KR20230166114A - 시퀀싱을 위한 뉴클레오타이드 유사체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵산 서열분석 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에서는 서열 분석을 위한 뉴클레오타이드 유사체를 제공한다. 뉴클레오타이드 유사체는 염기 또는 리보스 고리 3'-OH에 링커를 가지고 있으며 NGS 시퀀싱에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 키트 및 상기 뉴클레오타이드 유사체에 기초한 서열 분석 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 핵산 시퀀싱(sequencing)을 위한 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 서열분석을 위한 뉴클레오타이드 유사체(analogue)에 관한 것이다.
NGS 시퀀싱의 출현은 Sanger 시퀀싱의 높은 비용과 시간 요구라는 단점을 극복하고 유전자 시퀀싱 기술의 적용을 크게 촉진한다. 현재 NGS 시퀀싱은 산전 검사, 종양 진단, 종양 치료, 동식물 육종 등의 분야에 깊이 적용되어 과학과 의학의 발전을 촉진하고 있다.
가역적(reversible) 차단기(blocking group)를 운반하는(carrying) 디옥시-리보뉴클레오사이드 삼인산(deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP) 유사체는 NGS 시퀀싱의 핵심 원료이다. 가역적 차단기의 통합으로 인해 dNTP의 3'-OH기가 유지될 수 있으며, 이는 Sanger 시퀀싱의 단점을 극복하고 염기 인식의 정확성을 보장한다. 가역적 차단기를 갖는 dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate) 유사체는 NGS 시퀀싱에서 가장 중요한 기술이라고 할 수 있으며, NGS 시퀀싱에서 절단 가능한 링커와 검출 가능한 라벨이 있는 뉴클레오타이드를 적용하는 것이 염기 검출을 실현하는 열쇠이다.
본 발명은 염기 또는 뉴클레오타이드의 리보스 고리(ribose ring) 3'-OH에 절단 가능하고 검출 가능한 표지의 에스테르(ester) 또는 카르보네이트 에스테르(carbonate ester)를 갖는 것과 같은 NGS 시퀀싱에 유용한 dNTP 유사체 유형을 개발하려는 의도이다.
제1 유형의 dNTP 유사체는 도 1에 표시된 일반 구조를 가지며, 2-데옥시우리딘 삼인산(2'-deoxyuridine triphosphate), 2'-데옥시시티딘 삼인산(2'-deoxycytidine triphosphate), 7-데아자-2'-데옥시아데노신 삼인산(7-deaza-2'-deoxyadenosine triphosphate)의 및 7-데아자-2'-데옥시구아노신 삼인산(7-deaza-2'-deoxyguanosine triphosphate)의 주요 구조를 포함하여 염기에 절단 가능하고 검출 가능한 표지가 있는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 제1 유형의 dNTP 유사체에서는, 리보스 고리(ribose ring) 3'-OH가 해당 분야에서 3'-OH에 일반적으로 사용되는 임의의 가역적 차단기와 연결되어 우수한 효과를 나타낸다. 제2 유형의 dNTP 유사체는 도 2에 표시된 일반 구조를 가지며, 리보스 고리 3'-OH의 가역적 차단기에 연결된 감지 가능한 라벨이 있는 뉴클레오타이드를 나타낸다.
이를 위해, 본 발명의 제1 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물 또는 이의 염을 제공하고,
상기:
L1는 , , 선택되며;
r1, r2, r3a, r3b, r4은 서로 독립적으로, 1 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
M은 직접 결합, CH2, NH, O, S로부터 선택되며;
L2는 이고, 바람직하게, W는 R에 연결되며;
L3는 이고, 바람직하게, W는 R에 연결되며;
각 X는 독립적으로, O, S, NH로부터 선택되고;
Y는 직접 결합, O, S, NH로부터 선택되며;
각 W는 독립적으로, O, S, NH로부터 선택되고;
R은 이며;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나는 이고, 나머지는 서로 독립적으로, H, , 아지도(azido), 니트로(nitro), 아미노(amino), 설포(sulfo), 카르복실(carboxyl), 지방족 알킬(aliphatic alkyl)(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(cycloalkyl)(예: C3-C6 시클로알킬), 방향족 알킬(aromatic alkyl)(예: 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(alkoxyl)(예: C1-C6 알콕실)로부터 선택되며;
r5, r6, r7은 서로 독립적으로 1에서 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
r8, r9는 서로 독립적으로 0, 1로부터 선택되며, r8 및 r9는 동시에 0이 아니고;
M1, M2, M3은 서로 독립적으로, 직접 결합, NH, O, S로부터 선택되며;
Ra는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예: Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예, 페닐 -C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬)로부터 선택되고;
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx로부터 선택되며, 다른 하나는 H, 지방족 알킬(aliphatic alkyl)(예: C1-C6 알킬, 예: Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(aromatic alkyl)(예, 페닐 -C1-C6 알킬), 시클로알킬(cycloalkyl)(예를 들어, C3-C6 시클로알킬)로부터 선택되고, 상기 각 Rx는 독립적으로, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 C1-C6 알킬)로부터 선택되며;
R0는 H, 일인산기(monophosphate group)(), 이인산기(diphosphate group)(), 삼인산기(triphosphate group)(), 사인산기(tetraphosphate group)()로부터 선택되고;
각 Z는 독립적으로, O, S, BH로부터 선택되며;
염기1, 염기2는 서로 독립적으로, 염기(base), 데아자 염기(deaza base) 및 이의 토토머(tautomer), 예를 들어, 아데닌(adenine), 7-데아자아데닌(7-deazaadenine), 티민(thymine), 우라실(uracil), 시토신(cytosine), 구아닌(guanine), 7-데아자구아닌(7-deazaguanine) 및 이의 토토머로부터 선택되고;
화학식 I에서, R'은 가역적 차단기를 나타내며, 화학식 II에서, 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , , , , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , , , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r1은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r1은 1이다.
일부 구현예에 있어서, r2은 1, 2, 3 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r2은 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3a, r3b는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r3a, r3b는 서로 독립적으로 1, 2, 3으로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r3a는 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3b는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r4는 1, 2, 3으로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r4는 1이다.
일부 구현예에 있어서, M은 CH2, O로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 각 X는 독립적으로, O, S로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O이다.
일부 구현예에 있어서, Y는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, W는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로, H, 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나는 이고, 다른 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 H, 로부터 선택되며, 나머지 3개는 H이다.
일부 구현예에 있어서, r5는 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r7은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r7은 2이다.
일부 구현예에 있어서, M1은 직접 결합, NH, O로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, M2은NH이다.
일부 구현예에 있어서, M3는 직접 결합, NH로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Ra은 H, C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Ra은 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로부터 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me, -SS-Et로부터 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me로부터 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, R은 , , , , , , , , , , , , , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R0은 삼인산기()이다.
일부 구현예에 있어서, Z는 O이다.
일부 구현예에 있어서, 염기1은 , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 염기2은 , , , 로부터 선택된다.
본 발명의 제2 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 I-1 또는 이의 염의 화합물을 제공하고,
화학식 I-1
상기:
L1 은 , 로부터 선택되며;
r1, r2, r3a, r3b는 서로 독립적으로, 1 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
M은 직접 결합, CH2, NH, O, S로부터 선택되며;
X는 O, S, NH로부터 선택되고;
Y는 직접 결합, O, S, NH로부터 선택되며;
W는 직접 결합, O, S, NH로부터 선택되고;
R은 이며;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예: R2, R3 또는 R4)는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로, H, , 아지도(azido), 니트로(nitro), 아미노(amino), 설포(sulfo), 카르복실(carboxyl), 지방족 알킬(aliphatic alkyl)(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(cycloalkyl)(예: C3-C6 시클로알킬), 방향족 알킬(aromatic alkyl)(예: 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(alkoxyl)(예: C1-C6 알콕실)로부터 선택되며;
r5, r6은 서로 독립적으로, 1과 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
M1, M3은 서로 독립적으로, 직접 결합, NH, O, S로부터 선택되며;
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx로부터 선택되고, 다른 것들은 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예: Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예, 페닐 -C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬)로부터 선택되며, 상기 각 Rx는 독립적으로, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 C1-C6 알킬)로부터 선택되고;
Z는 O, S, BH로부터 선택되며;
염기1은 염기(base), 데아자 염기(deaza base) 및 이의 토토머(tautomer), 예를 들어, 아데닌(adenine), 7-데아자아데닌(7-deazaadenine), 티민(thymine), 우라실(uracil), 시토신(cytosine), 구아닌(guanine), 7-데아자구아닌(7-deazaguanine) 및 이의 토토머로부터 선택되고;
R'은 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , , , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r1은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r1은 1이다.
일부 구현예에 있어서, r2은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r2은 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3a, r3b는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r3a, r3b는 서로 독립적으로 1, 2, 3으로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r3a는 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3b는 2이다.
일부 구현예에 있어서, M은 CH2, O로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O, S로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O이다.
일부 구현예에 있어서, Y는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, W는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R2, R3 또는 R4)는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로 H, 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R2, R3 또는 R4)는 이고, 다른 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이며, 나머지 3개는 H이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, R3 또는 R4는 , R1은 이고, 나머지 3개는 H이다.
일부 구현예에 있어서, R은 , , , , , , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, M1은 직접 결합, NH, O로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, M3는 직접 결합, NH로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, M1이 NH, O 또는 S일 때, M3은 직접 결합이고, M3이 NH, O 또는 S일 때, M1은 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로부터 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me로부터 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, Z는 O이다.
일부 구현예에 있어서, 염기1은 , , , 로부터 선택된다.
본 발명의 제3 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 I-2 또는 이의 염의 화합물을 제공하고,
화학식 I-2
상기:
L1 은 , 로부터 선택되며;
r1, r2, r3a, r3b는 서로 독립적으로, 1 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
M은 직접 결합, CH2, NH, O, S로부터 선택되며;
X는 O, S, NH로부터 선택되고;
Y는 직접 결합, O, S, NH로부터 선택되며;
W는 직접 결합, O, S, NH로부터 선택되고;
R은 이며;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예: R1 또는 R5)는 이고, 나머지는 서로 독립적으로, H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬), 방향족 알킬(예: 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(예: C1-C6 알콕실)로부터 선택되며;
r5, r6, r7은 서로 독립적으로, 1에서 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
r8은 0, 1로부터 선택되며;
M1은 직접 결합, NH, O, S로부터 선택되고;
Ra는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예를 들어, Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예:, 페닐-C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬)로부터 선택되며;
Z는 O, S, BH로부터 선택되고;
염기1은 염기, 데아자 염기 또는 이의 토토머(tautomer), 예를 들어 아데닌, 7- 데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머로부터 선택되며;
R'은 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, L1 은 , , , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, L1 은 , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r1은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r1은 1이다.
일부 구현예에 있어서, r2는 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r2는 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3a, r3b는 서로 독립적으로, 1, 2, 3, 4, 5로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r3a, r3b는 서로 독립적으로, 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r3a는 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3b는 2이다.
일부 구현예에 있어서, M은 CH2, O로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O, S로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O이다.
일부 구현예에 있어서, Y는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, W는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이고, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, R1은 이고, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, R은 , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r7은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r7은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, M1은 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, Ra는C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Ra는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, Z는 O이다.
일부 구현예에 있어서, 염기1은 , , , 로부터 선택된다.
본 발명의 제4 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 II-1 또는 이의 염의 화합물을 제공하고,
화학식 II-1
상기:
X는 O, S, NH로부터 선택되며;
W는 직접 결합, O, S, NH로부터 선택되고;
R은 이며;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예: R3 또는 R4)는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로, H, , 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬), 방향족 알킬(예: 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(예: C1-C6 알콕실)로부터 선택되며;
r5, r6은 서로 독립적으로, 1에서 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
M1, M3 은 서로 독립적으로, 직접 결합, NH, O, S로부터 선택되며;
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx로부터 선택되고, 다른 하나는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예: Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예, 페닐 -C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬)로부터 선택되며, 상기 각 Rx는 독립적으로, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 C1-C6 알킬)로부터 선택되고;
Z는 O, S, BH로부터 선택되며;
염기2은 염기, 데아자 염기 또는 이의 토토머(tautomer), 예를 들어 아데닌, 7- 데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머로부터 선택되고;
은 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, X는 O, S로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O이다.
일부 구현예에 있어서, W는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R3 또는 R4)는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로, H, 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R3 또는 R4)는 이고, 다른 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이며, 나머지 3개는 H이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서 R3 또는 R4는 이고, R1은 이고, 나머지 3개는 H이다.
일부 구현예에 있어서, R은 , , , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, M1은 직접 결합, NH, O로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, M3는 직접 결합, NH로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로부터 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me로부터 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, Z는 O이다.
일부 구현예에 있어서, 염기2은 , , , 에서 선택된다.
본 발명의 제5 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 II-2 또는 이의 염의 화합물을 제공하고,
화학식 II-2
상기:
X는 O, S, NH로부터 선택되며;
W는 직접 결합, O, S, NH로부터 선택되고;
R은 이며;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예: R1 또는 R5)는 이고, 나머지는 서로 독립적으로, H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬), 방향족 알킬(예: 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(예: C1-C6 알콕실)로부터 선택되며;
r5, r6, r7은 1에서 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
r8은 0, 1로부터 선택되며;
M1은 직접 결합, NH, O, S로부터 선택되고;
Ra는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예를 들어, Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예:, 페닐-C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬)로부터 선택되며;
Z는 O, S, BH로부터 선택되고;
염기2은 염기, 데아자 염기 또는 이의 토토머(tautomer), 예를 들어 아데닌, 7- 데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머로부터 선택되며;
은 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, X는 O, S로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O이다.
일부 구현예에 있어서, W는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이고, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, R1은 이고, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, R은 , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r7은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r7은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, M1은 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, Ra는C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Ra는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, Z는 O이다.
일부 구현예에 있어서, 염기2은 , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 전술한 가역적 차단기 R'는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, , NH2, -ONH2, -OCORz, -OCONHRz로부터 선택되며, 상기 각 Rz는 독립적으로 지방족 알킬(예, C1-C6 알킬), 시클로알킬(예, C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예, 페닐 C1-C6 알킬)로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 R' 는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, , NH2로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 R' 는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 R' 은 N3-CH2-, CH3-CH2-S-S-CH2-, 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1', R2', R3', R4', R5'에서, 임의의 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로 H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬), 방향족 알킬(예: 페닐-C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(예: C1-C6 알콕실)로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1', R2', R3', R4', R5'에서, 임의의 하나(예컨대, R1' 또는 R5')는 이고, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, R1', R2', R3', R4', R5'에서, R1'은 이고, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx로부터 선택되고, 다른 하나는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예를 들어, Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예:, 페닐-C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬)로부터 선택되며, 상기 각 Rx는 독립적으로 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예: 페닐 C1-C6 알킬)로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로부터 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me로부터 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
본 발명의 제6 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 III 또는 이의 염의 화합물을 제공하고,
화학식 III
상기:
L1 은 로부터 선택되며;
r2는 1, 2, 3로부터 선택되고;
r3a는 1, 2, 3로부터 선택되며;
r3b는 0, 1, 2, 3로부터 선택되고;
M은 직접 결합, O로부터 선택되며;
L2 는 선택되고;
R은 이며;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R3)는 이고, 다른 하나 (예를 들어, R1 또는 R2)는 로부터 선택되며, 나머지 세 개는 H이고;
Lc는 직접 결합, , , 로부터 선택되며, 바람직하게는, Lc의 NH 말단은 H에 연결되고, Lc의 =O 말단은 NH에 연결되고;
rm은 0, 1, 2, 3로부터 선택되며;
r5 은 1, 2, 3로부터 선택되고;
r6 은 1, 2, 3로부터 선택되며;
r10 은 1 에서 10 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
r11 은 1 에서 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되며;
M1 은 NH, O로부터 선택되고;
M1 은 NH, O로부터 선택되며;
M3 은 직접 결합, NH로부터 선택되고;
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로부터 선택되며, 다른 하나는 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R0는 H, 일인산기(monophosphate group)(), 이인산기(diphosphate group)(), 삼인산기(triphosphate group)(), 사인산기(tetraphosphate group)()으로부터 선택되며;
각 Z는 독립적으로, O, S, BH로부터 선택되고;
염기1은 염기, 데아자 염기 또는 이의 토토머(tautomer), 예를 들어 아데닌, 7- 데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머로부터 선택되며;
화학식 III에서, R'은 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r2는 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3a는 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3b는 0, 2로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Lc는 직접 결합, , , , 로부터 선택되고, 바람직하게는, Lc의 NH 말단은 H에 연결되며, Lc의 =O 말단은 NH에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, rm은 0, 1로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r10은 2 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r10은 2 또는 6이다.
일부 구현예에 있어서, r11은 1, 2, 3로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r11은 1이다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc 에서, 임의의 하나는 -SS-Me이고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, R은 , , , , , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R0은 삼인산기()이다.
일부 구현예에 있어서, Z은 O이다.
일부 구현예에 있어서, 염기1은 , , , 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 R'은 이고, R1', R2', R3', R4', R5'에서, 임의의 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이며, 다른 하나(예를 들어, R3')는 H, C1-C6 알콕시(예를 들어, 메톡시)이고, 다른 것들은 H이고; Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로부터 선택되고, 다른 것들은 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1', R2', R3', R4', R5'에서, R1'은 이고, R3'는 H, C1-C6 알콕시(예를 들어, 메톡시)로부터 선택되며, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me로부터 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, 화합물은 다음 표 A에서 선택된다:
표 A:
일부 구현예에 있어서, 전술한 화합물 또는 이의 염은 검출 가능한 추가 라벨. 6를 운반한다.
일부 구현예에 있어서, 화합물 또는 이의 염에 의해 운반되는 추가적인 검출 가능한 표지는 친화성 시약(예를 들어, 항체, 압타머, 아피머, 노틴)에 의해 도입되는데, 상기 친화성 시약은 검출 가능한 표지를 운반하고, 친화성 시약은 화합물 또는 이의 염의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 화학식 I, 화학식 II, 화학식 I-1, 화학식 I-2, 화학식 II-1 또는 화학식 II-2의 화합물 내 R 또는 전술한 특정 화합물 내 R에 대응하는 구조적 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 의 말단 아미노기 또는 이에 대응하는 구조적 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨의 카르복실기 아미드 결합의 형성을 통해 말단 아미노기 또는 이에 대응하는 구조적 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 화학식 III의 화합물 내의 R 또는 전술한 특정 화합물 내의 R에 대응하는 구조적 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 의 말단 아미노기 또는 이에 대응하는 구조적 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 아미드 결합의 형성을 통해의 말단 아미노기 또는 이에 대응하는 구조적 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 염기1은 상이하고, 화학식 I의 화합물에 의해 운반되는 추가 검출 가능한 라벨은 다양하다.
일부 구현예에 있어서, 염기2는 상이하고, 화학식 II의 화합물에 의해 운반되는 추가 검출 가능한 라벨은 다양하다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 형광 라벨이다.
일부 구현예에 있어서, 감지 가능한 라벨은 다음 중에서 선택된다: iF700, , , , , , , , , , , , , , ,
.
일부 구현예에 있어서, 화합물은 다음 표 B에서 선택된다:
표 B:
본 발명의 일곱 번째 양태에 있어서, 본 발명은 핵산 합성을 종료하는 방법을 제공하며, 상기 종료되는 핵산 분자에 전술한 화합물 또는 이의 염을 결합시키는(incorporating) 단계를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 화합물 또는 이의 염의 결합은 말단 전이 효소, 말단 중합 효소 또는 역전사 효소에 의해 이루어진다.
일부 구현예에 있어서, 본 방법은 중합효소를 사용하여 종결될 핵산 분자에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 방법은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 종결될 핵산 분자의 3' 말단에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제8 양태에 있어서, 본 발명은 시퀀싱 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인, 신장되는(growing) 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 화합물 또는 이의 염을 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 결합시키는 단계를 포함하는데, 상기 화합물 또는 이의 염의 결합은 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 후속 뉴클레오타이드가 도입되는 것을 방지한다.
일부 구현예에 있어서, 화합물 또는 이의 염의 결합은 말단 전이 효소, 말단 중합 효소 또는 역전사 효소에 의해 이루어진다.
일부 구현예에 있어서, 이 방법은 중합효소를 사용하여 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 방법은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 신장되는 상보성 다핵산염의 3' 말단에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제9 양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정할 때 형성되는 핵산 중간체를 제공하며, 상기 핵산 중간체는 이하 단계에 따라 형성되는 핵산 중간체를 제공한다:
신장되는 핵산 가닥에 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 결합시켜 핵산 중간체를 형성하는 단계로서, 상기 결합된 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이다.
본 발명의 제10 양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정할 때 형성되는 핵산 중간체를 제공하며, 상기 핵산 중간체는 이하 단계에 따라 형성된다:
신장되는 핵산 가닥에 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 결합시켜 핵산 중간체를 형성하는 단계로서, 상기 결합된 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이고, 신장되는 핵산 가닥은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 사전에 결합시키며, 상기 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 사전에 결합된 뉴클레오타이드는 가역적 차단기(blocking group) 및 선택적 검출 가능한 라벨이 제거된 전술한 화합물 또는 이의 염이다.
본 발명의 제11 양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법을 제공하며, 이는 다음 단계를 포함한다:
1) 신장되는 핵산 가닥에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드의 결합을 모니터링하는 단계로서, 상기 결합된 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염인 것, 및
2) 결합된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기(blocking group) 및 선택적으로 검출 가능한 라벨은 다음 상보적 뉴클레오타이드가 도입되기 전에 제거된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기(blocking group)과 검출 가능한 라벨은 동시에 제거된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 및 검출 가능한 라벨은 순차적으로 제거된다; 예를 들어, 검출 가능한 라벨이 제거된 후에 가역적 차단기가 제거되거나, 가역적 차단기가 제거된 후에 검출 가능한 라벨이 제거된다.
일부 구현예에 있어서, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법은 다음 단계로 구성된다:
(a) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이고, 선택적으로, 나머지 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이다;
(b) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 서열에 결합시키는 단계로서, 상기 복수의 상이한 뉴클레오타이드는 검출 중에 서로 구별될 수 있다;
(c) 결합된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하기 위해 (b)단계의 뉴클레오타이드를 검출하는 단계;
(d) 가역적 차단기 및 (b)단계에서 뉴클레오타이드에 의해 운반되는 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계; 및
(e) 선택적으로 (a)-(d)단계를 한 번 이상 반복하는 단계;
이에 따라, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열이 결정된다.
일부 구현예에 있어서, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법은 다음 단계로 구성된다:
(1) 제1 뉴클레오타이드, 제2 뉴클레오타이드, 제3 뉴클레오타이드 및 제4 뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 상기 4개 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 전술한 화합물 또는 이의 염이고, 선택적으로, 나머지 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이다;
(2) 4개의 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; 신장되는 핵산 가닥에 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하는 단계; 신장되는 핵산 가닥에 결합된 뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 가역적 차단기 및 신장되는 핵산 가닥에 결합된 뉴클레오타이드에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계;
선택적으로 (1)-(2) 단계를 한 번 이상 반복하는 단계 (3)도 포함된다.
일부 구현예에 있어서, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법은 다음 단계로 구성된다:
(a) 듀플렉스, 적어도 하나의 전술한 화합물 또는 이의 염을 포함하는 뉴클레오타이드, 중합효소 및 절제 시약(excision reagent)을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 상기, 듀플렉스는 신장되는 핵산 가닥 및 서열화될 핵산 가닥을 포함한다;
(b) 다음 단계 (i), (ii) 및 (iii)를 포함하는 반응을 수행하는 단계로서, 선택적으로 단계들을 한 번 이상 반복한다:
단계 (I): 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 라벨을 포함하는 핵산 중간체를 형성하기 위해 중합효소를 사용하여 신장되는 핵산 가닥에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계;
단계 (II): 핵산 중간체를 검출하는 단계;
단계 (iii): 절제 시약을 사용하여 가역적 차단기와 핵산 중간체에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨의 제거는 동시에 수행되거나, 가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 라벨의 제거는 순차적으로 수행된다(예: 가역적 차단기가 먼저 제거되거나 검출 가능한 라벨이 먼저 제거됨).
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 라벨의 제거에 사용되는 시약과 동일하다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 라벨의 제거에 사용되는 시약과 상이하다.
일부 구현예에 있어서, 듀플렉스는 지지대(support)에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 신장되는 핵산 가닥은 프라이머이다.
일부 구현예에 있어서, 프라이머는 시퀀싱될 핵산 가닥에 어닐링되어 듀플렉스를 형성한다.
In some embodiments, the duplex, the compound or a salt thereof, and the polymerase together form a reaction system containing a solution phase and a solid phase.
일부 구현예에 있어서, 듀플렉스, 화합물 또는 이의 염 및 중합효소는 함께 용액상 및 고체상을 포함하는 반응 시스템을 형성한다.
일부 구현예에 있어서, 화합물 또는 이의 염은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 신장되는 핵산 가닥에 결합되어 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 라벨을 포함하는 핵산 중간체를 형성한다.
일부 구현예에 있어서, 중합효소는 KOD 중합효소 또는 이의 돌연변이체(예: KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391) 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 핵산 중간체를 검출하는 단계 전에, 이전 단계의 반응 시스템의 용액상이 제거되고, 지지체에 연결된 듀플렉스가 유지된다.
일부 구현예에 있어서, 절제 시약은 용액상 및 고체상을 포함하는 반응 시스템에서 듀플렉스 또는 신장되는 핵산 가닥과 접촉한다.
일부 구현예에 있어서, 절제 시약은 듀플렉스의 백본에 있는 포스포디에스테르 결합에 영향을 주지 않고 신장되는 핵산 가닥에 결합된 화합물에 의해 운반되는 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 및 핵산 중간체에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 임의의 단계 후에, 이 단계에서 반응 시스템의 용액 상이 제거된다.
일부 구현예에 있어서, 세척 과정은 제거 과정을 포함하는 임의의 단계 후에 수행된다.
일부 구현예에 있어서, 단계 (ii) 이후에, 본 방법은 단계 (ii)에서 검출된 신호에 따라 단계 (i)에서 신장되는 핵산 가닥에 결합된 화합물의 유형을 결정하는 단계 및 염기 상보쌍의 원리에 기초하여 시퀀싱될 핵산 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 제12 양태에 있어서, 본 발명은 적어도 하나 이상의 전술한 화합물 또는 이의 염을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에 있어서, 상기 키트는 제1 화합물, 제2 화합물, 제3 화합물 및 제4 화합물을 포함하며, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물은 각각 독립적으로 전술한 화합물 또는 이의 염이다.
일부 구현예에 있어서, 제 1 화합물에서, 염기1은 아데닌, 7- 데아자아데닌 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 제 2 화합물에서, 염기1은 티민, 우라실 또는 이의 토토머(예를 들어,); 세 번째 화합물에서, 염기1은 시토신 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 네 번째 화합물에서, 염기1은 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 토토머(예를 들어,) 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 제 1 화합물에서, 염기1은 아데닌, 7- 데아자아데닌 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 제 2 화합물에서, 염기1은 티민, 우라실 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 세 번째 화합물에서, 염기1은 시토신 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 네 번째 화합물에서, 염기1은 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 토토머(예를 들어, ) 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물에 함유된 염기1 또는 염기2는 서로 상이하다.
일부 구현예에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물에 의해 운반되는 추가적으로 검출 가능한 라벨은 서로 상이하다.
일부 구현예에 있어서, 키트는 추가적으로 다음을 포함한다: 핵산 분자를 전처리하기 위한 시약; 시퀀싱될 핵산 분자를 연결하기 위한 지지체; 시퀀싱될 핵산 분자를 지지체에 연결(예를 들어, 공유 결합 또는 비공유 결합)하기 위한 시약; 뉴클레오타이드 중합 반응을 개시하기 위한 프라이머; 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하기 위한 중합효소; 하나 이상의 완충 용액; 하나 이상의 세척 용액; 또는 이들의 임의의 조합.
본 발명의 제13 양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정에 있어서의 전술한 화합물 또는 이의 염 또는 전술한 키트의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 제14 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I-1의 화합물 또는 이의 염을 추가로 제공하고,
화학식 I-1
상기:
L1은 , 에서 선택되고;
r1, r2, r3A, r3B는 서로 독립적으로, 1 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되며;
M은 직접 결합, CH2, NH, O, S 중에서 선택되고;
X는 O, S, NH 중에서 선택되며;
Y는 직접 결합, O, S, NH 중에서 선택되고;
W는 직접 결합, O, S, NH 중에서 선택되며;
R은 이며;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예: R2, R3 또는 R4)는 이고, 나머지는 서로 독립적으로 H, , 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예: C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(예: 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(예: C1-C6 알콕실) 중에서 선택되고;
r5, r6은 서로 독립적으로 1에서 6 사이의 임의의 정수 중에서 선택되며;
M1, M3은 서로 독립적으로 직접 결합, NH, O, S로부터 선택되고;
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx 중에서 선택되고, 다른 하나는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예: Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예, 페닐 -C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬), 상기 각 Rx는 독립적으로 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 C1-C6 알킬) 중에서 선택되고;
Z는 O, S, BH 중에서 선택된다;
염기1은 염기, 데아자 염기 또는 이의 토토머, 예를 들어 아데닌, 7- 데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머 중에서 선택되고;
R'은 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , , , , , 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, L1은 , , 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r1은 1, 2, 3중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r1은 1이다.
일부 구현예에 있어서, r2은 1, 2, 3중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r2은 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3A, r3B는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r3A, r3B는 서로 독립적으로 1, 2, 3 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r3A는 1이다.
일부 구현예에 있어서, r3b는 2이다.
일부 구현예에 있어서, M은 CH2, O 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O, S 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, X는 O이다.
일부 구현예에 있어서, Y는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, W는 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R2, R3 또는 R4)는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로 H, 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R2, R3 또는 R4)는 이고, 다른 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이며, 나머지 3개는 H이다.
일부 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서 R3 또는 R4는 , R1은 이고, 나머지 3개는 H이다.
일부 구현예에 있어서, R은 , , , , , , , , 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 1, 2, 3 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r5는 2이다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1, 2, 3 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, r6은 1 또는 2이다.
일부 구현예에 있어서, M1은 직접 결합, NH, O 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, M3는 직접 결합, NH에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, M1이 NH, O 또는 S일 때, M3은 직접 결합이고, M3이 NH, O 또는 S일 때, M1은 직접 결합이다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) 중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, Z는 O이다.
일부 구현예에 있어서, 염기1은 , , , 에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, 화학식 I-1의 화합물에서:
L1 은 , 로부터 선택되고;
r1, r2, r3A, r3B는 서로 독립적으로, 1 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되며;
M은 직접 결합, CH2, NH, O, S 중에서 선택되며;
X는 O, S, NH 중에서 선택되고;
Y는 직접 결합, O, S, NH 중에서 선택되며;
W는 직접 결합, O, S, NH 중에서 선택되고;
R은 이며;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예: R2, R3 또는 R4)는 이고, 다른 하나(예: R1 또는 R5)는 이며, 나머지 세 개는 H이고;
r5, r6은 서로 독립적으로 1과 6 사이의 임의의 정수에서 선택되며;
M1, M3은 서로 독립적으로 직접 결합, NH, O, S에서 선택되고;
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬에서 선택되며;
Z는 O, S, BH 에서 선택되고;
염기1은 염기, 데아자 염기 또는 이의 토토머, 예를 들어 아데닌, 7- 데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머 중에서 선택되며;
R'은 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 특정 구현예에 있어서, L1은 , , 에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, r1은 1, 2, 3 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, r1은 1이다.
일부 특정 구현예에 있어서, r2는 1, 2, 3 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, r2는 1이다.
일부 특정 구현예에 있어서, r3A, r3B는 서로 독립적으로, 1, 2, 3, 4, 5 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, r3A, r3B는 서로 독립적으로 1, 2, 3 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, r3A는 1이다.
일부 특정 구현예에 있어서, r3b는 2이다.
일부 특정 구현예에 있어서, M은 CH2, O 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, X는 O, S 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, X는 O이다.
일부 특정 구현예에 있어서, Y는 직접 결합이다.
일부 특정 구현예에 있어서, W는 직접 결합이다.
일부 특정 구현예에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5에서, R3 또는 R4는 , R1은 이고, 나머지 3개는 H이다.
일부 특정 구현예에 있어서, r5는 1, 2, 3 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, r5는 2이다.
일부 특정 구현예에 있어서, r6은 1, 2, 3 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, r6은 1 또는 2이다.
일부 특정 구현예에 있어서, M1은 직접 결합, NH, O 중에서 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, M3는 직접 결합, NH로부터 선택된다.
일부 특정 구현예에 있어서, M1이 NH, O 또는 S일 때, M3는 직접 결합이고, M3가 NH, O 또는 S일 때, M1은 직접 결합이다.
일부 특정 구현예에 있어서, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 특정 구현예에 있어서, Z는 O이다.
일부 특정 구현예에 있어서, 염기1은 , , , 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 전술한 가역적 차단기 R'는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, , NH2, -ONH2, -OCORz, -OCONHRz 중에서 선택되며, 상기 각 Rz는 독립적으로 지방족 알킬(예, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예, C3-C6 사이클로알킬) 또는 방향족 알킬(예, 페닐 C1-C6 알킬) 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 R' 는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, , NH2 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 R' 는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 R' 은 N3-CH2-, CH3-CH2-S-S-CH2-, 로부터 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1', R2', R3', R4', R5'에서, 임의의 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로 H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예: C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(예: 페닐-C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(예: C1-C6 알콕실)에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R1', R2', R3', R4', R5'에서, 임의의 하나(예컨대, R1' 또는 R5')는 이고, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, R1', R2', R3', R4', R5'에서, R1'은 이고, 다른 것들은 H이다.
일부 구현예에 있어서, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx 에서 선택되고, 다른 하나는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예를 들어, Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예:, 페닐-C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬)에서 선택되며, 상기 각 Rx는 독립적으로 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예: 페닐 C1-C6 알킬) 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) 중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 화학식 I-1의 화합물 또는 이의 염을 제공하고,
화학식 I-1
상기:
L1은 , 에서 선택되고;
바람직하게는, L1은 , , 에서 선택되며;
r1, r2, r3A, r3B는 서로 독립적으로, 1 내지 6 사이의 임의의 정수 중에서 선택되고;
바람직하게는, r1은 1, 2, 3 중에서 선택되며;
보다 바람직하게는, r1은 1이고;
바람직하게는, r2는 1, 2, 3 중에서 선택되며;
보다 바람직하게는, r2는 1이고;
바람직하게는, r3A, r3B는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 중에서 선택되며;
보다 바람직하게는, r3A, r3B는 서로 독립적으로, 1, 2, 3 중에서 선택되고;
가장 바람직하게는, r3A는 1이며;
가장 바람직하게는, r3B는 2이고;
M은 직접 결합, CH2, NH, O, S 중에서 선택되며;
바람직하게는, M은 CH2, O로부터 선택되고;
X는 O, S, NH 중에서 선택되며;
바람직하게는, X는 O, S로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, X는 O이며;
Y는 직접 결합, O, S, NH 중에서 선택되고;
바람직하게는, Y는 직접 결합이며;
W는 직접 결합, O, S, NH 중에서 선택되고;
바람직하게는, W는 직접 결합이며;
R은 이고;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나(예를 들어, R2, R3 또는 R4)는 이고, 다른 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이며, 나머지 세 개는 H이고;
바람직하게는, R1, R2, R3, R4, R5에서, R3 또는 R4는 이고, R1은 이며, 나머지 3개는 H이고;
r5, r6은 서로 독립적으로 1에서 6 사이의 임의의 정수 중에서 선택되며;
바람직하게는, r5는 1, 2, 3 중에서 선택되고;
보다 바람직하게는, r5는 2이며;
바람직하게는, r6은 1, 2, 3 중에서 선택되고;
보다 바람직하게는, r6은 1 또는 2이며;
M1, M3은 서로 독립적으로, 직접 결합, NH, O, S로부터 선택되고;
바람직하게는, M1은 직접 결합, NH, O로부터 선택되며;
바람직하게는, M3는 직접 결합, NH로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, M1이 NH, O 또는 S일 때, M3는 직접 결합이고, M3가 NH, O 또는 S일 때, M1은 직접 결합이며;
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) 중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택되며;
바람직하게는, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이며;
Z는 O, S, BH 중에서 선택되고;
바람직하게는, Z는 O이며;
염기1은 염기, 데아자 염기 또는 이의 토토머, 예를 들어 아데닌, 7- 데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머 중에서 선택되고;
바람직하게는, 염기1은 , , , 에서 선택되며;
R' 은 가역적 차단기를 나타낸다.
일부 특정 구현예에 있어서, 가역적 차단기 R' 은 N3-CH2-, CH3-CH2-S-S-CH2-, 에서 선택되며;
R1', R2', R3', R4', R5'에서, 임의의 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이고, 다른 것들은 H이며,
바람직하게는, R1', R2', R3', R4', R5'에서, R1' 은 이고, 나머지는 H 이며,
Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) 중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택되며,
바람직하게는, Rb', Rc' 에서, 하나는 -N3, -SS-Me 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에 있어서, 전술한 화합물은 다음 표 C에서 선택된다:
표 C:
.
일부 구현예에 있어서, 전술한 화합물 또는 이의 염은 추가적인 검출 가능한 라벨을 운반한다.
일부 구현예에 있어서, 화합물 또는 이의 염에 의해 운반되는 추가적인 검출 가능한 표지는 친화성 시약(예를 들어, 항체, 압타머, 아피머, 노틴)에 의해 도입되는데, 상기 친화성 시약은 검출 가능한 표지를 운반하고, 친화성 시약은 화합물 또는 이의 염의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 화학식 I-1의 화합물에서 R 또는 전술한 특정 화합물에서 R에 대응하는 구조적 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 의 말단 아미노기에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨의 카르복실은 아미드 결합의 형성을 통해 의 말단 아미노기에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 염기1은 상이하고, 화학식 I-1의 화합물에 의해 운반되는 추가 검출 가능한 라벨은 다양하다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 형광 라벨이다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 다음에서 선택된다: iF700,
중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨은 iF700,
중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 전술한 화합물은 다음 표 D에서 선택된다:
[표 D]
본 발명의 제15 양태에 있어서, 본 발명은 핵산 합성을 종료하는 방법을 제공하며, 상기 종료되는 핵산 분자에 전술한 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 화합물 또는 이의 염의 결합은 말단 전이 효소, 말단 중합 효소 또는 역전사 효소에 의해 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 방법은 중합효소를 사용하여 종결될 핵산 분자에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 방법은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 종결될 핵산 분자의 3' 말단에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제16 양태에 있어서, 본 발명은 시퀀싱 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인, 신장되는(growing) 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 화합물 또는 이의 염을 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 결합시키는 단계를 포함하는데, 상기 화합물 또는 이의 염의 결합은 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 후속 뉴클레오타이드가 도입되는 것을 방지한다.
일부 구현예에 있어서, 화합물 또는 이의 염의 결합은 말단 전이 효소, 말단 중합 효소 또는 역전사 효소에 의해 이루어진다.
일부 구현예에 있어서, 이 방법은 중합효소를 사용하여 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 방법은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 신장되는 상보성 다핵산염의 3' 말단에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제17 양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정할 때 형성되는 핵산 중간체를 제공하며, 상기 핵산 중간체는 이하 단계에 따라 형성되는 핵산 중간체를 제공한다:
신장되는 핵산 가닥에 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 결합시켜 핵산 중간체를 형성하는 단계로서, 상기 결합된 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이다.
본 발명의 제 18 양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정할 때 형성되는 핵산 중간체를 제공하며, 상기 핵산 중간체는 이하 단계에 따라 형성된다:
신장되는 핵산 가닥에 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 결합시켜 핵산 중간체를 형성하는 단계로서, 상기 결합된 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이고, 신장되는 핵산 가닥은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 사전에 결합시키며, 상기 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 사전에 결합된 뉴클레오타이드는 가역적 차단기(blocking group) 및 선택적 검출 가능한 라벨이 제거된 전술한 화합물 또는 이의 염이다.
본 발명의 제19양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법을 제공하며, 이는 다음 단계를 포함한다:
1) 신장되는 핵산 가닥에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드의 결합을 모니터링하는 단계로서, 상기 결합된 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염인 것, 및
2) 결합된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기(blocking group) 및 선택적으로 검출 가능한 라벨은 다음 상보적 뉴클레오타이드가 도입되기 전에 제거된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기(blocking group)과 검출 가능한 라벨은 동시에 제거된다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 및 검출 가능한 라벨은 순차적으로 제거된다; 예를 들어, 검출 가능한 라벨이 제거된 후에 가역적 차단기가 제거되거나, 가역적 차단기가 제거된 후에 검출 가능한 라벨이 제거된다.
일부 구현예에 있어서, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법은 다음 단계로 구성된다:
(a) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이고, 선택적으로, 나머지 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이다;
(b) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 서열에 결합시키는 단계로서, 상기 복수의 상이한 뉴클레오타이드는 검출 중에 서로 구별될 수 있다;
(c) 결합된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하기 위해 (b)단계의 뉴클레오타이드를 검출하는 단계;
(d) 가역적 차단기 및 (b)단계에서 뉴클레오타이드에 의해 운반되는 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계; 및
(e) 선택적으로 (a)-(d)단계를 한 번 이상 반복하는 단계;
이에 따라, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열이 결정된다.
일부 구현예에 있어서, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법은 다음 단계로 구성된다:
(1) 제1 뉴클레오타이드, 제2 뉴클레오타이드, 제3 뉴클레오타이드 및 제4 뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 상기 4개 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 전술한 화합물 또는 이의 염이고, 선택적으로, 나머지 뉴클레오타이드는 전술한 화합물 또는 이의 염이다;
(2) 4개의 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; 신장되는 핵산 가닥에 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하는 단계; 신장되는 핵산 가닥에 결합된 뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 가역적 차단기 및 신장되는 핵산 가닥에 결합된 뉴클레오타이드에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계;
선택적으로 (1)-(2) 단계를 한 번 이상 반복하는 단계 (3)도 포함된다.
일부 구현예에 있어서, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법은 다음 단계로 구성된다:
(a) 듀플렉스, 적어도 하나의 전술한 화합물 또는 이의 염을 포함하는 뉴클레오타이드, 중합효소 및 절제 시약(excision reagent)을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 상기, 듀플렉스는 신장되는 핵산 가닥 및 서열화될 핵산 가닥을 포함한다;
(b) 다음 단계 (i), (ii) 및 (iii)를 포함하는 반응을 수행하는 단계로서, 선택적으로 단계들을 한 번 이상 반복한다:
단계 (I): 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 라벨을 포함하는 핵산 중간체를 형성하기 위해 중합효소를 사용하여 신장되는 핵산 가닥에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계;
단계 (II): 핵산 중간체를 검출하는 단계;
단계 (iii): 절제 시약을 사용하여 가역적 차단기와 핵산 중간체에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계.
일부 구현예에 있어서, 검출 가능한 라벨의 제거는 동시에 수행되거나, 가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 라벨의 제거는 순차적으로 수행된다(예: 가역적 차단기가 먼저 제거되거나 검출 가능한 라벨이 먼저 제거됨).
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 라벨의 제거에 사용되는 시약과 동일하다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 라벨의 제거에 사용되는 시약과 상이하다.
일부 구현예에 있어서, 듀플렉스는 지지대(support)에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 신장되는 핵산 가닥은 프라이머이다.
일부 구현예에 있어서, 프라이머는 시퀀싱될 핵산 가닥에 어닐링되어 듀플렉스를 형성한다.
일부 구현예에 있어서, 듀플렉스, 화합물 또는 이의 염 및 중합효소는 함께 용액상 및 고체상을 포함하는 반응 시스템을 형성한다.
일부 구현예에 있어서, 화합물 또는 이의 염은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 신장되는 핵산 가닥에 결합되어 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 라벨을 포함하는 핵산 중간체를 형성한다.
일부 구현예에 있어서, 중합효소는 KOD 중합효소 또는 이의 돌연변이체(예: KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391) 에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 핵산 중간체를 검출하는 단계 전에, 이전 단계의 반응 시스템의 용액상이 제거되고, 지지체에 연결된 듀플렉스가 유지된다.
일부 구현예에 있어서, 절제 시약은 용액상 및 고체상을 포함하는 반응 시스템에서 듀플렉스 또는 신장되는 핵산 가닥과 접촉한다.
일부 구현예에 있어서, 절제 시약은 듀플렉스의 백본에 있는 포스포디에스테르 결합에 영향을 주지 않고 신장되는 핵산 가닥에 결합된 화합물에 의해 운반되는 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 가역적 차단기 및 핵산 중간체에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 임의의 단계 후에, 이 단계에서 반응 시스템의 용액 상이 제거된다.
일부 구현예에 있어서, 세척 과정은 제거 과정을 포함하는 임의의 단계 후에 수행된다.
일부 구현예에 있어서, 단계 (ii) 이후에, 본 방법은 단계 (ii)에서 검출된 신호에 따라 단계 (i)에서 신장되는 핵산 가닥에 결합된 화합물의 유형을 결정하는 단계 및 염기 상보쌍의 원리에 기초하여 시퀀싱될 핵산 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 제 20 양태에 있어서, 본 발명은 적어도 하나 이상의 전술한 화합물 또는 이의 염을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에 있어서, 상기 키트는 제1 화합물, 제2 화합물, 제3 화합물 및 제4 화합물을 포함하며, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물은 각각 독립적으로 전술한 화합물 또는 이의 염이다.
일부 구현예에 있어서, 제 1 화합물에서, 염기1은 아데닌, 7- 데아자아데닌 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 제 2 화합물에서, 염기1은 티민, 우라실 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 세 번째 화합물에서, 염기1은 시토신 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 네 번째 화합물에서, 염기1은 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 토토머(예를 들어, ) 중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물에 함유된 염기1 는 서로 상이하다.
일부 구현예에 있어서, 키트는 추가적으로 다음을 포함한다: 핵산 분자를 전처리하기 위한 시약; 시퀀싱될 핵산 분자를 연결하기 위한 지지체; 시퀀싱될 핵산 분자를 지지체에 연결(예를 들어, 공유 결합 또는 비공유 결합)하기 위한 시약; 뉴클레오타이드 중합 반응을 개시하기 위한 프라이머; 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하기 위한 중합효소; 하나 이상의 완충 용액; 하나 이상의 세척 용액; 또는 이들의 임의의 조합.
본 발명의 제21 양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하기 위하여 전술한 화합물 또는 이의 염 또는 전술한 키트의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 제 22 양태에 있어서, 본 발명은 리보오스 또는 데옥시리보오스, 가역적 차단기, 염기 또는 데아자 염기 또는 이들의 토토머, 검출 가능한 라벨에 연결하기 위한 링커 및 선택적 인산염기로 형성되는 뉴클레오타이드 유사체를 더 제공하며, 상기 링커는 다음 화학식 A 또는 화학식 A' 에 도시된 구조를 포함한다:
상기:
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx 중에서 선택되고, 다른 하나는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예: Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예, 페닐 -C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬), 상기 각 Rx는 독립적으로 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 C1-C6 알킬) 중에서 선택되고;
바람직하게, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) 중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택된다.
보다 바람직하게, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me, -SS-Et 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
보다 바람직하게, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3 , -SS-Me 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
Ra는 H, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬, 예: Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예, 페닐 -C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬) 중에서 선택되고,
바람직하게는, Ra는 H, C1-C6 알킬 중에서 선택되며,
보다 바람직하게는, Ra는 메틸이고;
X는 O, S, NH중에서 선택되며;
바람직하게는, X는 O, S 중에서 선택되며;
보다 바람직하게는, X는 O이고;
M1 은 직접 결합, NH, O, S, CH2중에서 선택되며;
바람직하게는, M1 은 직접 결합, NH, O중에서 선택되며;
바람직하게는, 상기 가역적 차단기는 리보오스 또는 데옥시 리보오스의 3'-OH에 연결되며, 염기 또는 데아자 염기 또는 이들의 토토머는 리보오스 또는 데옥시 리보오스의 1'-C 에 연결되며, 선택적 인산염기는 리보오스 또는 데옥시리보오스의 5'-OH에 연결되고, 링커는 염기 또는 데아자 염기 또는 이들의 토토머에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 상기 화학식 A의 구조는 화학식 A-1, 화학식 A-2, 화학식 A-3, 화학식 A-4, 또는 화학식 A-5 중에서 선택되며, 바람직하게는 화학식 A의 구조는 화학식 A-1, 화학식 A-2 또는 화학식 A-5이며; 또는 상기 화학식 A'의 구조는 화학식 A'-1, 화학식 A'-2, 또는 화학식 A'-3에서 선택되며, 바람직하게는 상기 화학식 A'의 구조는 화학식 A'-1이다;
상기:
Ra, Rb, Rc, X, M1 는 상술한 정의와 동일한 정의를 갖는다.
일부 구현예에 있어서, 화학식 A의 구조는 다음에서 선택된다:
또는, 상기 화학식 A'의 구조는 이다.
일부 구현예에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체는 다음 화학식 B의 구조를 갖는다:
Lx 는 전술한 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A-1, 화학식 A-2, 화학식 A-3, 화학식 A-4, 화학식 A-5, 화학식 A'-1, 화학식 A'-2 또는 화학식 A'-3의 구조를 가지며, Lx 의 M1 끝 또는 S 끝은 Lb에 연결된며, Lx 의 O 끝은 La와 연결된다;
는 검출 가능한 라벨에 연결하기 위한 링커를 나타낸다;
염기1은 염기 또는 데아자 염기 또는 이의 토토머를 나타낸다;
R' 은 가역적 차단기를 나타낸다;
R0 은 H 또는 인산염기를 나타낸다;
La 는 염기 또는 데아자 염기 또는 이들의 토토머에 연결하기 위한 링커 내의 모이어티를 나타낸다;
Lb 는 검출 가능한 라벨에 연결하기 위한 링커 내의 모이어티를 나타낸다;
일부 구현예에 있어서, 상기 뉴클레오사타이드 유사체는 다음 화학식 B의 구조를 갖는다:
상기:
Lx 는 전술한 화학식 A, 화학식 A-1, 화학식 A-2, 화학식 A-3, 화학식 A-4, 화학식 A-5, 화학식 A'-1, 화학식 A'-2, 또는 화학식 A'-3의 구조를 가지며, Lx의 M1 끝 또는 S 끝은 Lb 와 연결되며, Lx 의 O 끝은 La 와 연결된다;
La 는 다음에서 선택된다:
바람직하게는, La는 다음에서 선택된다
또는, 바람직하게는, La는 다음에서 선택된다:
또는, 더 바람직하게는, La는 다음에서 선택된다:
또는 더욱 바람직하게는, La는 다음에서 선택된다:
또는 가장 바람직하게는, La는 다음에서 선택된다:
r1, r2, r3a, r3b, r4 는 서로 독립적으로 1 및 6사이의 임의의 정수 중에서 선택된다;
바람직하게는, r1 은 1, 2, 3 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, r1 은 1이다;
바람직하게는, r2 는1, 2, 3 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, r2 는 1이다;
바람직하게는, r3a, r3b 는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 중에서 선택되고, r3a, r3b 은 동시에 0이 아닌 것이 바람직하다;
더 바람직하게는, r3a, r3b 는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3 중에서 선택되고, r3a, r3b 은 동시에 0이 아닌 것 중에서 선택된다;
더욱 바람직하게는, r3a 는 0, 1 중에서 선택되고, r3b 는 0, 2 중에서 선택되고, r3a, r3b 는 동시에 0이 아닌 것 중에서 선택된다;
가장 바람직하게는, r3a 는 1이다;
가장 바람직하게는, r3b 는 2이다;
바람직하게는, r4 는 1, 2, 3 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, r4 는 1이다;
M 은 직접 결합, CH2, NH, O, S 중에서 선택된다;
바람직하게는, M 은 직접 결합, CH2, O 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, M 은 CH2, O 중에서 선택된다;
Lb 는 다음에서 선택된다:
바람직하게는, Lb 는 다음에서 선택된다:
더 바람직하게는, Lb 는 다음에서 선택된다:
가장 바람직하게는, Lb 는 다음에서 선택된다:
Lc 는 직접결합, 에서 선택되며, 바람직하게는, Lc 의 NH 끝은 Lb의 H에 연결되고, Lc 의 =O 끝은 Lb의 NH에 연결된다;
바람직하게는, Lc 는 직접 결합,
중에서 선택되고, 바람직하게는 Lc 의 NH 끝은 Lb의 H에 연결되고, Lc 의 =O 끝은 Lb의 NH에 연결된다;
rm 은 0 및 6사이의 임의의 정수 중에서 선택된다;
바람직하게는, rm 은 0, 1, 2, 3 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, rm 은 0, 1 중에서 선택된다;
r5, r6, r7, 은 서로 독립적으로, 1및 6사이의 임의의 정수 중에서 선택된다;
바람직하게는, r5 는 1, 2, 3 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, r5 는 2이다;
바람직하게는, r6 은 1, 2, 3 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, r6 은 1 또는 2이다;
바람직하게는, r7 은 1, 2, 3 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, r7 은 2이다;
r10 은 1 및 10 사이의 임의의 정수 중에서 선택된다;
바람직하게는, r10 은 2 및 6 사이의 임의의 정수 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, r10 은 2 또는 6이다;
r11 은 1 및 6 사이의 임의의 정수 중에서 선택된다;
바람직하게는, r11 은 1, 2, 3 중에서 선택된다;
더 바람직하게는, r11 은 1이다;
M1, M2, M3 은 서로 독립적으로, 직접 결합, NH, O, S, CH2 중에서 선택된다;
바람직하게는, M1 은직접 결합, NH, O 중에서 선택된다;
바람직하게는, M2 은 NH이다;
바람직하게는, M3 은 직접 결합, NH 중에서 선택된다;
염기1 은 염기 또는 데아자 염기를 나타낸다;
R' 은 가역적 차단기를 나타낸다;
은 검출 가능한 라벨에 연결하기 위한 링커를 나타낸다;
R0 은 H 또는 인산염기를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, 상기 염기1 은 아데닌, 7-데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 토토머 중에서 선택된다;
바람직하게는, 염기1은
중에서 선택된다.
일부 구현예에 있어서, R0 은 H, 일인산기(), 이인산기(), 삼인산기(), 사인산기() 중에서 선택된다;
바람직하게는, R0 은 삼인산기()이다;
각 Z는 독립적으로 O, S, BH 중에서 선택된다;
바람직하게는, Z 는 O이다.
일부 구현예에 있어서, 상기 가역적 차단기 R' 는N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬,, NH2, -ONH2, -OCORz, -OCONHRz 중에서 선택되고;
상기 각 Rz, 는 독립적으로 지방족 알킬 (예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 또는 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 C1-C6 알킬) 중에서 선택되고;
바람직하게는, 상기 가역적 차단기 R'는 N3-C1-C6 alkyl, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬,, NH2중에서 선택되고;
더 바람직하게는, 상기 가역적 차단기 R' 는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, 중에서 선택되고;
가장 바람직하게는, 상기 가역적 차단기 R' 는 N3-CH2-, CH3-CH2-S-S-CH2-, 중에서 선택되고;
R1', R2', R3', R4', R5'에서, 임의의 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이고, 다른 것들은 서로 독립적으로 H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐-C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(예: C1-C6 알콕실)에서 선택된다;
바람직하게는, R1', R2', R3', R4', R5'에서, 임의의 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이고, 다른것(예를 들어, R3')은 H, C1-C6 알콕실(예를 들어, 메톡실) 중에서 선택되고, 다른것들은 H이다,
더 바람직하게는, R1', R2', R3', R4', R5'에서 임의의 하나(예를 들어, R1' 또는 R5') 는 이고, 다른것들은 H이다,
가장 바람직하게는, R1', R2', R3', R4', R5'에서, R1' 는 이고, 다른것들은 H이다,
Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx 에서 선택되고, 다른 하나는 H, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬, 예를 들어, Me, Et, iPr, tBu), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐-C1-C6 알킬), 시클로알킬(예를 들어, C3-C6 시클로알킬)에서 선택되며, 상기 각 Rx는 독립적으로 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬) 또는 방향족 알킬(예: 페닐 C1-C6 알킬) 중에서 선택된다.
바람직하게는, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) 중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택되고,
더 바람직하게는, Rb', Rc' 에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 상기 표 A 및 표 C의 화합물 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 추가적인 검출 가능한 라벨을 운반하고, 검출 가능한 라벨은 링커(바람직하게는 Lb)에 연결된다;
바람직하게는, 뉴클레오타이드 유사체에 의해 운반되는 추가적인 검출 가능한 라벨은 친화성 시약(예를 들어, 항체, 압타머, 아피머, 노틴)에 의해 도입되고, 여기서 친화성 시약은 검출 가능한 라벨을 운반하고, 친화성 시약은 뉴클레오타이드 유사체의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있고; 바람직하게는 검출 가능한 라벨은 Lb의 말단 아미노 그룹에 연결되고; 바람직하게는 검출 가능한 라벨은 Lb의 말단 아미노 그룹에 연결되고;
바람직하게는, 검출 가능한 표지 내의 카르복실은 아미드 결합의 형성을 통해 Lb의 말단 아미노 그룹에 연결된다;
바람직하게는, 염기1은 상이하고, 뉴클레오타이드 유사체에 의해 운반되는 추가적인 검출 가능한 라벨은 상이하다;
바람직하게는, 검출 가능한 라벨은 형광 라벨이다;
바람직하게는, 검출 가능한 라벨은 다음 중에서 선택된다: iF700,
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 상기 표 B 및 표 D의 화합물 중에서 선택된다.
본 발명의 제23 양태에 있어서, 본 발명은 핵산 합성을 종료하는 방법을 제공하며, 상기 핵산 합성은 상기 뉴클레오타이드 유사체를 종료될 핵산 분자에 통합하는 단계를 포함한다;
바람직하게는, 뉴클레오타이드 유사체의 통합은 말단 전이 효소, 말단 중합 효소 또는 역전사 효소에 의해 달성된다;
바람직하게는, 상기 방법은 중합효소를 사용하여 종결될 핵산 분자에 뉴클레오타이드 유사체를 통합하는 것을 포함한다;
바람직하게는, 상기 방법은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 뉴클레오타이드 유사체를 종결될 핵산 분자의 3' 말단에 통합하는 것을 포함하는 것을 포함한다.
본 발명의 제24 양태에 있어서, 본 발명은 시퀀싱 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 성장하는 상보적인 폴리뉴클레오타이드에 상기 뉴클레오타이드 유사체를 통합하는 것을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오타이드 유사체의 통합은 성장하는 상보적인 폴리뉴클레오타이드에 임의의 후속 뉴클레오타이드가 도입되는 것을 방지하는 것을 특징으로 한다;
바람직하게는, 뉴클레오타이드 유사체의 통합은 말단 전이 효소, 말단 중합 효소 또는 역전사 효소에 의해 달성된다;
바람직하게는, 상기 방법은 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 유사체를 성장하는 상보성 폴리뉴클레오타이드에 통합하는 것을 포함한다;
바람직하게는, 상기 방법은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 뉴클레오타이드 유사체를 성장하는 상보성 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 통합하는 것을 포함한다.
본 발명의 제25 양태에 있에서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정할 때 형성되는 핵산 중간체를 제공하며, 여기서, 핵산 중간체는 다음 단계에 따라 형성된다,
상기 핵산 중간체는 상기 단계에 따라 형성되는 단계:
표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 성장하는 핵산 가닥에 통합하여 핵산 중간체를 형성하는 단계, 여기서, 통합된 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 뉴클레오타이드 유사체이다;
또는, 핵산 중간체는 단계에 따라 형성된다:
성장하는 핵산 가닥에 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 통합하여 핵산 중간체를 형성하는 단계, 여기서, 통합된 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 뉴클레오타이드 유사체이다, 성장하는 핵산 가닥은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 미리 통합하고, 상기 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 미리 통합된 뉴클레오타이드는 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 라벨이 제거된 전술한 뉴클레오타이드 유사체이고, 상기 핵산 가닥은 상기 상보적인 상보적 뉴클레오타이드와 사전 통합된 상기 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드와 사전 통합되는 것이다.
본 발명의 제26 양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법을 제공하며, 이는 다음을 포함한다:
1) 성장하는 핵산 가닥에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드의 통합을 모니터링하는 단계, 여기서, 통합된 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드는 전술한 뉴클레오타이드 유사체이고, 및 다음을 포함한다,
2) 통합된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계;
바람직하게는, 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 라벨은 다음 상보적 뉴클레오타이드가 도입되기 전에 제거된다;
가역적 차단기와 검출 가능한 라벨이 동시에 제거되는 것이 바람직하다;
가역적 차단기와 검출 가능한 라벨은 순차적으로 제거되는 것이 바람직하다; 예를 들어, 검출 가능한 라벨이 제거된 후에 가역적 차단기가 제거되거나, 가역적 차단기가 제거된 후에 검출 가능한 라벨이 제거되는 것이 바람직하다.
일부 구현예에 있어서, 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 전술한 뉴클레오타이드 유사체이고, 선택적으로 나머지 뉴클레오타이드가 전술한 뉴클레오타이드 유사체이며, 상기 복수의 뉴클레오타이드는 전술한 뉴클레오타이드 유사체이다;
(b) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 서열에 통합하는 단계, 여기서 복수의 상이한 뉴클레오타이드는 검출하는 동안 서로 구별될 수 있다;
(c) 통합된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하기 위해 (b)의 단계에서 뉴클레오타이드를 검출하는 단계;
(d) 가역적 차단기 및 (b)의 뉴클레오타이드에 의해 운반되는 선택적 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계; 및
(e) 선택적으로 (a)-(d)단계를 한 번 이상 반복하는 단계;
이에 따라, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열이 결정된다.
일부 구현예에 있어서, 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 제1 뉴클레오타이드, 제2 뉴클레오타이드, 제3 뉴클레오타이드 및 제4 뉴클레오타이드를 제공하는 단계, 여기서, 상기 4개 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 전술한 뉴클레오타이드 유사체이고, 선택적으로, 상기 나머지 뉴클레오타이드는 전술한 뉴클레오타이드 유사체이다;
(2) 4개의 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; 성장하는 핵산 가닥에 통합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하는 단계; 성장하는 핵산 가닥에 통합된 뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 가역적 차단기 및 성장하는 핵산 가닥에 통합된 뉴클레오타이드에 포함된 선택적 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계를 포함한다;
선택적으로, (3): (1)-(2) 단계를 한 번 이상 반복하는 단계도 포함된다.
일부 구현예에 있어서, 이 방법은 다음 단계를 포함합니다:
(a) 듀플렉스, 적어도 하나의 전술한 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드, 중합 효소 및 절제 시약을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 여기서, 듀플렉스는 성장하는 핵산 가닥 및 시퀀싱될 핵산 가닥을 포함한다;
(b) 다음 단계 (i), (ii) 및 (iii)를 포함하는 반응 수행, 선택적으로, 하나 이상의 단계를 반복하는 단계:
단계 (i): 중합 효소를 사용하여 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 라벨을 포함하는 핵산 중간체를 형성하여 뉴클레오타이드 유사체를 성장하는 핵산 가닥에 통합한다:
단계 (II): 핵산 중간체 검출;
단계 (iii): 절제 시약을 사용하여 핵산 중간체에 포함된 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계;
가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 라벨의 제거가 동시에 수행되거나, 가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 라벨의 제거가 순차적으로 수행되는 것이 바람직하다(예를 들어, 가역적 차단기가 먼저 제거되거나, 검출 가능한 라벨이 먼저 제거된다);
가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 라벨의 제거에 사용되는 시약과 동일한 것이 바람직하다;
가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 라벨의 제거에 사용되는 시약과 다른 것이 바람직하다.
일부 구현예에 있어서, 듀플렉스는 지지체에 연결된다;
바람직하게는, 성장하는 핵산 가닥은 프라이머이다;
바람직하게는, 프라이머는 듀플렉스를 형성하기 위해 서열화될 핵산 가닥에 어닐링된다;
바람직하게는, 듀플렉스, 뉴클레오타이드 유사체 및 중합 효소는 함께 용액상 및 고상을 포함하는 반응 시스템을 형성한다;
바람직하게는, 뉴클레오타이드 유사체는 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 성장하는 핵산 가닥에 통합되어 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 라벨을 함유하는 핵산 중간체를 형성한다;
바람직하게는, 중합 효소는 KOD 중합 효소 또는 이의 돌연변이체(예를 들어, KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391) 중에서 선택된다;
바람직하게는, 핵산 중간체를 검출하는 임의의 단계 전에, 이전 단계에서 반응 시스템의 용액 상이 제거되고, 지지체에 연결된 이중이 유지되는 것이 바람직하다;
바람직하게는, 절제 시약은 용액상 및 고상을 포함하는 반응 시스템에서 듀플렉스 또는 성장하는 핵산 가닥과 접촉하는 것이 바람직하다;
바람직하게는, 절제 시약은 듀플렉스의 백본상의 포스포디에스테르 결합에 영향을 주지 않고, 성장하는 핵산 가닥에 통합된 뉴클레오타이드 유사체에 의해 운반되는 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 라벨을 제거할 수 있다;
바람직하게는, 가역적 차단기 및 핵산 중간체에 함유된 선택적 검출 가능한 라벨을 제거하는 임의의 단계 후에, 이 단계에서의 반응 시스템의 용액상이 제거된다;
바람직하게는, 세척 동작은 제거 동작을 포함하는 임의의 단계 후에 수행된다;
바람직하게는, 단계 (ii) 후에, 방법은 단계 (ii)에서 검출된 신호에 따라 단계 (i)에서 성장하는 핵산 가닥에 통합된 뉴클레오타이드 유사체의 유형을 결정하고, 염기 상보쌍의 원리에 따라 시퀀싱될 핵산 가닥의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 제27 양태에 있어서, 본 발명은 적어도 하나의 전술한 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 키트를 제공한다;
바람직하게는, 키트는 제1 화합물, 제2 화합물, 제3 화합물 및 제4 화합물을 포함하며, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물은 각각 독립적으로 전술한 뉴클레오타이드 유사체이다;
바람직하게는, 상기 제1 화합물에서, 상기 염기1은 아데닌, 7- 데아자아데닌 또는 이의 토토머(예를 들어,) 중에서 선택되고; 상기 제2 화합물에서, 상기 염기1은 티민, 우라실 또는 이의 토토머(예를 들어,) 중에서 선택되고; 상기 제3 화합물에서, 상기 염기1은 시토신 또는 이의 토토머(예를 들어, ) 중에서 선택되고; 상기 제4 화합물에서, 상기 염기1은 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머(예를 들어, ) 중에서 선택되고;
바람직하게는, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물에 함유된 염기1은 서로 상이하다;
바람직하게는, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 화합물에 의해 운반되는 추가 검출 가능한 라벨은 서로 상이하다.
일부 구현예에 있어서, 키트는 추가적으로 다음을 포함한다: 핵산 분자를 전처리하기 위한 시약; 시퀀싱될 핵산 분자를 연결하기 위한 지지체; 시퀀싱될 핵산 분자를 지지체에 연결(예를 들어, 공유 결합 또는 비공유 결합)하기 위한 시약; 뉴클레오타이드 중합 반응을 개시하기 위한 프라이머; 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하기 위한 중합효소; 하나 이상의 완충 용액; 하나 이상의 세척 용액; 또는 이들의 임의의 조합.
본 발명의 제 28양태에 있어서, 본 발명은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하기 위해 전술한 뉴클레오타이드 유사체 또는 전술한 키트의 용도를 제공한다.
본 발명의 dNTP 유사체 유형을 이용하면, 염기 또는 뉴클레오타이드의 리보스 고리(ribose ring) 3'-OH에 절단 가능하고 검출 가능한 표지의 에스테르(ester) 또는 카르보네이트 에스테르(carbonate ester)를 갖는 것과 같은 NGS 시퀀싱에 유용하다.
도 1은 본 발명의 실시예에 예시된 바와 같이, 염기에 연결된 절단 가능한 (형광) 라벨을 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 예시한다;
도 2는 본 발명의 실시예에 예시된 바와 같이, 가역적 차단기인 3'-OH에 연결된 (형광) 라벨을 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 예시한다.
도 2는 본 발명의 실시예에 예시된 바와 같이, 가역적 차단기인 3'-OH에 연결된 (형광) 라벨을 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 예시한다.
본 발명의 구현예는 구체적인 구현예를 통해 아래에 상세히 설명되지만, 어떠한 경우에도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
달리 명시되지 않는 한, 상기 그룹 및 치환체(substituents)는 제약 화학 분야에서 일반적인 의미를 갖는다.
본 명세서의 여러 부분에서, 본 발명에 개시된 화합물의 치환체는 그룹의 종류 또는 범위에 따라 개시된다. 특히, 본 발명은 이러한 그룹 유형 및 범위의 모든 구성원의 각각의 독립적인 하위 조합을 포함한다는 점에 특히 유의해야 한다. 예를 들어, "C1-C6 알킬"이라는 용어는 특히 독립적으로 개시된 메틸, 에틸, C3 알킬, C4 알킬, C5 알킬 및 C6 알킬을 지칭한다.
또한, 달리 명확하게 지적되지 않는 한, 명세서 전체에서 사용되는 "각각... 독립적으로 선택된다" 와 "... 각각 독립적으로 선택된다" 는 표현은 상호 교환 가능하며, 둘 다 넓은 의미, 즉 다른 그룹에서 동일 또는 다른 기호로 표현되는 특정 옵션이 서로 독립적이라는 것을 의미하거나 동일한 그룹에서 동일 또는 다른 기호로 표현되는 특정 옵션이 서로 독립적이라는 것을 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
"지방족 알킬"이라는 용어는 탄소 원자가 1개에서 20개까지 포함된 직선형 또는 분지형 포화기(예: C1-C12 알킬, 바람직하게는 C1-C6 알킬)를 의미한다.
"C1-C6 알킬"이라는 용어는 메틸(Me), 에틸(Et), n-프로필, 이소프로필(iPr), n-부틸, 이소부틸, 삼차부틸(tertbutyl, tBu), sec-부틸, n-아밀, 삼차-아밀(tert-amyl), n-헥실 등과 같이 탄소 원자가 1개에서 6개까지 포함된 모든 직선 또는 분지 포화기를 의미한다.
"알콕시"라는 용어는 산소 원자(-O-)를 통해 분자의 나머지 부분과 연결된 상기 설명된 알킬(예: C1-C6 알킬 등)을 의미한다.
"사이클로알킬"이라는 용어는 3-10원 단환 고리계의 포화 사이클릭 탄화수소(예: C3-C8 사이클로알킬, 바람직하게는 C3-C6 사이클로알킬)를 의미한다.
"C3-C6 시클로알킬"이라는 용어는 3-6원 단환 고리계의 포화 사이클릭 탄화수소를 의미한다. C3-C6 시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 될 수 있다.
"방향족 알킬"이라는 용어는 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬을 의미하며, 상기 알킬은 정의된 것과 같다.
"헤테로아릴"이라는 용어는 방향족 헤테로사이클, 일반적으로 N, O 또는 S 중에서 선택된 하나 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5-, 6-, 7- 또는 8-원자 헤테로사이클을 의미하며, 헤테로아릴 고리는 선택적으로 방향족 또는 비방향족 카보사이클 또는 헤테로사이클 고리에 추가로 융합될 수 있다. 헤테로아릴의 비제한적인 예로는 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티옥사졸릴, 피롤릴, 페닐-피롤릴, 푸라닐, 페닐-푸라닐, 옥사졸릴, 이소사졸릴, 피라졸릴, 티오페닐, 벤조푸란닐, 벤조티아페닐, 벤조-1,3-디옥소올란(벤조디옥솔), 이소하이드로인돌릴, 벤지미다졸릴, 인다졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 1,2,3-트리아졸릴, 1-페닐-1,2, 3-트리아졸릴, 2,3-디하이드로인돌릴, 2,3-디하이드로벤조푸라닐, 2,3-디하이드로벤조티에닐, 벤조피라닐, 2,3-디하이드로벤족사지닐, 2,3-디하이드로퀴녹살리닐 등이 있다.
"아릴"이라는 용어는 탄소 원자가 6-14개인 탄소 고리 방향족기, 예를 들어, C6-C10 아릴, 바람직하게는 페닐을 의미한다.
상기 모든 설명으로부터 당업자에게는 "페닐 C1-C6 알킬"과 같은 결합된 이름을 갖는 임의의 그룹이, 예를 들어 페닐로 치환된 C1-C6 알킬로부터 구성된 것과 같이, 그것이 유래된 부분으로부터 통상적으로 구성된 것으로 이해되어야 하며, 상기 C1-C6 알킬기는 상기 정의된 바와 같은 것으로 이해되어야 하는 것이 명백하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "화학식 I, 화학식 I-1, 화학식 I-2, 화학식 II, 화학식 II-1, 화학식 II-2, 화학식 III의 화합물의 염"이라는 용어는 음이온을 형성하는 유기산의 유기산 부가염을 예시할 수 있으며, 이에는 포름산염, 아세테이트, 프로피오네이트, 벤조산염, 말레산염, 푸마르산염, 숙시네이트, 타르트산염, 구연산염, 아스코르브산염, α-케토글루타레이트, α-글리세로인산염, 알킬 설포네이트 또는 아릴 설포네이트를 포함하되 이에 제한되지 않는다; 바람직하게는, 알킬 설포네이트는 메탄 설포네이트 또는 에탄 설포네이트이고, 아릴 설포네이트는 벤젠 설포네이트 또는 p- 톨루엔 설포네이트이다. 또는, 상기 용어는 염산염, 하이드로브로마이드, 하이드로요오드화물, 질산염, 중탄산염 및 탄산염, 황산염 또는 인산염 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 무기산 염을 의미하기도 한다.
"직접 결합"이라는 용어는 양쪽의 그룹이 직접 연결되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 다음 화학식, 에서, M3이 직접 결합인 경우 다음과 같은 화학식이 된다:. 다른 예로, 다음 화학식, 에서 M3이 직접 결합인 경우 다음과 같은 화학식이 된다:. 또 다른 예로, 다음 화학식, 에서, M3이 직접 결합인 경우 다음과 같은 화학식이 된다:.
본 발명에서, 검출 가능한 라벨이, 의 말단 아미노기에 연결될 때, 다음 두 가지 상황이 있을 수 있다: 1) r8이 0이 아닌 경우, "말단 아미노"는 화학식의 마지막 아미노를 의미하고; 2) r8이 0인 경우, 화학식은 이며, 상기 M2는 NH일 수 있으며, 이러한 상황에서 "말단 아미노"는 변경된 화학식에서 마지막 아미노를 의미한다고 이해할 수 있다.
본 발명에서, 검출 가능한 라벨이, 의 말단 아미노기에 연결될 때, 상기 "말단 아미노"는 공식의 마지막 아미노를 지칭한다.
본 발명에서, 검출 가능한 라벨이 Lb의 말단 아미노기에 연결되고 Lb가 예를 들어 , 인 경우, "말단 아미노"는 공식에서 마지막 아미노를 지칭한다.
본 발명의 방법에서, 두 가닥, 즉 성장하는 핵산 가닥과 시퀀싱될 핵산 가닥으로 구성된 임의의 물질은 성장하는 핵산 가닥 또는 시퀀싱될 핵산 가닥의 길이에 관계없이 "듀플렉스"라고 부를 수 있다. 시퀀싱할 핵산 가닥은 성장하는 핵산 가닥보다 더 긴 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 방법에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 임의의 표적 핵산 분자일 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명의 방법에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 그 유형에 의해 제한되지 않는다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 DNA 또는 RNA이다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, mRNA, cDNA, miRNA, 또는 siRNA일 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 선형 또는 순환이다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 이중 가닥 또는 단일 가닥이다. 예를 들어, 시퀀싱될 핵산 가닥은 단일 가닥 DNA(ssDNA), 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA) 또는 DNA와 RNA의 하이브리드일 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 단일 가닥 DNA이다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 이중 가닥 DNA이다.
본 발명의 방법에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 그 공급원에 의해 제한되지 않는다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 임의의 세포, 조직 또는 유기체(예컨대, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물)와 같은 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 가닥은 포유류(예: 인간, 비인간 영장류, 설치류 또는 개과 동물), 식물, 조류, 파충류, 어류, 곰팡이, 박테리아 또는 바이러스로부터 유래한다.
세포, 조직 또는 유기체로부터 핵산 분자를 추출하거나 획득하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 적합한 방법에는 에탄올 침전 및 클로로포름 추출 등이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 이러한 방법에 대한 자세한 설명은 예를 들어 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; F.M. Ausubel 외, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley&Sons, Inc., 1995를 참조한다. 또한 다양한 상업용 키트를 사용하여 다양한 소스(예: 세포, 조직 또는 유기체)에서 핵산 분자를 추출할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 시퀀싱될 핵산 분자는 그 길이에 의해 제한되지 않는다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 분자의 길이는 적어도 10bp, 적어도 20bp, 적어도 30bp, 적어도 40bp, 적어도 50bp, 적어도 100bp, 적어도 200bp, 적어도 300bp, 적어도 400bp, 적어도 500bp, 적어도 1000bp, 또는 적어도 2000bp일 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 분자의 길이는 10-20bp, 20-30bp, 30-40bp, 40-50bp, 50-100bp, 100-200bp, 200-300bp, 300-400bp, 400-500bp, 500-1000bp, 1000-2000bp, 또는 2000bp 이상일 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 시퀀싱될 핵산 분자는 높은 처리량 시퀀싱을 용이하게 하기 위해 10-1000bp의 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 제조 또는 시퀀싱 방법에서, 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하기 위해 적합한 중합효소가 사용될 수 있다. 일부 예시적인 실시예에서, 중합 효소는 DNA를 템플릿으로 사용하여 새로운 DNA 가닥을 합성할 수 있다(예를 들어, DNA 중합 효소). 일부 예시적인 실시예에서, 중합 효소는 RNA를 템플릿으로 사용하여 새로운 DNA 가닥을 합성할 수 있다(예컨대, 역전사 효소). 일부 예시적인 실시예에서, 중합 효소는 DNA 또는 RNA를 템플릿으로 사용하여 새로운 RNA 사슬을 합성할 수 있다(예를 들어, RNA 중합 효소). 따라서, 일부 바람직한 실시예에서, 중합 효소는 DNA 중합 효소, RNA 중합 효소 및 역전사 효소 중에서 선택된다. 적절한 중합 효소는 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하기 위한 실제 필요에 따라 선택될 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 중합 반응은 중합 효소 연쇄 반응(PCR)이다. 일부 바람직한 실시예에서, 중합 반응은 역전사 반응이다.
본 발명의 방법에서, 뉴클레오타이드 중합 반응에는 KOD 중합효소 또는 그 돌연변이가 사용될 수 있다. KOD 중합효소 또는 그 돌연변이체(예를 들어, KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391)는 본 발명의 변형 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 대해 수용 가능한 결합 효율을 초래할 수 있다. 본 발명의 변형 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 대한 수용 가능한 결합 효율은 KOD POL391 및 KOD POL171을 유도한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 변형된 뉴클레오타이드에 대한 KOD POL391 또는 KOD POL171의 결합 효율은 70% - 80%, 80% - 90% 또는 90% - 100%와 같이 70% 이상이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 제조 또는 시퀀싱 방법에서, 뉴클레오타이드의 중합 반응은 적절한 조건 하에서 수행된다. 적합한 중합 조건은 용액상의 조성, 각 성분의 농도, 용액상의 pH 및 중합 온도를 포함한다. 중합은 허용 가능하고 더 높은 결합 효율을 얻기 위해 적절한 조건에서 수행됩니다.
본 발명의 일부 실시예에서, 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 B의 화합물에서 데옥시리보오스의 3'- 위치의 수산기(-OH)는 (R' 에 의해) 보호되어 중합효소(예를 들어, DNA 중합효소)에 의한 중합을 종결시킬 수 있다. 예를 들어, 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 B의 화합물이 성장하는 핵산 사슬의 3'- 끝에 도입되면 화합물의 데옥시 리보오스의 3'- 위치에 유리 하이드록실 (-OH)이 없기 때문에 중합 효소는 중합의 다음 라운드로 진행할 수없고 중합이 종료된다. 이러한 경우, 중합의 각 라운드에서 성장하는 핵산 사슬에는 하나의 염기만 통합된다.
또한, 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 B의 화합물에서 데옥시리보스의 3'- 위치에 있는 수산기(-OH)의 보호기(R')를 제거하여 유리 수산기(-OH)를 복원할 수 있다. 그런 다음 성장하는 핵산 사슬은 중합 효소와 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 B의 화합물을 사용하여 다음 중합 반응을 거쳐 다시 염기를 통합 할 수 있다.
즉, 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 B의 화합물에서 데옥시리보스의 3'- 위치의 하이드 록실 (-OH)이 가역적으로 차단된다: 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 B의 화합물이 성장하는 핵산 사슬의 3' 말단에 통합되면 중합 효소에 의한 중합을 종료하고 성장하는 핵산 사슬의 추가 연장을 중단하고; 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 B의 화합물에 포함 된 차단기가 제거된 후, 중합 효소는 성장하는 핵산 사슬의 중합을 계속하여 핵산 사슬을 연장시킬 수 있다. 본 명세서에 설명된 일부 실시예는 종래의 감지 가능한 라벨의 사용과 관련된다. 검출은 형광 분광법 또는 다른 광학 수단을 포함하는 임의의 적절한 방법으로 실현될 수 있다. 바람직한 라벨은 형광 라벨, 즉 에너지를 흡수한 후 특정 파장의 방사선을 방출하는 형광 발광체이다. 적합한 형광 라벨은 당업에 많이 알려져 있다. 예를 들어, Welch 등, (Chem. Eur. 5(3):951-960,1999)는 본 발명에 사용될 수 있는 단실-기능화 형광 모티브를 개시한다. Zhu 등(Cytometry 28:206-211, 1997)은 본 발명에 사용될 수 있는 형광 표지 Cy3 및 Cy5의 사용에 대해 설명한다. 사용하기에 적합한 라벨은 또한 Prober 등(Science 238:336-341, 1987), Connell 등(BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge 등(Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) 및 Smith 등(Nature 321:674, 1986)에 개시되어 있다. 기타 상업적으로 이용 가능한 형광 표지에는 iF700, 플루오레세인, 로다민(TMR, 텍사스 레드, 록스 포함), 알렉사, 보디피, 아크리딘, 쿠마린, 피렌, 벤잔트라센 및 시아닌이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 특히, US20180223358A1의 표 7에 표시된 바와 같이, iF700은 당업에서 일반적으로 사용되는 형광 라벨 중 하나라는 점에 주목할 필요가 있다. 이 형광 라벨은 상업적으로 이용 가능하다.
본 출원에서는 이중 플루오로포어 FRET 카세트와 같은 다중 라벨도 사용할 수 있다(Tet. Let. 46:8867-8871, 2000). 다중 플루오르 덴드리머 시스템(J. Am. Chem. Soc. 123:8101-8108, 2001)도 사용할 수 있다. 형광 라벨이 선호되지만, 다른 형태의 검출 가능한 라벨도 당업자에게 유용한 것으로 명백할 것이다. 예를 들어, 양자점(엠포도클스 등, Nature 399:126-130, 1999), 금 나노입자(라이히트 등, Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000) 및 마이크로비드(라코스테 등, Proc. Natl. Sci USA 97(17):9461-9466, 2000)를 모두 사용할 수 있다.
본 출원에서는 다중 성분 라벨도 사용할 수 있다. 다중 성분 라벨은 검출을 위해 추가 화합물과의 상호 작용에 의존하는 라벨이다. 생물학에서 사용되는 가장 일반적인 다중 성분 라벨은 비오틴-스트렙타비딘 시스템이다. 비오틴은 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드에 부착된 라벨로 사용됩니다. 그런 다음 스트렙타비딘을 별도로 추가하여 검출이 이루어질 수 있도록 한다. 다른 다중 성분 시스템을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 디니트로페놀에는 검출에 사용할 수 있는 상업적으로 이용 가능한 형광 항체가 있다.
본 명세서에 기술된 일부 실시예에서, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자에 상술한 검출 가능한 라벨을 부착하는 것은 친화성 시약(예를 들어, 항체, 압타머, 아피머 및 노틴)의 통합을 통해 달성될 수 있으며, 친화성 시약은 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자의 에피토프에 특이적으로 인식하고 결합할 수 있다. 구체적인 원리는 본원에 전체 참조로 통합되어 있는 WO2018129214A1에 개시되어 있다.
본 명세서에 기술된 다른 실시예에서, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자는 상술한 검출 가능한 라벨에 연결될 수 있다. 이러한 일부 실시예에서, 사용된 링커는 절단될 수 있다. 절단 가능한 링커를 사용하면, 검출 후 필요에 따라 라벨을 제거할 수 있으므로, 이후에 추가된 라벨링된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드로부터 간섭 신호를 피할 수 있다.
링커는 산, 염기, 친핵성, 전기성, 라디칼, 금속, 환원제 또는 산화제, 빛, 온도, 효소 등에 대한 노출을 포함하여 임의의 적절한 방법으로 절단될 수 있다. 여기에 설명된 링커는 염기의 보호기 절단에 사용되는 것과 동일한 촉매를 사용하여 절단할 수도 있다. 적합한 링커는 Greene & Wuts, 유기 합성의 보호기, John Wiley & Sons에 개시된 바와 같이 표준 화학 보호기로부터 조정할 수 있다. 고상 합성에 사용되는 더 적합한 절단 가능한 링커는 Guillier 등(Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000)에 개시되어 있다.
"절단 가능한 링커"라는 용어의 사용은 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드에서 전체 링커를 제거해야 한다는 것을 의미하지는 않는다. 검출 가능한 라벨이 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드에 부착된 경우, 뉴클레오사이드 절단 부위는 절단 후 링커의 일부가 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드에 부착된 상태로 유지되도록 하는 링커 상의 위치에 위치할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 가역적 차단 뉴클레오타이드 유사체를 이용하여 시퀀싱에 포함된 뉴클레오타이드의 종류를 하나씩 검출할 수 있기 때문에, 본 발명의 뉴클레오타이드가 Sanger 시퀀싱, 차세대 고처리량 시퀀싱(NGS 시퀀싱) 및 3세대 시퀀싱(단일 분자 시퀀싱)에 효과적일 수 있음을 당업자에게 알 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예와 함께 더욱 상세히 설명한다. 이하의 실시예에서는 4가지 염기 중 하나에 대한 뉴클레오타이드 유사체의 제조만을 예시하고 있으며, 당업자는 나머지 3가지 염기에 대한 뉴클레오타이드 유사체의 제조를 위해 이러한 제조 공정을 참조할 수 있음에 유의해야 한다. 또한, 다음의 실시예에 예시된 바와 같이 준비 공정의 최종 단계에서 화합물을 염료에 연결할 때, 당업자에게 공지된 임의의 염료가 연결에 사용될 수 있으며, 다음의 각 실시예에 예시된 염료는 단지 예시를 위한 것일 뿐 염료의 선택 범위에 제한을 두는 것은 아니다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 모든 원재료는 상업적으로 이용 가능한 것이다.
I. 화합물의 준비 예
실시예 1
링커 1의 합성
DCC의 존재하에 뉴클레오사이드를 산과 축합하고, 보호기 제거를 위해 TBAF로 처리되었고, 삼인산화시켰다. 아미노분해 후, 링커 1과 결합시키고, 트리플루오로아세틸을 제거한 후, 형광 염료와 커플링하여 최종 생성물을 얻었다.
실시예 2
링커 2의 합성
p-아미노 아지도벤조산과 트리플루오로아세틸로 보호된 PEG 링커의 축합을 통해 링커 2를 얻을 수 있었다.
DCC의 존재하에 뉴클레오사이드를 산과 축합하고, 아세틸기 제거를 위해 암모니아로 처리되었고, DCC의 존재 하에 다시 응축을 실시하였다. 보호기 제거를 위하여 TBAF로 처리되었고, 삼인산화시켰다. 트리플루오로아세틸기를 제거하기 위한 아미노분해 후 형광 염료와 커플링하여 최종 생성물을 얻었다.
실시예 3
링커 3의 합성
합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1에 따른다.
DCC의 존재하에 뉴클레오사이드를 산과 축합하고, 아세틸기 제거를 위해 암모니아로 처리되었고, DCC의 존재 하에 다시 응축을 실시하였다. 보호기 제거를 위해 TBAF로 처리되었고, 삼인산화시켰다. 트리플루오로아세틸기를 제거하기 위해 아미노분해 후, 형광 염료와 커플링하여 최종 생성물을 얻었다.
실시예 4
링커 4의 합성
DCC의 존재하에 뉴클레오사이드를 산과 축합하고, 보호기 제거를 위해 TBAF로 처리되었고, 삼인산화시켰다. 트리플루오로아세틸기를 제거하기 위한 아미노분해 후 링커 4와 커플링시킨 후 링커의 트리플루오로아세틸키를 제거하고, 형광 염료와 커플링하여 최종 생성물을 얻었다.
실시예 5
링커 5의 합성
DCC의 존재하에 뉴클레오사이드를 산과 축합하고, 보호기 제거를 위해 TBAF로 처리되었고, 삼인산화시켰다. 트리플루오로아세틸기를 제거하기 위한 아미노분해 후 링커 5와 커플링한 후, 링커의 트리플루오로아세틸기를 제거하고, 형광 염료와 커플링하여 최종 생성물을 얻었다.
실시예 6-1
링커 6의 합성
합성 공정은 실시예 7-2와 유사하였다. 15mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z1861.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.27 (s, 1H), 8.63 - 8.58 (m, 1H), 8.36 (t, J = 13.1 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.92 - 7.88 (m, 2H), 7.84 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 7.81 (s, 2H), 7.78 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.71 - 7.67 (m, 1H), 7.65 - 7.62 (m, 4H), 7.49 - 7.43 (m, 1H), 7.31 (dd, J = 8.3, 3.1 Hz, 2H), 6.67 - 6.54 (m, 2H), 6.31 (dd, J = 13.8, 5.3 Hz, 2H), 5.68 (s, 1H), 5.30 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 5.26 - 5.17 (m, 1H), 4.34 (dt, J = 22.7, 3.7 Hz, 1H), 4.22 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.11 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 4.08 - 4.00 (m, 2H), 3.67 - 3.65 (m, 1H), 3.59 - 3.56 (m, 2H), 3.22 - 3.15 (m, 2H), 2.21 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.11 (d, J = 2.3 Hz, 4H), 2.09 - 2.04 (m, 4H), 1.66 (s, 3H), 1.60 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.52 (dd, J = 14.9, 7.4 Hz, 2H), 1.37 - 1.29 (m, 2H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 4H).
실시예 6-2
링커의 합성
링커 6의 합성 공정은 실시예 6-1의 합성공정과 동일하였다.
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. 16mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1809.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.16 (s, 1H), 8.95 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.80 (s, 2H), 8.23 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.99 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.69 (dd, J = 8.7, 1.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.45 - 7.37 (m, 1H), 6.72 (s, 2H), 6.30 - 6.20 (m, 1H), 5.57 - 5.54 (m, 1H), 5.31 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 5.22 - 5.13 (m, 1H), 4.36 (d, J = 20.9 Hz, 1H), 4.24 - 4.19 (m, 2H), 4.14 (s, 2H), 4.08 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.06 - 4.00 (m, 2H), 3.80 (dd, J = 13.1, 6.8 Hz, 2H), 3.73 - 3.69 (m, 2H), 3.67 (dd, J = 7.0, 4.1 Hz, 2H), 3.63 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.07 (t, J = 7.8 Hz, 5H), 1.73 - 1.66 (m, 2H), 1.65 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.60 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 6.7 Hz, 12H), 1.00 (d, J = 2.0 Hz, 6H).
실시예 7-1
(1) 단계 1
링커 7의 합성
1g의 PEG-CF3 기질(OKeanos Tech, cat. No. OK20A409)을 DMF에 용해하고, TSTU(2 eq) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(3 eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 아닐린 기질(OKeanos Tech, cat. No. OK20A408)(1.2 eq)을 첨가하였다. 반응을 4시간 동안 진행시키고 물을 첨가하여 반응을 종료시키고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 농축하여 건조시킨 후, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색의 유성 화합물을 얻었다. MS[ES(-)], m/z 484.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.92 (s, 1H), 9.98 (s, 1H), 9.53 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.69 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 5.48 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.68 - 3.66 (m, 2H), 3.62 - 3.60 (m, 2H), 3.55 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.37 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.15 (s, 3H), 1.60 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
(2) 단계 2
상기 단계 1에서 얻은 기질 100mg을 3mL의 DMF에 용해하고, DCC(1.2 eq) 및 DMAP(10% mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반하고, 하이드록실산 기질(상하이 비데팜, 제품 번호 BD628858)(2 eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 12 시간 동안 교반한 후, 예비 HPLC (C18 역상 크로마토 그래피 컬럼, 250 * 30 mm)로 직접 분리하여 백색 고체 (링커 7) 85mg을 제공하였다. MS[ES(-)], m/z 585.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.06 (s, 1H), 9.53 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 4.40 - 4.30 (m, 3H), 4.11 (s, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.78 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.68 - 3.66 (m, 2H), 3.62 - 3.60 (m, 2H), 3.55 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.37 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.13 (s, 3H), 1.61 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
(3) 단계 3
요오드-U 뉴클레오시드 기질(OKeanos Tech, cat. No. OK-N-16001) 1g을 DMF에 용해하고, Pd(PPh3)4(10 몰%), CuI(15 몰%), 트리에틸아민(3 eq) 및 기질 프로파르길아민(OKeanos Tech, cat. No. OK20A410)(1.5 eq)을 첨가하였다. 반응을 60℃에서 12시간 동안 진행하고 물을 첨가하여 종료시킨 DCM으로 추출하였다. 농축 후, 잔류물을 컬럼 분리하여 백색 고체 생성물 1.1g을 얻었다. MS[ES(-)], m/z 491.1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.67 (s, 1H), 10.00 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 6.12 (dd, J = 7.6, 5.9 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.26 - 4.12 (m, 3H), 3.88 (q, J = 2.8 Hz, 1H), 3.81 (dd, J = 11.5, 2.6 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 11.5, 3.1 Hz, 1H), 2.17 (ddd, J = 13.2, 6.0, 2.8 Hz, 1H), 2.05 (ddd, J = 13.3, 7.7, 5.8 Hz, 1H), 0.87 (s, 9H), 0.08 (d, J = 1.8 Hz, 6H).
(4) 단계 4
상기 단계 3에서 얻은 기질 뉴클레오사이드 300mg을 10mL의 DMF에 용해하고, DCC(1.2 eq) 및 DMAP(10% mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반하고 이황화 카르복실산 기질(OKeanos Tech, cat. No. OK20A420)(1.5 eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 12시간 동안 교반한 후 컬럼 크로마토그래피로 직접 분리하여 백색 고체 359mg을 얻었다. MS[ES(-)], m/z 700.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.74 (s, 1H), 10.03 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.90 - 7.82 (m, 1H), 7.68 - 7.58 (m, 2H), 7.47 - 7.40 (m, 1H), 6.23 - 6.18 (m, 1H), 5.45 - 5.42 (m, 1H), 5.20 - 5.12 (m, 1H), 4.38 - 4.16 (m, 3H), 3.98 - 3.87 (m, 2H), 2.60 - 2.53 (m, 1H), 2.40 - 2.31 (m, 1H), 2.06 (d, J = 0.6 Hz, 3H), 1.65 (dd, J = 7.0, 1.0 Hz, 3H), 0.90 (s, 9H), 0.13 (d, J = 1.2 Hz, 6H).
(5) 단계 5
상기 단계 4에서 얻은 기질 뉴클레오사이드 300mg을 10mL의 THF에 용해하고 ℃에서 TBAF(2 eq, 1M in THF)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고 실온으로 데운 후 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 직접 분리하여 백색 고체 200mg을 얻었다. MS[ES(-)], m/z 587.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.68 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 10.06 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.88 - 7.78 (m, 1H), 7.66 - 7.56 (m, 2H), 7.43 - 7.39 (m, 1H), 6.25 - 6.13 (m, 1H), 5.48 - 5.45 (m, 1H), 5.31 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.18 - 5.12 (m, 1H), 4.28 - 4.16 (m, 3H), 3.76 - 3.67 (m, 2H), 2.50 - 2.40 (m, 2H), 2.04 (d, J = 9.2 Hz, 3H), 1.68 - 1.59 (m, 3H).
(6) 단계 6
상기 단계 5에서 얻은 기질 뉴클레오시드 200mg을 5mL의 트리메틸 포스페이트에 용해시켰다. 0℃에서 옥시염화인(1.5 eq)을 첨가한 후, 반응 혼합물을 0℃에서 120분간 교반한 후 DMF(5mL)의 트리부틸 암모늄 피로인산염(2 eq) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하면서 계속 교반하고 반응을 종료시키기 위해 0.1m TEAB 버퍼를 추가한 다음 예비 HPLC 역상 컬럼 크로마토그래피(C18, 이동상: 0.1m TEAB-아세토니트릴)로 분리하였다. 농축 후, 잔류물에 농축 수성 암모니아 3mL를 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후, 예비 HPLC 역상 컬럼 크로마토그래피(C18, 이동상: 0.1m TEAB-아세토니트릴)로 분리하여 백색 고체 120mg을 제공하였다. MS[ES(-)], m/z 745.5. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.51 (s, 1H), 7.90 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.67 (td, J = 7.6, 1.4 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.45 (td, J = 9.2, 5.7 Hz, 1H), 5.75 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 5.15 - 5.07 (m, 1H), 4.72 - 4.64 (m, 1H), 4.39 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 4.07 (s, 2H), 2.82 - 2.76 (m, 1H), 2.64 - 2.54 (m, 1H), 2.02 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.73 (dd, J = 7.1, 2.2 Hz, 3H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ -9.79 (dd, J = 20.3, 9.6 Hz, 1P), -11.68 (d, J = 19.2 Hz, 1P), -22.82 (td, J = 19.2, 6.1 Hz, 1P).
(7) 단계 7
상기 단계 2에서 얻은 링커 7 기질 20mg을 DMF 1mL에 용해하고, TSTU(1.5 eq) 및 디이소프로필에틸아민(3 eq)을 첨가한 후 실온에서 120분간 교반하였다. 반응 혼합물을 상기 단계 6에서 얻은 뉴클레오타이드 기질 (2 eq)과 첨가하고 실온에서 3 시간 동안 계속 교반하고 반응을 종료시키기 위해 0.1 M TEAB 버퍼를 첨가한 다음 예비 HPLC 역상 컬럼 크로마토 그래피 (C18, 이동상 : 0.1 M TEAB- 아세토 니트릴)로 분리하였다. 농축 후, 잔류물을 농축 수성 암모니아 3mL와 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 다음, 예비 HPLC 역상 컬럼 크로마토그래피(C18, 이동상: 0.1m TEAB- 아세토니트릴)로 분리하여 백색 고체 15mg을 얻었다. MS[ES(-)], m/z 1201.7. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.91 (s, 1H), 8.96 - 8.84 (m, 1H), 8.28 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 8.6, 1.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.63 - 7.57 (m, 2H), 7.46 - 7.38 (m, 1H), 6.21 (ddd, J = 14.8, 8.4, 6.2 Hz, 1H), 5.57 (s, 1H), 5.35 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 5.21 - 5.13 (m, 1H), 4.39 (d, J = 12.5 Hz, 2H), 4.32 (s, 2H), 4.22 (s, 2H), 4.14 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 4.09 (d, J = 3.7 Hz, 2H), 4.05 (s, 2H), 3.82 - 3.79 (m, 4H), 3.68 - 3.64 (m, 2H), 3.63 - 3.59 (m, 2H), 2.99 - 2.93 (m, 2H), 2.60 - 2.52 (m, 1H), 2.47 - 2.36 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.05 (d, J = 21.1 Hz, 3H), 1.64 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
(8) 단계 8
염료 10mg (베이징 켐도우 유한 회사, 제품 번호 CD0014)을 0.5mL의 DMF에 용해시키고 TNTU (1.5 eq) 및 디이소 프로필 에틸 아민 (3 eq)을 첨가한 후 실온에서 120분 동안 교반하였다. 상기 단계 7에서 얻은 뉴클레오타이드 기질 (2 eq)을 첨가 한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 계속 교반하고, 반응을 종료시키기 위해 0.1 M TEAB 버퍼를 첨가 한 후, 예비 HPLC 역상 컬럼 크로마토 그래피 (C18, 이동상 : 0.1 M TEAB- 아세토 니트릴)로 분리하여 적색 고체 8mg을 제공 하였다. HPLC 순도 ＞99%. MS[ES(-)], m/z 1938.7. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.39 (brs, 1H), 9.15 - 9.10 (m, 1H), 8.28 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.03 - 8.00 (m, 1H), 7.88 - 7.79 (m, 3H), 7.76 - 7.67 (m, 3H), 7.66 - 7.60 (m, 3H), 7.58 - 7.39 (m, 3H), 6.99 (s, 2H), 6.80 (s, 2H), 6.27 - 6.20 (m, 1H), 5.59 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.34 - 5.29 ( m, 1H), 5.18 (p, J = 6.8 Hz, 1H), 4.44 - 4.29 (m, 4H), 4.14 - 4.04 (m, 9H), 3.81 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.77 - 3.61 (m, 7H), 3.59 - 3.51 (m, 6H), 3.40 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.19 - 3.14 (m, 2H), 3.11 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.69 - 2.65 (d, J = 6.5 Hz, 4H), 2.59 - 2.55 (m, 5H), 2.46 - 2.35 (m, 1H), 2.14 (d, J = 3.5 Hz, 3H), 2.08 (s, 1H), 2.04 (s, 1H), 2.00 - 1.91 (m, 4H), 1.87 - 1.80 (m, 4H), 1.70 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.65 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.60 (d, J = 6.8 Hz, 3H). 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ -11.24 (d, J = 22.7 Hz, 1P), -12.05 (d, J = 22.9 Hz, 1P), -23.63 (t, J = 22.7 Hz, 1P).
실시예 7-2
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. 요오드-U 뉴클레오사이드 기질 대신에 요오드-A 뉴클레오사이드 기질(OKeanos Tech, cat. No. OK-N-16003)을 대체하여 사용하였다. MS[ES(-)], m/z 513.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.04 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 6.85 (s, 2H), 6.47 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 5.29 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 4.33 - 4.29 (m, 1H), 4.27 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 3.81 (q, J = 3.9 Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 11.1, 4.1 Hz, 1H), 3.67 (dd, J = 11.1, 4.1 Hz, 1H), 2.43 - 2.36 (m, 1H), 2.24 - 2.18 (m, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.03 (d, J = 1.8 Hz, 6H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 723.1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.05 (s, 1H), 8.10 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.91 - 7.83 (m, 1H), 7.74 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.65 - 7.56 (m, 2H), 7.46 - 7.40 (m, 1H), 6.84 (brs, 2H), 6.64 - 6.48 (m, 1H), 5.58 - 5.52 (m, 1H), 5.24 - 5.10 (m, 1H), 4.37 - 4.15 (m, 3H), 3.95 - 3.74 (m, 2H), 2.84 - 2.75 (m, 1H), 2.70 - 2.54 (m, 1H), 2.06 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.64 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.28 - 1.17 (m, 1H), 0.87 (s, 9H), 0.07 (dd, J = 4.8, 2.7 Hz, 6H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 609.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.10 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.90 (dd, J = 7.4, 5.0 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.66 - 7.61 (m, 2H), 7.48 - 7.43 (m, 1H), 6.82 (brs, 2H), 6.60 - 6.51 (m, 1H), 5.59 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.36 (td, J = 5.5, 1.5 Hz, 1H), 5.21 (qd, J = 7.0, 4.1 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 4.26 - 4.20 (m, 1H), 3.75 - 3.64 (m, 2H), 2.90 - 2.77 (m, 1H), 2.65 - 2.51 (m, 1H), 2.09 (d, J = 8.6 Hz, 3H), 1.67 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 753.0. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.04 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.95 - 7.83 (m, 2H), 7.72 - 7.56 (m, 2H), 7.49 - 7.44 (m, 1H), 6.70 - 6.48 (m, 1H), 5.71 (dd, J = 17.3, 4.9 Hz, 1H), 5.12 - 5.00 (m, 1H), 4.62 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.41 - 4.21 (m, 2H), 4.18 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 2.78 - 2.31 (m, 2H), 2.03 - 1.83 (m, 3H), 1.70 (dd, J = 10.3, 7.1 Hz, 3H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ -7.18 (dd, J = 20.1, 13.4 Hz, 1P), -11.24 (d, J = 19.0 Hz, 1P), -22.25 (td, J = 19.6, 11.0 Hz, 1P).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1225.1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.18 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.37 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.21 (dd, J = 7.4, 1.7 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.69 - 7.58 (m, 3H), 7.47 - 7.40 (m, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.40 (s, 2H), 6.30 (dd, J = 9.4, 5.7 Hz, 1H), 5.66 (s, 1H), 5.35 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 5.20 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 8.4, 4.2 Hz, 1H), 4.30 (s, 2H), 4.13 - 4.08 (m, 2H), 4.06 - 4.03 (m, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.83 - 3.80 (m, 2H), 3.67 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 3.63 - 3.61 (m, 6H), 2.98 - 2.93 (m, 2H), 2.60 - 2.52 (m, 1H), 2.47 - 2.36 (m, 1H), 2.13 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.64 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였으며, 상기 염료는 AF532(OKeanos Tech로부터 상업적으로 입수 가능함, cat. No. OK F 532)로 대체되었다. 13mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1833.0. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.43 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 8.91 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.80 (s, 2H), 8.50 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.07 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.90 (dd, J = 7.6, 2.4 Hz, 1H), 7.84 - 7.79 (m, 2H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 7.49 - 7.42 (m, 3H), 6.70 (s, 2H), 6.65 - 6.58 (m, 1H), 5.69 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.33 - 5.27 (m, 1H), 5.21 (qd, J = 7.2, 2.0 Hz, 1H), 4.45 - 4.34 (m, 3H), 4.32 - 4.30 (m, 1H), 4.18 (s, 2H), 4.14 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 4.01 (s, 3H), 3.81 - 3.77 (m, 7H), 3.73 - 3.69 (m, 4H), 3.68 - 3.63 (m, 7H), 3.52 (q, J = 5.6 Hz, 4H), 2.12 (d, J = 2.4 Hz, 3H), 2.10 (s, 1H), 2.05 (s, 1H), 1.65 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.59 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.99 (d, J = 2.8 Hz, 5H). 31P NMR (162 MHz, DMSO-d 6 ) δ -10.99 (d, J = 20.6 Hz, 1P), -12.48 (d, J = 24.0 Hz, 1P), -23.41 (t, J = 22.5 Hz, 1P).
실시예 7-3
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. 요오드-U 뉴클레오사이드 기질 대신 요오드-G 뉴클레오사이드 기질(OKeanos Tech, cat. No. OK-N-16004)을 사용하였다. MS[ES(-)], m/z 529.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.48 (s, 1H), 9.98 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 6.38 - 6.21 (m, 3H), 5.23 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.26 (s, 1H), 4.18 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.78 (q, J = 4.0 Hz, 1H), 3.73 - 3.60 (m, 2H), 2.32 - 2.19 (m, 1H), 2.13 - 2.08 (m, 1H), 2.04 (s, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.03 (d, J = 1.8 Hz, 6H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 739.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.53 (s, 1H), 10.00 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.83 (dd, J = 7.5, 3.6 Hz, 1H), 7.61 - 7.58 (m, 2H), 7.48 - 7.39 (m, 1H), 7.29 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.42 - 6.25 (m, 3H), 5.72 (s, 1H), 5.58 - 5.46 (m, 1H), 5.16 (p, J = 7.2 Hz, 1H), 4.25 - 4.14 (m, 3H), 3.82 (t, J = 3.6 Hz, 2H), 2.71 - 2.60 (m, 1H), 2.50 - 2.45 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.75 - 1.55 (m, 4H), 1.29 - 0.96 (m, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.13 - 0.02 (m, 6H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 625.7. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.53 (s, 1H), 10.00 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.83 (dd, J = 7.5, 3.6 Hz, 1H), 7.61 - 7.58 (m, 2H), 7.48 - 7.39 (m, 1H), 7.29 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.42 - 6.25 (m, 3H), 5.72 (s, 1H), 5.58 - 5.46 (m, 1H), 5.16 (p, J = 7.2 Hz, 1H), 4.25 - 4.14 (m, 3H), 3.82 (t, J = 3.6 Hz, 2H), 2.71 - 2.60 (m, 1H), 2.50 - 2.45 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.75 - 1.55 (m, 4H), 1.29 - 0.96 (m, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.13 - 0.02 (m, 6H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 769.2. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.81 - 7.74 (m, 1H), 7.51 - 7.40 (m, 3H), 7.31 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 6.38 - 6.19 (m, 1H), 5.65 (dd, J = 11.2, 5.2 Hz, 1H), 5.07 - 4.96 (m, 1H), 4.53 (d, J = 20.8 Hz, 1H), 4.35 - 4.18 (m, 2H), 4.10 (s, 2H), 2.87 - 2.70 (m, 1H), 2.54 - 2.40 (m, 1H), 1.97 - 1.76 (m, 3H), 1.59 - 1.54 (m, 3H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ -9.27 (d, J = 19.6 Hz, 1P), -11.36 (d, J = 18.5 Hz, 1P), -22.79 (td, J = 19.2, 4.7 Hz, 1P).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1241.6. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.25 (s, 1H), 8.29 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.69 - 7.58 (m, 3H), 7.47 - 7.40 (m, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.40 (s, 2H), 6.30 (dd, J = 9.4, 5.7 Hz, 1H), 5.66 (s, 1H), 5.35 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 5.20 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 8.4, 4.2 Hz, 1H), 4.30 (s, 2H), 4.13 - 4.08 (m, 2H), 4.06 - 4.03 (m, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.83 - 3.80 (m, 2H), 3.67 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 3.63 - 3.61 (m, 6H), 2.98 - 2.93 (m, 2H), 2.47 - 2.42 (m, 1H), 2.41 - 2.30 (m, 1H), 2.13 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.66 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.62 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였으며, 상기 염료는 CY5(OKeanos Tech로부터 상업적으로 입수 가능함, cat. No. OK-F-13103)로 대체되었다. 18mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1878.9. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (brs, 1H), 10.43 (s, 1H), 8.43 - 8.32 (m, 2H), 8.03 (s, 1H), 7.92 - 7.82 (m, 2H), 7.82 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.72 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.66 - 7.60 (m, 3H), 7.46 - 7.42 (m, 1H), 7.31 (dd, J = 8.0, 3.6 Hz, 2H), 6.59 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 6.58 - 6.47 (m, 1H), 6.35 - 6.27 (m, 2H), 5.66 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 5.20 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.45 - 4.34 (m, 2H), 4.31 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.25 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.14 (s, 2H), 4.12 - 4.05 (m, 5H), 4.00 (s, 2H), 3.81 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 3.66 -3.64 (m, 2H), 3.58 -3.55 (m, 2H), 3.41 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.19 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.13 (d, J = 3.6 Hz, 3H), 2.08 -2.05 (m, 2H), 1.68 (s, 9H), 1.65 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.61 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.56 -1.49 (m, 2H), 1.35 -1.30 (m, 2H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H). 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ -11.33 (d, J = 22.6 Hz, 1P), -11.92 (d, J = 22.8 Hz, 1P), -23.68 (t, J = 22.6 Hz, 1P).
실시예 7-4
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. 요오드-U 뉴클레오사이드 기질 대신 요오드-C 뉴클레오사이드 기질(OKeanos Tech, cat. No. OK-N-16002)을 사용하였다. MS[ES(-)], m/z 678.1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.97 (s, 1H), 7.94 - 7.79 (m, 2H), 7.65 - 7.54 (m, 2H), 7.46 - 7.33 (m, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.18 - 6.14 (m, 1H), 5.40 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 5.16 (qd, J = 7.0, 2.1 Hz, 1H), 4.35 - 4.24 (m, 1H), 3.97 - 3.85 (m, 2H), 2.55 - 2.47 (m, 1H), 2.24 - 2.16 (m, 1H), 2.04 (d, J = 3.2 Hz, 3H), 1.63 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.12 (s, 6H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 700.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.93 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.85 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 7.47 - 7.40 (m, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.25 - 6.20 (m, 1H), 5.42 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 5.17 (qd, J = 7.0, 2.2 Hz, 1H), 4.36 - 4.29 (m, 1H), 4.27 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.95 - 3.87 (m, 2H), 2.65 - 2.52 (m, 1H), 2.27 - 2.17 (m, 1H), 2.06 (d, J = 2.8 Hz, 3H), 1.65 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.11 (d, J = 0.8 Hz, 6H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 580.5. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.94 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.82 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.61 (q, J = 4.1, 3.0 Hz, 2H), 7.41 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.26 - 6.17 (m, 1H), 5.45 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.28 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.15 (qd, J = 7.0, 3.6 Hz, 1H), 4.35 - 4.16 (m, 3H), 3.70 (dt, J = 5.6, 3.3 Hz, 2H), 2.54 - 2.44 (m, 1H), 2.33 - 2.26 (m, 1H), 2.04 (d, J = 5.7 Hz, 3H), 1.63 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 745.3. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.51 (s, 1H), 7.91 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.47 - 6.42 (m, 1H), 5.73 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.18 - 5.06 (m, 1H), 4.71 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.39 (q, J = 12.5 Hz, 2H), 4.09 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 2.83 - 2.79 (m, 1H), 2.58 - 2.50 (m, 1H), 2.03 (dd, J = 3.0, 1.5 Hz, 3H), 1.74 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ -9.99 (d, J = 19.4 Hz, 1P), -11.68 (d, J = 19.1 Hz, 1P), -22.93 (t, J = 19.4 Hz, 1P).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1201.6. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.99 (s, 1H), 8.75 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.07 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.87 - 7.84 (m, 3H), 7.70 - 7.58 (m, 3H), 7.47 - 7.37 (m, 1H), 6.95 (s, 1H), 6.23 (dd, J = 16.7, 8.2 Hz, 1H), 5.55 (s, 1H), 5.33 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 5.21 - 5.14 (m, 1H), 4.44 - 4.36 (m, 2H), 4.32 (dd, J = 7.8, 4.1 Hz, 2H), 4.24 (s, 2H), 4.13 (d, J = 3.3 Hz, 4H), 4.04 (s,2H), 3.82 (s, 2H), 3.68 - 3.55 (m, 6H), 2.97 (s, 2H), 2.46 - 2.34 (m, 2H), 2.13 (d, J = 2.1 Hz, 3H), 2.05 (d, J = 16.9 Hz, 3H), 1.64 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였으며, 상기 염료는 iF700 제품(iFluor™700 숙신이미딜 에스테르, AAT Bioquest로부터 상업적으로 입수 가능)으로 대체되었다. 16mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1962.8. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.30 (s, 1H), 8.91 - 8.84 (m, 1H), 8.80 - 8.74 (m, 1H), 8.41 - 8.35 (m, 3H), 8.25 (t, J = 13.2 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.90 - 7.78 (m, 4H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.65 - 7.60 (m, 2H), 7.53 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.48 - 7.37 (m, 3H), 6.94 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.65 (d, J = 8.0z, 2H), 6.54 (t, J = 12.6 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 6.28 - 6.22 (m, 1H), 6.08 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 5.55 (s, 1H), 5.31 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 5.18 (p, J = 7.2 Hz, 1H), 4.64 (s, 2H), 4.44 - 4.30 (m, 4H), 4.14 - 4.04 (m, 8H), 3.82 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 3.68 - 3.63 (m, 3H), 3.60 - 3.43 (m, 8H), 3.39 - 3.31 (m, 4H), 3.17 (s, 3H), 2.56 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.46 - 2.41 (m, 1H), 2.31 - 2.25 (m, 2H), 2.12 (s, 2H), 2.08 (s, 1H), 2.04 (s, 1H), 1.80 (s, 2H), 1.65 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 1.60 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.47 (s, 5H). 31P NMR (162 MHz, DMSO-d 6 ) δ -11.13 (d, J = 22.3 Hz, 1P), -11.90 (d, J = 22.6 Hz, 1P), -23.56 (t, J = 22.3 Hz, 1P).
실시예 8
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. 15mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1968.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.31 (d, J = 18.9 Hz, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.05 - 7.88 (m, 3H), 7.87 - 7.77 (m, 2H), 7.72 - 7.67 (m, 3H), 7.63 (dd, J = 5.2, 3.6 Hz, 1H), 7.57 - 7.43 (m, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.99 (s, 3H), 6.79 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 6.27 - 6.20 (m, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.34 - 5.28 (m, 2H), 4.44 - 4.36 (m, 2H), 4.32 (d, J = 16.2 Hz, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.09 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.82 - 3.79 (m, 2H), 3.67 - 3.64 (m, 2H), 3.42 - 3.38 (m,2H), 3.19 - 3.14 (m, 2H), 3.13 - 3.08 (m, 2H), 2.89 (d, J = 3.8 Hz, 2H), 2.70 - 2.64 (m, 4H), 2.59 - 2.53 (m, 6H), 2.13 (s, 5H), 2.08 (d, J = 11.3 Hz, 2H), 1.97 (dt, J = 10.7, 7.0 Hz, 5H), 1.83 (dt, J = 12.2, 6.0 Hz, 4H), 1.71 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.63 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.60 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.23 (s, 3H).
실시예 9
링커의 합성
링커 8의 합성 공정은 실시예 7-1의 공정과 동일하였다. MS[ES(-)], m/z 548.2. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 10.08 (s, 1H), 9.51 (s, 1H), 7.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 8.6, 2.0 Hz, 1H), 5.70 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 4.41 - 4.32 (m, 2H), 4.12 (s, 2H), 3.96 (s, 2H), 3.79 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.67 (dd, J = 5.7, 3.2 Hz, 2H), 3.61 (dd, J = 5.7, 3.1 Hz, 2H), 3.55 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.37 (dd, J = 11.3, 5.6 Hz, 2H), 2.07 (s, 1H), 1.44 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1203.2. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 11.18 (s, 1H), 8.28 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.65 - 7.58 (m, 2H), 7.43 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 6.47 - 6.32 (m, 2H), 6.32 - 6.24 (m, 1H), 5.70 (q, J = 6.5 Hz, 1H), 5.63 (s, 1H), 5.22 - 5.18 (m, 1H), 4.41 - 4.37 (m, 2H), 4.32 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 4.28 (s, 2H), 4.26 (s, 1H), 4.11 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.66 (d, J = 13.7 Hz, 2H), 3.63 - 3.59 (m, 4H), 2.97 (s, 2H), 2.10 (d, J = 32.7 Hz, 3H), 1.65 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.44 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3과 유사하였다. 20mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1842.4. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 10.55 (s, 1H), 10.38 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.35 (t, J = 13.1 Hz, 2H), 8.03 (s, 1H), 7.88 (dd, J = 10.9, 6.8 Hz, 3H), 7.81 (s, 2H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.68 - 7.58 (m, 4H), 7.47 - 7.40 (m, 1H), 7.35 - 7.25 (m, 3H), 6.59 (t, J = 12.3 Hz, 1H), 6.40 (s, 2H), 6.30 (dd, J = 13.7, 7.2 Hz, 3H), 5.69 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 5.63 (s, 1H), 5.20 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 4.44 - 4.36 (m, 2H), 4.32 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 4.25 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 4.16 - 4.09 (m, 6H), 4.06 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.84 - 3.79 (m, 2H), 3.65 (dd, J = 5.4, 3.5 Hz, 2H), 3.59 - 3.55 (m, 2H), 3.43 - 3.39 (m, 2H), 3.19 (dd, J = 11.5, 5.8 Hz, 2H), 2.45 (dd, J = 11.6, 6.5 Hz, 1H), 2.38 (dd, J = 13.6, 5.4 Hz, 1H), 2.10 (d, J = 29.1 Hz, 3H), 2.04 (dd, J = 12.6, 6.9 Hz, 2H), 1.68 (s, 12H), 1.65 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.56 - 1.49 (m, 2H), 1.43 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.32 (dd, J = 14.2, 7.8 Hz, 2H), 1.26 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.23 (s, 2H).
실시예 10-1
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1047.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.06 (s, 1H), 8.81 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.92 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.10 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 5.36 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.81 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.49 - 4.43 (m, 1H), 4.41 - 4.35 (m, 1H), 4.33 - 4.26 (m, 1H), 4.24 (s, 2H), 4.10 (dd, J = 10.1, 3.4 Hz, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.00 (dd, J = 11.0, 5.5 Hz, 2H), 3.83 - 3.78 (m, 2H), 3.66 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.64 - 3.57 (m, 6H), 2.99 - 2.91 (m, 2H), 2.37 - 2.27 (m, 2H), 2.15 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-1과 유사하였다. 16mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1783.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.39 (d, J = 18.2 Hz, 1H), 9.00 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.03 - 7.98 (m, 1H), 7.82 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.75 - 7.66 (m, 3H), 7.66 - 7.60 (m, 1H), 7.58 - 7.41 (m, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.79 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 6.11 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 5.30 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.83 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.49 - 4.45 (m, 1H), 4.44 - 4.32 (m, 2H), 4.14 (s, 2H), 4.11 - 4.07 (m, 2H), 4.03 (s, 4H), 3.81 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 3.70 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 3.68 - 3.63 (m, 2H), 3.56 (dd, J = 9.5, 5.3 Hz, 6H), 3.40 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.20 - 3.14 (m, 2H), 3.13 - 3.06 (m, 2H), 2.67 (s, 3H), 2.58 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 2.40 - 2.26 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.02 - 1.91 (m, 4H), 1.84 (d, J = 5.0 Hz, 4H), 1.70 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 1.60 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.28 - 1.16 (m, 3H), 1.01 - 0.92 (m, 1H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d 6) δ -11.29 (d, J = 23.1 Hz), -12.09 (d, J = 23.0 Hz), -23.70 (t, J = 22.7 Hz).
실시예 10-2
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 7-2와 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1069.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.18 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.37 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.21 (dd, J = 7.4, 1.7 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.68 - 7.60 (m, 1H), 6.50 (dd, J = 8.5, 6.1 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.43 - 4.32 (m, 2H), 4.29 (s, 2H), 4.16 - 4.09 (m, 4H), 4.01 (s, 2H), 3.98 - 3.93 (m, 2H), 3.83 - 3.79 (m, 2H), 3.67 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 3.62 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 2.95 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 2.69 - 2.62 (m, 1H), 2.39 (dd, J = 13.0, 6.0 Hz, 1H), 2.11 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 1.59 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-2와 유사하였다. 18mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1678.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.52 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 8.94 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 8.80 (s, 2H), 8.48 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.08 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.82 - 7.74 (m, 2H), 7.70 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.71 (s, 2H), 6.49 (dd, J = 8.7, 5.9 Hz, 1H), 5.29 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.44 - 4.34 (m, 2H), 4.19 (s, 2H), 4.13 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.97 - 3.92 (m, 2H), 3.82 - 3.77 (m, 4H), 3.74 - 3.70 (m, 2H), 3.68 - 3.63 (m, 4H), 3.53 (dd, J = 10.6, 5.0 Hz, 2H), 2.68 - 2.63 (m, 1H), 2.39 (dd, J = 13.1, 6.1 Hz, 1H), 2.12 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 1.58 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.5 Hz, 6H), 1.13 (s, 6H), 0.99 (d, J = 2.0 Hz, 6H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d 6) δ -11.12 (d, J = 22.8 Hz), -12.12 (d, J = 23.4 Hz), -23.53 (t, J = 22.7 Hz).
실시예 10-3
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 7-3과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1085.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.24 (s, 1H), 8.25 (s, 2H), 7.86 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.49 (s, 2H), 6.23 (dd, J = 8.9, 5.8 Hz, 1H), 5.34 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.85 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.42 - 4.31 (m, 2H), 4.29 (s, 2H), 4.12 - 4.06 (m, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.84 - 3.78 (m, 2H), 3.66 (s, 2H), 3.61 (d, J = 4.9 Hz, 4H), 2.98 - 2.89 (m, 2H), 2.61 - 2.54 (m, 1H), 2.28 (dd, J = 13.1, 5.1 Hz, 1H), 2.13 (d, J = 1.6 Hz, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3과 유사하였다. 14mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1724.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.56 (s, 1H), 10.35 (s, 1H), 8.43 - 8.29 (m, 3H), 8.01 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.89 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.86 - 7.79 (m, 3H), 7.74 - 7.68 (m, 1H), 7.67 - 7.59 (m, 2H), 7.31 (dd, J = 8.3, 2.9 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 6.59 (t, J = 12.3 Hz, 1H), 6.47 (s, 2H), 6.30 (dd, J = 13.8, 5.2 Hz, 2H), 6.22 (dd, J = 8.9, 5.8 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.86 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.44 - 4.35 (m, 2H), 4.16 - 4.09 (m, 4H), 4.09 - 4.04 (m, 2H), 3.99 (s, 2H), 3.97 - 3.88 (m, 2H), 3.83 - 3.79 (m, 2H), 3.65 (dd, J = 5.7, 3.4 Hz, 2H), 3.59 - 3.55 (m, 2H), 3.41 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.19 (dd, J = 11.6, 5.9 Hz, 2H), 2.62 (dd, J = 14.8, 5.7 Hz, 1H), 2.29 (dd, J = 13.3, 6.0 Hz, 1H), 2.13 (s, 3H), 2.06 (dd, J = 9.4, 5.0 Hz, 2H), 1.60 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.52 (dt, J = 14.8, 7.3 Hz, 2H), 1.33 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 3H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d 6) δ -11.06 (d, J = 21.0 Hz), -12.40 (d, J = 23.7 Hz), -23.60 (t, J = 22.2 Hz).
실시예 10-4
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 7-4와 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1047.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.15 (s, 1H), 8.66 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 8.29 (dd, J = 4.5, 1.8 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.69 - 7.62 (m, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.11 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 5.35 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.81 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.46 - 4.36 (m, 2H), 4.26 (s, 2H), 4.11 (d, J = 3.7 Hz, 4H), 4.04 (s, 2H), 4.02 - 3.91 (m, 2H), 3.84 - 3.78 (m, 2H), 3.69 - 3.64 (m, 2H), 3.64 - 3.56 (m, 4H), 2.94 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 2.31 (dd, J = 12.2, 4.5 Hz, 1H), 2.18 - 2.15 (m, 1H), 2.14 (s, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-4와 유사하였다. 20mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1807.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.28 (s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.76 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 8.39 (d, J = 18.8 Hz, 3H), 8.25 (t, J = 12.6 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.87 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.71 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 7.56 - 7.51 (m, 1H), 7.47 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.99 - 6.87 (m, 2H), 6.65 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.54 (t, J = 12.6 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 6.10 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.30 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.64 (s, 1H), 4.44 - 4.34 (m, 2H), 4.11 (d, J = 9.2 Hz, 4H), 4.02 (s, 2H), 3.81 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 3.66 - 3.62 (m, 2H), 3.59 - 3.52 (m, 4H), 3.52 - 3.46 (m, 2H), 3.35 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 3.17 (s, 2H), 2.55 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 2.35 - 2.22 (m, 3H), 2.21 - 2.15 (m, 1H), 2.12 (s, 3H), 1.80 (s, 2H), 1.59 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.47 (s, 5H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d 6) δ -11.10 (d, J = 21.6 Hz), -12.24 (d, J = 23.1 Hz), -23.61 (t, J = 22.4 Hz).
실시예 11
(1) 링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
(2) 염료의 합성
염료 AF532 (63 mg, 0.1 mmol, 1.0 eq) 및 TSTU (1.5 eq, 45.2 mg)를 50mL 원형 바닥 플라스크에 순차적으로 첨가하고 DMF 3ml를 첨가하여 용해시킨 다음 DIPEA (2.5 eq, 52 μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 45→에서 3 시간 동안 오일 배스에서 교반하고, PEG 링커 2-(2-(2- 아미노에톡시)에톡시)아세트산(40 mg, 2.0 eq)을 첨가한 후 45°C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 물을 첨가하여 반응을 냉각시킨 다음 예비 액상 크로마토그래피(preparative liquid phase chromatography)로 정제하여 목표 생성물(65.6 mg, 85% 수율)을 수득하였다. 생성물은 MS로 분석하였다. MS[ES(-)], m/z 771.2.
(3) 최종 생성물 합성
합성 공정은 실시예 7-2와 유사하였으며, 염료는 상기 단계 (2)에서 얻은 염료로 대체되었다. 21mg의 고체, HPLC 순도 ＞99%. MS[ES(-)], m/z 1978.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.46 (s, 1H), 8.88 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 8.80 (s, 2H), 8.52 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.90 (dd, J = 7.7, 3.0 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 11.5, 6.6 Hz, 2H), 7.74 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 3.8 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.47 - 7.41 (m, 1H), 6.70 (s, 2H), 6.66 - 6.56 (m, 1H), 5.70 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.30 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 5.21 (qd, J = 6.9, 2.1 Hz, 1H), 4.45 - 4.38 (m, 2H), 4.36 - 4.28 (m, 2H), 4.14 (s, 4H), 4.09 - 4.05 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.89 (s,2H), 3.83 - 3.76 (m, 4H), 3.65 - 3.63 (m, 2H), 3.61 (s, 2H), 3.58 - 3.56 (m, 2H), 3.53 - 3.49 (m, 2H), 3.48 - 3.44 (m, 2H), 3.30 - 3.26 (m, 2H), 2.12 (d, J = 2.0 Hz, 3H), 2.08 (d, J = 19.2 Hz, 3H), 1.66 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.60 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.13 (s, 6H), 1.00 (s, 6H).
실시예 12
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
합성 공정은 실시예 11과 유사하였다.
실시예 13
(1) 링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
(2) 염료의 합성
염료의 합성 공정은 실시예 11의 공정과 유사하였다.
(3) 최종 생성물 합성
합성 공정은 실시예 11의 공정과 유사하였으며, 상기 염료는 상기 단계 (2)에서 얻은 염료로 대체되었다. 23mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 2154.5. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.94 (s, 1H), 8.88 - 8.83 (m, 1H), 8.80 (s, 2H), 8.56 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.10 - 8.06 (m, 2H), 7.94 - 7.83 (m, 4H), 7.82 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.47 - 7.43 (m, 1H), 6.71 (s, 2H), 6.65 - 6.57 (m, 1H), 5.67 (s, 1H), 5.26 - 5.11 (m, 2H), 4.53 - 4.41 (m, 2H), 4.40 - 4.28 (m, 2H), 4.15 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 4.12 - 4.05 (m, 2H), 4.02 (s, 4H), 3.83 (dd, J = 8.2, 4.3 Hz, 4H), 3.80 - 3.75 (m, 2H), 3.59 (s, 4H), 3.56 (d, J = 5.9 Hz, 4H), 2.10 (d, J = 7.5 Hz, 5H), 2.06 (s, 2H), 1.66 (d, J = 6.3 Hz, 6H), 1.17 (s, 6H), 0.99 (s, 6H).
실시예 14
링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
사용된 염료와 최종 생성물의 합성 공정은 실시예 11과 유사하였다.
실시예 15-1
(1) 링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
(2) 염료의 합성
염료의 합성 공정은 실시예 15-2의 공정과 유사하였다. 염료 CY5 대신 염료 AF532가 사용되었다.
(3) 최종 생성물 합성
합성 공정은 실시예 7-2와 유사하였으며, 상기 염료는 상기 단계 (2)에서 얻은 염료로 대체되었다. 18mg의 고체, HPLC 순도 >99%. MS[ES(-)], m/z 1983.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.42 (d, J = 144.3 Hz, 1H), 8.97 - 8.80 (m, 2H), 8.50 (d, J = 30.7 Hz, 1H), 8.14 - 8.05 (m, 3H), 7.91 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 12.3, 8.6 Hz, 2H), 7.75 - 7.60 (m, 3H), 7.55 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.49 - 7.42 (m, 1H), 7.39 - 7.25 (m, 2H), 6.97 - 6.89 (m, 1H), 6.71 (s, 1H), 6.64 - 6.58 (m, 1H), 5.70 - 5.64 (m, 1H), 5.34 - 5.26 (m, 1H), 5.22 (qd, J = 7.0, 1.8 Hz, 1H), 4.58 - 4.30 (m, 4H), 4.19 (s, 1H), 4.14 (s, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.84 - 3.79 (m, 2H), 3.68 - 3.65 (m, 2H), 3.60 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 3.27 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 3.15 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 2.74 (s, 6H), 2.12 (s, 3H), 2.09 (d, J = 19.8 Hz, 3H), 1.67 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.60 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 3H), 1.23 (s, 2H), 1.18 - 1.13 (m, 6H), 1.00 (d, J = 1.8 Hz, 3H).
실시예 15-2
(1) 링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
(2) 염료의 합성
염료 CY5 (250 mg, 0.38 mmol, 1.0 eq) 및 TSTU (1.2 eq, 110 mg)를 50mL 건조 원형 바닥 플라스크에 순차적으로 첨가하고 DMF 5ml를 첨가하여 용해시킨 다음 DIPEA (3.0 eq, 200 μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 설폰산 기능 단편(114 mg, 2.0 eq)을 갖는 화합물을 첨가한 후 실온에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 물을 첨가하여 반응을 냉각시키고 예비 액상 크로마토 그래피(preparative liquid phase chromatography)로 정제하여 목표 생성물(325 mg, 수율 89 %)을 수득하였다. 생성물을 MS로 분석하였다. MS[ES(-)], m/z 807.2.
(3) 최종 생성물 합성
합성 공정은 실시예 7-3과 유사하였으며, 염료는 상기 단계 (2)에서 얻은 염료로 대체되었다. 25mg의 고체, HPLC 순도 ＞99%.
MS[ES(-)], m/z 2030.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.52 (s, 1H), 10.28 (s, 1H), 8.43 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.34 (t, J = 13.0 Hz, 2H), 8.00 (s, 1H), 7.97 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.86 - 7.81 (m, 2H), 7.80 (s, 2H), 7.73 (dd, J = 8.6, 1.9 Hz, 1H), 7.67 - 7.58 (m, 4H), 7.47 - 7.41 (m, 1H), 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 5.8, 2.4 Hz, 2H), 6.70 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 6.39 (s, 2H), 6.37 - 6.24 (m, 3H), 5.64 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 5.24 - 5.16 (m, 1H), 4.42 - 4.34 (m, 3H), 4.33 - 4.23 (m, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.12 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 4.08 - 4.02 (m, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.83 - 3.79 (m, 2H), 3.66 - 3.62 (m, 2H), 3.58 - 3.55 (m, 2H), 3.43 - 3.39 (m, 2H), 3.23 - 3.16 (m, 2H), 2.76 (dd, J = 13.9, 7.9 Hz, 2H), 2.41 - 2.32 (m, 1H), 2.13 (d, J = 1.9 Hz, 5H), 2.08 (s, 1H), 1.66 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.59 - 1.50 (m, 2H), 1.40 (dd, J = 16.1, 9.0 Hz, 2H), 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 4H).
실시예 16
(1) 링커의 합성
링커 7의 합성 공정 및 생성물 동정은 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
(2) 염료의 합성
염료의 합성 공정은 실시예 15-2의 공정과 유사하였다. 염료 CY5 대신 염료 AF532가 사용되었다.
(3) 최종 생성물 합성
합성 공정은 실시예 7-2와 유사하였으며, 염료는 상기 단계 (2)에서 얻은 염료로 대체되었다. 22mg의 고체, HPLC 순도 ＞99%.
MS[ES(-)], m/z 1984.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.28 (s, 1H), 8.81 (s, 3H), 8.51 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.96 - 7.88 (m, 2H), 7.82 (dd, J = 12.3, 6.3 Hz, 2H), 7.67 (dd, J = 12.5, 6.7 Hz, 2H), 7.64 (s, 2H), 7.52 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.48 - 7.41 (m, 1H), 6.72 (s, 2H), 6.64 - 6.57 (m, 1H), 5.67 - 5,64 (m, 1H), 5.30 (q, J = 6.4 Hz, 1H), 5.21 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 4.47 - 4.27 (m, 4H), 4.13 (s, 4H), 4.11 - 4.06 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.80 (dd, J = 12.6, 5.7 Hz, 4H), 3.68 - 3.64 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.57 (dd, J = 11.3, 5.1 Hz, 2H), 3.49 (s, 4H), 3.47 (d, J = 2.6 Hz, 4H), 3.25 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.21 (dd, J = 11.6, 5.8 Hz, 2H), 2.69 - 2.65 (m, 1H), 2.57 (dd, J = 5.7, 2.7 Hz, 1H), 2.31 (t, J = 6.5 Hz, 3H), 2.12 (s, 2H), 2.11 (d, J = 3.4 Hz, 3H), 2.07 (s, 2H), 2.06 (s, 2H), 1.66 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.60 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.14 (s, 6H), 1.01 (d, J = 1.9 Hz, 6H).
실시예 17
링커의 합성
링커 9의 합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
합성 공정은 실시예 7-2와 유사하였다. 25mg의 고체, HPLC 순도 ＞99%.
MS[ES(-)], m/z 1934.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.21 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 9.05 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 8.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.81 (s, 2H), 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.95 - 7.88 (m, 3H), 7.72 (dd, J = 13.2, 7.5 Hz, 2H), 7.66 - 7.59 (m, 2H), 7.51 - 7.43 (m, 3H), 6.71 (s, 2H), 6.67 - 6.58 (m, 1H), 5.70 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 5.30 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 5.25 - 5.17 (m, 1H), 4.82 - 4.70 (m, 2H), 4.38 - 4.28 (m, 2H), 4.21 (d, J = 4.3 Hz, 3H), 4.12 (s, 2H), 4.09 - 4.01 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.82 - 3.77 (m, 2H), 3.64 (dd, J = 4.7, 2.1 Hz, 2H), 3.61 (s, 2H), 3.58 (dd, J = 5.4, 2.9 Hz, 2H), 3.53 - 3.49 (m, 2H), 3.49 - 3.43 (m, 2H), 3.29 (dd, J = 11.8, 5.9 Hz, 2H), 2.62 - 2.52 (m, 2H), 2.16 (s, 3H), 2.08 (d, J = 17.6 Hz, 3H), 1.66 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.59 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.5 Hz, 6H), 1.14 (d, J = 1.2 Hz, 6H), 1.00 (d, J = 2.1 Hz, 6H).
실시예 18
링커의 합성
링커 9의 합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 19
링커의 합성
에틸 벤조산을 산 조건에서 에스테르화한 다음 NBS를 사용하여 브롬화하여 브롬화 생성물을 얻었다. 브롬화 생성물을 황산염과 반응시켜 중간체를 생성하고, 이를 머캅타민(mercaptamine) 화합물과 추가로 반응시켜 이황화물 화합물을 생성하였다. 이황화 화합물을 가수 분해하고 PEG 단편과 응축하여 링커 (10)를 수득하였다.
MS[ES(-)], m/z 599.1. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.59 (s, 1H), 7.80 (dd, J = 14.3, 6.9 Hz, 2H), 7.59 (q, J = 8.1 Hz, 2H), 7.42 - 7.36 (m, 1H), 5.13 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.44 - 4.33 (m, 2H), 3.89 (s,2H), 3.85 (s, 2H), 3.81 - 3.75 (m, 2H), 3.61 (s, 2H), 3.55 (s, 4H), 3.51 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.35 (dd, J = 10.6, 5.2 Hz, 2H), 3.30 - 3.23 (m, 2H), 1.63 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1254.2. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.54 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.89 - 7.83 (m, 1H), 7.76 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 7.46 - 7.37 (m, 2H), 7.30 - 7.18 (m, 1H), 6.69 - 6.63 (m, 1H), 6.35 (s, 2H), 5.56 (dd, J = 6.2, 5.2 Hz, 1H), 5.32 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 9.6, 4.7 Hz, 1H), 5.14 - 5.07 (m, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.37 - 4.25 (m, 2H), 4.12 (dd, J = 3.2, 2.3 Hz, 2H), 4.01 (s, 4H), 3.89 - 3.84 (m, 2H), 3.83 (dd, J = 6.8, 4.4 Hz, 2H), 3.63 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 3.56 (s, 4H), 3.45 - 3.42 (m, 2H), 2.45 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 2.36 (d, J = 0.6 Hz, 1H), 2.02 - 1.96 (m, 6H), 1.66 - 1.60 (m, 6H).
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다.
16 mg의 고체, HPLC 순도 >99%.
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다. 16 mg의 고체, HPLC 순도 >99%.
MS[ES(-)], m/z 1893.4. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 10.53 (s, 1H), 8.46 - 8.30 (m, 2H), 7.87 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.81 (s, 2H), 7.79 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.65 - 7.62 (m, 3H), 7.58 (q, J = 7.8 Hz, 2H), 7.46 - 7.36 (m, 2H), 7.31 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.29 (s, 1H), 6.59 (t, J = 12.3 Hz, 1H), 6.40 (s, 2H), 6.34 - 6.20 (m, 3H), 5.63 (s, 1H), 5.22 - 5.18 (m, 1H), 5.13 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.49 - 4.44(m, 1H), 4.41 - 4.37 (m, 1H), 4.32 (s, 1H), 4.26 (s, 1H), 4.12 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 4.07 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.85 (s, 2H), 3.82 (t, J = 4.0 Hz,, 3H), 3.53 (s, 4H), 3.52 (s, 2H), 3.40 - 3.35 (m, 2H), 3.29 - 3.24 (m, 2H), 3.17 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 2.13 (s, 1H), 2.06 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 1.67 (s, 12H), 1.65 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.62 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.56 - 1.49 (m, 2H), 1.35 - 1.29 (m, 2H), 1.26 - 1.23 (m, 6H).
실시예 20-1
링커의 합성
링커 9의 합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 585.1. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.97 (s, 1H), 9.59 (s, 1H), 8.04 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.13 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.44 - 4.34 (m, 2H), 4.09 (s, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.78 (s, 2H), 3.66 (dd, J = 5.7, 3.1 Hz, 2H), 3.61 (dd, J = 5.6, 3.1 Hz, 2H), 3.55 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.37 (dd, J = 11.0, 5.4 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.62 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1240.2. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 10.83 (s, 1H), 8.44 - 8.36 (m, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.03 - 7.91 (m, 1H), 7.87 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.66 - 7.58 (m, 2H), 7.52 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.48 - 7.40 (m, 1H), 7.33 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.30 - 7.23 (m, 1H), 7.07 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.41 - 6.37 (m, 2H), 6.35 - 6.27 (m, 1H), 5.64 (s, 1H), 5.22 - 5.16 (m, 2H), 4.51 - 4.41 (m, 1H), 4.41 - 4.35 (m, 1H), 4.34 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.26 (s, 1H), 4.25 (s, 2H), 4.15 - 4.10 (m, 2H), 4.05 (s, 4H), 3.82 (s, 2H), 3.68 - 3.58 (m, 6H), 3.55 - 3.51 (m, 2H), 2.63 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 2.37 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 2.11 (d, J = 18.7 Hz, 3H), 2.08 (s, 3H), 1.66 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.60 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다. 18mg의 고체, HPLC 순도 ＞99%.
MS[ES(-)], m/z 1779.4. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 10.51 (s, 1H), 10.21 (s, 1H), 8.43 - 8.29 (m, 3H), 8.12 (s, 1H), 7.91 (dd, J = 10.0, 3.2 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.81 (s, 2H), 7.64 - 7.62 (m, 4H), 7.53 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.44 (td, J = 7.2, 1.8 Hz, 1H), 7.35 - 7.28 (m, 3H), 7.27 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 12.3 Hz, 1H), 6.37 (s, 1H), 6.31 (dd, J = 14.2, 6.9 Hz, 3H), 5.63 (s, 1H), 5.23 - 5.16 (m, 1H), 5.13 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 4.48 - 4.39 (m, 2H), 4.33 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 4.13 (s, 2H), 4.11 (s, 2H), 4.06 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.83 - 3.80 (m, 2H), 3.65 - 3.63 (m, 2H), 3.56 (dd, J = 7.8, 3.4 Hz, 2H), 3.53 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.40 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 3.19 (dd, J = 11.3, 5.7 Hz, 2H), 2.63 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 2.41 - 2.34 (m, 1H), 2.13 (s, 1H), 2.10 - 2.06 (m, 6H), 1.68 (s, 12H), 1.65 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.54 - 1.49 (m, 2H), 1.32 (dd, J = 12.2, 6.8 Hz, 2H), 1.25 (dd, J = 11.3, 4.5 Hz, 9H).
실시예 20-2
링커의 합성
링커의 합성 공정은 실시예 20-1의 합성 공정과 유사하였다.
합성 공정은 실시예 20-1의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 21
링커의 합성
링커 12의 합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
MS[ES(-)], m/z 629.2. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.53 (s, 1H), 8.22 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 5.33 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 4.63 - 4.53 (m, 2H), 4.40 - 4.30 (m, 2H), 3.94 (s, 2H), 3.79 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 3.52 - 3.48 (m, 4H), 3.46 - 3.43 (m, 2H), 3.36 - 3.32 (m, 4H), 3.29 (dd, J = 11.8, 5.9 Hz, 2H), 2.13 (s, 3H), 1.62 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1284.2. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.77 (s, 1H), 8.46 (dd, J = 14.7, 6.2 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 17.9, 8.1 Hz, 2H), 7.66 - 7.60 (m, 2H), 7.47 - 7.41 (m, 1H), 7.30 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.07 - 6.99 (m, 1H), 6.51 - 6.35 (m, 2H), 6.35 - 6.23 (m, 1H), 5.64 (s, 1H), 5.35 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 6.9, 2.8 Hz, 1H), 4.66 (s, 2H), 4.44 - 4.38 (m, 1H), 4.37 - 4.33 (m, 1H), 4.32 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.25 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 4.11 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 4.05 - 4.02 (m, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.83 - 3.80 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.51 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 3.45 (d, J = 5.5 Hz, 4H), 3.29 - 3.25 (m, 2H), 2.49 - 2.43 (m, 1H), 2.41 - 2.36 (m, 1H), 2.10 (d, J = 26.1 Hz, 6H), 1.66 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.62 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다. 21mg의 고체, HPLC 순도 ＞99%.
MS[ES(-)], m/z 1924.4. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 10.55 (s, 1H), 8.49 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.36 (t, J = 12.9 Hz, 2H), 7.89 - 7.84 (m, 2H), 7.81 (s, 2H), 7.65 - 7.59 (m, 3H), 7.47 - 7.40 (m, 1H), 7.31 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.01 - 6.94 (m, 1H), 6.59 (t, J = 12.2 Hz, 1H), 6.40 (s, 2H), 6.30 (dd, J = 13.2, 4.5 Hz, 2H), 5.60 (d, J = 58.2 Hz, 1H), 5.33 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 12.8, 5.8 Hz, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.44 - 4.33 (m, 2H), 4.33 - 4.28 (m, 1H), 4.28 - 4.22 (m, 1H), 4.13 (dd, J = 11.7, 5.6 Hz, 2H), 4.09 - 4.05 (m, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.82 - 3.79 (m, 2H), 3.48 (s, 2H), 3.45 - 3.42 (m, 2H), 3.38 - 3.34 (m, 2H), 3.28 (dd, J = 11.5, 5.8 Hz, 2H), 3.16 (dd, J = 11.3, 5.5 Hz, 2H), 2.13 (s, 1H), 2.12 (s, 2H), 2.08 - 2.03 (m, 3H), 1.68 (s, 9H), 1.65 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.55 - 1.49 (m, 2H), 1.35 - 1.30 (m, 2H), 1.25 (dd, J = 12.0, 4.4 Hz, 6H).
실시예 22
링커의 합성
링커 13의 합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 599.1. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.53 (s, 1H), 8.81 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.84 (s, 2H), 5.17 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 4.50 - 4.31 (m, 2H), 3.84 (s, 2H), 3.80 - 3.77 (m, 2H), 3.55 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 3.53 (s, 4H), 3.49 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.43 (dd, J = 11.5, 5.7 Hz, 2H), 3.32 (dd, J = 10.7, 5.3 Hz, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.67 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다. MS[ES(-)], m/z 1099.2. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.36 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.06 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.45 (s, 2H), 6.23 (dd, J = 8.8, 6.0 Hz, 1H), 5.18 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.85 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.51 - 4.36 (m, 2H), 4.14 - 4.05 (m, 4H), 4.01 (s, 2H), 3.90 (dd, J = 11.1, 6.1 Hz, 2H), 3.85 - 3.80 (m, 2H), 3.63 - 3.58 (m, 6H), 3.54 (s, 4H), 2.62 - 2.54 (m, 1H), 2.28 (dd, J = 12.9, 5.5 Hz, 1H), 2.09 (d, J = 2.8 Hz, 3H), 1.66 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다. 13 mg의 고체, HPLC 순도 ＞99%.
MS[ES(-)], m/z 1738.4. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 10.55 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.45 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.35 (t, J = 13.0 Hz, 2H), 8.04 (s, 1H), 7.92 - 7.84 (m, 3H), 7.80 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 7.64 (ddd, J = 8.2, 3.7, 1.5 Hz, 2H), 7.31 (dd, J = 8.3, 3.0 Hz, 2H), 7.22 (s, 1H), 6.59 (t, J = 12.3 Hz, 1H), 6.46 (s, 2H), 6.30 (dd, J = 13.7, 4.3 Hz, 2H), 6.21 (dd, J = 8.9, 5.8 Hz, 1H), 5.15 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.85 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.51 - 4.44 (m, 1H), 4.44 - 4.38 (m, 1H), 4.15 - 4.09 (m, 4H), 4.09 - 4.03 (m, 2H), 3.99 (s, 2H), 3.97 - 3.87 (m, 2H), 3.84 - 3.80 (m, 2H), 3.76 - 3.72 (m, 2H), 3.44 - 3.41 (m, 2H), 3.38 - 3.34 (m, 4H), 3.15 (dd, J = 11.6, 5.8 Hz, 2H), 2.91 - 2.88 (m, 2H), 2.66 - 2.60 (m, 1H), 2.28 (dd, J = 13.1, 5.6 Hz, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.07 - 2.02 (m, 2H), 1.67 (s, 12H), 1.65 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 1.56 - 1.48 (m, 2H), 1.35 - 1.29 (m, 2H), 1.26 - 1.22 (m, 5H).
실시예 23
링커의 합성
합성 공정은 실시예 19의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 24
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 25
합성 공정은 실시예 7-3의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 26
링커 2의 합성 공정은 실시예 2에 따른다.
DCC의 존재하에 뉴클레오사이드를 링커 2와 축합하여 에스테르화된 생성물을 얻었고, 이 생성물은 TBS 보호기 제거, 삼인산화 및 아미노분해를 거쳐 원하는 단편을 생성하였다. 이 단편과 염료의 커플링을 통하여 목표 생성물을 얻었다.
실시예 27
합성 공정은 실시예 19의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 28
합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 29
합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 30
합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 31
합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 32
합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 33
합성 공정은 실시예 7-1의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 34
합성 공정은 실시예 19에 따른다.
실시예 35
합성 공정은 실시예 22의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 36
합성 공정은 실시예 19의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 37
합성 공정은 실시예 8의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 38
합성 공정은 실시예 7-2의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 39
합성 공정은 실시예 6-2의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 40
합성 공정은 실시예 19의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 41
합성 공정은 실시예 22의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 42
링커 2의 합성 공정은 실시예 2에 따른다.
화합물을 축합시켜 TBS-보호 뉴클레오사이드를 생성하였다. 아미노분해에 의해 아세틸기를 제거한 후, 화합물을 DCC의 존재하에 링커 2와 축합하고, TBS 보호기를 제거한 후 삼인산화 및 아미노분해를 거쳐 아미노 화합물을 얻었으며, 최종적으로 형광 염료로 표지하여 생성물을 얻었다.
실시예 43
링커의 합성
링커를 DCC 축합 조건에서 반응시킨 후 TBS 보호기를 제거하고, 삼인산화를 통하여 삼인산화 생성물을 생성하였으며, 아미노분해를 통하여 트리플루오로아세틸기를 제거하고, 최종적으로 형광 염료와 축합하여 생성물을 얻었다.
실시예 44
링커 2의 합성
링커 2를 DCC 축합 조건에서 반응시킨 후 TBS 보호기를 제거하고, 삼인산화를 통하여 삼인산화 생성물을 생성하였으며, 아미노분해를 통하여 트리플루오로아세틸기를 제거하고, 최종적으로 형광 염료와 축합하여 생성물을 얻었다.
실시예 45
링커의 합성
합성 공정은 실시예 2의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 46
링커의 합성
링커의 합성 공정은 실시예 3에 따른다.
실시예 47
링커의 합성
합성 공정은 실시예 2의 합성 공정과 유사하였다.
실시예 48
링커의 합성
링커는 2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)아세테이트 염산염(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)acetate hydrochloride)으로, Energy Chemical에서 상업적으로 구입 가능하다. cat. 번호 A012027.
합성 공정은 실시예 19의 합성 공정과 유사하였다.
II. 시퀀싱 유효성 평가 실시예
대조군으로 사용된 다음의 4 가지 콜드 dNTP(cold dNTP)는 PCT/CN2021/125262의 실시예 30, 실시예 31, 실시예 32 및 실시예 33에 개시된 제조 방법에 따라 합성되었다.
특히:
는 다음의 방법으로 합성되었다:
MW = 692. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.90 - 7.82 (m, 2H), 7.69 - 7.58 (m, 2H), 7.46 - 7.39 (m, 1H), 6.47 - 6.35 (m, 1H), 5.73 (s, 1H), 5.10 - 5.01 (m, 1H), 4.57 (dd, J = 13.6, 3.0 Hz, 1H), 4.41 - 4.24 (m, 2H), 2.65 - 2.52 (m, 2H), 1.98 (d, J = 15.2 Hz, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.68 (d, J = 7.2 Hz, 3H).
는 다음의 방법으로 합성되었다:
MW = 717. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.14 (t, J = 3.1 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 8.1, 3.1 Hz, 1H), 7.55 (q, J = 3.2 Hz, 2H), 7.38 - 7.34 (m, 1H), 6.31 - 6.22 (m, 1H), 5.76 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 5.10 - 5.00 (m, 1H), 4.65 - 4.55 (m, 1H), 4.36 - 4.21 (m, 2H), 3.02 - 2.94 (m, 1H), 2.71 - 2.61 (m, 1H), 1.94 (dd, J = 22.2, 3.2 Hz, 3H), 1.62 (dd, J = 7.2, 3.3 Hz, 3H).
는 다음의 방법으로 합성되었다:
MW = 677. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.08 - 8.00 (m, 1H), 7.91 - 7.84 (m, 1H), 7.72 - 7.59 (m, 2H), 7.49 - 7.40 (m, 1H), 6.48 - 6.40 (m, 1H), 6.19 (dd, J = 7.7, 2.3 Hz, 1H), 5.73 - 5.64 (m, 1H), 5.13 - 5.02 (m, 1H), 4.60 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 4.36 - 4.27 (m, 2H), 2.71 - 2.64 (m, 1H), 2.55 - 2.44 (m, 1H), 2.00 (dd, J = 9.5, 2.2 Hz, 3H), 1.69 (dd, J = 7.2, 2.1 Hz, 3H).
는 다음의 방법으로 합성되었다:
MW = 701. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.53 (dd, J = 5.2, 1.8 Hz, 1H), 8.18 - 8.10 (m, 1H), 7.83 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.55 - 7.51 (m, 2H), 7.38 - 7.34 (m, 1H), 6.49 - 6.40 (m, 1H), 5.81 - 5.73 (m, 1H), 5.07 - 5.00 (m, 1H), 4.67 - 4.57 (m, 1H), 4.39 - 4.18 (m, 2H), 3.06 - 2.95 (m, 1H), 2.75 (ddd, J = 21.2, 14.2, 5.6 Hz, 1H), 1.93 (dd, J = 25.1, 1.9 Hz, 3H), 1.60 (dd, J = 6.9, 4.0 Hz, 3H).
시퀀싱 실시예 1
뉴클레오타이드 기질
(1) 핫 dNTP(hot dNTP): 실시예 7-1 내지 실시예 7-4의 방법으로 합성된 4개의 최종 생성물(SSEB Hot Mix_V8로 명명)을 얻었으며, 구조는 아래와 같다.
SSEB Hot Mix_V8
(2) 콜드 dNTP (cold dNTP): 상술한 공정을 통하여 4개의 콜드 dNTP가 합성되었으며, 그 구조는 아래와 같다.
시퀀싱은 상기 뉴클레오타이드 기질과 MGISEQ-2000 고처리량 시퀀싱 키트(MGISEQ-2000 high-throughput sequencing kit)(FCL SE50)를 사용하여 MGISEQ-2000 시퀀서의 작동 프로토콜에 따라 수행하였다.
1. Ecoli 시퀀싱 라이브러리를 사용하여 DNA 나노볼을 준비한다;
2. BGISEQ2000 시퀀싱 칩에 DNA 나노볼을 로드한다;
3. 로드된 시퀀싱 칩을 BGISEQ2000 시퀀서에 로드하고 시퀀싱 프로세스를 설정한다, 핫 dNTP 통합(incorporation): 60℃ 2분; 콜드 dNTP 통합: 60℃ 2분; 신호 수집; 차단기(blocking group) 절단: 65℃ 2분;
4. 오프라인 데이터에 대한 베이스콜(basecall) 분석을 수행하여 매핑률(mapping rate), 오류율(error rate), Q30 등의 시퀀싱 인덱스 결과를 출력한다. 결과는 표 1에 나타내었다.
결과에 따르면 이와 같은 종류의 뉴클레오타이드 유사체는 고처리량 시퀀싱에서 가역적 차단 효과가 우수하며 시퀀싱에 통합된 뉴클레오타이드 유형을 하나씩 검출할 수 있다.
| 뉴클레오타이드 유사체 (Nucleotide analogue) hot dNTP Mix |
SSEB Hot Mix_V8 |
| Reference | Ecoli |
| Cycle Number | 51 |
| Q30(%) | 92.67 |
| Lag(%) | 0.43 |
| Runon(%) | 0.31 |
| ESR(%) | 82.60 |
| 매핑률(Mapping Rate) (%) | 98.15 |
| 평균 오류율(AvgError Rate) (%) | 0.50 |
참고:
1. Q30(%)은 베이스콜 결과에서 오차율이 0.001 미만(정확도 99.9% 이상)인 베이스의 비율을 나타낸다;
2. Lag(%)는 시퀀싱 지연의 비율을 의미한다;
3. Runon (%)은 시퀀싱 오버런의 비율을 의미한다;
4. ESR(%)은 최종 시퀀싱을 필터링하여 얻은 총 판독값과 베이스콜이 인식한 DNB 수의 비율을 의미한다.
시퀀싱 실시예 2
뉴클레오타이드 기질
（1）
핫 dNTP(hot dNTP): 실시예 7-1, 실시예 7-4, 실시예 11, 실시예 15-2의 방법으로 합성된 4개의 최종 생성물(SSEB Hot Mix-V8V9V11로 명명)을 얻었으며, 구조는 아래와 같다.
SSEB Hot Mix-V8V9V11
(2) 콜드 dNTP (cold dNTP): 상술한 공정을 통하여 4개의 콜드 dNTP가 합성되었으며, 그 구조는 아래와 같다.
시퀀싱은 상기 뉴클레오타이드 기질과 MGISEQ-2000 고처리량 시퀀싱 키트(MGISEQ-2000 high-throughput sequencing kit)( FCL PE100)를 사용하여 MGISEQ-2000 시퀀서의 작동 프로토콜에 따라 수행하였다.
1. Ecoli 시퀀싱 라이브러리를 사용하여 DNA 나노볼을 준비한다;
2. BGISEQ2000 시퀀싱 칩에 DNA 나노볼을 로드한다;
3. 로드된 시퀀싱 칩을 BGISEQ2000 시퀀서에 로드하고 시퀀싱 프로세스를 설정한다, 핫 dNTP 통합(incorporation): 55℃ 30초; 콜드 dNTP 통합: 55℃ 60초; 신호 수집; 차단기(blocking group) 절단: 55℃ 8초;
4. 오프라인 데이터에 대한 베이스콜(basecall) 분석을 수행하여 매핑률(mapping rate), 오류율(error rate), Q30 등의 시퀀싱 인덱스 결과를 출력한다. 결과는 표 2에 나타내었다.
결과에 따르면 이와 같은 종류의 뉴클레오타이드 유사체는 고처리량 시퀀싱에서 가역적 차단 효과가 우수하며 시퀀싱에 통합된 뉴클레오타이드 유형을 하나씩 검출할 수 있다.
| 뉴클레오타이드 유사체 (Nucleotide analogue) hot dNTP Mix |
SSEB Hot Mix-V8V9V11 |
| Reference | Ecoli |
| Cycle Number | 212 |
| Q30(%) | 95.79 |
| Lag 1(%) | 0.08 |
| Lag 2(%) | 0.11 |
| Runon 1(%) | 0.12 |
| Runon 2(%) | 0.26 |
| ESR(%) | 76.81 |
| 매핑률(Mapping Rate) (%) | 99.89 |
| 평균 오류율(AvgError Rate) (%) | 0.15 |
시퀀싱 실시예 3
뉴클레오타이드 기질
(1) 핫 dNTP (hot dNTP): 실시예 10-1, 실시예 10-2, 실시예 10-3, 실시예 10-4의 방법으로 합성된 4개의 최종 생성물(SSEB Hot Mix-N3로 명명)을 얻었으며, 구조는 아래와 같다.
SSEB Hot Mix-N3
(2) 콜드 dNTP (cold dNTP): 상술한 공정을 통하여 4개의 콜드 dNTP가 합성되었으며, 그 구조는 아래와 같다.
시퀀싱은 상기 뉴클레오타이드 기질과 MGISEQ-2000 고처리량 시퀀싱 키트(MGISEQ-2000 high-throughput sequencing kit)( FCL PE100)를 사용하여 MGISEQ-2000 시퀀서의 작동 프로토콜에 따라 수행하였다.
1. Ecoli 시퀀싱 라이브러리를 사용하여 DNA 나노볼을 준비한다;
2. BGISEQ2000 시퀀싱 칩에 DNA 나노볼을 로드한다;
3. 로드된 시퀀싱 칩을 BGISEQ2000 시퀀서에 로드하고 시퀀싱 프로세스를 설정한다, 핫 dNTP 통합(incorporation): 60℃ 2분; 콜드 dNTP 통합: 60℃ 2분; 신호 수집; 차단기(blocking group) 절단: 65℃ 2분;
4. 오프라인 데이터에 대한 베이스콜(basecall) 분석을 수행하여 매핑률(mapping rate), 오류율(error rate), Q30 등의 시퀀싱 인덱스 결과를 출력한다. 결과는 표 3에 나타내었다.
결과에 따르면 이와 같은 종류의 뉴클레오타이드 유사체는 고처리량 시퀀싱에서 가역적 차단 효과가 우수하며 시퀀싱에 통합된 뉴클레오타이드 유형을 하나씩 검출할 수 있다.
| 뉴클레오타이드 유사체 (Nucleotide analogue) hot dNTP Mix |
SSEB Hot Mix-N3 |
| Reference | Ecoli |
| Cycle Number | 53 |
| Q30(%) | 95.45 |
| Lag 1(%) | 0.20 |
| Lag 2(%) | 0.22 |
| Runon 1(%) | 0.43 |
| Runon 2(%) | 0.45 |
| ESR(%) | 80.29 |
| Mapping Rate (%) | 96.82 |
| AvgError Rate (%) | 0.57 |
Claims (60)
- 하기 화학식 I 또는 화학식 II로 표시되는 화합물 또는 이의 염으로서,
여기서:
L1는 , 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
또는 바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
또는 보다 바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
또는 가장 바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
r1, r2, r3a, r3b 및 r4는 각각 1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r1는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r1은 1이며;
바람직하게는, r2는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r2은 1이며;
바람직하게는, r3a 및 r3b는 각각 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
보다 바람직하게는, r3a 및 r3b는 각각 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
가장 바람직하게는, r3a는 1이고;
가장 바람직하게는, r3b는 2이며;
바람직하게는, r4는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
보다 바람직하게는, r4은 1이며;
M은 직접 결합(direct bond), CH2, NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, M은 CH2 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되며;
L2는 이고, 바람직하게는, W는 R에 연결되며;
L3는 이고, 바람직하게는, W는 R에 연결되며;
각 X는 O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, 각 X는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
보다 바람직하게는, X는O이고;
Y는 직접 결합, O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, Y는 직접 결합이고;
각 W는 직접 결합, O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, W는 직접 결합이고;
R는 이며;
R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나는 이고, 나머지는 각각 H, , 아지도(azido), 니트로(nitro), 아미노(amino), 설포(sulfo), 카르복실(carboxyl), 지방족 알킬(aliphatic alkyl)(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(cycloalkyl)(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(aromatic alkyl)(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl 및 알콕실(예를 들어, C1-C6 알콕실)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나는 이고, 나머지는 각각 H 및 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
보다 바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나는 이고, 다른 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 H 및 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 나머지 3개는 H이고;
r5, r6 및 r7는 각각 1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r5는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r5는 2이고;
바람직하게는, r6는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, r6는 1 또는 2이고;
바람직하게는, r7는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, r7는 2이고;
r8 및 r9는 각각 0 및 1로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, r8 및 r9는 동시에 0이 아니고;
M1, M2 및 M3는 각각 직접 결합, NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, M1는 직접 결합, NH 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, M2는 NH이며;
바람직하게는, M3는 직접 결합 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ra는 H, 지방족 알킬(예를 들어, Me, Et, iPr, tBu과 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬) 및 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, Ra는 H 및 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, Ra는 메틸이며;
Rb 및 Rc 중 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx 및 -OCONHRx로 이루어진 군으로부터 선택되고, 나머지는 H, 지방족 알킬(예를 들어, Me, Et, iPr, tBu과 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬) 및 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 각 Rx는 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 및 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, Rb 및 Rc 중 하나는 -N3 및 -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, Rb 및 Rc 중 하나는 -N3, -SS-Me 및 -SS-Et로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 메틸이고;
가장 바람직하게는, Rb 및 Rc 중 하나는 -N3 및 -SS-Me로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 메틸이고;
바람직하게는, R는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R0는 H, 일인산기(monophosphate group) (), 이인산기(diphosphate group) (), 삼인산기(triphosphate group) () 및 사인산기(tetraphosphate group) ()로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, R0는 삼인산기()이며;
각 Z는 O, S 및 BH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, Z는 O이며;
염기1(base1) 및 염기2(base2)는 각각 염기(base), 데아자 염기(deaza base) 및 이의 토토머(tautomer), 예를 들어, 아데닌(adenine), 7-데아자아데닌(7-deazaadenine), 티민(thymine), 우라실(uracil), 시토신(cytosine), 구아닌(guanine), 7-데아자구아닌(7-deazaguanine) 및 이의 토토머로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, 염기1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, 염기2는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
화학식 I에서, R'는 가역적(reversible) 차단기(blocking group)를 나타내며, 화학식 II에서, 는 가역적 차단기를 나타내는 것인, 화합물 또는 이의 염.
- 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 I-1로 표시되는 화합물로서,
화학식 I-1
여기서:
L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
r1, r2, r3a 및 r3b는 각각 1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r1는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r1는 1이며;
바람직하게는, r2는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r2는 1이며;
바람직하게는, r3a 및 r3b는 각각 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
보다 바람직하게는, r3a 및 r3b는 각각 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
가장 바람직하게는, r3a는 1이며;
가장 바람직하게는, r3b는 2이고;
M는 직접 결합, CH2, NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, M는 CH2 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, X는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, X는 O이며;
Y는 직접 결합, O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, Y는 직접 결합이며;
W는 직접 결합, O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, W는 직접 결합이며;
R는 이고;
R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R2, R3 또는 R4)는 이고, 나머지는 각각 H, , 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 및 알콕실(예를 들어, C1-C6 알콕실)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R2, R3 또는 R4)는 이고, 나머지는 각각 H 및 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
보다 바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R2, R3 또는 R4)는 이고, 다른 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이며, 나머지 3개는 H이고;
더욱 바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중에서, R3 또는 R4는 이며, R1는 이고, 나머지 3개는 H이며;
가장 바람직하게는, R는 , 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
r5 및 r6는 각각 1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r5는 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r5는 2이고;
바람직하게는, r6는 1, 2, 3으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, r6는 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
M1 및 M3는 각각 직접 결합, NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, M1는 직접 결합, NH 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, M3는 직접 결합 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, M1이 NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 경우, M3는 직접 결합이고, M3이 NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 경우, M1는 직접 결합이며;
Rb 및 Rc 중 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx 및 -OCONHRx로 이루어진 군으로부터 선택되고, 나머지는 H, 지방족 알킬(예를 들어, 예를 들어, Me, Et, iPr, tBu과 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬) 및 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 각 Rx는 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 및 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, Rb 및 Rc 중 하나는 -N3 및 -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로 이루어진 군으로부터 선택되며 나머지는 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, Rb 및 Rc 중 하나는 -N3 및 -SS-Me로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 메틸이고;
Z는 O, S 및 BH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, Z는 O이고;
염기1는 염기, 데아자 염기 및 이의 토토머, 예를 들어, 아데닌, 7-데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7-데아자구아닌 및 이의 토토머로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, 염기1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R'는 가역적 차단기를 나타내는 것인, 화합물 또는 이의 염.
- 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 I-2로 표시되는 화합물로서,
화학식 I-2
여기서:
L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
r1, r2, r3a 및 r3b는 각각 1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r1는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r1는 1이며;
바람직하게는, r2는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r2는 1이며;
바람직하게는, r3a 및 r3b는 각각 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
보다 바람직하게는, r3a 및 r3b는 각각 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
가장 바람직하게는, r3a는 1이고;
가장 바람직하게는, r3b는 2이며;
M는 직접 결합, CH2, NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, M는 CH2 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되며;
X는 O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, X는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, X는 O이고;
Y는 직접 결합, O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, Y는 직접 결합이고;
W는 직접 결합, O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, W는 직접 결합이고;
R는 이며;
R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이고, 나머지는 각각 H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl 및 알콕실(예를 들어, C1-C6 알콕실)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5중 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이고, 나머지는 H이며;
보다 바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중에서, R1는 이고, 나머지는 H이며;
가장 바람직하게는, R는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
r5, r6 및 r7은 각각1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r5는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r5는 2이며;
바람직하게는, r6는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r6는 1이며;
바람직하게는, r7는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r7는 2이며;
r8는 0 및 1로 이루어진 군으로부터 선택되고;
M1는 직접 결합, NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, M1는 직접 결합이며;
Ra는 H, 지방족 알킬(예를 들어, Me, Et, iPr, tBu과 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬) 및 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, Ra는 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, Ra는 메틸이고;
Z는 O, S 및 BH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, Z는 O이고;
염기1는 염기, 데아자 염기 및 이의 토토머, 예를 들어, 아데닌, 7-데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7-데아자구아닌 및 이의 토토머로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, 염기1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R'는 가역적 차단기를 나타내는 것인, 화합물 또는 이의 염.
- 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 II-1로 표시되는 화합물로서,
화학식 II-1
여기서:
X는 O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, X는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, X는 O이고;
W는 직접 결합, O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, W는 직접 결합이고;
R는 이며;
R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R3 또는 R4)는 이고, 나머지는 각각 H, , 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl 및 알콕실(예를 들어, C1-C6 알콕실)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R3 또는 R4)는 이고, 나머지는 각각 H 및 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
보다 바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R3 또는 R4)는 이고, 다른 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이며, 나머지 3개는 H이고;
더욱 바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중에서, R3 또는 R4는 이며, R1는 이고, 나머지 3개는 H이며;
가장 바람직하게는, R는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
r5 및 r6는 각각 1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r5는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r5는 2이고;
바람직하게는, r6는1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, r6는 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
M1 및 M3는 각각 직접 결합, NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, M1는 직접 결합, NH 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, M3는 직접 결합 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
Rb 및 Rc 중 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx 및 -OCONHRx로 이루어진 군으로부터 선택되고, 나머지는 H, 지방족 알킬(예를 들어, Me, Et, iPr, tBu과 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬) 및 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 각 Rx는 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 및 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, Rb 및 Rc 중 하나는 -N3 및 -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, Rb 및 Rc 중 하나는 -N3 및 -SS-Me로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 메틸이고;
Z는 O, S 및 BH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, Z는 O이고;
염기2는 염기, 데아자 염기 및 이의 토토머, 예를 들어, 아데닌, 7-데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7-데아자구아닌 및 이의 토토머로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, 염기2는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
는 가역적 차단기를 나타내는 것인, 화합물 또는 이의 염.
- 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 II-2로 표시되는 화합물로서,
화학식 II-2
여기서:
X는 O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, X는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, X는 O이고;
W는 직접 결합, O, S 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, W는 직접 결합이고;
R는 이며;
R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이고, 나머지는 각각 H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl 및 알콕실(예를 들어, C1-C6 알콕실)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R1 또는 R5)는 이며, 나머지는 H이고;
보다 바람직하게는, R1, R2, R3, R4 및 R5 중에서, R1는 이며, 나머지는 H이고;
가장 바람직하게는, R는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
r5, r6 및 r7은 1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r5는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r5는 2이며;
바람직하게는, r6는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r6는 1이며;
바람직하게는, r7는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, r7는 2이며;
r8는 0 및 1로 이루어진 군으로부터 선택되고;
M1는 직접 결합, NH, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, M1는 직접 결합이며;
Ra는 H, 지방족 알킬(예를 들어, Me, Et, iPr, tBu과 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬) 및 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, Ra는 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, Ra는 메틸이고;
Z는 O, S 및 BH로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, Z는 O이고;
염기2는 염기, 데아자 염기 및 이의 토토머, 예를 들어, 아데닌, 7-데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7-데아자구아닌 및 이의 토토머로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, 염기2는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
는 가역적 차단기를 나타내는 것인, 화합물 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가역적 차단기 R'는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, , NH2, -ONH2, -OCORz 및 -OCONHRz로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각 Rz는 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 및 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, 가역적 차단기 R'는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, 및 NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, 가역적 차단기 R'는 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
가장 바람직하게는, 가역적 차단기 R'는 N3-CH2-, CH3-CH2-S-S-CH2- 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1', R2', R3', R4' 및 R5' 중 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이며, 나머지는 각각 H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl 및 알콕실(예를 들어, C1-C6 알콕실)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
바람직하게는, R1', R2', R3', R4' 및 R5' 중 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이며, 나머지는 H이고,
보다 바람직하게는, R1', R2', R3', R4' 및 R5' 중에서, R1'는 이며, 나머지는 H이고,
Rb' 및 Rc' 중 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx 및 -OCONHRx로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 H, 지방족 알킬(예를 들어, Me, Et, iPr, tBu과 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬) 및 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각 Rx는 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 및 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며,
바람직하게는, Rb' 및 Rc' 중 하나는 -N3 및 -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 나머지는 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며,
보다 바람직하게는, Rb' 및 Rc' 중 하나는 -N3 및 -SS-Me로 이루어진 군으로부터 선택되고, 나머지는 메틸인 것인, 화합물 또는 이의 염.
- 하기 화학식 III로 표시되는 화합물 또는 이의 염으로서,
화학식 III
여기서:
L1는 로부터 선택되고;
바람직하게는, L1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
r2는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, r2는 1이며;
r3a는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, r3a는 1이며;
r3b는 0, 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, r3b는 0 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되며;
M는 직접 결합 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L2는 이며;
R는 이고;
R1, R2, R3, R4 및 R5 중 하나(예를 들어, R3)는 이며, 나머지 하나(예를 들어, R1 또는 R2)는 로부터 선택되고, 나머지 3개는 H이며;
Lc는 직접 결합, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는, Lc-의 NH 말단은 H에 연결되며, Lc-의 =O 말단은 NH에 연결되고;
바람직하게는, Lc는 직접 결합, , 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는, Lc-의 NH 말단은 H에 연결되고, Lc-의 =O 말단은 NH에 연결되며;
rm는 0, 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, rm는 0 및 1로 이루어진 군으로부터 선택되며;
r5는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, r5는 2이며;
r6는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, r6는 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
r10는 1 내지 10의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되며;
바람직하게는, r10는 2 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
보다 바람직하게는, r10는 2 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
r11는 1 내지 6의 임의의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, r11는 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
보다 바람직하게는, r11는 1이고;
M1는 NH 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되며;
M3는 직접 결합 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Rb 및 Rc 중 하나는 -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 나머지는 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, Rb 및 Rc 중 하나는 -SS-Me이고, 나머지는 메틸이며;
바람직하게는, R는 , , , 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R0는 H, 일인산기(monophosphate group) (), 이인산기(diphosphate group) (), 삼인산기(triphosphate group) () 및 사인산기(tetraphosphate group) ()로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, R0는 삼인산기()이고;
각 Z는 O, S 및 BH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, Z는 O이며;
염기1(base1)는 염기(base), 데아자 염기(deaza base) 및 이의 토토머(tautomer), 예를 들어, 아데닌(adenine), 7-데아자아데닌(7-deazaadenine), 티민(thymine), 우라실(uracil), 시토신(cytosine), 구아닌(guanine), 7-데아자구아닌(7-deazaguanine) 및 이의 토토머로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는, 염기1는 및 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
화학식 III에서, R'은 가역적(reversible) 차단기(blocking group)를 나타내는 것인, 화합물 또는 이의 염.
- 제7항에 있어서, 상기 가역적 차단기 R'는 이고,
R1', R2', R3', R4' 및 R5' 중 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이며, 다른 하나(예를 들어, R3')는 H 및 C1-C6 알콕실(예를 들어, 메톡실)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 나머지는 H이며,
바람직하게는, R1', R2', R3', R4' 및 R5' 중에서, R1'는 이고, R3'는 H 및 C1-C6 알콕실(예를 들어, 메톡실)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 H이고,
Rb' 및 Rc' 중 하나는 -N3 및 -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
바람직하게는, Rb' 및 Rc' 중 하나는 -N3 및 -SS-Me로 이루어진 군으로부터 선택되며, 나머지는 메틸인 것인, 화합물 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 이의 염:
.
.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 이의 염은 검출 가능한 추가 라벨을 운반하는 것인, 화합물 또는 이의 염으로서;
바람직하게, 화합물 또는 이의 염에 의해 운반되는 추가적인 검출 가능한 표지는 친화성 시약(예를 들어, 항체, 압타머, 아피머, 노틴)에 의해 도입되는데, 상기 친화성 시약은 검출 가능한 표지를 운반하고, 친화성 시약은 화합물 또는 이의 염의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있으며;
또는 바람직하게, 검출 가능한 라벨은 화학식 I, 화학식 II, 화학식 I-1, 화학식 I-2, 화학식 II-1 또는 화학식 II-2의 화합물 내 R, 또는 제9항에 따른 화합물 내 R에 대응하는 구조적 모이어티에 연결되고;
바람직하게, 검출 가능한 라벨은 의 말단 아미노기 또는 이에 대응하는 구조적 모이어티에 연결되며;
바람직하게, 검출 가능한 라벨의 카르복실기는 아미드 결합의 형성을 통해 의 말단 아미노기 또는 이에 대응하는 구조적 모이어티에 연결되고;
또는 바람직하게, 검출 가능한 라벨은 화학식 III의 화합물 내 R 또는 제9항에 따른 화합물의 R에 대응하는 구조적 모이어티에 연결되며;
또는 바람직하게, 검출 가능한 라벨은 의 말단 아미노기 또는 이에 대응하는 구조적 모이어티에 연결되고;
또는 바람직하게, 검출 가능한 라벨은 아미드 결합의 형성을 통해 의 말단 아미노기 또는 이에 대응하는 구조적 모이어티에 연결되며;
바람직하게, 염기1은 상이하고, 화학식 I의 화합물에 의해 운반되는 추가 검출 가능한 라벨은 다양하며;
바람직하게, 염기2는 상이하고, 화학식 II의 화합물에 의해 운반되는 추가 검출 가능한 라벨은 다양하며;
바람직하게, 검출 가능한 라벨은 형광 라벨이고;
바람직하게, 검출 가능한 라벨은 다음 중에서 선택됨: iF700,
, , , , , , , , , , , , , , .
- 제10항에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 이의 염:
.
- 종결될 핵산 분자에 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함하는 것인, 핵산 합성을 종료하는 방법:
바람직하게, 화합물 또는 이의 염의 결합은 말단 전이 효소, 말단 중합 효소 또는 역전사 효소에 의해 이루어지고;
바람직하게, 상기 방법은 중합효소를 사용하여 종결될 핵산 분자에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함하며;
바람직하게, 상기 방법은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 종결될 핵산 분자의 3' 말단에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함함.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염을 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 결합시키는 단계를 포함하고, 상기 화합물 또는 이의 염의 결합은 신장되는 상보적인 폴리뉴클레오타이드에 임의의 후속 뉴클레오타이드가 도입되는 것을 방지하는 것인, 시퀀싱 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인, 신장되는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법:
바람직하게, 상기 화합물 또는 이의 염의 결합은 말단 전이 효소, 말단 중합 효소 또는 역전사 효소에 의해 이루어지고;
바람직하게, 상기 방법은 중합 효소를 사용하여 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함하며;
바람직하게, 상기 방법은 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 신장되는 상보적 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계를 포함함.
- 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정할 때 형성되고, 핵산 중간체는 다음의 단계에 따라 형성되는 것인, 핵산 중간체:
신장되는 핵산 가닥에 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 결합시켜 핵산 중간체를 형성하는 단계로서, 상기 결합된 상보적인 뉴클레오타이드는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염임;
또는, 다음의 단계에 따라 형성되는 핵산 중간체:
신장되는 핵산 가닥에 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 결합시켜 핵산 중간체를 형성하는 단계로서, 상기 결합된 상보적인 뉴클레오타이드는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염이고, 신장되는 핵산 가닥은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드를 사전에 결합시키며, 상기 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 사전에 결합된 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드는 가역적 차단기(reversible blocking group) 및 선택적 검출 가능한 라벨이 제거된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염임.
- 다음 단계를 포함하는 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법:
1) 신장되는 핵산 가닥에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드의 결합을 모니터링하는 단계로서, 상기 결합된 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염임, 및,
2) 결합된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계;
바람직하게, 가역적 차단기(reversible blocking group) 및 선택적으로 검출 가능한 라벨은 다음 상보적 뉴클레오타이드가 도입되기 전에 제거되고;
바람직하게, 가역적 차단기 및 검출 가능한 라벨은 동시에 제거되며;
바람직하게, 가역적 차단기 및 검출 가능한 라벨은 순차적으로 제거됨; 예를 들어, 검출 가능한 라벨이 제거된 후, 가역적 차단기는 제거되거나, 가역적 차단기가 제거된 후에 검출 가능한 라벨이 제거됨.
- 제15항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것인, 방법:
(a) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염이고, 선택적으로, 나머지 뉴클레오타이드는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염임;
(b) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 서열에 결합시키는 단계로서, 상기 복수의 상이한 뉴클레오타이드는 검출 중에 서로 구별될 수 있음;
(c) 결합된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하기 위해 단계 (b)의 뉴클레오타이드를 검출하는 단계;
(d) 가역적 차단기 및 단계 (b)에서 뉴클레오타이드에 의해 운반되는 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계; 및
(e) 선택적으로 단계 (a)-(d)를 한 번 이상 반복하는 단계;
이에 따라, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열이 결정됨.
- 제15항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것인, 방법:
(1) 제1뉴클레오타이드, 제2뉴클레오타이드, 제3뉴클레오타이드 및 제4뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 상기 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염이고, 선택적으로, 나머지 뉴클레오타이드는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염임;
(2) 4개의 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; 신장되는 핵산 가닥에 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하는 단계; 신장되는 핵산 가닥에 결합된 뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 가역적 차단기 및 신장되는 핵산 가닥에 결합된 뉴클레오타이드에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계;
선택적으로, 단계 (1)-(2)를 한번 이상 반복하는 단계 (3)도 포함됨.
- 제15항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것인, 방법:
(a) 듀플렉스, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 뉴클레오타이드, 중합 효소 및 절제 시약을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로, 상기 듀플렉스는 신장되는 핵산 가닥 및 서열화될 핵산 가닥을 포함함;
(b) 다음 단계 (i), (ii) 및 (iii)를 포함하는 반응을 수행하는 단계로서, 선택적으로, 단계들을 한 번 이상 반복하는 단계:
단계 (i): 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 라벨을 포함하는 핵산 중간체를 형성하기 위해 중합효소를 사용하여 신장되는 핵산 가닥에 화합물 또는 이의 염을 결합시키는 단계;
단계 (ii): 핵산 중간체를 검출하는 단계;
단계 (iii): 절제 시약을 사용하여 가역적 차단기와 핵산 중간체에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 단계;
바람직하게, 검출 가능한 라벨의 제거는 동시에 수행되거나, 가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 라벨의 제거는 순차적으로 수행되고 (예를 들어, 가역적 차단기가 먼저 제거되거나 검출 가능한 라벨이 먼저 제거됨);
바람직하게, 가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 라벨의 제거에 사용되는 시약과 동일하며;
바람직하게, 가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 라벨의 제거에 사용되는 시약과 상이함.
- 제18항에 있어서, 상기 듀플렉스는 지지대(support)에 연결되는 것인, 방법:
바람직하게, 신장되는 핵산 가닥은 프라이머이고;
바람직하게, 프라이머는 시퀀싱될 핵산 가닥에 어닐링되어 듀플렉스를 형성하며,
바람직하게, 듀플렉스, 화합물 또는 이의 염 및 중합효소는 함께 용액상 및 고체상을 포함하는 반응 시스템을 형성하고;
바람직하게, 화합물 또는 이의 염은 중합 효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합 효소를 사용하여 신장되는 핵산 가닥에 결합되어 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 라벨을 포함하는 핵산 중간체를 형성하며;
바람직하게, 중합 효소는 KOD 중합효소 또는 이의 돌연변이체 (예: KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391)에서 선택되고;
바람직하게, 핵산 중간체를 검출하는 임의의 단계 전에, 이전 단계의 반응 시스템의 용액상이 제거되고, 지지체에 연결된 듀플렉스가 연결되고;
바람직하게, 절제 시약은 용액상 및 고체상을 포함하는 반응 시스템에서 듀플렉스 또는 신장되는 핵산 가닥과 접촉하며;
바람직하게, 절제 시약은 듀플렉스의 백본에 있는 포스포디에스테르 결합에 영향을 주지 않고, 신장되는 핵산 가닥에 결합된 화합물에 의해 운반되는 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능함 라벨을 제거할 수 있고;
바람직하게, 가역적 차단기 및 핵산 중간체에 포함된 선택적으로 검출 가능한 라벨을 제거하는 임의의 단계 후에, 이 단계에서 반응 시스템의 용액 상이 제거되며;
바람직하게, 세척 과정은 제거 과정을 포함하는 임의의 단계 후에 수행되고;
바람직하게, 단계 (ii) 이후에, 다음 단계를 추가로 포함하는 방법임: 단계 (ii)에서 검출된 신호에 따라 단계 (i)에서 신장되는 핵산 가닥에 결합된 화합물의 유형을 결정하는 단계 및 염기 상보쌍의 원리에 기초하여 시퀀싱될 핵산 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염을 적어도 하나 이상 포함하는 것인, 키트:
바람직하게, 상기 키트는 제1화합물, 제2화합물, 제3화합물 및 제4화합물을 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4화합물은 각각 독립적으로 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염이고;
바람직하게, 제1화합물에서, 염기1은 아데닌, 7-데아자아데닌 또는 이의 토토머 (예를 들어, ); 제2화합물에서 염기1은 티민, 우라실 또는 이의 토토머 (예를 들어, ); 제3화합물에서 염기1은 사이토신 또는 이의 토토머 (예를 들어, ); 제4화합물에서 염기1은 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 토토머 (예를 들어, ) 중에서 선택되며,
바람직하게, 제1화합물에서, 염기2는 아데닌, 7- 데아자아데닌 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 제 2 화합물에서, 염기2는 티민, 우라실 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 제3화합물에서, 염기2는 시토신 또는 이의 토토머(예를 들어, ); 제4화합물에서, 염기2는 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 토토머(예를 들어, ) 중에서 선택되고,
바람직하게, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 화합물에 포함된 염기1 또는 염기2는 서로 상이하며;
바람직하게, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 화합물에 의해 운반되는 추가적으로 검출 가능한 라벨은 서로 상이함.
- 제20항에 있어서, 핵산 분자를 전처리하기 위한 시약; 시퀀싱될 핵산 분자를 연결하기 위한 지지체; 시퀀싱될 핵산 분자를 지지체에 연결(예를 들어, 공유 결합 또는 비공유 결합)하기 위한 시약; 뉴클레오타이드 중합 반응을 개시하기 위한 프라이머; 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하기 위한 중합 효소; 하나 이상의 완충 용액; 하나 이상의 세척 용액; 또는 이들의 임의의 조합을 추가적으로 포함하는 것인, 키트.
- 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염 또는 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
- 화학식 I-1의 화합물 또는 이의 염,
화학식 I-1
상기:
L1은 , 에서 선택되고;
바람직하게, L1은 , , 에서 선택되며;
r1, r2, r3a, r3b는, 서로 독립적으로, 1 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
바람직하게, r1은 1,2,3 중에서 선택되며;
더 바람직하게, r1은 1이고;
바람직하게, r2은 1, 2, 3 중에서 선택되며;
더 바람직하게, r2은 1이고;
바람직하게, r3a, r3b는, 서로 독립적으로, 1, 2, 3, 4, 5 중에서 선택되며;
더 바람직하게, r3a, r3b는, 서로 독립적으로, 1, 2, 3 중에서 선택되고;
가장 바람직하게, r3a는 1이며;
가장 바람직하게, r3a는 2이고;
M은 직접 결합, CH2, NH, O, S 중에서 선택되며;
바람직하게, M은 CH2, O 중에서 선택되고;
X는 O, S, NH 중에서 선택되며;
바람직하게, X는 O, S 중에서 선택되고;
더 바람직하게, X는 O이며;
Y는 직접 결합, O, S, NH 중에서 선택되고;
바람직하게, Y는 직접 결합이며;
W는 직접 결합, O, S, NH 중에서 선택되고;
바람직하게, W는 직접 결합이며;
R은 이고;
R1, R2, R3, R4, R5에서, 임의의 하나 (예: R2, R3 또는 R4)는 이며, 나머지 (예: R1 또는 R5)는 이고, 나머지 3개는 H이며;
바람직하게, R1, R2, R3, R4, R5에서, R3, 또는 R4는 이고, R1은 이며, 나머지 3개는 H이고;
r5, r6는, 서로 독립적으로, 1 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되며;
바람직하게, r5는 1, 2, 3 중에서 선택되고;
더 바람직하게, r5는 2이며;
바람직하게, r6는 1, 2, 3 중에서 선택되고;
더 바람직하게, r6는 1 또는 2이며;
M1, M3는, 서로 독립적으로, 직접 결합, NH, O, S중에서 선택되고;
바람직하게, M1는, 직접 결합, NH, O중에서 선택되며;
바람직하게, M3은, 직접 결합, NH중에서 선택되고;
더 바람직하게, M1이 NH, O 또는 S일 때, M3은 직접 결합이며, M3
이 NH, O 또는 S일 때, M1은 직접 결합이고;
Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬 (예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)로부터 선택되며, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택되고;
바람직하게, Rb, Rc에서, 임의의 하나는 -N3, -SS-Me 중에서 선택되며, 다른 하나는 메틸이고;
Z는 O, S, BH중에서 선택되며;
바람직하게, Z는 O이고;
염기1은 염기, 데아자 염기 또는 이의 토토머, 예를 들어, 아데닌, 7- 데아자아데닌, 티민, 우라실, 사이토신, 구아닌, 7- 데아자구아닌 또는 이의 토토머 중에서 선택되며; 바람직하게, 염기1은 , , , 중에서 선택되고;
R'은 가역적 차단기를 나타냄.
- 제23항에 있어서, 상기 가역적 차단기 R'은 N3-CH2-, CH3-CH2-S-S-CH2-, 중에서 선택되는 것인, 화합물 또는 이의 염;
R1', R2', R3', R4', R5'에서, 어느 하나 (예: R1' 또는 R5')는 이고, 다른 하나는 H이며,
바람직하게, R1', R2', R3', R4', R5'에서, R1'는 이고, 다른 하나는 H이며,
Rb', Rc'에서, 어느 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬 (예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu)중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 alkyl중에서 선택되며,
바람직하게, Rb', Rc'에서, 어느 하나는 -N3, -SS-Me이고, 다른 하나는 메틸임.
- 제23항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 이의 염:
.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 이의 염은 추가적으로 검출 가능한 라벨을 운반하는 것인, 화합물 또는 이의 염;
바람직하게, 화합물 또는 이의 염에 의해 운반되는 추가적으로 검출 가능한 라벨은 친화성 시약(예: 항체, 압타머, 아피머, 노틴)에 의해 도입되는데, 상기 친화성 시약은 검출 가능한 라벨을 운반하고, 친화성 시약은 화합물 또는 이의 염의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있거나;
또는 바람직하게, 검출 가능한 라벨은 제23항 및 제24항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I-1의 화합물 내 R 또는 제25항에 따른 화합물 내 R에 대응하는 구조적 모이어티에 결합되고;
바람직하게, 검출 가능한 라벨은 의 말단 아미노기에 연결되며;
바람직하게, 검출 가능한 라벨의 카르복실은 아미드 결합의 형성을 통해 의 말단 아미노기에 연결되고;
바람직하게, 염기1은 상이하고, 화학식 I-1의 화합물에 의해 운반되는 추가 검출 가능한 라벨은 다양하며;
바람직하게, 검출 가능한 라벨은 형광 라벨이고;
바람직하게, 검출 가능한 라벨은 다음으로부터 선택됨: iF700,
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , .
- 제26항에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 이의 염:
- 핵산 합성을 종료하는 방법에 있어서,
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염을 핵산 분자에 혼입시켜 종료시키는 단계를 포함하는, 방법;
바람직하게는, 화합물 또는 이의 염의 혼입은 말단 트랜스퍼라제(terminal transferase), 말단 중합효소(terminal polymerase) 또는 역전사효소에 의해 달성되며;
바람직하게는, 상기 방법은 중합효소(polymerase)를 사용하여 종결될 핵산 분자에 화합물 또는 이의 염을 혼입시키는 단계를 포함하고;
바람직하게는, 중합효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건에서 중합효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써, 화합물 또는 그의 염을 핵산 분자의 3' 말단에 결합시켜 종결시키는 단계를 포함한다.
- 서열분석 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법에 있어서,
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염을 상기 성장하는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 포함시키는 것을 포함하며, 여기서 화합물 또는 이의 염의 포함은, 임의의 후속 뉴클레오타이드가 성장하는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 도입되는 것을 방지하고;
바람직하게는, 상기 화합물 또는 이의 염의 포함은 말단 트랜스퍼라제, 말단 중합효소 또는 역전사효소에 의해 달성되며;
바람직하게는, 상기 방법은 중합효소를 사용하여 화합물 또는 이의 염을 성장하는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 포함시키는 단계를 포함하고;
바람직하게는, 상기 방법은 중합효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써 화합물 또는 그의 염을 성장하는 상보적 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 포함시키는 것을 포함하는, 방법.
- 표적 단일가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는데 있어서 형성되는 핵산 중간체(nucleic acid intermediate)에 있어서,
상기 핵산 중간체는 다음 단계에 따라 형성됨:
표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 성장하는 핵산 가닥에 통합시켜 핵산 중간체를 형성하는 단계, 여기서, 통합된 상보적 뉴클레오타이드는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염임;
또는, 상기 핵산 중간체는 다음 단계에 따라 형성됨:
표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 성장하는 핵산 가닥에 삽입하여 핵산 중간체를 형성하는 단계, 여기서, 삽입된 상보적 뉴클레오타이드는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염이고, 성장하는 핵산 가닥은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오타이드와 사전 통합되고, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 사전 통합된 뉴클레오타이드는 제23항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 염이고, 가역적 차단기(reversible blockin group) 및 선택적인 검출 가능한 표지(optional detectable label)가 제거된 것인, 방법.
- 다음 단계를 포함하는 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법:
1) 성장하는 핵산 가닥에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드의 혼입을 모니터링하는 단계, 여기서 혼입된 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염이고, 및
2) 혼입된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계;
바람직하게는, 다음 상보적 뉴클레오타이드가 도입되기 전에 가역적 차단기(reversible blocking group) 및 선택적인 검출 가능한 표지(optional detectable label)가 제거되고;
바람직하게는 가역적 차단기 및 검출 가능한 표지가 동시에 제거되고;
바람직하게는 가역적 차단기 및 검출 가능한 표지는 순차적으로 제거되며; 예를 들어, 검출 가능한 라벨이 제거된 후 가역적 차단기가 제거되거나, 또는 가역적 차단기가 제거된 후 검출 가능한 라벨이 제거됨.
- 제31항에 있어서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
(a) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염이고, 선택적으로,나머지 뉴클레오타이드는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염임;
(b) 복수의 서로 다른 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 서열에 포함시키는 단계, 여기서, 복수의 서로 다른 뉴클레오타이드는 검출되는 동안 서로 구별될 수 있음;
(c) 단계 (b)에서 뉴클레오타이드를 검출하여 포함된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계;
(d) 단계 (b)에서 뉴클레오타이드에 의해 운반되는 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 제거하는 단계; 및
(e) 선택적으로 단계 (a)-(d)를 1회 이상 반복하는 단계;
이로써 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열이 결정됨.
- 제31항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(1) 제1 뉴클레오타이드, 제2 뉴클레오타이드, 제3 뉴클레오타이드 및 제4 뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 염이고, 선택적으로, 나머지 뉴클레오타이드는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염이고;
(2) 4개의 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; 성장하는 핵산 가닥에 포함되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하는 단계; 성장하는 핵산 가닥에 포함된 뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 성장하는 핵산 가닥에 포함되는 뉴클레오타이드에 운반되는 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 표지를 제거하는 단계;
선택적으로, (3) 단계 (1)-(2)를 1회 이상 반복하는 단계.
- 제31항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 듀플렉스, 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 뉴클레오타이드, 중합효소, 및 절제 시약(excision reagent)을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 상기 듀플렉스는 성장하는 핵산 가닥과 서열분석될 핵산 가닥을 포함하고;
(b) 하기 단계 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 반응을 수행하고, 선택적으로 해당 단계를 1회 이상 반복하는 단계:
단계 (i): 중합효소를 사용하여 성장하는 핵산 가닥에 화합물 또는 이의 염을 포함시켜 가역적 차단 기(reversible blocking group) 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 포함하는 핵산 중간체를 형성하는 단계;
단계 (ii): 핵산 중간체를 검출하는 단계;
단계 (iii): 절제 시약을 사용하여 핵산 중간체에 포함된 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 제거하는 단계;
바람직하게는, 가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 표지의 제거가 동시에 수행되거나, 가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 표지의 제거가 순차적으로 수행됨(예를 들어, 가역성 차단기의 제거가 먼저 제거되거나, 검출 가능한 표지의 제거가 먼저 수행됨);
바람직하게는 가역적 차단기 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 표지 제거에 사용되는 것과 동일하며;
바람직하게는, 가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 표지의 제거에 사용되는 것과 다름.
- 제34항에 있어서, 듀플렉스는 지지체(support)에 연결되고;
바람직하게는, 성장하는 핵산 가닥은 프라이머이고;
바람직하게는, 프라이머는 서열분석될 핵산 가닥에 어닐링되어 듀플렉스를 형성하고;
바람직하게는, 듀플렉스, 이의 화합물 또는 염, 및 중합효소는 함께 용액상 및 고체상을 포함하는 반응 시스템을 형성하고;
바람직하게는, 중합효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합효소를 사용하여 화합물 또는 이의 염을 성장하는 핵산 가닥에 통합함으로써 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 표지를 함유하는 핵산 중간체를 형성함;
바람직하게는, 중합효소는 KOD 중합효소 또는 이의 돌연변이체임(예를 들어, KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391);
바람직하게는, 핵산 중간체를 검출하는 임의의 단계 전에, 이전 단계에서 반응 시스템의 용액상을 제거하고, 지지체에 연결된 듀플렉스를 유지하며;
바람직하게는, 절제 시약은 용액상 및 고체상을 함유하는 반응 시스템에서 듀플렉스 또는 성장하는 핵산 가닥과 접촉하고;
바람직하게는, 절제 시약은 듀플렉스의 백본 상의 포스포디에스테르 결합에 영향을 주지 않으면서 성장하는 핵산 가닥에 혼입되는 화합물에 의해 운반되는 가역적 차단기 및 선택적인 검출 가능한 표지를 제거할 수 있고;
바람직하게는, 핵산 중간체에 포함된 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 제거하는 임의의 단계 후에, 이 단계에서 반응 시스템의 용액상을 제거하고;
바람직하게는, 제거 작업을 포함하는 임의의 단계 후에 세척 작업이 수행되고;
바람직하게는, 단계 (ii) 후에, 방법은 단계 (ii)에서 검출된 신호에 따라 단계 (i)에서 성장하는 핵산 가닥에 혼입된 화합물의 유형을 결정하는 단계, 및 염기서열의 상보적 짝짓기 원리에 기초하여 염기서열을 분석할 핵산 가닥의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계를 추가로 포함함.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 키트;
바람직하게는, 상기 키트는 제1 화합물, 제2 화합물, 제3 화합물 및 제4 화합물을 포함하며, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물은 각각 독립적으로 제23항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 염이다;
바람직하게는, 제1 화합물에서 염기1은 아데닌, 7-데아자아데닌 또는 이들의 호변이성체(tautomer)(예를 들어, )로부터 선택되고; 두 번째 화합물에서 염기1은 티민, 우라실 또는 이의 호변이성체(예:)로부터 선택되고; 세 번째 화합물에서 염기1은 시토신 또는 이의 호변이성체(예: )로부터 선택되고; 네 번째 화합물에서 염기1은 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 호변이성체(예: )로부터 선택되고;
바람직하게는, 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물에 함유된 염기1은 서로 상이하고;
바람직하게는, 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물에 의해 운반되는 추가의 검출 가능한 표지는 서로 상이함.
- 제36항에 있어서, 상기 키트는 핵산 분자를 전처리하기 위한 시약; 서열 분석될 핵산 분자를 연결하기 위한 지지체; 서열 분석될 핵산 분자를 지지체에 연결(예를 들어, 공유 또는 비공유 연결)하기 위한 시약; 뉴클레오타이드 중합 반응을 개시하기 위한 프라이머; 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하기 위한 중합효소; 하나 이상의 완충 용액; 하나 이상의 세척 용액; 또는 이들의 조합.
- 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하기 위한, 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 염, 또는 제36항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
- 리보스 또는 데옥시리보스, 가역적 차단기, 염기 또는 데아자 염기 또는 이의 호변이성체, 검출 가능한 표지에 연결하기 위한 링커, 및 선택적 포스페이트 기에 의해 형성되는 뉴클레오타이드 유사체로서, 링커는 다음 공식 A 또는 공식 A'로 표시되는 구조를 포함함:
여기서:
Rb, Rc 중 어느 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, - OCORx, -OCONHRx, -S-SO2Rx, 그리고 다른 하나는 H, 지방족 알킬(예: Me, Et, iPr, tBu와 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예: 페닐 -C1-C6 알킬)에서 선택되고, 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬), 여기서 각각의 Rx는 독립적으로 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 또는 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 C1- C6 알킬);
바람직하게는, Rb, Rc 중 어느 하나가 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) 중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택되고;
더욱 바람직하게는 Rb, Rc 중 어느 하나가 -N3, -SS-Me, -SS-Et 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이고;
가장 바람직하게는 Rb, Rc 중 어느 하나가 -N3, -SS-Me 중에서 선택되고, 다른 하나는 메틸이고;
Ra는 H, 지방족 알킬(예를 들어, Me, Et, iPr, tBu와 같은 C1-C6 알킬), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐-C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬)로부터 선택되고;
바람직하게는 Ra는 H, C1-C6 알킬로부터 선택되고;
보다 바람직하게는 Ra는 메틸이고;
X는 O, S, NH로부터 선택되고;
바람직하게는, X는 O, S로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 X는 O이고;
M1은 직접 결합, NH, O, S, CH2로부터 선택되고;
바람직하게는 M1은 직접 결합, NH, O로부터 선택되고;
바람직하게는 가역적 차단기는 리보스 또는 데옥시리보스의 3'-OH에 연결되고, 염기 또는 데아자 염기 또는 이의 호변이성체는 리보스 또는 데옥시리보스의 1'-C에 연결되고, 선택적인 인산염 그룹은 리보스 또는 데옥시리보스의 5'-OH, 그리고 링커는 염기 또는 데아자 염기 또는 이의 호변이성체에 연결됨.
- 제39항에 있어서, 화학식 A의 구조는 화학식 A-1, 화학식 A-2, 화학식 A-3, 화학식 A-4 또는 화학식 A-5로부터 선택되고, 바람직하게는 하기 화학식의 구조인 A는 화학식 A-1, 화학식 A-2 또는 화학식 A-5이고; 또는, 화학식 A'의 구조는 화학식 A'-1, 화학식 A'-2 또는 화학식 A'-3으로부터 선택되고, 바람직하게는 화학식 A'의 구조는 화학식 A'-1이고;
여기서:
Ra, Rb, Rc, X, M1은 위와 동일한 정의를 가진다.
- 제39항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 식 A의 구조는 다음으로부터 선택되는 것인 뉴클레오타이드 유사체:
또는, 상기 화학식 A'의 구조는 임.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체의 구조는 하기 화학식 B로 표시되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 유사체:
Lx는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A-1, 화학식 A-2, 화학식 A-3, 화학식 A-4, 화학식 A-5, 화학식 A'-1, 화학식 A'-2 또는 화학식 A'-3의 구조를 가지고, Lx의 M1 말단 또는 S 말단은 Lb에 연결되고, Lx의 O 말단은 La에 연결되며;
는 검출 가능한 라벨에 연결하기 위한 링커를 나타내고,
base1은 염기 또는 데아자 염기 또는 이의 호변이성체를 나타내고;
R'은 가역적 차단기를 나타내고;
R0는 H 또는 인산기를 나타내고;
La는 염기 또는 데아자 염기 또는 이의 호변이성체에 연결하기 위한 링커의 모이어티를 나타내고;
Lb는 검출 가능한 라벨에 연결하기 위한 링커의 모이어티를 나타냄.
- 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체의 구조는 하기 화학식 B로 표시되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 유사체:
여기서:
Lx는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A-1, 화학식 A-2, 화학식 A-3, 화학식 A-4, 화학식 A-5, 화학식 A'-1, 화학식 A'-2 또는 화학식 A'-3의 구조를 가지고, Lx의 M1 말단 또는 S 말단은 Lb에 연결되고, Lx의 O 말단은 La에 연결되며;
La는 로부터 선택되고;
바람직하게는, La 는 로부터 선택되고;
또는 바람직하게는, La 는 다음으로부터 선택됨:
;
또는 더욱 바람직하게는, La 는 다음으로부터 선택됨:
;
또는 보다 바람직하게는, La 는 다음으로부터 선택됨:
;
또는 가장 바람직하게는, La 는 다음으로부터 선택됨:
r1, r2, r3a, r3b, r4는 서로 독립적으로 1과 6 사이의 정수 중에서 선택되고;
바람직하게는, r1은 1, 2, 3으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 r1은 1이고;
바람직하게는, r2는 1, 2, 3으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 r2는 1이고;
바람직하게는, r3a, r3b는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5로부터 선택되고, r3a, r3b는 동시에 0이 아니며;
더 바람직하게는, r3a, r3b는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3으로부터 선택되고, r3a, r3b는 동시에 0이 아니며;
더욱 바람직하게는, r3a는 0, 1로부터 선택되고, r3b는 0, 2로부터 선택되고, r3a, r3b는 동시에 0이 아니며;
가장 바람직하게는 r3a는 1이고;
가장 바람직하게는 r3b는 2이고;
바람직하게는, r4는 1, 2, 3으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 r4는 1이고;
M은 직접 결합, CH2, NH, O, S로부터 선택되고;
바람직하게는, M은 직접 결합, CH2, O로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 M은 CH2, O로부터 선택되고;
Lb 는 , , 로부터 선택되고;
바람직하게는, Lb 는 , , 로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는, Lb 는 , , 로부터 선택되고;
가장 바람직하게는, Lb 는 다음으로부터 선택됨:
;
Lc 는 직접 결합, , , 으로부터 선택되고,
바람직하게는, Lc 에서 NH 말단은 Lb의 H 와 연결되고, Lc 의 =O 말단은 Lb의 NH에 연결되고;
바람직하게는, Lc 는 직접 결합, , , 으로부터 선택되고,
바람직하게는, Lc 의 NH말단은 Lb의 H와 연결되고, Lc 의 =O 말단은 Lb의 NH와 연결됨;
rm은 0과 6 사이의 정수 중에서 선택되고;
바람직하게는, rm은 0, 1, 2, 3으로부터 선택되고;
보다 바람직하게는 rm은 0, 1로부터 선택되고;
r5, r6, r7은 서로 독립적으로 1과 6 사이의 정수 중에서 선택되고;
바람직하게는, r5는 1, 2, 3으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 r5는 2이고;
바람직하게는, r6은 1, 2, 3으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 r6은 1 또는 2이고;
바람직하게는, r7은 1, 2, 3으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 r7은 2이고;
r10은 1과 10 사이의 정수 중에서 선택되고;
바람직하게는, r10은 2 내지 6 사이의 임의의 정수로부터 선택되고;
보다 바람직하게는 r10은 2 또는 6이고;
r11은 1과 6 사이의 정수 중에서 선택되고;
바람직하게는, r11은 1, 2, 3으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는 r11은 1이고;
M1, M2, M3은 서로 독립적으로 직접 결합, NH, O, S, CH2로부터 선택되고;
바람직하게는 M1은 직접 결합, NH, O로부터 선택되고;
바람직하게는 M2는 NH이고;
바람직하게는, M3은 직접 결합, NH;
base1은 염기 또는 데아자 염기를 나타내고;
R'은 가역적 차단기를 나타내며;
은 검출 가능한 표지에 연결하기 위한 링커를 나타내고;
R0는 H 또는 인산기를 나타냄.
- 제42항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, base1이 아데닌, 7-데아자아데닌, 티민, 우라실, 시토신, 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 호변이성체로부터 선택되고;
바람직하게는, base1이 로부터 선택되는 것인, 뉴클레오타이드 유사체.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, R0는 H, 일인산기(), 이인산기(), 삼인산기(), 사인산기()으로부터 선택되고;
바람직하게는, R0는 삼인산기()이고;
각각의 Z는 독립적으로 O, S, BH로부터 선택되고;
바람직하게는 Z는 O인, 뉴클레오타이드 유사체.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 가역적 차단기 R'은 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, , NH2, -ONH2, -OCORz, -OCONHRz(여기서 각 Rz는 독립적으로 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예: C3-C6 사이클로알킬) 또는 방향족 알킬(예: 페닐 C1-C6 알킬) 중에서 선택되는 것인 뉴클레오타이드 유사체;
바람직하게는, 가역적 차단기 R'은 N3-C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, , NH2로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는, 상기 가역적 차단기 R'은 N3-C1-C6 alkyl, C1-C6 알킬-SS-C1-C6 알킬, 로부터 선택되고;
가장 바람직하게는, 상기 가역적 차단기 R' 은 N3-CH2-, CH3-CH2-S-S-CH2-, 로부터 선택되고;
R1', R2', R3', R4', R5'에서 어느 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이고, 나머지는 서로 독립적으로 H, 아지도, 니트로, 아미노, 설포, 카르복실, 지방족 알킬(예: C1-C6 알킬), 시클로알킬(예: C3-C6 시클로알킬), 방향족 알킬(예: 페닐-C1-C6 알킬), F, I, Br, Cl, 알콕실(예: C1 -C6 알콕실)로부터 선택되고,
바람직하게는, R1', R2', R3', R4', R5' 중 어느 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이고, 다른 것(예를 들어, R3')은 H, C1-C6 알콕실(예를 들어, 메톡시), 나머지는 H,
더욱 바람직하게는, R1', R2', R3', R4', R5' 중 어느 하나(예를 들어, R1' 또는 R5')는 이고 나머지는 H이고,
가장 바람직하게는 R1', R2', R3', R4', R5' 중, R1'은 이고, 나머지는 H이고,
Rb', Rc' 중, 어느 하나는 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예: -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH2, -OCORx, -OCONHRx 중에서 선택된 어느 하나이고, 다른 하나는 H, 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬; Me, Et, iPr, tBu와 같은), 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 -C1-C6 알킬), 사이클로알킬 (예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 중에서 선택되고, 여기서 각각의 Rx는 독립적으로 지방족 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 사이클로알킬(예를 들어, C3-C6 사이클로알킬) 또는 방향족 알킬(예를 들어, 페닐 C1-C6 알킬)로부터 선택되고,
바람직하게는, Rb', Rc' 중 어느 하나가 -N3, -SS-C1-C6 알킬(예를 들어, -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) 중에서 선택되고, 다른 하나는 C1-C6 알킬 중에서 선택되고,
더욱 바람직하게는 Rb', Rc' 중 어느 하나가 -N3, -SS-Me 중 선택되고, 다른 하나는 메틸임.
- 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제9항에 따른 화합물로부터 선택되는 뉴클레오타이드 유사체.
- 제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체는 추가의 검출 가능한 표지를 운반하고, 검출 가능한 표지는 링커(바람직하게는 Lb)에 연결되고;
바람직하게는, 뉴클레오타이드 유사체에 의해 운반되는 추가의 검출 가능한 표지는 친화성 시약(예: 항체, 앱타머, Affimer, Knottin)에 의해 도입되며, 여기서 친화성 시약은 검출 가능한 표지를 운반하고, 친화성 시약은 뉴클레오타이드 유사체의 에피토프를 특이적으로 인식하여 결합할 수 있음; 바람직하게는, 검출가능한 표지는 Lb의 말단 아미노기에 연결되고;
바람직하게는, 검출가능한 표지의 카르복실기는 아미드 결합의 형성을 통해 Lb의 말단 아미노기에 연결되며;
바람직하게는 base1은 다르고, 상기 뉴클레오타이드 유사체에 의해 운반되는 추가의 검출 가능한 표지는 다양하며;
바람직하게는, 검출가능한 표지는 형광 표지이고;
바람직하게는, 검출가능한 표지는 iF700,
로부터 선택되는 것인, 뉴클레오타이드 유사체.
- 제48항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체는 제11항에 따른 화합물로부터 선택되는 것인, 뉴클레오타이드 유사체.
- 다음 단계를 포함하는 핵산 합성을 종료하는 방법:
제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체를 종결될 핵산 분자에 혼입시키는 단계;
바람직하게는 뉴클레오타이드 유사체의 혼입은 말단 전이효소, 말단 중합효소 또는 역전사효소에 의해 달성되며;
바람직하게는, 상기 방법은 중합효소를 사용하여 종결될 핵산 분자에 뉴클레오타이드 유사체를 통합시키는 단계를 포함하고;
바람직하게는, 상기 방법은 중합효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써 뉴클레오타이드 유사체를 핵산 분자의 3' 말단에 통합시켜 종결시키는 단계를 포함한다.
- 다음 단계를 포함하는 서열분석 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법,
제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체를 성장하는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 혼입하는 단계, 여기서, 뉴클레오타이드 유사체의 혼입은 임의의 후속 뉴클레오타이드가 성장하는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 도입되는 것을 방지함;
바람직하게는 뉴클레오타이드 유사체의 혼입은 말단 전이효소, 말단 중합효소 또는 역전사효소에 의해 달성되며;
바람직하게는, 상기 방법은 중합효소를 사용하여 뉴클레오타이드 유사체를 성장하는 상보적 폴리뉴클레오타이드에 포함시키는 단계를 포함하고;
바람직하게는, 상기 방법은 중합효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합효소를 사용하여 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행함으로써 뉴클레오타이드 유사체를 성장하는 상보적 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 혼입시키는 것을 포함한다.
- 표적 단일가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는데 있어서 형성되는 핵산 중간체로서,
다음 단계에 따라 형성되는 것인 핵산 중간체:
표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 성장하는 핵산 가닥에 통합하여 핵산 중간체를 형성하는 단계, 여기서, 통합된 상보적 뉴클레오타이드는 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체임;
또는, 다음 단계에 따라 형성되는 것인 핵산 중간체:
표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 성장하는 핵산 가닥에 통합하여 핵산 중간체를 형성하는 단계, 여기서, 통합된 상보적 뉴클레오타이드는 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체이고, 성장하는 핵산은 가닥은 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오타이드와 미리 통합되고, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 적어도 하나의 미리 삽입된 뉴클레오타이드는 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체이며, 여기에서 가역적 차단기 및 선택적 검출가능한 표지는 제거된 것임.
- 다음을 포함하는 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법:
1) 성장하는 핵산 가닥에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드의 혼입을 모니터링하며, 여기서 혼입된 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드는 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체이고,
2) 삽입된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하는 단계;
바람직하게는, 다음 상보적 뉴클레오타이드가 도입되기 전에 가역적 차단기 및 선택적인 검출 가능한 표지가 제거되고;
바람직하게는 가역적 차단기 및 검출 가능한 표지가 동시에 제거되고;
바람직하게는 가역적 차단기 및 검출 가능한 표지는 순차적으로 제거되며; 예를 들어, 검출 가능한 라벨이 제거된 후 가역적 차단기가 제거되거나, 가역적 차단기가 제거된 후 검출 가능한 라벨이 제거됨.
- 제53항에 있어서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
(a) 복수의 상이한 뉴클레오타이드를 제공하는 단계, 여기서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 제48항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체이고, 선택적으로 나머지 뉴클레오타이드는 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체임;
(b) 복수의 서로 다른 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 서열에 포함시키는 단계, 여기서, 복수의 서로 다른 뉴클레오타이드는 검출되는 동안 서로 구별될 수 있음;
(c) 포함된 뉴클레오타이드의 유형을 결정하기 위해 단계 (b)에서 뉴클레오타이드를 검출하는 단계;
(d) 단계 (b)에서 뉴클레오타이드에 의해 운반되는 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 제거하는 단계; 및
(e) 선택적으로 단계 (a)-(d)를 1회 이상 반복하는 단계;
이로써 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열이 결정된다.
- 제53항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(1) 첫 번째 뉴클레오타이드, 두 번째 뉴클레오타이드, 세 번째 뉴클레오타이드 및 네 번째 뉴클레오타이드를 제공하는 단계, 여기서 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 제48항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체이고, 선택적으로 나머지 뉴클레오타이드는 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체임;
(2) 4개의 뉴클레오타이드를 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; 성장하는 핵산 가닥에 포함되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하는 단계; 성장하는 핵산 가닥에 포함된 뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 성장하는 핵산 가닥에 통합되는 뉴클레오타이드에 운반되는 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 표지를 제거하는 단계;
선택적으로 (3): 상기 (1)-(2)의 단계를 한 번 이상 반복한다.
- 제53항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 듀플렉스, 제48항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드, 중합효소, 및 절제 시약을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 상기 듀플렉스는 성장하는 핵산 가닥과 서열분석될 핵산 가닥을 포함하고;
(b) 하기 단계 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 반응을 수행하는 단계, 선택적으로 해당 단계를 1회 이상 반복하는 단계:
단계 (i): 중합효소를 사용하여 뉴클레오타이드 유사체를 성장하는 핵산 가닥에 통합시켜 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 포함하는 핵산 중간체를 형성하는 단계;
단계 (ii): 핵산 중간체를 검출하는 단계;
단계 (iii): 절제 시약을 사용하여 핵산 중간체에 포함된 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 제거하는 단계;
바람직하게는, 가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 표지의 제거가 동시에 수행되거나, 가역적 차단기의 제거와 검출 가능한 표지의 제거가 순차적으로 수행된다(예를 들어, 가역성 차단기의 제거가 먼저 제거되거나, 검출 가능한 표지가 먼저 제거된다);
바람직하게는 가역적 차단기 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 표지 제거에 사용되는 것과 동일하며;
바람직하게는, 가역적 차단기의 제거에 사용되는 절제 시약은 검출 가능한 표지의 제거에 사용되는 것과 다르다.
- 제56항에 있어서, 듀플렉스는 지지체에 연결되고;
바람직하게는, 성장하는 핵산 가닥은 프라이머이고;
바람직하게는, 프라이머는 서열분석될 핵산 가닥에 어닐링되어 듀플렉스를 형성하고;
바람직하게는, 듀플렉스, 뉴클레오타이드 유사체 및 중합효소가 함께 용액상 및 고체상을 함유하는 반응 시스템을 형성하고;
바람직하게는, 뉴클레오타이드 유사체는 중합효소가 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하도록 허용되는 조건 하에서 중합효소를 사용하여 성장하는 핵산 가닥에 통합되어 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 포함하는 핵산 중간체를 형성하고;
바람직하게는, 중합효소는 KOD 중합효소 또는 이의 돌연변이체(예를 들어, KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391);
바람직하게는, 핵산 중간체를 검출하는 임의의 단계 전에, 이전 단계에서 반응 시스템의 용액상을 제거하고, 지지체에 연결된 듀플렉스를 유지하며;
바람직하게는, 절제 시약은 용액상 및 고체상을 함유하는 반응 시스템에서 듀플렉스 또는 성장하는 핵산 가닥과 접촉하고;
바람직하게는, 절제 시약은 듀플렉스의 백본 상의 포스포디에스테르 결합에 영향을 주지 않으면서 성장하는 핵산 가닥에 통합되는 뉴클레오타이드 유사체에 의해 운반되는 가역적 차단기 및 선택적 검출 가능한 표지를 제거할 수 있고;
바람직하게는, 핵산 중간체에 함유된 가역적 차단기 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 제거하는 임의의 단계 후에, 이 단계에서 반응 시스템의 용액상을 제거하고;
바람직하게는, 제거 작업을 포함하는 임의의 단계 후에 세척 작업이 수행되고;
바람직하게는, 단계 (ii) 후에, 방법은 다음을 추가로 포함하는 것인 방법:
단계 (ii)에서 검출된 신호에 따라 단계 (i)에서 성장하는 핵산 가닥에 포함된 뉴클레오타이드 유사체의 유형을 결정하고,
염기 상보적 짝짓기 원리에 기초하여 서열 분석할 핵산 가닥의 상응하는 위치에 있는 뉴클레오타이드 유형을 결정하는 단계.
- 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 키트에 있어서;
바람직하게는, 키트는 제1 화합물, 제2 화합물, 제3 화합물 및 제4 화합물을 포함하며, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물은 각각 독립적으로 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체이고;
바람직하게는, 제1 화합물에서 base1은 아데닌, 7-데아자아데닌 또는 이들의 호변이성체(예를 들어, )로부터 선택되고; 두 번째 화합물에서 base1은 티민, 우라실 또는 이의 호변이성체(예: )로부터 선택되고; 세 번째 화합물에서 base1은 시토신 또는 이의 호변이성체(예: )로부터 선택되고; 네 번째 화합물에서 base1은 구아닌, 7-데아자구아닌 또는 이의 호변이성체(예: )로부터 선택되고;
바람직하게는, 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물에 함유된 base1은 서로 상이하고;
바람직하게는, 제1, 제2, 제3 및 제4 화합물에 의해 운반되는 추가의 검출 가능한 표지는 서로 상이하다.
- 제58항에 있어서, 핵산 분자를 전처리하기 위한 시약; 서열 분석할 핵산 분자를 연결하기 위한 지지체; 서열 분석될 핵산 분자를 지지체에 연결(예를 들어, 공유 또는 비공유 연결)하기 위한 시약; 뉴클레오타이드 중합 반응을 개시하기 위한 프라이머; 뉴클레오타이드 중합 반응을 수행하기 위한 중합효소; 하나 이상의 완충 용액; 하나 이상의 세척 용액; 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는, 키트.
- 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하기 위한, 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 유사체 또는 제58항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
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