5.21(dd,J＝13.9,6.9Hz,0.5H),5.20(dd,J＝13.9,7.0Hz,0.5H),4.85-4.79(m,1H),4.63-4.50(m,2H),4.40-4.34(m,1H),2.97-2.85(m,1H),2.65-2.55(m,1H),1.96(s,1.5H),1.95(s,1.5H),1.62(d,J＝7.0Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.3,165.2,152.5,152.3，149.6，144.1，144.0，141.9，141.8，133.6，132.9，132.4，130.2，129.1，129.1，128.9，128.1，127.8，127.1127.0,123.4,85.1,85.0,84.9,84.8,71.3,71.6,64.6,64.4,53.5,43.8,43.7,40.0,23.6,23.5,20.4；MS(ESI)calcd.for C27H28N5O5S2(M+H)+:566.7,found:566.6.
实施例12 5’-SSEB-2’-dA(Bz)-phosphoramidite(7b)的合成
取化合物6b(1.70g,3mmol)于100mL圆底烧瓶中，密封，抽换氩气，加入20mL干燥的二氯甲烷溶解，将体系用冰浴冷却，依次滴加DIPEA(1.98mL，12mmol)与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1.34mL,6mmol)，加完后保持冰浴下搅拌30min。用20mL二氯甲烷稀释反应体系，后依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，HEX/EA/TEA体系过柱。得到5’-SSEB-2’-dA(Bz)-phosphoramidite(7b)1.56g,产率68％；产物为四个差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.36(brs,1H),8.12(s,1H),8.01-7.95(m,2H),7.77-7.70(m,1H),7.57-7.50(m,2H),7.48-7.42(m,3H),7.27-7.20(m,1H),6.48-6.40(m,1H),5.28-5.20(m,1H),4.94-4.83(m,1H),4.68-4.40(m,3H),3.92-3.82(m,1H),3.80-3.71(m,1H),3.68-3.58(m,2H),3.12-2.96(m,1H),2.74-2.58(m,3H),2.04-1.90(m,3H),1.66-1.58(m,3H),1.24-1.12(m,12H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.0,167.0,167.0,166.9,152.5,151.4,151.4,151.3,151.3,149.7,144.1,144.1,141.9,141,8,133.7,132.7,132.3,130.2,129.1,129.0,129.0,128.8,127.9,127.7,127.0,127.0,123.7,117.6,85.0,84.9,84.3,84.3,84.2,84.2,84.1,84.0,83.9,83.9,73.8,73.6,73.2,73.2,73.0,73.0,64.3,64.2,64.1,64.0,58.5,58.3,58.3,58.1,46.1,43.6,43.4,43.4,43.3,43.2,39.0,39.0,38.9,24.7,24.6,24.6,23.5,23.4,23.4,20.5,20.4,20.4；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ149.2,149.2,149.1,149.1；MS(ESI)calcd.for C36H45N7O6PS2(M+H)+:766.9,found:766.8.
实施例13 5’-DMT-2’-dG(iBu)(2c)的合成
取脱氧核苷1c(3.37g，10mmol)于100mL圆底烧瓶中，加吡啶旋蒸带水3次(3*20mL),加入25mL干燥的吡啶溶解，然后加入DMTCl(3.72g,11mmol),室温下搅拌2小时。将体系旋干，加入20mL甲苯再旋干带出剩余吡啶，过柱，得到5’-DMT-2’-dG(iBu)(2c)5.90g,产率93％。
实施例14 5’-DMT-3’-TBS-2’-d G(iBu)(3c)的合成
取醇2c(5.75g,9mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL干燥的DMF溶解，后加入咪唑(1.53g，22.5mmol),TBSCl(2.7g,18mmol)，加完后室温下搅拌过夜。加甲醇(5mL)淬灭反应，将吡啶旋干，加入二氯甲烷(50mL)溶解，溶液用饱和碳酸钠洗，饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过柱，得到5’-DMT-3’-TBS-2’-dG(iBu)(3c)5.90g，产率87％。
实施例15 3’-TBS-2’-dG(iBu)(4c)的合成
取化合物3c(5.42g,8mmol)与250mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷溶解，冰浴下搅拌下加入三氯乙酸(13.7g，80mmol)，加完后保持冰浴搅拌10分钟，用饱和碳酸钠调节体系pH至碱性，分液，二氯甲烷萃取水相，合并有机相，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱，得到3’-TBS-2’-dG(iBu)(4c)3.24g，产率90％.
实施例16 5’-SSEB-3’-TBS-2’-dG(iBu)(5c)的合成
取醇4c(2.71g,6mmol)与2-(1-甲基二硫基)乙基苯甲酸(1.5g，6.6mmol)于100mL圆底烧瓶，加入30mL二氯甲烷溶解，加入DCC(1.37g,6.6mmol)与DMAP(100mg)，加完后搅拌3h，过滤，有二氯甲烷洗涤滤渣，将滤液旋干，过柱，得到5’-SSEB-3’-TBS-2’-dG(iBu)(5c)3.50g,产率88％.产物5c为两个差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.11(brs,0.5H),12.09(brs,0.5H),9.49(brs,0.5H),9.43(brs,0.5H),7.78-7.76(m,1H),7.75-7.68(m,1H),7.59-7.55(m,1H),7.49(t,J＝7.6Hz,0.5H),7.49(t,J＝7.6Hz,0.5H),7.28(t,J＝7.5Hz,1H),6.27-6.21(m,1H),5.25-5.18(m,1H),4.78(dd,J＝11.4,5.9,Hz,0.5H),4.75(dd,J＝11.7,5.5,Hz,0.5H),4.60-4.47(m,2H),4.36-4.28(m,1H),2.92-2.71(m,2H),2.38-2.30(m,1H),1.95(s,1.5H),1.92(s,1.5H),1.64(d,J＝7.0Hz,1.5H),1.62(d,J＝7.0Hz,1.5H)，1.25-1.20(m，6H)，0.88(s，4.5H)，0.87(s，4.5H)，0.10-0.07(m，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ179.2,179.1,168.2,167.8,155.7,147.9,147.8,147.6,147.5,144.1,144.0,138.2,137.8,132.6,132.5,130.3,130.2,129.1,128.9,127.9,127.9,127.2,122.4,122.1,85.9,85.2,73.1,72.9,64.6,64.2,43.9,43.7,39.9,39.6,36.4,36.4,34.0,33.9,25.8,23.7,23.6,20.4,20.3,19.2,19.1,18.9,18.0,-4.6,-4.6,-4.7,-4.8；MS(ESI)calcd.for C30H44N5O6S2Si(M+H)+:662.9,found:662.9.
实施例17 5’-SSEB-2’-dG(iBu)(6c)的合成
取化合物5c(2.65g，4mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL THF溶解，加入Et3N·3HF(2.15g,40mmol HF),室温下搅拌过夜，用饱和碳酸钠调节体系pH至碱性，旋干THF，加DCM萃取水相，合并有机相，用饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱，得到5’-SSEB-2’-dG(iBu)(6c)1.75g，产率80％；产物6c为差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.43(brs,1H),10.51(brs,0.5H),10.43(brs,0.5H),7.95-7.91(m,1H),7.70(t,J＝7.6Hz,1H),7.51(d,J＝7.9Hz,1H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.21(t,J＝7.5Hz,1H),6.29-6.20(m,1H),5.20-5.13(m,1H),5.01-4.93(m,1H),4.68-4.48(m,2H),4.42-4.35(m,1H),2.97-2.87(m,1H),2.82-2.70(m,1H),2.60-2.50(m,1H),1.93(s,1.5H),1.90(s,1.5H),1.60(d,J＝7.0Hz,3H),1.29-1.23(m,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ180.4,168.0,167.7,156.0,148.3,148.2,148.2,144.0,144.0,138.8,138.6,132.4,130.4,129.4,129.2,127.8,127.1,121.4,121.2,85.7,85.4,85.0,71.5,71.4,65.3,65.0,53.6,43.9,43.8,39.8,36.4,36.3,23.6,23.5,20.4,20.4,19.2,19.2,19.1；MS(ESI)calcd.for C24H30N5O6S2(M+H)+:548.6,found:548.5.
实施例18 5’-SSEB-2’-dG(iBu)-phosphoramidite(7c)的合成
取化合物6c(1.64g,3mmol)于100mL圆底烧瓶中，密封，抽换氩气，加入20mL干燥的二氯甲烷溶解，将体系用冰浴冷却，依次滴加DIPEA(1.98mL，12mmol)与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1.34mL,6mmol)，加完后保持冰浴下搅拌30min。用20mL二氯甲烷稀释反应体系，后依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，HEX/EA/TEA体系过柱。得到5’-SSEB-2’-dG(iBu)-phosphoramidite(7c)1.36g,产率60％；产物为四个差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.35(brs,1H),7.84-7.60(m,2H),7.59-7.42(m,2H),7.29-7.21(m,1H),6.24-6.16(m,1H),5.26-5.18(m，1H)，4.96-4.82(m，1H)，4.77-4.66(m，1H)，4.62-4.52(m，1H)，4.50-4.38(m，1H)，3.96-3.84(m，1H)3.77-3.69(m,1H),3.67-3.54(m,2H),3.01-2.50(m,5H),1.99-1.94(m,3H),1.67-1.60(m,3H),1.25-1.15(m,18H)；179.5,179.5,179.4,179.3,179.3,170.3,167.9,167.8,167.6,167.4,155.7,152.5,147.8,147.7,147.7,147.6,147.6,144.0,144.0,143.9,138.4,138.2,137.9,137.6,133.4,132.4,132.4,130.6,130.5,130.3,130.2,129.2,129.1,128.9,128.1,127.8,127.7,127.1,127.0,124.9,123.6,118.0,117.9,85.9,85.7,85.4,85.0,84.3,84.2,84.1,84.0,83.8,74.6,74.4,73.6,73.5,64.9,64.6,64.4,64.3,57.9,57.8,57.7,57.4,45.3,43.8,43.6,43.4,43.4,43.3,43.2,39.3,38.9,38.8,36.2,36.1,36.0,35.9,34.5,24.7,24.6,24.6,24.6,24.5,23.5,20.7,20.6,20.6,20.4,20.3,20.3,19.1,19.1,19.1,18.9,18.9；31PNMR(162MHz,CDCl3)δ149.2,149.1,148.4,148.3；MS(ESI)calcd.for C33H47N7O7PS2(M+H)+:748.9,found:748.8.
实施例19 5’-DMT-2’-dC(Ac)(2d)的合成
取脱氧核苷1d(2.69g，10mmol)于100mL圆底烧瓶中，加吡啶旋蒸带水3次(3*20mL),加入25mL干燥的吡啶溶解，然后加入DMTCl(3.72g,11mmol)，室温下搅拌2小时。将体系旋干，加入20mL甲苯再旋干带出剩余吡啶，过柱，得到5’-DMT-2’-dC(Ac)(2d)5.20g，产率91％。
实施例20 5’-DMT-3’-TBS-2’-dC(Ac)(3d)的合成
取醇2d(5.13g,9mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL干燥的DMF溶解，后加入咪唑(1.53g，22.5mmol),TBSCl(2.7g,18mmol)，加完后室温下搅拌过夜。加甲醇(5mL)淬灭反应，将吡啶旋干，加入二氯甲烷(50mL)溶解，溶液用饱和碳酸钠洗，饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过柱，得到5’-DMT-3’-TBS-2’-dC(Ac)(3d)5.56g，产率90％。
实施例21 3’-TBS-2’-dC(Ac)(4d)的合成
取化合物3d(5.49g，8mmol)与250mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷溶解，冰浴下搅拌下加入三氯乙酸(13.7g，80mmol)，加完后保持冰浴搅拌10分钟，用饱和碳酸钠调节体系pH至碱性，分液，二氯甲烷萃取水相，合并有机相，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱，得到3’-TBS-2’-dC(Ac)(4d)2.60g，产率85％.
实施例22 5’-SSEB-3’-TBS-2’-dC(Ac)(5d)的合成
取醇4d(2.30g,6mmol)与2-(1-甲基二硫基)乙基苯甲酸(1.5g，6.6mmol)于100mL圆底烧瓶，加入30mL二氯甲烷溶解，加入DCC(1.37g,6.6mmol)与DMAP(100mg)，加完后搅拌3h，过滤，有二氯甲烷洗涤滤渣，将滤液旋干，过柱，得到5’-SSEB-3’-TBS-2’-dC(Ac)(5d)3.14g,产率88％.产物5d为两个差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.06(brs,1H),8.08(t,J＝8.0Hz,1H),7.76-7.71(m,1H),7.64-7.60(m,1H),7.58-7.53(m,1H),7.37-7.32(m,1H),7.30(d,J＝7.6Hz,0.5H),7.21(d,J＝7.5Hz,0.5H),6.24-6.16(m,1H),5.31-5.24(m,1H),4.61(dd,J＝12.4,4.0Hz,0.5H),4.54(d,J＝4.0Hz,1H),4.51(dd,J＝12.4,3.0Hz,0.5H),4.39-4.31(m,1H),4.26-4.21(m,1H),2.62-2.52(m,1H),2.27(s,1.5H),2.26(s,1.5H),2.20-2.10(m,1H),2.06(s,1.5H),1.98(s,1.5H),1.69(d,J＝7.0Hz,1.5H),1.69(d,J＝7.0Hz,1.5H),0.87(s,9H),0.08-0.04(m,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.0,167.1,167.0,162.9,154.8,144.3,144.3,144.0,143.9,132.7,132.7,129.8,129.8,129.2,129.0,128.1,127.2,96.7,87.3,87.2,85.3,84.9,71.2,70.6,63.5,63.4,43.7,43.6,42.2,42.0,25.8,25.0,23.6,23.6,20.4,20.4,18.0,-4.5,-4.5,-4.8,-4.8；MS(ESI)calcd.for C27H39N2O7S2Si(M+H)+:594.8,found:594.6.
实施例23 5’-SSEB-2’-dC(Ac)(6d)的合成
取化合物5d(2.38g，4mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL THF溶解，加入Et3N·3HF(2.15g,40mmol HF),室温下搅拌过夜，用饱和碳酸钠调节体系pH至碱性，旋干THF，加DCM萃取水相，合并有机相，用饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱，得到5’-SSEB-2’-dC(Ac)(6d)1.70g，产率89％；产物6d为差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.51(brs,1H),8.09(t,J＝7.5Hz,1H),7.77-7.73(m,1H),7.62-7.57(m,1H),7.52(t,J＝7.8Hz,1H),7.35-7.27(m,2H),6.28(t,J＝5.9Hz,1H),5.29-5.21(m,1H),4.71(dd,J＝4.4,12.4Hz,0.5H),4.64-4.50(m,1.5H),4.50-4.42(m,1H),4.40-4.34(m,1H),2.88-2.76(m,1H),2.24(s,1.5H),2.23(s,1.5H),2.20-2.10(m,1H),2.03(s,1.5H),1.99(s，1.5H)，1.68(d，J＝7.0Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ170.9，170.8，167.5，167.4，162.6，155.5，144.2,144.1,132.6,130.0,129.2,129.1,128.0,127.3,127.2,97.0,96.9,87.6,85.1,84.9,70.9,70.9,64.4,64.1,43.8,43.7,41.7,25.0,23.7,23.6,20.4,20.3；MS(ESI)calcd.for C21H25N2O7S2(M+H)+:480.6,found:480.5.
实施例24 5’-SSEB-2’-dC(Ac)-phosphoramidite(7d)的合成
取化合物6d(1.44g,3mmol)于100mL圆底烧瓶中，密封，抽换氩气，加入20mL干燥的二氯甲烷溶解，将体系用冰浴冷却，依次滴加DIPEA(1.98mL，12mmol)与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1.34mL,6mmol)，加完后保持冰浴下搅拌30min。用20mL二氯甲烷稀释反应体系，后依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，HEX/EA/TEA体系过柱。得到5’-SSEB-2’-dC(Ac)-phosphoramidite(7d)1.34g,产率66％；产物为四个差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.86(brs,1H),8.08-7.98(m,1H),7.78-7.72(m,1H),7.64-7.58(m,1H),7.57-7.50(m,1H),7.36-7.20(m,2H),6.28-6.18(m,1H),5.31-5.22(m,1H),4.70-4.49(m,3H),4.47-4.36(m,1H),3.90-3.80(m,1H),3.78-3.68(m,1H),3.66-3.54(m,2H),2.82-2.68(m,1H),2.66-2.58(m,2H),2.25(s,1.5H),2.24(s,1.5H),2.05(s,0.75H),2.04(s,0.75H),1.99(s,1.5H),1.72-1.67(m,3H),1.19-1.14(m,12H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.0,167.1,167.0,167.0,166.9,162.9,162.9,155.0,144.3,144.2,143.8,132.6,129.9,129.2,129.1,129.0,129.0,128.1,128.0,127.2,117.6,96.8,96.8,96.8.87.4,87.3,87.2,84.6,84.2,84.2,83.8,72.7,72.5,72.2,63.8,63.7,58.4,58.2,46.2,43.7,43.6,43.5,43.5,43.4,43.4,41.0,41.0,40.9,40.9,25.0,24.7,24.7,24.6,23.6,23.6,20.4,20.4；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ149.6,149.5,149.5,149.4；MS(ESI)calcd.for C30H43N5O7PS2(M+H)+:680.8,found:680.8。
实施例25 5’-SSEB-2’-dT-CPG的合成
(1)5’-SSEB-3’-succinic acid-2’-dT(8a)的合成
取醇6a(904mg,2mmol)与DMAP(366mg，3mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入50mL干燥吡啶溶解，之后往体系中加入琥珀酸酐(300mg，3mmol)。反应在室温下搅拌48h,加入3mL水淬灭反应，将吡啶旋干，后用甲苯溶解旋干带出剩余吡啶，用二氯甲烷/甲醇体系过柱，得到酸8a约972mg，产率88％。8a,差向异构体混合物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.05(brs,1H),7.81-7.75(m,1H),7.65-7.60(m,1H),7.56-7.60(m,1H),7.34-7.28(m,1H),7.26-7.24(m,1H),6.36-6.29(m,1H),5.41-5.34(m,1H),5.31-5.22(m,1H),4.70-4.48(m,2H),4.43-4.38(m,1H),2.74-2.62(m,4H),2.59-2.48(m,1H),2.26-2.15(m,1H),2.13(s,1.5H),2.06(s,1.5H),1.72-1.65(m,4.5H),1.56-1.53(m,1.5H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.2,172.0,171.9,167.0,166.9,164.6,150.6,144.6,135.2,132.7,129.8,129.7,129.1,129.0,128.2,128.2,127.2,111.9,111.7,84.8,82.0,74.7,74.5,64.6,64.4,43.6,43.4,37.7,37.6,29.3,29.0,23.6,20.5,20.3,12.3,12.3。
(2)5’-SSEB-2’-dT-CPG的合成
取CPG-linker-NH2(500mg),化合物8a(156mg,0.3mmol)于100mL锥形瓶中，加入10mL吡啶，再加入DCC(550mg，2.64mmol)，将体系于室温下密封震荡48h,将体系过滤，得到的CPG粉末依次用吡啶，二氯甲烷，乙腈清洗，干燥。将得到的CPG粉末置于100mL干燥的锥形瓶中，加入商业化的盖帽试剂A(Cap A)，盖帽试剂(Cap B)(迪纳兴科)各5mL。将体系于密封下震荡48h，过滤，得到的CPG粉末用乙腈清洗，干燥，得到500mg CPG-dT-SSEB 9(CPG-A)。
SSEB含量测定：称取10mg的CPG-dT-SSEB 9，使用0.5mL 20mM THPP水溶液处理，并用0.5mL乙腈清洗处理后的CPG，将两者合并，检测HPLC并与标准曲线(以SSEB脱除后的产物作为标准品，配制梯度浓度1.5mg/mL,750ug/mL,250ug/mL,150ug/mL,75ug/mL,15ug/mL，用HPLC分析,以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标绘制标准曲线)对照，得到合成的CPG的SSEB含量约29.5μmol/g。
下述实施例中，氧化试剂为0.02M I2的吡啶/四氢呋喃/水溶液。
实施例26寡核苷酸T4的合成
寡核苷酸T4的合成是在ABI 3400寡核苷酸合成仪上，使用CPG-A(SSEB-2’-dT-CPG)为固相载体，合成量为0.2μmol，合成使用合成仪上设定的0.2μmol标准合成程序，采用DMT-OFF合成模式，在完成最后一个碱基的合成后脱除SSEB。合成中使用的5-乙巯基四氮唑活化剂，氧化试剂，Cap A,Cap B试剂均采用迪纳兴科购买的商业化试剂，脱保护试剂采用20mM THPP的水溶液，单体采用SSEB-2’-dT-phosphoramidite(7a)的乙腈溶液，浓度为50mg/mL。合成完成后，使用1mL浓氨水处理CPG载体1h以将产物从CPG上切下，再将所得氨水溶液与60℃下脱保护16h，将体系60℃真空下浓缩氨水得到T4的粗产物，使用200μL去离子水溶解，使用HPLC检测，并与目标序列的HPLC谱图对照。ESI-MS analysis(calculated m/zfor T4 1154.1，found 1153.1[M-H+]-,576[M-2H+]2-。
实施例27寡核苷酸T10的合成
寡核苷酸T10的合成是在ABI 3400寡核苷酸合成仪上，使用CPG-A(SSEB-2’-dT-CPG)为固相载体，合成量为0.2μmol，合成使用合成仪上设定的0.2μmol标准合成程序，采用DMT-OFF合成模式，在完成最后一个碱基的合成后脱除SSEB。合成中使用的5-乙巯基四氮唑活化剂，氧化试剂，Cap A,Cap B试剂均采用迪纳兴科购买的商业化试剂，脱保护试剂采用20mM THPP的水溶液，单体采用SSEB-2’-dT-phosphoramidite(7a)的乙腈溶液，浓度为50mg/mL。合成完成后，使用1mL浓氨水处理CPG载体1h以将产物从CPG上切下，再将所得氨水溶液与60℃下脱保护16h，将体系60℃真空下浓缩氨水得到T10的粗产物，使用200μL去离子水溶解，使用HPLC检测，并与目标序列的HPLC谱图对照。ESI-MS analysis(calculated m/zfor T10 2980.0,744.0[M-2H+]2-,595.3[M-5H+]5-。
实施例28寡核苷酸T15的合成
寡核苷酸T15的合成是在ABI 3400寡核苷酸合成仪上，使用CPG-A(SSEB-2’-dT-CPG)为固相载体，合成量为0.2μmol，合成使用合成仪上设定的0.2μmol标准合成程序，采用DMT-OFF合成模式，在完成最后一个碱基的合成后脱除SSEB。合成中使用的5-乙巯基四氮唑活化剂，氧化试剂，Cap A,Cap B试剂均采用迪纳兴科购买的商业化试剂，脱保护试剂采用20mM THPP的水溶液，单体采用SSEB-2’-dT-phosphoramidite(7a)的乙腈溶液，浓度为50mg/mL。合成完成后，使用1mL浓氨水处理CPG载体1h以将产物从CPG上切下，再将所得氨水溶液与60℃下脱保护16h，将体系60℃真空下浓缩氨水得到T15的粗产物，使用200μL去离子水溶解，使用HPLC检测，并与目标序列的HPLC谱图对照。ESI-MS analysis(calculated m/zfor T15 4501.0，found 1502.0[M-3H+]3-,1124.0[M-4H+]4-,898.2[M-5H+]5-,748.4[M-6H+]6-。
实施例29寡核苷酸T20的合成
寡核苷酸T20的合成是在ABI 3400寡核苷酸合成仪上，使用CPG-A(SSEB-2’-dT-CPG)为固相载体，合成量为0.2μmol，合成使用合成仪上设定的0.2μmol标准合成程序，采用DMT-OFF合成模式，在完成最后一个碱基的合成后脱除SSEB。合成中使用的5-乙巯基四氮唑活化剂，氧化试剂，Cap A,Cap B试剂均采用迪纳兴科购买的商业化试剂，脱保护试剂采用20mM THPP的水溶液，单体采用SSEB-2’-dT-phosphoramidite(7a)的乙腈溶液，浓度为50mg/mL。合成完成后，使用1mL浓氨水处理CPG载体1h以将产物从CPG上切下，再将所得氨水溶液与60℃下脱保护16h，将体系60℃真空下浓缩氨水得到T20的粗产物，使用200μL去离子水溶解，使用HPLC检测，并与目标序列的HPLC谱图对照。ESI-MS analysis(calculated m/zfor T20 6021.1，1504.3[M-4H+]4-,1023.2[M-5H+]5-,1002.5[M-6H+]6-,859.1[M-7H+]7-,668.0[M-9H+]9-。
实施例30寡核苷酸TA4的合成
寡核苷酸TA4的合成是在ABI 3400寡核苷酸合成仪上，使用CPG-A(SSEB-2’-dT-CPG)为固相载体，合成量为0.2μmol，合成使用合成仪上设定的0.2μmol标准合成程序，采用DMT-OFF合成模式，在完成最后一个碱基的合成后脱除SSEB。合成中使用的5-乙巯基四氮唑活化剂，氧化试剂，Cap A,Cap B试剂均采用迪纳兴科购买的商业化试剂，脱保护试剂采用20mM THPP的水溶液，单体采用SSEB-2’-dA(Bz)-phosphoramidite(7b)的乙腈溶液，浓度为100mg/mL。合成完成后，使用1mL浓氨水处理CPG载体1h以将产物从CPG上切下，再将所得氨水溶液与60℃下脱保护16h，将体系60℃真空下浓缩氨水得到TA4的粗产物，使用200μL去离子水溶解，使用HPLC检测，并与目标序列的HPLC谱图对照。ESI-MS analysis(calculatedm/z for TA4 2913.0，found 970.0[M-3H+]3-，727.4[M-4H+]4-。
实施例31寡核苷酸TC4的合成
寡核苷酸TC4的合成是在ABI 3400寡核苷酸合成仪上，使用CPG-A(SSEB-2’-dT-CPG)为固相载体，合成量为0.2μmol，合成使用合成仪上设定的0.2μmol标准合成程序，采用DMT-OFF合成模式，在完成最后一个碱基的合成后脱除SSEB。合成中使用的5-乙巯基四氮唑活化剂，氧化试剂，Cap A,Cap B试剂均采用迪纳兴科购买的商业化试剂，脱保护试剂采用20mM THPP的水溶液，单体采用SSEB-2’-dC(Ac)-phosphoramidite(7d)的乙腈溶液，浓度为100mg/mL。合成完成后，使用1mL浓氨水处理CPG载体1h以将产物从CPG上切下，再将所得氨水溶液与60℃下脱保护16h，将体系60℃真空下浓缩氨水得到TC4的粗产物，使用200μL去离子水溶解，使用HPLC检测，并与目标序列的HPLC谱图对照。ESI-MS analysis(calculatedm/z for TC4 1399.0，found 1397.8[M-H+]-,698.4[M-2H+]2-。
实施例32寡核苷酸TGTG的合成
寡核苷酸TGTG的合成是在ABI 3400寡核苷酸合成仪上，使用CPG-A(SSEB-2’-dT-CPG)为固相载体，合成量为0.2μmol，合成使用合成仪上设定的0.2μmol标准合成程序，采用DMT-OFF合成模式，在完成最后一个碱基的合成后脱除SSEB。合成中使用的5-乙巯基四氮唑活化剂，氧化试剂，Cap A,Cap B试剂均采用迪纳兴科购买的商业化试剂，脱保护试剂采用20mM THPP的水溶液，单体采用SSEB-2’-dT-phosphoramidite(7a)的乙腈溶液，浓度为50mg/mL,SSEB-2’-dG(iBu)-phosphoramidite(7c)的乙腈溶液，浓度为100mg/mL。合成完成后，使用1mL浓氨水处理CPG载体1h以将产物从CPG上切下，再将所得氨水溶液与60℃下脱保护16h，将体系60℃真空下浓缩氨水得到TGTG的粗产物，使用200μL去离子水溶解，使用HPLC检测，并与目标序列的HPLC谱图对照。ESI-MS analysis(calculated m/z for TGTG1204.9，found 1204.0[M-H+]-,601.5[M-2H+]2-。
本发明合成的寡核苷酸的单循环产率如下表所示，均在98％以上。
表1合成的寡核苷酸的单循环产率
序列 单循环产率
T4 99％
T10 98.5％
T15 98.5％
T20 98.5％
TAAAA 98％
TCCCC 98.5％
TGTG 98.5％
实施例33脱保护溶剂的筛选
使用上述合成的5’-SSEB-3’-TBS-2’-dT(5a)为底物尝试不同溶剂配置的THPP溶液的脱除效率。配置1mM 5’-SSEB-3’-TBS-2’-dT的乙腈溶液，然后将其与待测的20mM THPP溶液1:1混合，静止1min后用HPLC检测对照。测试结构如下表所示。
表2 20mM THPP在不同溶剂中的脱保护效率检测
由上表可知，当使用纯有机溶剂，如乙腈，甲醇时，脱保护效率最差，在此情况下，原料部分分解，而体系中大部分为关环前的中间体，产物量很少。使用20mM THPP的纯水溶液效果最好，可在1分钟之内基本完成脱保护。
实施例34保护基(SSEB)的稳定性
在上机进行oligo合成时，在每一循环的偶联，氧化，盖帽这三个步骤中，SSEB保护基都是存在于oligo末端，从而会长期暴露于偶联的活化剂，氧化试剂以及盖帽试剂中。因此需要考察该基团在这些试剂中是否能稳定存在。
将5’-SSEB-3’-TBS-2’-dT(5a)作为模型用于考察SSEB在这些试剂中是否稳定。配置5’-SSEB-3’-TBS-2’-dT(5a)的1mM乙腈溶液，并将其与等体积的商业化的活化剂(0.25M5-乙巯基四氮唑的乙腈溶液),氧化试剂(0.02M I2的吡啶/四氢呋喃/水溶液)，盖帽试剂A(CAP A),盖帽试剂B(CAP B),CAP A/CAP B(1:1,v:v)混合，24小时后经HPLC检测均无明显变化，因此认为商业化的合成仪配套试剂可用于SSEB保护的体系的oligo合成。
实施例35脱保护试剂(THPP)对氨基保护的影响
除T碱基之外，A，C，G单体上碱基均有活泼氨基，在亚磷酰胺合成以及oligo合成过程中均会对反应造成影响。因此，A，C，G的碱基在合成亚磷酰胺之前均需要先对氨基进行保护。本实施例中A碱基用苯甲酰基(Bz)保护，C碱基用乙酰基(Ac)保护，而G碱基用异丁酰基(iBu)保护。
因此，本发明合成了相应的5’-DMT-3’-TBS-2’-dA(Bz)(5b),5’-DMT-3’-TBS-2’-dG(iBu)(5c),5’-DMT-3’-TBS-2’-dC(Ac)(5d)，并将其配成1mM的乙腈溶液，与等体积的20mM THPP混合24小时后经HPLC检测，仍无变化。因此，可推知THPP不会对氨基上的相应保护基产生影响，因此本发明中，单体A碱基的氨基用苯甲酰基(Bz)保护，单体C碱基的氨基用乙酰基(Ac)可保护，而单体G碱基的氨基使用异丁酰基(iBu)保护。
实施例36固相载体与oligo之间的连接臂(linker)的筛选
(1)使用市场化的DMT保护的通用CPG尝试合成，首先使用TCA手动脱除DMT保护基后上合成仪，使用本发明的全套试剂(SSEB-2’-dT-亚磷酰胺单体溶液，THPP脱保护试剂以及盖帽试剂，氧化试剂)进行polyT的合成，结果基本无产物生成。
(2)将5’-SSEB-2’-dT(6a)与丁二酸酐反应得到5’-SSEB-3’-丁二酸-2’-dT(8a)的产物，再将其与CPG-Linker-NH2反应，后使用盖帽试剂将未反应的氨基淬灭，从而得到两种带不同linker的SSEB-2’-dT-CPG：CPG A与CPG B。其中，CPG A的linker为一长碳链，而CPGB的linker则与通用CPG的linker类似。经过上机测试，发现CPG A可以很好的适用于本发明的SSEB保护-脱保护合成体系，而与通用CPG类似的CPG B，则与商业化的通用CPG脱DMT后类似，不适用于本体系，例如，使用CPG A与CPG B分别用我们的体系合成T15，发现与通用CPG类似，CPG B合成无法得到反应产物，而使用CPG A则可成功合成T15，结果如图4所示(注：图4中叠影不影响对技术方案/效果的解读)，

Claims (16)

1.如式A所示的化合物或如式B所示的化合物，
其中，Basepg指碱基或带有保护基的碱基；
R1和R2分别独立地为C1-6烷基；
或者R1和R2连接形成C2-20环烷基、被一个或多个C1-6烷基取代的C2-20环烷基或“杂原子选自N、O和S中的1种、2种或3种，杂原子数为1、2或3个的C2-20碳杂环”；
R3、R4、R5、R6分别独立地为氢、卤素、带有保护基的氨基、带有保护基的羟基或C1-6烷基；
或者，R3与R4、R4与R5或R5与R6连接形成C2-20环烷基、被一个或多个C1-6烷基取代的C2-20环烷基或“杂原子选自N、O和S中的1种、2种或3种，杂原子数为1、2或3个的C2-20碳杂环”；
R7为磷酸保护基团；
R8和R9分别独立地为C1-6烷基；
或者，R8和R9连接形成C2-20环烷基、被一个或多个C1-6烷基取代的C2-20环烷基或“杂原子选自N、O和S中的1种、2种或3种，杂原子数为1、2或3个的C2-20碳杂环”。
2.如权利要求1所述的如式A所示的化合物或如式B所示的化合物，其特征在于，其满足以下条件中的一个或多个：
(1)带有保护基的碱基为带有苯丙酰基的A碱基、带有乙酰基的C碱基或带有异丁酰基的G碱基；
(2)所述R1和R2分别独立地为甲基、乙基或异丙基，优选甲基；
(3)所述R3、R4、R5、R6为氢；
(4)所述R7为β-氰乙基、甲基、苄基、烯丙基、2-(对硝基苯基)-1-乙基、4-甲硫基-1-丁基、2-(N-乙酰基)-氨基-1-乙基或2-萘基氨基甲酰氧基-1-乙基，优选β-氰乙基基团；
(5)所述R8和R9分别独立地为甲基、乙基或异丙基，优选为异丙基。
3.如权利要求1所述的如式A所示的化合物或如式B所示的化合物，其特征在于，所述如式A所示的化合物为
4.一种如权利要求1所述如式A所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，在碱存在下，化合物A-1与进行如下所示的反应，得到化合物A；
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Basepg如权利要求1所述的如式A所示的化合物或如B所示的化合物所定义，
所述溶剂优选为卤代烷烃类溶剂，更优选二氯甲烷；
所述碱优选为N,N-二异丙基乙胺；
所述与所述化合物A-1的摩尔比优选为2:1；
所述碱与所述化合物A-1的摩尔比优选为4:1。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，化合物A-2与Et3N·3HF进行如下所示的反应，得到化合物A-1；
其中，
所述溶剂优选为醚类溶剂，更优选四氢呋喃；
所述Et3N·3HF与所述化合物A-2的摩尔比优选为10:1。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，在碱和脱水剂存在下，化合物A-3与如式C所示的化合物进行如下所示的反应，得到化合物A-2；
其中，
所述溶剂优选为卤代烷烃类溶剂，更优选二氯甲烷；
所述碱优选为4-二甲氨基吡啶；
所述碱与所述化合物A-3的摩尔比优选为0.14:1；
所述脱水剂优选为二环己基碳二亚胺；
所述脱水剂与所述化合物A-3的摩尔比优选为1.1:1；
所述如式C所示化合物与所述化合物A-3的摩尔比优选为1.1:1。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，在酸存在下，所述化合物A-4进行如下所示反应，得到化合物A-3；
其中，
所述溶剂优选为卤代烷烃类溶剂，更优选二氯甲烷；
所述酸优选为三氯乙酸；
所述酸与所述化合物A-4的摩尔比优选为10：1。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，在咪唑存在下，化合物A-5与TBS-Cl进行如下所示的反应，得到化合物A-4；
其中，
所述溶剂优选为酰胺类溶剂，更优选N,N-二甲基甲酰胺；
所述咪唑与所述化合物A-5的摩尔比优选为2.5:1；
所述TBS-Cl与所述化合物A-5的摩尔比优选为2:1。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述如式A所示化合物的制备方法还包括如下步骤：在溶剂中，化合物A-6与DMT-Cl进行如下所示的反应，得到化合物A-5；
其中，
所述溶剂优选为吡啶；
所述DMT-Cl与所述化合物A-6的摩尔比优选为1.1:1。
10.一种如式C所示的化合物在合成核酸中的应用；
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6如权利要求1所述的如式A所示的化合物或如B所示的化合物所定义，
所述如式C所示的化合物优选为
11.一种如式C所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，化合物D与三羟丙基膦进行如下所示的反应，得到化合物C，R为 R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Basepg如权利要求1所述的如式A所示的化合物或如B所示的化合物所定义，
所述溶剂优选为腈类溶剂(例如乙腈)、醇类溶剂(例如甲醇)和水中的一种或多种。
12.一种含有起始核酸分子的固相载体(SSEB-2’-dN-CPG)的制备方法，其包括如下步骤：
在脱水剂和碱存在下，CPG-linker-NH2与化合物E(SSEB-2’-dN)进行如下所示的反应，得到含有起始核酸分子的固相载体(SSEB-2’-dN-CPG)，R1、R2、R3、R4、R5、R6、Basepg的定义如权利要求1所述，dN代表dA、dC、dT和dG以及其它脱氧核苷酸的任一种，
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，其满足以下条件中的一个或多个：
(1)所述CPG-linker-NH2为
(2)所述化合物E为
(3)所述脱水剂为二环己基碳二亚胺；
(4)所述碱为吡啶；
(5)所述反应还包括如下后处理步骤：洗涤和干燥，所述洗涤所用溶剂优选为吡啶、二氯甲烷和乙腈；
(6)所述含有起始核酸分子的固相载体的制备方法还包括盖帽步骤，例如使用盖帽试剂A和盖帽试剂B盖帽。
14.一种核酸合成方法，其包括如下步骤：
(1)在溶剂中，将如权利要求12所述的方法所制备的SSEB-2’-dN-CPG与三羟丙基膦进行脱保护反应，得到
(2)在活化剂存在下，将所述dN-CPG与如权利要求1所述的如式A所示的化合物反应，生成带有保护基的亚磷酸三酯；
(3)在氧化剂作用下，将带有保护基的亚磷酸三酯进行氧化反应，得到带有保护基的磷酸酯；
(4)在溶剂中，将带有保护基的磷酸酯与三羟丙基膦进行脱保护反应，得到第一延伸产物；
(5)任选地，重复步骤(2)、(3)、(4)，得到延伸产物；
(6)所述延伸产物或第一延伸产物与切除溶剂反应，以切除CPG-Linker-NH2。
15.如权利要求14所述的核酸合成方法，其特征在于，其满足以下条件中的一个或多个：
(1)步骤(1)中，所述溶剂为腈类溶剂(例如乙腈)、醇类溶剂(例如甲醇)和水中的一种或多种；
(2)步骤(1)中，所述三羟丙基膦与所述SSEB-2’-dN-CPG的摩尔比为20:1；
(3)步骤(2)中，所述活化剂为5-乙巯基四氮唑，优选0.25mol/L的5-乙巯基四氮唑的乙腈溶液；
(4)步骤(3)中，所述氧化剂为I2/吡啶/四氢呋喃/水体系，优选0.02mol/L的I2的吡啶、四氢呋喃和水的混合溶液；
(5)步骤(4)中，所述溶剂为腈类溶剂(例如乙腈)、醇类溶剂(例如甲醇)和水中的一种或多种；
(6)步骤(4)中，所述三羟丙基膦与所述带有保护基的磷酸酯的摩尔比为20:1；
(7)步骤(6)中，所述切除溶剂为氨水，优选为1mL浓氨水；
(8)所述步骤(2)还包括盖帽步骤，例如使用盖帽试剂A和盖帽试剂B进行盖帽；
(9)还包括以下步骤：将步骤(6)所得体系进一步脱保护例如16h，并真空浓缩，优选所述脱保护与真空浓缩在例如60℃下进行。
16.一种含有如权利要求1所述的如式A所示化合物或如式B所示化合物的试剂盒，优选地，所述试剂盒还含有如权利要求14所述的核酸合成方法所定义的活化剂、氧化剂、三羟丙基膦和切除溶剂、如权利要求15所述的核酸合成方法所定义的盖帽试剂A和盖帽试剂B中的一种或多种。
CN202210682346.9A 2022-06-15 2022-06-15 一种化合物及核酸合成方法 Pending CN117264004A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210682346.9A CN117264004A (zh) 2022-06-15 2022-06-15 一种化合物及核酸合成方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210682346.9A CN117264004A (zh) 2022-06-15 2022-06-15 一种化合物及核酸合成方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117264004A true CN117264004A (zh) 2023-12-22

Family

ID=89201475

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210682346.9A Pending CN117264004A (zh) 2022-06-15 2022-06-15 一种化合物及核酸合成方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117264004A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2627216C (en) Polynucleotide labelling reagent
EP2599785A1 (en) Novel methods for the synthesis and purification of oligomers
US5869696A (en) Universal solid supports and methods for their use
NO309482B1 (no) Fremgangsmåte for syntese av mer enn ett oligonukleotid samt forbindelse og anvendelse derav
JPH0812697A (ja) 新規ポリヌクレオチド
JP4705716B2 (ja) オリゴヌクレオチドの脱保護法
EP3778619A1 (en) Segment for oligonucleotide synthesis, production method for same, and oligonucleotide synthesis method using same
JPH09510206A (ja) オリゴヌクレオチドの合成に用いる組成物および方法
KR101437824B1 (ko) 올리고뉴클레오티드의 합성
KR20030032924A (ko) 포스포로티오에이트 트리에스테르의 제조 방법
US5808039A (en) 2'-OMe CAC phosphoramidite and methods for preparation and use thereof
CN110891961B (zh) 制备伊美司他(imetelstat)的改良方法
WO2007059912A1 (en) Polynucleotide labelling reagent
CN117264004A (zh) 一种化合物及核酸合成方法
Chillar et al. PEGylated Dmoc phosphoramidites for sensitive oligodeoxynucleotide synthesis
CN114014902B (zh) 一种二聚核苷酸及其合成方法
JP4015136B2 (ja) フェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体および光応答性ヌクレオチド
KR100228606B1 (ko) 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성 방법
JP4805143B2 (ja) ２‘水酸基を修飾された新規人工ｒｎａ
CA2685515A1 (en) Synthesis of oligonucleotides
KR20230166114A (ko) 시퀀싱을 위한 뉴클레오타이드 유사체
RU2440364C2 (ru) Синтез фосфитилированных соединений с использованием четвертичного гетероциклического активатора
Yagodkin et al. Universal linker phosphoramidite
WO2011102414A1 (ja) オリゴヌクレオチド誘導体
JP2005255528A (ja) 新規炭酸エステル誘導体及びそれらを利用する核酸合成法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination