CN115197289A - 用于测序的核苷酸类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸测序领域。特别地，本发明提供了用于测序的核苷酸类似物，所述核苷酸类似物的碱基上或者糖环3’‑OH带有连接物，可用于NGS测序。本发明还涉及包含所述核苷酸类似物的试剂盒，以及基于所述核苷酸类似物的测序方法。
Description
技术领域
本发明涉及核酸测序领域。具体地，本发明涉及用于测序的核苷酸类似物。
背景技术
NGS测序的出现克服了Sanger测序成本高、测序时间长等缺点，极大地推动了基因测序技术的应用。目前，NGS测序已经在产前筛查、肿瘤诊断、肿瘤治疗、动植物育种等领域深度应用，带动了科技与医学的进步。
带有可逆阻断基团的核苷三磷酸(dNTP)类似物是NGS测序中关键原材料。由于可逆阻断基团的引入，使得dNTP中3’-OH基团可以保留，克服了Sanger测序中的缺点，同时保证了碱基识别的准确性。可以说带有可逆阻断基团的核苷三磷酸类似物(dNTP)是NGS测序中最为关键的技术。而NGS测序中带有可切断linker与可检测标记的核苷酸更是实现碱基检测的关键所在。
发明内容
本发明旨在开发一类在碱基上或者核苷酸糖环3’-OH带有可切断可检测标记的酯基、碳酸酯等dNTP类似物用于NGS测序。
第一类dNTP类似物的结构通式如图1所示，碱基带有可切断可检测标记的核苷酸，包括2’脱氧尿苷三磷酸、2’脱氧胞苷三磷酸、7-脱氮-2’脱氧腺苷三磷酸与7-脱氮--2’脱氧鸟苷三磷酸的主体结构。第一类dNTP类似物中，糖环3’-OH上连接有本领域常规使用的连接在3’-OH上效果优良的任意可逆阻断基团。第二类dNTP类似物的结构通式如图2所示，糖环3’-OH可逆阻断基团上带有可检测标记的核苷酸。
为此，在本发明的第一方面，本发明提供了式I或式II所示的化合物或其盐，
其中：
L1选自
r1、r2、r3a、r3b、r4各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH2、NH、O、S；
L2为
优选地，W与R相连；
L3为
优选地，W与R相连；
各X独立地选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
各W独立地选自直接键、O、S、NH；
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个为
其余各自独立地选自H、
叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r5、r6、r7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
r8、r9各自独立地选自0、1，且r8、r9不同时为0；
M1、M2、M3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
Ra选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
R0选自H、单磷酸基团
二磷酸基团
三磷酸基团
四磷酸基团
各Z独立地选自O，S，BH；
base1、base2各自独立地选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
式I中，R’表示可逆阻断基团，式II中，
表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L1选
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，r1选自1、2、3。
在一些实施方案中，r1为1。
在一些实施方案中，r2选自1、2、3。
在一些实施方案中，r2为1。
在一些实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3。
在一些实施方案中，r3a为1。
在一些实施方案中，r3b为2。
在一些实施方案中，r4选自1、2、3。
在一些实施方案中，r4为1。
在一些实施方案中，M选自CH2、O。
在一些实施方案中，各X独立地选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，Y为直接键。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个为
其余各自独立地选自H、
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个为
另一个(如R1或R5)选自H、
剩余三个为H。
在一些实施方案中，r5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r5为2。
在一些实施方案中，r6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r6为1或2。
在一些实施方案中，r7选自1、2、3。
在一些实施方案中，r7为2。
在一些实施方案中，M1选自直接键、NH、O。
在一些实施方案中，M2为NH。
在一些实施方案中，M3选自直接键、NH。
在一些实施方案中，Ra选自H、C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Ra为甲基。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me、-SS-Et，另一个为甲基。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，R选自
在一些实施方案中，R0为三磷酸基团
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base1选自
在一些实施方案中，base2选自
在本发明的第二方面，本发明提供了式I-1所示的化合物或其盐，
其中：
L1选自
r1、r2、r3a、r3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH2、NH、O、S；
X选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R2、R3或R4)为
其余各自独立地选自H、
叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r5、r6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M1、M3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
Z选自O，S，BH；
base1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，r1选自1、2、3。
在一些实施方案中，r1为1。
在一些实施方案中，r2选自1、2、3。
在一些实施方案中，r2为1。
在一些实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3。
在一些实施方案中，r3a为1。
在一些实施方案中，r3b为2。
在一些实施方案中，M选自CH2、O。
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，Y为直接键。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R2、R3或R4)为
其余各自独立地选自H、
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R2、R3或R4)为
另一个(如R1或R5)为
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，R3或R4为
R1为
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R选自
在一些实施方案中，r5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r5为2。
在一些实施方案中，r6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r6为1或2。
在一些实施方案中，M1选自直接键、NH、O。
在一些实施方案中，M3选自直接键、NH。
在一些实施方案中，M1为NH、O或S时，M3为直接键，且M3为NH、O或S时，M1为直接键。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base1选自
在本发明的第三方面，本发明提供了式I-2所示的化合物或其盐，
其中：
L1选自
r1、r2、r3a、r3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH2、NH、O、S；
X选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R1或R5)为
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r5、r6、r7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
r8选自0、1，
M1选自直接键、NH、O、S；
Ra选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
Z选自O，S，BH；
base1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，r1选自1、2、3。
在一些实施方案中，r1为1。
在一些实施方案中，r2选自1、2、3。
在一些实施方案中，r2为1。
在一些实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3。
在一些实施方案中，r3a为1。
在一些实施方案中，r3b为2。
在一些实施方案中，M选自CH2、O。
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，Y为直接键。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R1或R5)为
其余为H。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，R1为
其余为H。
在一些实施方案中，R选自
在一些实施方案中，r5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r5为2。
在一些实施方案中，r6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r6为1。
在一些实施方案中，r7选自1、2、3。
在一些实施方案中，r7为2。
在一些实施方案中，M1为直接键。
在一些实施方案中，Ra选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Ra为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base1选自
在本发明的第四方面，本发明提供了式II-1所示的化合物或其盐，
其中：
X选自O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R3或R4)为
其余各自独立地选自H、
叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r5、r6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M1、M3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
Z选自O，S，BH；
base2选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R3或R4)为
其余各自独立地选自H、
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R3或R4)为
另一个(如R1或R5)为
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，R3或R4为
R1为
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R选自
在一些实施方案中，r5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r5为2。
在一些实施方案中，r6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r6选自1、2。
在一些实施方案中，M1选自直接键、NH、O。
在一些实施方案中，M3选自直接键、NH。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个为-N3或-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base2选自
在本发明的第五方面，本发明提供了式II-2所示的化合物或其盐，
其中：
X选自O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R1或R5)为
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r5、r6、r7选自1-6之间的任意整数；
r8选自0、1；
M1选自直接键、NH、O、S；
Ra选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
Z选自O，S，BH；
base2选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R1或R5)为
其余为H。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，R1为
其余为H。
在一些实施方案中，R选自
在一些实施方案中，r5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r5为2。
在一些实施方案中，r6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r6为1。
在一些实施方案中，r7选自1、2、3。
在一些实施方案中，r7为2。
在一些实施方案中，M1为直接键。
在一些实施方案中，Ra选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Ra为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base2选自
在一些实施方案中，前述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
NH2、-ONH2、-OCORz、-OCONHRz，其中，各Rz独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
NH2。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N3-CH2-、CH3-CH2-S-S-CH2-、
在一些实施方案中，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)。
在一些实施方案中，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余为H。
在一些实施方案中，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，R1’为
其余为H。
在一些实施方案中，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)。
在一些实施方案中，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在本发明的第六方面，本发明还提供了式III所示的化合物或其盐，
其中：
L1选自
r2选自1、2、3；
r3a选自1、2、3；
r3b选自0、1、2、3；
M选自直接键、O；
L2为
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R3)为
另一个(如R1或R2)选自
剩余三个为H；
Lc选自直接键、
优选地，Lc中的NH端与H相连，Lc中的＝O端与NH相连；
rm选自0、1、2、3；
r5选自1、2、3；
r6选自1、2、3；
r10选自1-10之间的任意整数；
r11选自1-6之间的任意整数；
M1选自NH、O；
M1选自NH、O；
M3选自直接键、NH；
Rb、Rc中，任意一个选自-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
R0选自H、单磷酸基团
二磷酸基团
三磷酸基团
四磷酸基团
各Z独立地选自O，S，BH；
base1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
式III中，R’表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，r2为1。
在一些实施方案中，r3a为1。
在一些实施方案中，r3b选自0、2。
在一些实施方案中，Lc选自直接键、
优选地，Lc中的NH端与H相连，Lc中的＝O端与NH相连。
在一些实施方案中，rm选自0、1。
在一些实施方案中，r5为2。
在一些实施方案中，r6为1或2。
在一些实施方案中，r10选自2-6之间的任意整数。
在一些实施方案中，r10为2或6。
在一些实施方案中，r11选自1、2、3。
在一些实施方案中，r11为1。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个为-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，R选自
在一些实施方案中，R0为三磷酸基团
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base1选自
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’为
R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
另一个(如R3’)选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H；Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，R1’为
R3’选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H。
在一些实施方案中，Rb’、Rc’中，任意一个为-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，前述化合物选自以下表A：
表A：
在一些实施方案中，前述化合物或其盐携带额外的可检测标记。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述化合物或其盐的表位。
在一些实施方案中，所述可检测标记与式I、式II、式I-1、式I-2、式II-1或式II-2所示化合物中的R或前述具体化合物中对应于R的结构部分连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与
或者与其对应的结构部分中的末端氨基连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记中的羧基与
或者与其对应的结构部分中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与式III所示化合物中的R连接或前述具体化合物中对应于R的结构部分连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与
或者与其对应的结构部分中的末端氨基连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与
或者与其对应的结构部分中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接。
在一些实施方案中，base1不同，式I所示化合物携带的额外的可检测标记不同。
在一些实施方案中，base2不同，式II所示化合物携带的额外的可检测标记不同。
在一些实施方案中，所述可检测标记为荧光标记。
在一些实施方案中，所述可检测标记选自以下：iF700、
在一些实施方案中，前述化合物选自以下表B：
表B：
在本发明的第七方面，本发明提供了终止核酸合成的方法，其包括：将前述的化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中。
在一些实施方案中，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子的3'端。
在本发明的第八方面，本发明提供了制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将前述的化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述化合物或其盐的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸。
在一些实施方案中，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
在本发明的第九方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐。
在本发明的第十方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的前述的化合物或其盐。
在本发明的第十一方面，本发明提供了测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐，以及，
2)确定掺入的核苷酸的类型。
在一些实施方案中，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是前述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是前述的化合物或其盐；
(b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
(c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
(d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
(e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是前述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是前述的化合物或其盐；
(2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(a)提供包含双链体、包含至少一种前述的化合物或其盐的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
(b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
步骤(i)：使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的所述可检测标记切除。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
在一些实施方案中，所述双链体连接于支持物上。
在一些实施方案中，所述生长的核酸链为引物。
在一些实施方案中，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体。
在一些实施方案中，所述双链体、所述化合物或其盐、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系。
在一些实施方案中，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体。
在一些实施方案中，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KODPOL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)。
在一些实施方案中，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体。
在一些实施方案中，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中接触。
在一些实施方案中，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的化合物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键。
在一些实施方案中，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相。
在一些实施方案中，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作。
在一些实施方案中，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的化合物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
在本发明的第十二方面，本发明提供了试剂盒，其包含至少一个前述的化合物或其盐。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为前述的化合物或其盐。
在一些实施方案中，所述第一化合物中，base1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
)；所述第二化合物中，base1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第三化合物中，base1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第四化合物中，base1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
)。
在一些实施方案中，所述第一化合物中，base2选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
)；所述第二化合物中，base2选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第三化合物中，base2选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第四化合物中，base2选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
)。
在一些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base1或base2互不相同。
在一些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
在本发明的第十三方面，本发明提供了前述的化合物或其盐或者前述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
另外，在本发明的第十四方面，本发明还提供了式I-1所示的化合物或其盐，
其中：
L1选自
r1、r2、r3a、r3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH2、NH、O、S；
X选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R2、R3或R4)为
其余各自独立地选自H、
叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r5、r6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M1、M3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
Z选自O，S，BH；
base1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，r1选自1、2、3。
在一些实施方案中，r1为1。
在一些实施方案中，r2选自1、2、3。
在一些实施方案中，r2为1。
在一些实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3。
在一些实施方案中，r3a为1。
在一些实施方案中，r3b为2。
在一些实施方案中，M选自CH2、O。
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，Y为直接键。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R2、R3或R4)为
其余各自独立地选自H、
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R2、R3或R4)为
另一个(如R1或R5)为
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，R3或R4为
R1为
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R选自
在一些实施方案中，r5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r5为2。
在一些实施方案中，r6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r6为1或2。
在一些实施方案中，M1选自直接键、NH、O。
在一些实施方案中，M3选自直接键、NH。
在一些实施方案中，M1为NH、O或S时，M3为直接键，且M3为NH、O或S时，M1为直接键。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base1选自
在一些具体实施方案中，式I-1所示的化合物中：
L1选自
r1、r2、r3a、r3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH2、NH、O、S；
X选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R2、R3或R4)为
另一个(如R1或R5)为
剩余三个为H；
r5、r6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M1、M3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
Z选自O，S，BH；
base1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团。
在一些具体实施方案中，L1选自
在一些具体实施方案中，r1选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r1为1。
在一些具体实施方案中，r2选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r2为1。
在一些具体实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些具体实施方案中，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r3a为1。
在一些具体实施方案中，r3b为2。
在一些具体实施方案中，M选自CH2、O。
在一些具体实施方案中，X选自O、S。
在一些具体实施方案中，X为O。
在一些具体实施方案中，Y为直接键。
在一些具体实施方案中，W为直接键。
在一些具体实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5中，R3或R4为
R1为
剩余三个为H。
在一些具体实施方案中，r5选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r5为2。
在一些具体实施方案中，r6选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r6为1或2。
在一些具体实施方案中，M1选自直接键、NH、O。
在一些具体实施方案中，M3选自直接键、NH。
在一些具体实施方案中，M1为NH、O或S时，M3为直接键，且M3为NH、O或S时，M1为直接键。
在一些具体实施方案中，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些具体实施方案中，Z为O。
在一些具体实施方案中，base1选自
在一些实施方案中，前述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
NH2、-ONH2、-OCORz、-OCONHRz，其中，各Rz独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
NH2。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N3-CH2-、CH3-CH2-S-S-CH2-、
在一些实施方案中，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)。
在一些实施方案中，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余为H。
在一些实施方案中，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，R1’为
其余为H。
在一些实施方案中，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)。
在一些实施方案中，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些具体实施方案中，本发明提供了式I-1所示的化合物或其盐，
其中：
L1选自
优选地，L1选自
r1、r2、r3a、r3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r1选自1、2、3；
更优选地，r1为1；
优选地，r2选自1、2、3；
更优选地，r2为1；
优选地，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3、4、5；
更优选地，r3a、r3b各自独立地选自1、2、3；
最优选地，r3a为1；
最优选地，r3b为2；
M选自直接键、CH2、NH、O、S；
优选地，M选自CH2、O；
X选自O、S、NH；
优选地，X选自O、S；
更优选地，X为O；
Y选自直接键、O、S、NH；
优选地，Y为直接键；
W选自直接键、O、S、NH；
优选地，W为直接键；
R为
R1、R2、R3、R4、R5中，任意一个(如R2、R3或R4)为
另一个(如R1或R5)为
剩余三个为H；
优选地，R1、R2、R3、R4、R5中，R3或R4为
R1为
剩余三个为H；
r5、r6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r5选自1、2、3；
更优选地，r5为2；
优选地，r6选自1、2、3；
更优选地，r6为1或2；
M1、M3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
优选地，M1选自直接键、NH、O；
优选地，M3选自直接键、NH；
更优选地，M1为NH、O或S时，M3为直接键，且M3为NH、O或S时，M1为直接键；
Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
优选地，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基；
Z选自O，S，BH；
优选地，Z为O；
base1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
优选地，base1选自
R’表示可逆阻断基团。
在一些具体实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N3-CH2-、CH3-CH2-S-S-CH2-、
R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余为H，
优选地，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，R1’为
其余为H，
Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
优选地，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，前述化合物选自以下表C：
表C：
在一些实施方案中，前述化合物或其盐携带额外的可检测标记。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物、结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述化合物或其盐的表位。
在一些实施方案中，所述可检测标记与式I-1所示化合物中的R或前述具体化合物中对应于R的结构部分连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与
中的末端氨基连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记中的羧基与
中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接。
在一些实施方案中，base1不同，式I-1所示化合物携带的额外的可检测标记不同。
在一些实施方案中，所述可检测标记为荧光标记。
在一些实施方案中，所述可检测标记选自以下：iF700、
在一些实施方案中，所述可检测标记选自以下：iF700、
在一些实施方案中，前述化合物选自以下表D：
表D：
在本发明的第十五方面，本发明提供了终止核酸合成的方法，其包括：将前述的化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中。
在一些实施方案中，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子的3'端。
在本发明的第十六方面，本发明提供了制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将前述的化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述化合物或其盐的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸。
在一些实施方案中，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
在本发明的第十七方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐。
在本发明的第十八方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的前述的化合物或其盐。
在本发明的第十九方面，本发明提供了测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐，以及，
2)确定掺入的核苷酸的类型。
在一些实施方案中，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是前述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是前述的化合物或其盐；
(b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
(c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
(d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
(e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是前述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是前述的化合物或其盐；
(2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(a)提供包含双链体、包含至少一种前述的化合物或其盐的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
(b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
步骤(i)：使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的所述可检测标记切除。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
在一些实施方案中，所述双链体连接于支持物上。
在一些实施方案中，所述生长的核酸链为引物。
在一些实施方案中，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体。
在一些实施方案中，所述双链体、所述化合物或其盐、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系。
在一些实施方案中，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体。
在一些实施方案中，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KODPOL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)。
在一些实施方案中，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体。
在一些实施方案中，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中接触。
在一些实施方案中，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的化合物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键。
在一些实施方案中，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相。
在一些实施方案中，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作。
在一些实施方案中，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的化合物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
在本发明的第二十方面，本发明提供了试剂盒，其包含至少一个前述的化合物或其盐。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为前述的化合物或其盐。
在一些实施方案中，所述第一化合物中，base1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
)；所述第二化合物中，base1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第三化合物中，base1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第四化合物中，base1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
)。
在一些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base1互不相同。
在一些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
在本发明的第二十一方面，本发明提供了前述的化合物或其盐或者前述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
另外，在本发明的第二十二方面，本发明还进一步提供了一种核苷酸类似物，其由核糖或脱氧核糖、可逆阻断基团、碱基或脱氮碱基或其互变异构体、用于连接可检测标记的连接子和任选的磷酸基团形成，其中，所述连接子包含如下式A或式A’所示的结构：
其中：
Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx、-S-SO2Rx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
优选地，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
更优选地，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me、-SS-Et，另一个为甲基；
最优选地，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基；
Ra选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
优选地，Ra选自H、C1-C6烷基；
更优选地，Ra为甲基；
X选自O、S、NH；
优选地，X选自O、S；
更优选地，X为O；
M1选自直接键、NH、O、S、CH2；
优选地，M1选自直接键、NH、O；
优选地，所述可逆阻断基团与所述核糖或脱氧核糖的3’-OH相连，所述碱基或脱氮碱基或其互变异构体与所述核糖或脱氧核糖的1’-C相连，所述任选的磷酸基团与所述核糖或脱氧核糖的5’-OH相连，所述连接子与所述碱基或脱氮碱基或其互变异构体相连。
在一些实施方案中，式A所示的结构如式A-1、式A-2、式A-3、式A-4或式A-5所示，优选如式A-1、式A-2或式A-5所示；或者，式A’所示的结构如式A’-1、式A’-2或式A’-3所示，优选如式A’-1所示；
其中：
Ra、Rb、Rc、X、M1的定义如前所述。
在一些实施方案中，式A所示的结构选自以下：
或者，式A’所示的结构式为
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物具有如下式B所示的结构：
Lx具有前述的式A、式A’、式A-1、式A-2、式A-3、式A-4、式A-5、式A’-1、式A’-2或式A’-3所示的结构式，且Lx的M1端或S端与Lb相连，Lx的O端与La相连；
base1表示碱基或脱氮碱基或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团；
R0表示H或磷酸基团；
La表示所述连接子中用于连接碱基或脱氮碱基或其互变异构体的部分；
Lb表示所述连接子中用于连接可检测标记的部分。
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物具有如下式B所示的结构：
其中：
Lx具有如前所述的式A、式A’、式A-1、式A-2、式A-3、式A-4、式A-5、式A’-1、式A’-2或式A’-3所示的结构式，且Lx的M1端或S端与Lb相连，Lx的O端与La相连；
La选自
优选地，La选自
或者优选地，La选自:
或者更优选地，La选自:
或者进一步优选地，La选自：
或者最优选地，La选自:
r1、r2、r3a、r3b、r4各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r1选自1、2、3；
更优选地，r1为1；
优选地，r2选自1、2、3；
更优选地，r2为1；
优选地，r3a、r3b各自独立地选自0、1、2、3、4、5，且r3a、r3b不同时为0；
更优选地，r3a、r3b各自独立地选自0、1、2、3，且r3a、r3b不同时为0；
进一步优选地，r3a选自0、1，r3b选自0、2，且r3a、r3b不同时为0；
最优选地，r3a为1；
最优选地，r3b为2；
优选地，r4选自1、2、3；
更优选地，r4为1；
M选自直接键、CH2、NH、O、S；
优选地，M选自直接键、CH2、O；
更优选地，M选自CH2、O；
Lb选自
优选地，Lb选自
更优选地，Lb选自
最优选地，Lb选自：
Lc选自直接键、
优选地，Lc中的NH端与Lb中的H相连接，Lc中的＝O端与Lb中的NH相连接；
优选地，Lc选自直接键、
优选地，Lc中的NH端与Lb中的H相连接，Lc中的＝O端与Lb中的NH相连接；
rm选自0-6之间的任意整数；
优选地，rm选自0、1、2、3；
更优选地，rm选自0、1；
r5、r6、r7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r5选自1、2、3；
更优选地，r5为2；
优选地，r6选自1、2、3；
更优选地，r6为1或2；
优选地，r7选自1、2、3；
更优选地，r7为2；
r10选自1-10之间的任意整数；
优选地，r10选自2-6之间的任意整数；
更优选地，r10为2或6；
r11选自1-6之间的任意整数；
优选地，r11选自1、2、3；
更优选地，r11为1；
M1、M2、M3各自独立地选自直接键、NH、O、S、CH2；
优选地，M1选自直接键、NH、O；
优选地，M2为NH；
优选地，M3选自直接键、NH；
base1表示碱基或脱氮碱基；
R’表示可逆阻断基团；
R0表示H或磷酸基团。
在一些实施方案中，所述base1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
优选地，base1选自
在一些实施方案中，R0选自H、单磷酸基团
二磷酸基团
三磷酸基团
四磷酸基团
优选地，R0为三磷酸基团
各Z独立地选自O，S，BH；
优选地，Z为O。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
NH2、-ONH2、-OCORz、-OCONHRz，其中，各Rz独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
优选地，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
NH2；
更优选地，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
最优选地，所述可逆阻断基团R’选自N3-CH2-、CH3-CH2-S-S-CH2-、
R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)，
优选地，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
另一个(如R3’)选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H，
更优选地，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余为H，
最优选地，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，R1’为
其余为H，
Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)，
优选地，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
更优选地，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，所述的核苷酸类似物选自前述表A、表C中的化合物。
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物携带额外的可检测标记，且所述可检测标记与连接子(优选Lb)连接；
优选地，所述核苷酸类似物携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物、结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述核苷酸类似物的表位；优选地，所述可检测标记与所述Lb的末端氨基连接；
优选地，所述可检测标记中的羧基与所述Lb的末端氨基通过形成酰胺键进行连接；
优选地，base1不同，所述核苷酸类似物携带的额外的可检测标记不同；
优选地，所述可检测标记为荧光标记；
优选地，所述可检测标记选自以下：iF700、
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物选自前述表B、表D中的化合物。
在本发明的第二十三方面，本发明提供了终止核酸合成的方法，其包括：将前述的核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子中；
优选地，所述核苷酸类似物的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子中；
优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子的3'端。
在本发明的第二十四方面，本发明提供了制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将前述的核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述核苷酸类似物的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中；
优选地，所述核苷酸类似物的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸；
优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
在本发明的第二十五方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，
所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的核苷酸类似物；
或者，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的核苷酸类似物，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的前述的核苷酸类似物。
在本发明的第二十六方面，本发明提供了测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是前述的核苷酸类似物，以及，
2)确定掺入的核苷酸的类型；
优选地，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去；
优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去；
优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是前述的核苷酸类似物，任选地其余的核苷酸是前述的核苷酸类似物；
(b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
(c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
(d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
(e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是前述的核苷酸类似物，任选地其余的核苷酸是前述的核苷酸类似物；
(2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含双链体、包含至少一种前述的核苷酸类似物的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
(b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
步骤(i)：使用聚合酶，使所述核苷酸类似物掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记切除；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
在一些实施方案中，所述双链体连接于支持物上；
优选地，所述生长的核酸链为引物；
优选地，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体；
优选地，所述双链体、所述核苷酸类似物、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系；
优选地，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述核苷酸类似物掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体；
优选地，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)；
优选地，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体；
优选地，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中接触；
优选地，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的核苷酸类似物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键；
优选地，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相；
优选地，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作；
优选地，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的核苷酸类似物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
在本发明的第二十七方面，本发明提供了试剂盒，其包含至少一个前述的核苷酸类似物；
优选地，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为前述的核苷酸类似物；
优选地，所述第一化合物中，base1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
)；所述第二化合物中，base1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第三化合物中，base1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第四化合物中，base1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
)；
优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base1互不相同；
优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
在本发明的第二十八方面，本发明提供了前述的核苷酸类似物或者前述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
附图说明
图1表示本发明实施例的碱基带有可切断(荧光)标记核苷酸类似物；
图2表示本发明实施例的3’-OH可逆阻断基团带有(荧光)标记核苷酸类似物。
具体实施方式
下面通过具体实施例详细描述本发明的实施方式，但是无论如何它们不能解释为对本发明的限制。
除非特殊说明，上述基团和取代基具有药物化学领域的普通含义。
在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-C6烷基”特别指独立公开的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本文中通篇采用的描述方式“各…独立地为/选自”和“…各自独立地为/选自”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同或不同的符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同或不同的符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
术语“脂肪族烷基”指的是任意的含有1-20个碳原子的直链或支链饱和基团，例如，C1-C12烷基，优选C1-C6烷基。
术语“C1-C6烷基”指的是任意的含有1-6个碳原子的直链或支链饱和基团，例如甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基、异丙基(iPr)、正丁基、异丁基、叔丁基(tBu)、仲丁基、正戊基、叔戊基、正己基等。
术语“烷氧基”指的是任意上述烷基(例如C1-C6烷基等)，其通过氧原子(-O-)连接到分子的其余部分。
术语“环烷基”是指具有饱和环的3-10元单环系统的烃，例如，C3-C8环烷基，优选C3-C6环烷基。
术语“C3-C6环烷基”是指具有饱和环的3-6元单环系统的烃，C3-C6环烷基可以为环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
术语“芳香族烷基”指的是芳基烷基或杂芳基烷基，其中烷基如上文所定义。
术语“杂芳基”是指芳族的杂环，通常为具有1至3个选自N、O或S的杂原子的5-、6-、7-、8-元的杂环；杂芳基环可以任选地进一步稠合或连接于芳族和非芳族的碳环和杂环。所述杂芳基的非限制性的实例为例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻噁唑基、吡咯基、苯基-吡咯基、呋喃基、苯基-呋喃基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并1,3-二氧戊环(苯并二噁茂)、异二氢吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、1,2,3-三唑基、1-苯基-1,2,3-三唑基、2,3-二氢吲哚基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3-二氢苯并噻吩基、苯并吡喃基、2,3-二氢苯并噁嗪基、2,3-二氢喹喔啉基等。
术语“芳基”指的是具有6-14个碳原子的碳环芳族体系的基团，例如C6-C10芳基，优选苯基。
从所有上述描述中，对本领域技术人员显而易见的是，其名称是复合名称的任意基团，例如“苯基C1-C6烷基”，应该指的是常规地从其衍生的部分例如从被苯基取代的C1-C6烷基来构建，其中C1-C6烷基如上文所定义。
如本文所使用，术语“式I、式I-1、式I-2、式II、式II-1、式II-2、式III所示的化合物的盐”的例子是由形成阴离子的有机酸形成的有机酸加合盐，包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-甘油磷酸盐、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；优选地，所述烷基磺酸盐为甲基磺酸盐或乙基磺酸盐；所述芳基磺酸盐为苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。也可形成合适的无机盐，包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐等。
术语“直接键”表示其两侧的基团直接相连，例如，式
中，若M3为直接键，则其结构式变成
又例如，式
中，若M3为直接键，则其结构式变成
又例如，式
中，若M3为直接键，则其结构式变成
本发明中，所述可检测标记与
中的末端氨基连接，其包含以下两种情况：1)当r8不为0时，“末端氨基”指的是该结构式最末尾的氨基；2)当r8为0时，该结构式变为
M2可以为NH，此时，可以理解的是，“末端氨基”指的是该变更后的结构式最末尾的氨基。
本发明中，所述可检测标记与
中的末端氨基连接，其中，“末端氨基”指的是该结构式最末尾的氨基。
本发明中，所述可检测标记与与所述Lb的末端氨基连接，且所述Lb例如为
时，“末端氨基”指的是该结构式最末尾的氨基。
在本发明的方法中，只要是由生长的核酸链和待测序的核酸链这两条链组成的物质，均称其为“双链体”，与生长的核酸链或待测序的核酸链的链长无关，待测序的核酸链可以比生长的核酸链的链长更长。
在本发明的方法中，待测序的核酸分子可以是任何目的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、或其任何组合。在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其类型的限制。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为DNA或RNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子可以为基因组DNA，线粒体DNA，叶绿体DNA，mRNA，cDNA，miRNA，或siRNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为线性的或者环状的。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为双链的或者单链的。例如，所述待测序的核酸分子可以为单链DNA(ssDNA)，双链DNA(dsDNA)，单链RNA(ssRNA)，双链RNA(dsRNA)，或者DNA和RNA的杂合体。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为单链DNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为双链DNA。
在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其来源的限制。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子可以获自任何来源，例如，任何细胞、组织或生物体(例如，病毒，细菌，真菌，植物和动物)。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子源自哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、啮齿类动物或犬科动物)、植物、鸟类、爬行类、鱼类、真菌、细菌或病毒。
从细胞、组织或生物体中提取或获得核酸分子的方法是本领域技术人员公知的。合适的方法包括但不限于乙醇沉淀法，氯仿抽提法等。关于此类方法的详细描述可参见例如，J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995。另外，还可使用各种商业化的试剂盒来从各种来源(例如细胞、组织或生物体)提取核酸分子。
在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其长度的限制。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的长度可以为至少10bp，至少20bp，至少30bp，至少40bp，至少50bp，至少100bp，至少200bp，至少300bp，至少400bp，至少500bp，至少1000bp，或者至少2000bp。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的长度可以为10-20bp，20-30bp，30-40bp，40-50bp，50-100bp，100-200bp，200-300bp，300-400bp，400-500bp，500-1000bp，1000-2000bp，或者超过2000bp。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子可具有10-1000bp的长度，以利于进行高通量测序。
在本发明的制备多核苷酸的方法或测序方法中，可使用合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以DNA为模板合成新的DNA链(例如DNA聚合酶)。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以RNA为模板合成新的DNA链(例如反转录酶)。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以DNA或RNA为模板合成新的RNA链(例如RNA聚合酶)。因此，在某些优选的实施方案中，所述聚合酶选自DNA聚合酶，RNA聚合酶，和反转录酶。可根据实际需要，选择合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应。在某些优选的实施方案中，所述聚合反应为聚合酶链式反应(PCR)。在某些优选的实施方案中，所述聚合反应为反转录反应。
在本发明的方法中，可以使用KOD聚合酶或其突变体进行核苷酸聚合反应。KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KODPOL391)对本发明的修饰的核苷或核苷酸具有可接受的聚合效率。KOD POL391和KODPOL171对本发明的修饰的核苷酸的具有可接受的聚合效率。在某些实施方案中，KODPOL391或KOD POL171对本发明的修饰的核苷酸的聚合效率在70％以上，例如70％-80％、80％-90％或90％-100％。
在本发明的制备多核苷酸的方法或测序方法中，核苷酸的聚合反应在适宜的条件下进行。适宜的聚合条件包括溶液相的组成以及各成分的浓度、溶液相的pH、聚合温度等。在适宜的条件下进行聚合，有利于获得可接受的、甚至高的聚合效率。
在本发明的一些实施方案中，式I、式II、式III、式B所示化合物中，脱氧核糖3'位置处的羟基(-OH)受保护(被R’所保护)，因此，它们能够终止聚合酶(例如DNA聚合酶)的聚合作用。例如，当式I、式II、式III、式B所示化合物被引入生长的核酸链的3'端时，由于该化合物的脱氧核糖的3'位置处不存在游离的羟基(-OH)，聚合酶将无法继续进行下一轮的聚合反应，从而聚合反应将被终止。在这种情况下，在每一轮的聚合反应中，将有且只有一个碱基被掺入生长的核酸链。
此外，所述式I、式II、式III、式B所示化合物的脱氧核糖3'位置处羟基(-OH)的保护基团(R’)能够被去除，并转变为游离的羟基(-OH)。随后，可使用聚合酶和式I、式II、式III、式B所示化合物对生长的核酸链进行下一轮的聚合反应，并再次引入一个碱基。
因此，所述式I、式II、式III、式B所示化合物的脱氧核糖3'位置处羟基(-OH)可以被可逆阻断：当式I、式II、式III、式B所示化合物被掺入生长的核酸链的3'端时，它们将终止聚合酶继续进行聚合作用，终止生长的核酸链的进一步延伸；并且，在式I、式II、式III、式B所示化合物所包含的阻断基团被去除后，聚合酶将能够继续对生长的核酸链进行聚合作用，继续延伸核酸链。
本文描述的某些实施方案涉及常规可检测标记的使用。可通过任何适合的方法进行检测，包括荧光光谱学或其他光学手段。优选的标记为荧光标记即荧光团，该荧光团在吸收能量后发出限定波长的辐射。已知许多种适合的荧光标记。例如，Welch等人(Chem.Eur.J.5(3):951-960,1999)公开了丹酰基-功能化的荧光部分，其可在本发明中使用。Zhu等人(Cytometry28:206-211,1997)描述了荧光标记Cy3和Cy5的使用，其也可以在本发明中使用。Prober等人(Science238:336-341,1987)、Connell等人(BioTechniques5(4):342-384,1987)、Ansorge等人(Nucl.AcidsRes.15(11):4593-4602,1987)和Smith等人(Nature321:674,1986)也公开了适合使用的标记。其他可商业购得的荧光标记包括但不限于iF700、荧光素、若丹明(包括TMR、德克萨斯红和Rox)、alexa、氟硼荧、吖啶、香豆素、芘、苯并蒽和花青苷。特别说明的是，iF700是本领域常规使用的荧光标记，例如参见US20180223358A1的Table 7，该荧光标记可以市购获得。
本申请中也可以使用多重标记，例如双荧光团FRET盒(Tet.Let.46:8867-8871,2000)、也可以使用多荧光体树枝状系统(J.Am.Chem.Soc.123:8101-8108,2001)。虽然优选荧光标记，对于本领域的普通技术人员来说其他形式的可检测标记也明显适用。例如微颗粒，包括量子点(Empodocles等人,Nature 399:126-130,1999)、金纳米颗粒(Reichert等人,Anal.Chem.72:6025-6029,2000)和微珠(Lacoste等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA 97(17):9461-9466,2000)也都可以使用。
本申请也可以使用多组分标记。多组分标记是依赖于与用于检测的另外化合物的相互作用的标记。在生物学中最常用的多组分标记是生物素-链霉亲和素系统。生物素用作与核苷酸或修饰的核苷酸相连接的标记。然后单独加入链霉亲和素使检测发生。可以使用其他多组分系统。例如，二硝基苯酚具有可商业购得的可用于检测的荧光抗体。
在本文描述的某些实施方案中，可以通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物Affimer、结蛋白Knottin)的引入使得修饰的核苷酸或核苷分子携带上文描述的可检测标记，所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述修饰的核苷酸或核苷分子的表位，具体原理详见WO2018129214A1。WO2018129214A1中的全部相关内容引入本申请中。
在本文描述的另外一些实施方案中，可以将修饰的核苷酸或核苷分子与上文描述的可检测标记相连接。在某些这类实施方案中，所用的连接基团可裂解。使用可裂解的连接基团确保了在需要时所述标记能够在检测后被除去，这避免了与随后并入的任何标记的核苷酸或核苷的任何干扰信号。
可通过任何适合的方法裂解所述连接基团，包括暴露于酸、碱、亲核试剂、亲电试剂、自由基、金属、还原剂或氧化剂、光、温度、酶等。还可以使用用于断裂碱基处的保护基的相同催化剂裂解本文中讨论的连接基团。如Greene&Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis(有机合成中的保护基),John Wiley&Sons中所公开的，合适的连接基团可修改自标准的化学保护基。Guillier等人(Chem.Rev.100:2092-2157,2000)中还公开了用于固相合成的合适的可裂解的连接基团。
使用术语“可裂解的连接基团”并非意味着需要除去整个连接基团，例如，从核苷酸或修饰的核苷酸中除去。当可检测标记与核苷酸或修饰的核苷酸相连接时，核苷裂解位点可位于连接基团上的位置，该位置能够确保在裂解后一部分的连接基团仍与所述核苷酸或修饰的核苷酸保持连接。
本领域技术人员可知，本申请中的核苷酸在Sanger法测序、第二代高通量测序(NGS测序)和第三代测序(单分子测序)中均具有效用，因为通过使用本文描述的可逆阻断核苷酸类似物可实现逐个检测测序中掺入的核苷酸类型。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。需要说明的是，以下各实施例仅列举了四种碱基中的一种碱基的核苷酸类似物的制备方法，本领域技术人员可以参照该方法，制备合成剩余三种碱基的核苷酸类似物。而且，以下各实施例化合物在最后一步与染料相连接时，可以与任意已知的染料进行连接，以下实施例各列举了一种染料，仅为示例，并非对染料选择范围的限制。另外，除非特别说明，否则各原料均可以市购获得。
一、化合物制备实施例
实施例1
linker1的合成
核苷与酸DCC缩合后，TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解后与linker1偶联，在脱去三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例2
linker2的合成
对氨基叠氮苯甲酸与三氟乙酰基保护的PEG linker缩合得到linker 2。
核苷与酸DCC缩合后，氨基脱去乙酰基，然后再DCC缩合。利用TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解脱去三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例3
linker 3的合成
合成路线与鉴定结果参见实施例7-1。
核苷与酸DCC缩合后，氨基脱去乙酰基，然后再DCC缩合。利用TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解脱去三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例4
linker 4的合成
核苷与酸DCC缩合后，利用TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解脱去三氟乙酰基，与linker 4偶联，再脱去linker中三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例5
linker 5的合成
实施例6-1
linker 6的合成
合成方法与实施例7-2类似。15mg固体，HPLC纯度＞99％。MS[ES(-)],m/z1861.4.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.27(s,1H),8.63-8.58(m,1H),8.36(t,J＝13.1Hz,2H),8.09(d,J＝6.3Hz,1H),8.00(s,1H),7.92-7.88(m,2H),7.84(d,J＝4.5Hz,1H),7.81(s,2H),7.78(d,J＝8.6Hz,1H),7.71–7.67(m,1H),7.65-7.62(m,4H),7.49–7.43(m,1H),7.31(dd,J＝8.3,3.1Hz,2H),6.67–6.54(m,2H),6.31(dd,J＝13.8,5.3Hz,2H),5.68(s,1H),5.30(q,J＝6.9Hz,1H),5.26–5.17(m,1H),4.34(dt,J＝22.7,3.7Hz,1H),4.22(t,J＝4.8Hz,2H),4.13(s,2H),4.11(d,J＝5.0Hz,2H),4.08–4.00(m,2H),3.67-3.65(m,1H),3.59–3.56(m,2H),3.22–3.15(m,2H),2.21(t,J＝6.6Hz,2H),2.11(d,J＝2.3Hz,4H),2.09–2.04(m,4H),1.66(s,3H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.52(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.37–1.29(m,2H),1.26(t,J＝7.1Hz,4H).
实施例6-2
linker的合成
linker 6的合成方法同实施例6-1。
合成方法与实施例7-1类似，16mg固体，HPLC纯度＞99％。MS[ES(-)],m/z1809.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.16(s,1H),8.95(d,J＝8.2Hz,1H),8.85(t,J＝5.5Hz,1H),8.80(s,2H),8.23(d,J＝8.2Hz,1H),8.14(d,J＝8.4Hz,2H),7.99(d,J＝1.7Hz,1H),7.86(d,J＝7.6Hz,1H),7.82(d,J＝8.5Hz,1H),7.69(dd,J＝8.7,1.6Hz,1H),7.62(d,J＝3.5Hz,2H),7.52(d,J＝7.9Hz,2H),7.45–7.37(m,1H),6.72(s,2H),6.30–6.20(m,1H),5.57-5.54(m,1H),5.31(q,J＝6.9Hz,1H),5.22–5.13(m,1H),4.36(d,J＝20.9Hz,1H),4.24–4.19(m,2H),4.14(s,2H),4.08(d,J＝4.0Hz,1H),4.06–4.00(m,2H),3.80(dd,J＝13.1,6.8Hz,2H),3.73–3.69(m,2H),3.67(dd,J＝7.0,4.1Hz,2H),3.63(d,J＝5.6Hz,2H),2.22(t,J＝7.0Hz,2H),2.13(s,3H),2.07(t,J＝7.8Hz,5H),1.73–1.66(m,2H),1.65(d,J＝6.9Hz,3H),1.60(d,J＝7.0Hz,3H),1.17(d,J＝6.7Hz,12H),1.00(d,J＝2.0Hz,6H).
实施例7-1
(1)步骤1
linker 7的合成
PEG-CF3底物(OKeanos Tech，货号OK20A409)1g溶解在DMF中，加入TSTU(2eq)与N,N二异丙基乙胺(3eq)，反应在室温搅拌2h后，加入苯胺底物(OKeanos Tech，货号OK20A408)(1.2eq)。反应4h后，加入水淬灭反应。利用二氯甲烷萃取，浓缩干燥后利用柱分离提纯得到无色油状化合物。MS[ES(-)],m/z 484.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.92(s,1H),9.98(s,1H),9.53(t,J＝5.2Hz,1H),7.88(d,J＝2.0Hz,1H),7.81(d,J＝8.4Hz,1H),7.69(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),5.48(q,J＝6.8Hz,1H),4.11(s,2H),3.68–3.66(m,2H),3.62–3.60(m,2H),3.55(t,J＝5.6Hz,2H),3.37(q,J＝5.6Hz,2H),2.15(s,3H),1.60(d,J＝6.8Hz,3H).
(2)步骤2
将步骤1获得的底物100mg溶解在3mL的DMF中，加入DCC(1.2eq)与DMAP(10％mol)，反应搅拌30分钟后，加入羟基酸底物(毕得医药，货号BD628858)(2eq)。反应搅拌12小时后，直接利用制备HPLC进行分离(C18反相柱，250*30mm，)得到白色固体(linker 7)85mg。MS[ES(-)],m/z 585.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.06(s,1H),9.53(t,J＝5.2Hz,1H),7.92(d,J＝2.0Hz,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),5.31(q,J＝6.8Hz,1H),4.40–4.30(m,3H),4.11(s,2H),3.88(s,2H),3.78(t,J＝4.8Hz,2H),3.68–3.66(m,2H),3.62–3.60(m,2H),3.55(t,J＝5.6Hz,2H),3.37(q,J＝5.6Hz,2H),2.13(s,3H),1.61(d,J＝6.8Hz,3H).
(3)步骤3
碘代U核苷底物(OKeanos Tech，货号OK-N-16001)1g溶解于DMF中，加入Pd(PPh3)4(10mol％)，CuI(15mol％)，三乙胺(3eq)与底物炔丙胺(OKeanos Tech，货号OK20A410)(1.5eq)在60度条件下反应12h。加入水淬灭反应，DCM萃取。浓缩后柱分离得到白色固体产品1.1g。MS[ES(-)],m/z 491.1.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.67(s,1H),10.00(t,J＝5.5Hz,1H),7.94(s,1H),6.12(dd,J＝7.6,5.9Hz,1H),5.28(d,J＝4.1Hz,1H),4.26-4.12(m,3H),3.88(q,J＝2.8Hz,1H),3.81(dd,J＝11.5,2.6Hz,1H),3.73(dd,J＝11.5,3.1Hz,1H),2.17(ddd,J＝13.2,6.0,2.8Hz,1H),2.05(ddd,J＝13.3,7.7,5.8Hz,1H),0.87(s,9H),0.08(d,J＝1.8Hz,6H).
(4)步骤4
将步骤3获得的底物核苷300mg溶解在10mL的DMF中，加入DCC(1.2eq)与DMAP(10％mol)，反应搅拌30分钟后，加入二硫羧酸底物(OKeanos Tech，货号OK20A420)(1.5eq)。反应搅拌12小时后，直接柱分离得到白色固体359mg。MS[ES(-)],m/z 700.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.74(s,1H),10.03(t,J＝5.5Hz,1H),7.98(s,1H),7.90–7.82(m,1H),7.68–7.58(m,2H),7.47-7.40(m,1H),6.23-6.18(m,1H),5.45-5.42(m,1H),5.20-5.12(m,1H),4.38–4.16(m,3H),3.98–3.87(m,2H),2.60-2.53(m,1H),2.40-2.31(m,1H),2.06(d,J＝0.6Hz,3H),1.65(dd,J＝7.0,1.0Hz,3H),0.90(s,9H),0.13(d,J＝1.2Hz,6H).
(5)步骤5
将步骤4获得的底物核苷300mg溶解在10mL的THF中，在0度下加入TBAF(2eq,1MinTHF)，反应在0度搅拌30分钟后，升至室温搅拌4小时。反应直接柱分离得到白色固体200mg。MS[ES(-)],m/z 587.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.68(d,J＝3.2Hz,1H),10.06(t,J＝5.6Hz,1H),8.23(d,J＝3.2Hz,1H),7.88–7.78(m,1H),7.66–7.56(m,2H),7.43–7.39(m,1H),6.25–6.13(m,1H),5.48–5.45(m,1H),5.31(t,J＝5.2Hz,1H),5.18–5.12(m,1H),4.28–4.16(m,3H),3.76–3.67(m,2H),2.50–2.40(m,2H),2.04(d,J＝9.2Hz,3H),1.68–1.59(m,3H).
(6)步骤6
将步骤5获得的底物核苷200mg溶解在5mL的磷酸三甲酯中，在0度下加入三氯氧磷(1.5eq)，反应在0度搅拌120分钟后，将反应液加入到三丁基焦磷酸铵(2eq)的DMF(5mL)溶液中，反应在0度继续搅拌3h后，加入0.1M TEAB缓冲液淬灭。反应利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离，浓缩后直接加入浓氨水3mL，反应2h后利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离得到白色固体120mg。MS[ES(-)],m/z 745.5.1HNMR(400MHz,D2O)δ8.51(s,1H),7.90(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),7.73(d,J＝7.8Hz,1H),7.67(td,J＝7.6,1.4Hz,1H),7.48(t,J＝7.5Hz,1H),6.45(td,J＝9.2,5.7Hz,1H),5.75(t,J＝4.7Hz,1H),5.15–5.07(m,1H),4.72–4.64(m,1H),4.39(d,J＝3.3Hz,2H),4.07(s,2H),2.82-2.76(m,1H),2.64–2.54(m,1H),2.02(d,J＝6.4Hz,3H),1.73(dd,J＝7.1,2.2Hz,3H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ-9.79(dd,J＝20.3,9.6Hz,1P),-11.68(d,J＝19.2Hz,1P),-22.82(td,J＝19.2,6.1Hz,1P).
(7)步骤7
将步骤2获得的linker 7底物20mg溶解在1mL的DMF中，加入TSTU(1.5eq)与二异丙基乙基胺(3eq)，反应在室温搅拌120分钟后，加入步骤6获得的核苷酸底物(2eq)，反应在室温继续搅拌3h后，加入0.1M TEAB缓冲液淬灭。反应利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1MTEAB-乙腈)分离，浓缩后直接加入浓氨水3mL，反应2h后利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离得到白色固体15mg。MS[ES(-)],m/z 1201.7.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.91(s,1H),8.96–8.84(m,1H),8.28(d,J＝2.0Hz,1H),8.18(d,J＝11.6Hz,1H),7.92(dd,J＝8.6,1.5Hz,1H),7.86(d,J＝7.1Hz,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.63–7.57(m,2H),7.46–7.38(m,1H),6.21(ddd,J＝14.8,8.4,6.2Hz,1H),5.57(s,1H),5.35(q,J＝6.8Hz,1H),5.21-5.13(m,1H),4.39(d,J＝12.5Hz,2H),4.32(s,2H),4.22(s,2H),4.14(d,J＝6.3Hz,2H),4.09(d,J＝3.7Hz,2H),4.05(s,2H),3.82–3.79(m,4H),3.68–3.64(m,2H),3.63–3.59(m,2H),2.99–2.93(m,2H),2.60-2.52(m,1H),2.47–2.36(m,1H),2.15(s,3H),2.05(d,J＝21.1Hz,3H),1.64(d,J＝7.0Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
(8)步骤8
将染料(北京澄道科技有限公司，货号CD0014)10mg溶解在0.5mL的DMF中，加入TNTU(1.5eq)与二异丙基乙基胺(3eq)，反应在室温搅拌120分钟后，加入步骤7获得的核苷酸底物(2eq)，反应在室温继续搅拌3h后，加入0.1M TEAB缓冲液淬灭。反应利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离得到红色固体8mg。HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1938.7.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.39(brs,1H),9.15–9.10(m,1H),8.28(d,J＝8.8Hz,1H),8.03–8.00(m,1H),7.88–7.79(m,3H),7.76–7.67(m,3H),7.66–7.60(m,3H),7.58–7.39(m,3H),6.99(s,2H),6.80(s,2H),6.27–6.20(m,1H),5.59(d,J＝5.6Hz,1H),5.34–5.29(m,1H),5.18(p,J＝6.8Hz,1H),4.44–4.29(m,4H),4.14–4.04(m,9H),3.81(t,J＝4.8Hz,2H),3.77–3.61(m,7H),3.59–3.51(m,6H),3.40(t,J＝6.0Hz,2H),3.19–3.14(m,2H),3.11(t,J＝7.6Hz,2H),2.69–2.65(d,J＝6.5Hz,4H),2.59–2.55(m,5H),2.46–2.35(m,1H),2.14(d,J＝3.5Hz,3H),2.08(s,1H),2.04(s,1H),2.00–1.91(m,4H),1.87–1.80(m,4H),1.70(t,J＝7.6Hz,2H),1.65(d,J＝7.2Hz,3H),1.60(d,J＝6.8Hz,3H).31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-11.24(d,J＝22.7Hz,1P),-12.05(d,J＝22.9Hz,1P),-23.63(t,J＝22.7Hz,1P).
实施例7-2
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例7-1类似，使用碘代A核苷底物(OKeanos Tech，货号OK-N-16003)替代碘代U核苷底物。MS[ES(-)],m/z 513.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.04(t,J＝5.5Hz,1H),8.09(s,1H),7.67(s,1H),6.85(s,2H),6.47(t,J＝6.7Hz,1H),5.29(d,J＝4.2Hz,1H),4.33–4.29(m,1H),4.27(d,J＝5.4Hz,2H),3.81(q,J＝3.9Hz,1H),3.75(dd,J＝11.1,4.1Hz,1H),3.67(dd,J＝11.1,4.1Hz,1H),2.43–2.36(m,1H),2.24–2.18(m,1H),0.85(s,9H),0.03(d,J＝1.8Hz,6H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 723.1.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H),8.10(d,J＝4.4Hz,1H),7.91–7.83(m,1H),7.74(d,J＝3.6Hz,1H),7.65–7.56(m,2H),7.46–7.40(m,1H),6.84(brs,2H),6.64–6.48(m,1H),5.58–5.52(m,1H),5.24–5.10(m,1H),4.37–4.15(m,3H),3.95–3.74(m,2H),2.84–2.75(m,1H),2.70–2.54(m,1H),2.06(d,J＝1.2Hz,3H),1.64(d,J＝7.0Hz,3H),1.28–1.17(m,1H),0.87(s,9H),0.07(dd,J＝4.8,2.7Hz,6H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 609.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.10(t,J＝5.2Hz,1H),8.12(d,J＝4.8Hz,1H),7.90(dd,J＝7.4,5.0Hz,1H),7.85(s,1H),7.66–7.61(m,2H),7.48–7.43(m,1H),6.82(brs,2H),6.60–6.51(m,1H),5.59(d,J＝4.4Hz,1H),5.36(td,J＝5.5,1.5Hz,1H),5.21(qd,J＝7.0,4.1Hz,1H),4.32(d,J＝5.3Hz,2H),4.26–4.20(m,1H),3.75–3.64(m,2H),2.90–2.77(m,1H),2.65–2.51(m,1H),2.09(d,J＝8.6Hz,3H),1.67(d，J＝7.0Hz，3H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 753.0.1H NMR(400MHz,D2O)δ8.04(d,J＝7.1Hz,1H),7.95–7.83(m,2H),7.72–7.56(m,2H),7.49–7.44(m,1H),6.70–6.48(m,1H),5.71(dd,J＝17.3,4.9Hz,1H),5.12–5.00(m,1H),4.62(d,J＝10.7Hz,1H),4.41–4.21(m,2H),4.18(d,J＝8.9Hz,2H),2.78–2.31(m,2H),2.03–1.83(m,3H),1.70(dd,J＝10.3,7.1Hz,3H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ-7.18(dd,J＝20.1,13.4Hz,1P),-11.24(d,J＝19.0Hz,1P),-22.25(td,J＝19.6,11.0Hz,1P).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 1225.1.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.18(d,J＝6.1Hz,1H),8.37(t,J＝5.4Hz,1H),8.21(dd,J＝7.4,1.7Hz,1H),8.09(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,1H),7.69–7.58(m,3H),7.47–7.40(m,1H),7.29(s,1H),6.40(s,2H),6.30(dd,J＝9.4,5.7Hz,1H),5.66(s,1H),5.35(q,J＝6.9Hz,1H),5.20(q,J＝6.9Hz,1H),4.41(d,J＝12.9Hz,1H),4.34(dd,J＝8.4,4.2Hz,1H),4.30(s,2H),4.13–4.08(m,2H),4.06-4.03(m,2H),4.01(s,2H),3.83–3.80(m,2H),3.67(d,J＝2.8Hz,2H),3.63-3.61(m,6H),2.98–2.93(m,2H),2.60-2.52(m,1H),2.47–2.36(m,1H),2.13(s,3H),2.07(s,3H),1.64(d,J＝7.0Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
合成方法与实施例7-1类似，将染料替换为AF532(购自OKeanos Tech，货号OK F532)。13mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1833.0.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.43(t,J＝4.8Hz,1H),8.91(t,J＝5.6Hz,1H),8.80(s,2H),8.50(t,J＝5.6Hz,1H),8.15(d,J＝8.8Hz,2H),8.07(d,J＝6.4Hz,1H),8.03(s,1H),7.90(dd,J＝7.6,2.4Hz,1H),7.84–7.79(m,2H),7.69(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝4.4Hz,2H),7.49–7.42(m,3H),6.70(s,2H),6.65–6.58(m,1H),5.69(d,J＝2.8Hz,1H),5.33–5.27(m,1H),5.21(qd,J＝7.2,2.0Hz,1H),4.45–4.34(m,3H),4.32–4.30(m,1H),4.18(s,2H),4.14(d,J＝5.6Hz,3H),4.01(s,3H),3.81–3.77(m,7H),3.73–3.69(m,4H),3.68–3.63(m,7H),3.52(q,J＝5.6Hz,4H),2.12(d,J＝2.4Hz,3H),2.10(s,1H),2.05(s,1H),1.65(d,J＝6.8Hz,3H),1.59(d,J＝7.2Hz,3H),0.99(d,J＝2.8Hz,5H).31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-10.99(d,J＝20.6Hz,1P),-12.48(d,J＝24.0Hz,1P),-23.41(t,J＝22.5Hz,1P).
实施例7-3
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例7-1类似，使用碘代G核苷底物(OKeanos Tech，货号OK-N-16004)替代碘代U核苷底物。MS[ES(-)],m/z 529.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.48(s,1H),9.98(t,J＝5.6Hz,1H),7.21(s,1H),6.38–6.21(m,3H),5.23(d,J＝3.8Hz,1H),4.26(s,1H),4.18(d,J＝5.6Hz,2H),3.78(q,J＝4.0Hz,1H),3.73–3.60(m,2H),2.32–2.19(m,1H),2.13–2.08(m,1H),2.04(s,1H),0.85(s,9H),0.03(d,J＝1.8Hz,6H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 739.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),10.00(t,J＝5.6Hz,1H),7.83(dd,J＝7.5,3.6Hz,1H),7.61–7.58(m,2H),7.48–7.39(m,1H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),6.42–6.25(m,3H),5.72(s,1H),5.58–5.46(m,1H),5.16(p,J＝7.2Hz,1H),4.25–4.14(m,3H),3.82(t,J＝3.6Hz,2H),2.71–2.60(m,1H),2.50–2.45(m,1H),2.07(s,3H),1.75–1.55(m,4H),1.29–0.96(m,2H),0.88(s,9H),0.13–0.02(m,6H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 625.7.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),10.00(t,J＝5.6Hz,1H),7.83(dd,J＝7.5,3.6Hz,1H),7.61–7.58(m,2H),7.48–7.39(m,1H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),6.42–6.25(m,3H),5.72(s,1H),5.58–5.46(m,1H),5.16(p,J＝7.2Hz,1H),4.25–4.14(m,3H),3.82(t,J＝3.6Hz,2H),2.71–2.60(m,1H),2.50–2.45(m,1H),2.07(s,3H),1.75–1.55(m,4H),1.29–0.96(m,2H),0.88(s,9H),0.13–0.02(m,6H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 769.2.1H NMR(400MHz,D2O)δ7.81–7.74(m,1H),7.51–7.40(m,3H),7.31(q,J＝6.9Hz,1H),6.38–6.19(m,1H),5.65(dd,J＝11.2,5.2Hz,1H),5.07–4.96(m,1H),4.53(d,J＝20.8Hz,1H),4.35–4.18(m,2H),4.10(s,2H),2.87–2.70(m,1H),2.54–2.40(m,1H),1.97–1.76(m,3H),1.59–1.54(m,3H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ-9.27(d,J＝19.6Hz,1P),-11.36(d,J＝18.5Hz,1P),-22.79(td,J＝19.2,4.7Hz,1P).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 1241.6.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.25(s,1H),8.29(d,J＝7.7Hz,2H),7.87(d,J＝7.0Hz,2H),7.69–7.58(m,3H),7.47–7.40(m,1H),7.29(s,1H),6.40(s,2H),6.30(dd,J＝9.4,5.7Hz,1H),5.66(s,1H),5.35(q,J＝6.9Hz,1H),5.20(q,J＝6.9Hz,1H),4.41(d,J＝12.9Hz,1H),4.34(dd,J＝8.4,4.2Hz,1H),4.30(s,2H),4.13–4.08(m,2H),4.06-4.03(m,2H),4.01(s,2H),3.83–3.80(m,2H),3.67(d,J＝2.8Hz,2H),3.63-3.61(m,6H),2.98–2.93(m,2H),2.47–2.42(m,1H),2.41–2.30(m,1H),2.13
(s,3H),2.07(s,3H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H),1.62(d,J＝6.9Hz,3H).
合成方法与实施例7-1类似，将染料替换为CY5(购自OKeanos Tech，货号OK-F-13103)。18mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1878.9.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.66(brs,1H),10.43(s,1H),8.43–8.32(m,2H),8.03(s,1H),7.92–7.82(m,2H),7.82(d,J＝1.6Hz,2H),7.72(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),7.66–7.60(m,3H),7.46–7.42(m,1H),7.31(dd,J＝8.0,3.6Hz,2H),6.59(t,J＝12.4Hz,1H),6.58–6.47(m,1H),6.35–6.27(m,2H),5.66(t,J＝5.2Hz,1H),5.31(q,J＝7.2Hz,1H),5.20(q,J＝7.2Hz,1H),4.45–4.34(m,2H),4.31(t,J＝5.2Hz,1H),4.25(t,J＝5.2Hz,1H),4.14(s,2H),4.12–4.05(m,5H),4.00(s,2H),3.81(t,J＝4.4Hz,2H),3.66–3.64(m,2H),3.58–3.55(m,2H),3.41(t,J＝5.6Hz,2H),3.19(q,J＝5.6Hz,2H),2.13(d,J＝3.6Hz,3H),2.08–2.05(m,2H),1.68(s,9H),1.65(d,J＝7.2Hz,2H),1.61(d,J＝7.2Hz,2H),1.56–1.49(m,2H),1.35–1.30(m,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H).31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-11.33(d,J＝22.6Hz,1P),-11.92(d,J＝22.8Hz,1P),-23.68(t,J＝22.6Hz,1P).
实施例7-4
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例7-1类似，使用碘代C核苷底物(OKeanos Tech，货号OK-N-16002)替代碘代U核苷底物。MS[ES(-)],m/z 678.1.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.97(s,1H),7.94–7.79(m,2H),7.65–7.54(m,2H),7.46–7.33(m,1H),6.68(s,1H),6.18–6.14(m,1H),5.40(d,J＝6.1Hz,1H),5.16(qd,J＝7.0,2.1Hz,1H),4.35–4.24(m,1H),3.97–3.85(m,2H),2.55–2.47(m,1H),2.24–2.16(m,1H),2.04(d,J＝3.2Hz,3H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H),0.89(s,9H),0.12(s,6H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 700.4.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.93(t,J＝5.2Hz,1H),7.99(s,1H),7.91(s,1H),7.85(d,J＝7.6Hz,1H),7.62(d,J＝5.3Hz,2H),7.47–7.40(m,1H),6.97(s,1H),6.25–6.20(m,1H),5.42(d,J＝5.9Hz,1H),5.17(qd,J＝7.0,2.2Hz,1H),4.36–4.29(m,1H),4.27(d,J＝5.2Hz,2H),3.95–3.87(m,2H),2.65–2.52(m,1H),2.27–2.17(m,1H),2.06(d,J＝2.8Hz,3H),1.65(d,J＝7.0Hz,3H),0.88(s,9H),0.11(d,J＝0.8Hz,6H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 580.5.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.94(s,1H),8.18(s,1H),7.89(s,1H),7.82(d,J＝7.6Hz,1H),7.61(q,J＝4.1,3.0Hz,2H),7.41(t,J＝8.1Hz,1H),6.91(s,1H),6.26–6.17(m,1H),5.45(d,J＝6.0Hz,1H),5.28(t,J＝5.2Hz,1H),5.15(qd,J＝7.0,3.6Hz,1H),4.35–4.16(m,3H),3.70(dt,J＝5.6,3.3Hz,2H),2.54–2.44(m,1H),2.33–2.26(m,1H),2.04(d,J＝5.7Hz,3H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 745.3.1H NMR(400MHz,D2O)δ8.51(s,1H),7.91(d,J＝7.7Hz,1H),7.74(d,J＝7.9Hz,1H),7.68(t,J＝7.7Hz,1H),7.48(t,J＝7.5Hz,1H),6.47-6.42(m,1H),5.73(d,J＝5.6Hz,1H),5.18–5.06(m,1H),4.71(d,J＝9.0Hz,1H),4.39(q,J＝12.5Hz,2H),4.09(d,J＝1.6Hz,2H),2.83-2.79(m,1H),2.58-2.50(m,1H),2.03(dd,J＝3.0,1.5Hz,3H),1.74(d,J＝7.0Hz,3H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ-9.99(d,J＝19.4Hz,1P),-11.68(d,J＝19.1Hz,1P),-22.93(t,J＝19.4Hz,1P).
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 1201.6.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.99(s,1H),8.75(d,J＝7.2Hz,1H),8.23(s,1H),8.07(d,J＝7.3Hz,1H),7.87-7.84(m,3H),7.70–7.58(m,3H),7.47–7.37(m,1H),6.95(s,1H),6.23(dd,J＝16.7,8.2Hz,1H),5.55(s,1H),5.33(q,J＝6.8Hz,1H),5.21-5.14(m,1H),4.44–4.36(m,2H),4.32(dd,J＝7.8,4.1Hz,2H),4.24(s,2H),4.13(d,J＝3.3Hz,4H),4.04(s,2H),3.82(s,2H),3.68–3.55(m,6H),2.97(s,2H),2.46–2.34(m,2H),2.13(d,J＝2.1Hz,3H),2.05(d,J＝16.9Hz,3H),1.64(d,J＝6.7Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
合成方法与实施例7-1类似，其中，将染料替换为iF700商品(iFluorTM700succinimidyl ester，购自AAT Bioquest)。16mg固体，HPLC纯度＞99％。MS[ES(-)],m/z 1962.8.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.30(s,1H),8.91–8.84(m,1H),8.80–8.74(m,1H),8.41–8.35(m,3H),8.25(t,J＝13.2Hz,1H),8.13(d,J＝6.4Hz,1H),7.99(s,1H),7.90–7.78(m,4H),7.71(d,J＝8.8Hz,1H),7.65–7.60(m,2H),7.53(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.48–7.37(m,3H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),6.65(d,J＝8.0z,2H),6.54(t,J＝12.6Hz,1H),6.38(d,J＝13.6Hz,1H),6.28–6.22(m,1H),6.08(d,J＝13.6Hz,1H),5.55(s,1H),5.31(q,J＝6.8Hz,1H),5.18(p,J＝7.2Hz,1H),4.64(s,2H),4.44–4.30(m,4H),4.14–4.04(m,8H),3.82(t,J＝4.4Hz,2H),3.68–3.63(m,3H),3.60–3.43(m,8H),3.39–3.31(m,4H),3.17(s,3H),2.56(t,J＝7.2Hz,2H),2.46–2.41(m,1H),2.31–2.25(m,2H),2.12(s,2H),2.08(s,1H),2.04(s,1H),1.80(s,2H),1.65(d,J＝6.8Hz,2H),1.60(d,J＝7.2Hz,2H),1.47(s,5H).31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-11.13(d,
J＝22.3Hz,1P),-11.90(d,J＝22.6Hz,1P),-23.56(t,J＝22.3Hz,1P).
实施例8
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例7-1类似。15mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1968.4.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.31(d,J＝18.9Hz,1H),9.00(s,1H),8.23(d,J＝8.9Hz,1H),8.05–7.88(m,3H),7.87–7.77(m,2H),7.72-7.67(m,3H),7.63(dd,J＝5.2,3.6Hz,1H),7.57–7.43(m,1H),7.09(s,1H),6.99(s,3H),6.79(d,J＝5.3Hz,2H),6.27-6.20(m,1H),5.51(s,1H),5.34–5.28(m,2H),4.44–4.36(m,2H),4.32(d,J＝16.2Hz,2H),4.13(s,2H),4.09(s,2H),4.03(s,2H),3.84(s,3H),3.82–3.79(m,2H),3.67–3.64(m,2H),3.42–3.38(m,2H),3.19–3.14(m,2H),3.13–3.08(m,2H),2.89(d,J＝3.8Hz,2H),2.70–2.64(m,4H),2.59–2.53(m,6H),2.13(s,5H),2.08(d,J＝11.3Hz,2H),1.97(dt,J＝10.7,7.0Hz,5H),1.83(dt,J＝12.2,6.0Hz,4H),1.71(t,J＝7.2Hz,2H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.23(s,3H).
实施例9
linker的合成
linker 8的合成方法同实施例7-1。MS[ES(-)],m/z 548.2.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.08(s,1H),9.51(s,1H),7.94(d,J＝2.0Hz,1H),7.86(d,J＝8.6Hz,1H),7.77(dd,J＝8.6,2.0Hz,1H),5.70(q,J＝6.6Hz,1H),4.41–4.32(m,2H),4.12(s,2H),3.96(s,2H),3.79(t,J＝4.6Hz,2H),3.67(dd,J＝5.7,3.2Hz,2H),3.61(dd,J＝5.7,3.1Hz,2H),3.55(t,J＝5.7Hz,2H),3.37(dd,J＝11.3,5.6Hz,2H),2.07(s,1H),1.44(d,J＝6.7Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1203.2.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.18(s,1H),8.28(d,J＝6.3Hz,2H),7.92(d,J＝8.5Hz,1H),7.87(d,J＝7.7Hz,1H),7.69(d,J＝7.1Hz,1H),7.65–7.58(m,2H),7.43(t,J＝5.3Hz,1H),7.27(d,J＝4.3Hz,1H),6.47–6.32(m,2H),6.32–6.24(m,1H),5.70(q,J＝6.5Hz,1H),5.63(s,1H),5.22-5.18(m,1H),4.41-4.37(m,2H),4.32(t,J＝4.9Hz,1H),4.28(s,2H),4.26(s,1H),4.11(d,J＝5.9Hz,2H),4.04(s,2H),4.01(s,2H),3.82(s,2H),3.66(d,J＝13.7Hz,2H),3.63–3.59(m,4H),2.97(s,2H),2.10(d,J＝32.7Hz,3H),1.65(d,J＝6.9Hz,3H),1.44(d,J＝6.6Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。20mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1842.4.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.55(s,1H),10.38(s,1H),8.42(s,1H),8.35(t,J＝13.1Hz,2H),8.03(s,1H),7.88(dd,J＝10.9,6.8Hz,3H),7.81(s,2H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.68–7.58(m,4H),7.47–7.40(m,1H),7.35–7.25(m,3H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.40(s,2H),6.30(dd,J＝13.7,7.2Hz,3H),5.69(q,J＝6.6Hz,1H),5.63(s,1H),5.20(q,J＝6.8Hz,1H),4.44-4.36(m,2H),4.32(t,J＝4.7Hz,1H),4.25(t,J＝4.4Hz,1H),4.16–4.09(m,6H),4.06(s,2H),4.00(s,2H),3.84–3.79(m,2H),3.65(dd,J＝5.4,3.5Hz,2H),3.59–3.55(m,2H),3.43–3.39(m,2H),3.19(dd,J＝11.5,5.8Hz,2H),2.45(dd,J＝11.6,6.5Hz,1H),2.38(dd,J＝13.6,5.4Hz,1H),2.10(d,J＝29.1Hz,3H),2.04(dd,J＝12.6,6.9Hz,2H),1.68(s,12H),1.65(d,J＝7.0Hz,3H),1.56–1.49(m,2H),1.43(d,J＝6.6Hz,3H),1.32(dd,J＝14.2,7.8Hz,2H),1.26(d,J＝7.0Hz,3H),1.23(s,2H).
实施例10-1
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 1047.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.06(s,1H),8.81(d,J＝5.8Hz,1H),8.32(s,1H),8.04(s,1H),7.92(d,J＝8.6Hz,1H),7.65(d,J＝8.7Hz,1H),6.10(t,J＝7.0Hz,1H),5.36(q,J＝6.9Hz,1H),4.92(d,J＝8.9Hz,1H),4.81(d,J＝8.9Hz,1H),4.49–4.43(m,1H),4.41–4.35(m,1H),4.33–4.26(m,1H),4.24(s,2H),4.10(dd,J＝10.1,3.4Hz,2H),4.04(s,2H),4.00(dd,J＝11.0,5.5Hz,2H),3.83–3.78(m,2H),3.66(d,J＝4.8Hz,2H),3.64–3.57(m,6H),2.99–2.91(m,2H),2.37-2.27(m,2H),2.15(d,J＝1.1Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
合成方法与实施例7-1类似。16mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1783.4.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.39(d,J＝18.2Hz,1H),9.00(t,J＝5.0Hz,1H),8.13(s,1H),8.03–7.98(m,1H),7.82(d,J＝8.6Hz,2H),7.75–7.66(m,3H),7.66–7.60(m,1H),7.58–7.41(m,1H),6.99(s,2H),6.79(d,J＝5.6Hz,2H),6.11(t,J＝6.9Hz,1H),5.30(q,J＝6.9Hz,1H),4.91(d,J＝8.9Hz,1H),4.83(d,J＝8.9Hz,1H),4.49–4.45(m,1H),4.44–4.32(m,2H),4.14(s,2H),4.11–4.07(m,2H),4.03(s,4H),3.81(t,J＝4.4Hz,2H),3.70(d,J＝7.8Hz,2H),3.68–3.63(m,2H),3.56(dd,J＝9.5,5.3Hz,6H),3.40(t,J＝5.9Hz,2H),3.20–3.14(m,2H),3.13–3.06(m,2H),2.67(s,3H),2.58(t,J＝7.1Hz,4H),2.40–2.26(m,2H),2.13(s,3H),2.02–1.91(m,4H),1.84(d,J＝5.0Hz,4H),1.70(t,J＝7.2Hz,1H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.28–1.16(m,3H),1.01–0.92(m,1H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-11.29(d,J＝23.1Hz),-12.09(d,J＝23.0Hz),-23.70(t,J＝22.7Hz).
实施例10-2
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例7-2类似。MS[ES(-)],m/z 1069.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.18(d,J＝6.1Hz,1H),8.37(t,J＝5.4Hz,1H),8.21(dd,J＝7.4,1.7Hz,1H),8.09(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,1H),7.74(d,J＝2.4Hz,1H),7.68–7.60(m,1H),6.50(dd,J＝8.5,6.1Hz,1H),5.31(q,J＝6.9Hz,1H),4.93(d,J＝8.9Hz,1H),4.87(d,J＝8.9Hz,1H),4.60(d,J＝4.3Hz,1H),4.43–4.32(m,2H),4.29(s,2H),4.16–4.09(m,4H),4.01(s,2H),3.98–3.93(m,2H),3.83–3.79(m,2H),3.67(d,J＝3.0Hz,2H),3.62(d,J＝7.5Hz,4H),2.95(t,J＝4.9Hz,2H),2.69–2.62(m,1H),2.39(dd,J＝13.0,6.0Hz,1H),2.11(d,J＝5.6Hz,3H),1.59(d,J＝6.8Hz,3H).
合成方法与实施例7-2类似。18mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1678.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.52(d,J＝4.9Hz,1H),8.94(t,J＝5.0Hz,1H),8.80(s,2H),8.48(t,J＝5.3Hz,1H),8.16(d,J＝8.4Hz,2H),8.08(s,1H),8.04(s,1H),7.82–7.74(m,2H),7.70(d,J＝8.5Hz,1H),7.49(d,J＝7.9Hz,2H),6.71(s,2H),6.49(dd,J＝8.7,5.9Hz,1H),5.29(q,J＝7.0Hz,1H),4.92(d,J＝8.9Hz,1H),4.87(d,J＝8.9Hz,1H),4.60(d,J＝4.8Hz,1H),4.44–4.34(m,2H),4.19(s,2H),4.13(d,J＝5.4Hz,2H),4.00(s,2H),3.97–3.92(m,2H),3.82–3.77(m,4H),3.74–3.70(m,2H),3.68-3.63(m,4H),3.53(dd,J＝10.6,5.0Hz,2H),2.68–2.63(m,1H),2.39(dd,J＝13.1,6.1Hz,1H),2.12(d,J＝1.4Hz,3H),1.58(d,J＝6.9Hz,3H),1.16(d,J＝6.5Hz,6H),1.13(s,6H),0.99(d,J＝2.0Hz,6H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-11.12(d,J＝22.8Hz),-12.12(d,J＝23.4Hz),-23.53(t,J＝22.7Hz).
实施例10-3
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1085.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.24(s,1H),8.25(s,2H),7.86(d,J＝8.5Hz,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),6.49(s,2H),6.23(dd,J＝8.9,5.8Hz,1H),5.34(q,J＝6.9Hz,1H),4.91(d,J＝8.8Hz,1H),4.85(d,J＝8.8Hz,1H),4.54(d,J＝3.8Hz,1H),4.42-4.31(m,2H),4.29(s,2H),4.12–4.06(m,2H),4.00(s,2H),3.92(s,2H),3.84–3.78(m,2H),3.66(s,2H),3.61(d,J＝4.9Hz,4H),2.98–2.89(m,2H),2.61–2.54(m,1H),2.28(dd,J＝13.1,5.1Hz,1H),2.13(d,J＝1.6Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。14mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1724.4.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.56(s,1H),10.35(s,1H),8.43–8.29(m,3H),8.01(d,J＝1.7Hz,1H),7.89(t,J＝5.5Hz,1H),7.86–7.79(m,3H),7.74–7.68(m,1H),7.67–7.59(m,2H),7.31(dd,J＝8.3,2.9Hz,2H),7.21(s,1H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.47(s,2H),6.30(dd,J＝13.8,5.2Hz,2H),6.22(dd,J＝8.9,5.8Hz,1H),5.31(q,J＝6.9Hz,1H),4.91(d,J＝8.9Hz,1H),4.86(d,J＝8.9Hz,1H),4.53(d,J＝4.5Hz,1H),4.44–4.35(m,2H),4.16–4.09(m,4H),4.09–4.04(m,2H),3.99(s,2H),3.97–3.88(m,2H),3.83–3.79(m,2H),3.65(dd,J＝5.7,3.4Hz,2H),3.59–3.55(m,2H),3.41(t,J＝5.8Hz,2H),3.19(dd,J＝11.6,5.9Hz,2H),2.62(dd,J＝14.8,5.7Hz,1H),2.29(dd,J＝13.3,6.0Hz,1H),2.13(s,3H),2.06(dd,J＝9.4,5.0Hz,2H),1.60(d,J＝7.0Hz,3H),1.52(dt,J＝14.8,7.3Hz,2H),1.33(d,J＝6.7Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-11.06(d,J＝21.0Hz),-12.40(d,J＝23.7Hz),-23.60(t,J＝22.2Hz).
实施例10-4
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例7-4类似。MS[ES(-)],m/z 1047.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.15(s,1H),8.66(d,J＝3.9Hz,1H),8.29(dd,J＝4.5,1.8Hz,1H),7.94(s,1H),7.88(d,J＝8.6Hz,1H),7.78(s,1H),7.69–7.62(m,1H),6.90(s,1H),6.11(t,J＝6.3Hz,1H),5.35(q,J＝6.9Hz,1H),4.91(d,J＝8.9Hz,1H),4.81(d,J＝8.9Hz,1H),4.46–4.36(m,2H),4.26(s,2H),4.11(d,J＝3.7Hz,4H),4.04(s,2H),4.02–3.91(m,2H),3.84–3.78(m,2H),3.69–3.64(m,2H),3.64–3.56(m,4H),2.94(t,J＝4.9Hz,2H),2.31(dd,J＝12.2,4.5Hz,1H),2.18-2.15(m,1H),2.14(s,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
合成方法与实施例7-4类似。20mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1807.2.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.28(s,1H),8.89(s,1H),8.76(d,J＝5.9Hz,2H),8.39(d,J＝18.8Hz,3H),8.25(t,J＝12.6Hz,1H),7.99(d,J＝9.1Hz,2H),7.87(s,1H),7.82(d,J＝8.6Hz,1H),7.78(s,1H),7.71(d,J＝9.7Hz,1H),7.56–7.51(m,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,2H),6.99–6.87(m,2H),6.65(d,J＝8.2Hz,2H),6.54(t,J＝12.6Hz,1H),6.38(d,J＝12.7Hz,1H),6.10(t,J＝6.0Hz,1H),5.30(q,J＝6.9Hz,1H),4.90(d,J＝8.9Hz,1H),4.82(d,J＝8.9Hz,1H),4.64(s,1H),4.44–4.34(m,2H),4.11(d,J＝9.2Hz,4H),4.02(s,2H),3.81(t,J＝4.3Hz,2H),3.66–3.62(m,2H),3.59–3.52(m,4H),3.52–3.46(m,2H),3.35(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),3.17(s,2H),2.55(d,J＝7.2Hz,1H),2.35–2.22(m,3H),2.21–2.15(m,1H),2.12(s,3H),1.80(s,2H),1.59(d,J＝6.9Hz,3H),1.47(s,5H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-11.10(d,J＝21.6Hz),-12.24(d,J＝23.1Hz),-23.61(t,J＝22.4Hz).
实施例11
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
向50mL干燥的圆底烧瓶中依次加入染料AF532(63mg,0.1mmol,1.0eq)，TSTU(1.5eq,45.2mg),加毕，加入3ml DMF溶解，最后加入DIPEA(2.5eq,52uL)，然后置于45℃油浴搅拌3h，加入PEG linker 2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)acetic acid(40mg,2.0eq)，45℃反应过夜，加入水淬灭反应。使用制备液相纯化得目标产物(65.6mg,85％产率)，产物通过MS鉴定。MS[ES(-)],m/z 771.2.
(3)终产物的合成
合成方法与实施例7-2类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。21mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1978.4.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.46(s,1H),8.88(t,J＝5.2Hz,1H),8.80(s,2H),8.52(t,J＝5.1Hz,1H),8.14(d,J＝8.4Hz,2H),8.06(d,J＝6.6Hz,1H),8.04(s,1H),7.90(dd,J＝7.7,3.0Hz,1H),7.84(dd,J＝11.5,6.6Hz,2H),7.74(t,J＝5.7Hz,1H),7.69(d,J＝8.7Hz,1H),7.64(d,J＝3.8Hz,2H),7.49(d,J＝8.0Hz,2H),7.47–7.41(m,1H),6.70(s,2H),6.66–6.56(m,1H),5.70(d,J＝4.2Hz,1H),5.30(q,J＝7.0Hz,1H),5.21(qd,J＝6.9,2.1Hz,1H),4.45–4.38(m,2H),4.36–4.28(m,2H),4.14(s,4H),4.09-4.05(m,2H),4.02(s,2H),3.89(s,2H),3.83–3.76(m,4H),3.65-3.63(m,2H),3.61(s,2H),3.58-3.56(m,2H),3.53–3.49(m,2H),3.48–3.44(m,2H),3.30-3.26(m,2H),2.12(d,J＝2.0Hz,3H),2.08(d,J＝19.2Hz,3H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.16(d,J＝6.6Hz,6H),1.13(s,6H),1.00(s,6H).
实施例12
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
合成方法与实施例11类似。
实施例13
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
染料合成方法与实施例11类似。
(3)终产物的合成
合成方法与实施例11类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。23mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 2154.5.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.94(s,1H),8.88–8.83(m,1H),8.80(s,2H),8.56(s,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,2H),8.10-8.06(m,2H),7.94–7.83(m,4H),7.82(d,J＝4.5Hz,1H),7.63(d,J＝3.9Hz,2H),7.51(d,J＝8.2Hz,2H),7.47-7.43(m,1H),6.71(s,2H),6.65–6.57(m,1H),5.67(s,1H),5.26–5.11(m,2H),4.53–4.41(m,2H),4.40–4.28(m,2H),4.15(d,J＝5.2Hz,2H),4.12–4.05(m,2H),4.02(s,4H),3.83(dd,J＝8.2,4.3Hz,4H),3.80–3.75(m,2H),3.59(s,4H),3.56(d,J＝5.9Hz,4H),2.10(d,J＝7.5Hz,5H),2.06(s,2H),1.66(d,J＝6.3Hz,6H),1.17(s,6H),0.99(s,6H).
实施例14
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
染料以及终产物的合成方法与实施例11类似。
实施例15-1
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
染料合成方法与实施例15-2类似，使用染料AF532替代CY5。
(3)终产物的合成
合成方法与实施例7-2类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。18mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1983.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.42(d,J＝144.3Hz,1H),8.97-8.80(m,2H),8.50(d,J＝30.7Hz,1H),8.14–8.05(m,3H),7.91(d,J＝7.8Hz,1H),7.84(dd,J＝12.3,8.6Hz,2H),7.75–7.60(m,3H),7.55(d,J＝8.3Hz,1H),7.49–7.42(m,1H),7.39–7.25(m,2H),6.97–6.89(m,1H),6.71(s,1H),6.64-6.58(m,1H),5.70–5.64(m,1H),5.34–5.26(m,1H),5.22(qd,J＝7.0,1.8Hz,1H),4.58-4.30(m,4H),4.19(s,1H),4.14(s,2H),4.02(s,2H),3.84–3.79(m,2H),3.68–3.65(m,2H),3.60(d,J＝4.6Hz,2H),3.27(d,J＝4.5Hz,2H),3.15(d,J＝8.9Hz,2H),2.74(s,6H),2.12(s,3H),2.09(d,J＝19.8Hz,3H),1.67(d,J＝6.9Hz,3H),1.60(dd,J＝6.6,2.4Hz,3H),1.23(s,2H),1.18–1.13(m,6H),1.00(d,J＝1.8Hz,3H).
实施例15-2
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
向50mL干燥的圆底烧瓶中依次加入染料CY5(250mg,0.38mmol,1.0eq)，TSTU(1.2eq,110mg),加毕，加入5ml DMF溶解，最后加入DIPEA(3.0eq,200uL)，然后室温搅拌3h，随后，加入带磺酸的片段(114mg,2.0eq)，室温搅拌6h，反应完全后，加入水淬灭反应。使用制备液相纯化获得目标产物(325mg,产率89％)，产物通过MS鉴定。MS[ES(-)],m/z 807.2.
(3)终产物的合成
合成方法与实施例7-3类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。25mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 2030.4.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.52(s,1H),10.28(s,1H),8.43(d,J＝2.5Hz,1H),8.34(t,J＝13.0Hz,2H),8.00(s,1H),7.97(d,J＝6.3Hz,1H),7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.86–7.81(m,2H),7.80(s,2H),7.73(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H),7.67–7.58(m,4H),7.47–7.41(m,1H),7.34(d,J＝8.4Hz,1H),7.30(dd,J＝5.8,2.4Hz,2H),6.70(t,J＝12.4Hz,1H),6.39(s,2H),6.37–6.24(m,3H),5.64(t,J＝4.0Hz,1H),5.31(q,J＝6.8Hz,1H),5.24–5.16(m,1H),4.42–4.34(m,3H),4.33–4.23(m,2H),4.13(s,2H),4.12(d,J＝5.4Hz,2H),4.08–4.02(m,2H),4.00(s,2H),3.83–3.79(m,2H),3.66–3.62(m,2H),3.58–3.55(m,2H),3.43–3.39(m,2H),3.23-3.16(m,2H),2.76(dd,J＝13.9,7.9Hz,2H),2.41–2.32(m,1H),2.13(d,J＝1.9Hz,5H),2.08(s,1H),1.66(d,J＝7.1Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H),1.59–1.50(m,2H),1.40(dd,J＝16.1,9.0Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,4H).
实施例16
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
染料合成方法与实施例15-2类似，使用染料AF532替代CY5。
(3)终产物的合成
合成方法与实施例7-2类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。22mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1984.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.28(s,1H),8.81(s,3H),8.51(s,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,2H),8.08(d,J＝6.2Hz,1H),8.00(s,1H),7.96–7.88(m,2H),7.82(dd,J＝12.3,6.3Hz,2H),7.67(dd,J＝12.5,6.7Hz,2H),7.64(s,2H),7.52(d,J＝8.0Hz,2H),7.48–7.41(m,1H),6.72(s,2H),6.64–6.57(m,1H),5.67-5,64(m,1H),5.30(q,J＝6.4Hz,1H),5.21(t,J＝6.1Hz,1H),4.47–4.27(m,4H),4.13(s,4H),4.11–4.06(m,2H),4.02(s,2H),3.89(s,2H),3.80(dd,J＝12.6,5.7Hz,4H),3.68–3.64(m,2H),3.62(s,2H),3.57(dd,J＝11.3,5.1Hz,2H),3.49(s,4H),3.47(d,J＝2.6Hz,4H),3.25(d,J＝5.7Hz,2H),3.21(dd,J＝11.6,5.8Hz,2H),2.69–2.65(m,1H),2.57(dd,J＝5.7,2.7Hz,1H),2.31(t,J＝6.5Hz,3H),2.12(s,2H),2.11(d,J＝3.4Hz,3H),2.07(s,2H),2.06(s,2H),1.66(d,J＝7.1Hz,3H),1.60(d,J＝7.1Hz,3H),1.17(d,J＝6.6Hz,6H),1.14(s,6H),1.01(d,J＝1.9Hz,6H).
实施例17
linker的合成
linker 9的合成方法与实施例7-1类似。
合成方法与实施例7-2类似，25mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1934.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.21(d,J＝3.5Hz,1H),9.05(d,J＝4.9Hz,1H),8.85(t,J＝5.5Hz,1H),8.81(s,2H),8.13(d,J＝8.4Hz,2H),8.09(d,J＝6.6Hz,1H),7.99(s,1H),7.95–7.88(m,3H),7.72(dd,J＝13.2,7.5Hz,2H),7.66–7.59(m,2H),7.51-7.43(m,3H),6.71(s,2H),6.67–6.58(m,1H),5.70(d,J＝3.4Hz,1H),5.30(q,J＝6.6Hz,1H),5.25–5.17(m,1H),4.82-4.70(m,2H),4.38–4.28(m,2H),4.21(d,J＝4.3Hz,3H),4.12(s,2H),4.09–4.01(m,2H),3.89(s,2H),3.82–3.77(m,2H),3.64(dd,J＝4.7,2.1Hz,2H),3.61(s,2H),3.58(dd,J＝5.4,2.9Hz,2H),3.53–3.49(m,2H),3.49–3.43(m,2H),3.29(dd,J＝11.8,5.9Hz,2H),2.62–2.52(m,2H),2.16(s,3H),2.08(d,J＝17.6Hz,3H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H),1.59(d,J＝6.9Hz,3H),1.16(d,J＝6.5Hz,6H),1.14(d,J＝1.2Hz,6H),1.00(d,J＝2.1Hz,6H).
实施例18
linker的合成
linker 9的合成方法与实施例7-1类似。
实施例19
linker的合成
乙基苯甲酸在酸的条件下酯化，然后利用NBS溴代得到溴代产物。随后利用硫酸盐制备得到中间体，再利用硫醇胺制备二硫键化合物，水解后与PEG片段缩合得到linker 10。MS[ES(-)],m/z 599.1.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.59(s,1H),7.80(dd,J＝14.3,6.9Hz,2H),7.59(q,J＝8.1Hz,2H),7.42–7.36(m,1H),5.13(q,J＝6.9Hz,1H),4.44-4.33(m,2H),3.89(s,2H),3.85(s,2H),3.81–3.75(m,2H),3.61(s,2H),3.55(s,4H),3.51(t,J＝5.7Hz,2H),3.35(dd,J＝10.6,5.2Hz,2H),3.30–3.23(m,2H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1254.2.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.54(s,1H),7.95(s,1H),7.89–7.83(m,1H),7.76(d,J＝5.1Hz,1H),7.63(d,J＝6.0Hz,2H),7.58(d,J＝6.7Hz,2H),7.46–7.37(m,2H),7.30–7.18(m,1H),6.69–6.63(m,1H),6.35(s,2H),5.56(dd,J＝6.2,5.2Hz,1H),5.32(t,J＝4.8Hz,1H),5.20(dd,J＝9.6,4.7Hz,1H),5.14–5.07(m,1H),4.44(s,2H),4.37–4.25(m,2H),4.12(dd,J＝3.2,2.3Hz,2H),4.01(s,4H),3.89–3.84(m,2H),3.83(dd,J＝6.8,4.4Hz,2H),3.63(d,J＝7.7Hz,2H),3.56(s,4H),3.45–3.42(m,2H),2.45(d,J＝1.9Hz,1H),2.36(d,J＝0.6Hz,1H),2.02-1.96(m,6H),1.66–1.60(m,6H).
合成方法与实施例7-3类似。16mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1893.4.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),8.46–8.30(m,2H),7.87(d,J＝6.8Hz,2H),7.81(s,2H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H),7.65-7.62(m,3H),7.58(q,J＝7.8Hz,2H),7.46–7.36(m,2H),7.31(d,J＝8.2Hz,2H),7.29(s,1H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.40(s,2H),6.34–6.20(m,3H),5.63(s,1H),5.22-5.18(m,1H),5.13(q,J＝6.9Hz,1H),4.49-4.44(m,1H),4.41-4.37(m,1H),4.32(s,1H),4.26(s,1H),4.12(d,J＝5.0Hz,2H),4.07(t,J＝8.0Hz,2H),4.00(s,2H),3.85(s,2H),3.82(t,J＝4.0Hz,,3H),3.53(s,4H),3.52(s,2H),3.40–3.35(m,2H),3.29–3.24(m,2H),3.17(d,J＝5.7Hz,2H),2.13(s,1H),2.06(d,J＝4.0Hz,1H),1.67(s,12H),1.65(d,J＝6.9Hz,3H),1.62(d,J＝6.9Hz,3H),1.56–1.49(m,2H),1.35-1.29(m,2H),1.26-1.23(m,6H).
实施例20-1
linker的合成
linker 11的合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 585.1.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.97(s,1H),9.59(s,1H),8.04(d,J＝2.1Hz,1H),7.89(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),7.55(d,J＝8.6Hz,1H),5.13(q,J＝6.9Hz,1H),4.44–4.34(m,2H),4.09(s,2H),3.87(s,2H),3.78(s,2H),3.66(dd,J＝5.7,3.1Hz,2H),3.61(dd,J＝5.6,3.1Hz,2H),3.55(t,J＝5.7Hz,2H),3.37(dd,J＝11.0,5.4Hz,2H),2.10(s,3H),1.62(d,J＝7.0Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1240.2.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.83(s,1H),8.44–8.36(m,1H),8.25(s,1H),8.03–7.91(m,1H),7.87(d,J＝7.8Hz,1H),7.66–7.58(m,2H),7.52(d,J＝8.7Hz,1H),7.48–7.40(m,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),7.30–7.23(m,1H),7.07(d,J＝8.3Hz,1H),6.41-6.37(m,2H),6.35–6.27(m,1H),5.64(s,1H),5.22-5.16(m,2H),4.51–4.41(m,1H),4.41–4.35(m,1H),4.34(d,J＝4.7Hz,1H),4.26(s,1H),4.25(s,2H),4.15–4.10(m,2H),4.05(s,4H),3.82(s,2H),3.68–3.58(m,6H),3.55–3.51(m,2H),2.63(t,J＝7.1Hz,1H),2.37(d,J＝13.0Hz,1H),2.11(d,J＝18.7Hz,3H),2.08(s,3H),1.66(d,J＝6.9Hz,3H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。18mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1779.4.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.51(s,1H),10.21(s,1H),8.43–8.29(m,3H),8.12(s,1H),7.91(dd,J＝10.0,3.2Hz,2H),7.87(d,J＝7.4Hz,1H),7.81(s,2H),7.64-7.62(m,4H),7.53(d,J＝8.6Hz,1H),7.44(td,J＝7.2,1.8Hz,1H),7.35–7.28(m,3H),7.27(d,J＝4.8Hz,1H),7.07(d,J＝8.5Hz,1H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.37(s,1H),6.31(dd,J＝14.2,6.9Hz,3H),5.63(s,1H),5.23–5.16(m,1H),5.13(q,J＝7.0Hz,1H),4.48–4.39(m,2H),4.33(t,J＝4.2Hz,1H),4.26(t,J＝3.5Hz,1H),4.13(s,2H),4.11(s,2H),4.06(s,2H),4.00(s,2H),3.83–3.80(m,2H),3.65-3.63(m,2H),3.56(dd,J＝7.8,3.4Hz,2H),3.53(d,J＝7.3Hz,2H),3.40(d,J＝5.4Hz,2H),3.19(dd,J＝11.3,5.7Hz,2H),2.63(t,J＝5.4Hz,1H),2.41–2.34(m,1H),2.13(s,1H),2.10–2.06(m,6H),1.68(s,12H),1.65(d,J＝7.0Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H),1.54–1.49(m,2H),1.32(dd,J＝12.2,6.8Hz,2H),1.25(dd,J＝11.3,4.5Hz,9H).
实施例20-2
linker的合成
linker的合成方法与实施例20-1类似。
合成路线与实施例20-1类似。
实施例21
linker的合成
linker 12的合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 629.2.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),8.22(t,J＝5.7Hz,1H),7.85(d,J＝8.7Hz,1H),7.14(d,J＝2.5Hz,1H),6.96(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),5.33(q,J＝6.8Hz,1H),4.63–4.53(m,2H),4.40-4.30(m,2H),3.94(s,2H),3.79(t,J＝4.5Hz,2H),3.52–3.48(m,4H),3.46–3.43(m,2H),3.36–3.32(m,4H),3.29(dd,J＝11.8,5.9Hz,2H),2.13(s,3H),1.62(d,J＝7.0Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1284.2.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.77(s,1H),8.46(dd,J＝14.7,6.2Hz,1H),7.89(dd,J＝17.9,8.1Hz,2H),7.66–7.60(m,2H),7.47–7.41(m,1H),7.30(d,J＝4.2Hz,1H),7.09(d,J＝1.9Hz,1H),7.07–6.99(m,1H),6.51–6.35(m,2H),6.35–6.23(m,1H),5.64(s,1H),5.35(d,J＝6.9Hz,1H),5.20(dd,J＝6.9,2.8Hz,1H),4.66(s,2H),4.44–4.38(m,1H),4.37–4.33(m,1H),4.32(d,J＝4.8Hz,1H),4.25(t,J＝4.2Hz,1H),4.11(d,J＝5.2Hz,2H),4.05–4.02(m,2H),4.01(s,2H),3.83–3.80(m,2H),3.62(s,2H),3.51(d,J＝7.5Hz,4H),3.45(d,J＝5.5Hz,4H),3.29–3.25(m,2H),2.49–2.43(m,1H),2.41-2.36(m,1H),2.10(d,J＝26.1Hz,6H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H),1.62(d,J＝6.9Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。21mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1924.4.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.55(s,1H),8.49(d,J＝6.0Hz,1H),8.36(t,J＝12.9Hz,2H),7.89–7.84(m,2H),7.81(s,2H),7.65–7.59(m,3H),7.47–7.40(m,1H),7.31(dd,J＝8.2,1.4Hz,2H),7.12(d,J＝2.2Hz,1H),7.01–6.94(m,1H),6.59(t,J＝12.2Hz,1H),6.40(s,2H),6.30(dd,J＝13.2,4.5Hz,2H),5.60(d,J＝58.2Hz,1H),5.33(q,J＝6.9Hz,1H),5.20(dd,J＝12.8,5.8Hz,1H),4.58(s,2H),4.44–4.33(m,2H),4.33–4.28(m,1H),4.28–4.22(m,1H),4.13(dd,J＝11.7,5.6Hz,2H),4.09–4.05(m,2H),4.00(s,2H),3.82–3.79(m,2H),3.48(s,2H),3.45–3.42(m,2H),3.38–3.34(m,2H),3.28(dd,J＝11.5,5.8Hz,2H),3.16(dd,J＝11.3,5.5Hz,2H),2.13(s,1H),2.12(s,2H),2.08–2.03(m,3H),1.68(s,9H),1.65(d,J＝6.2Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H),1.55–1.49(m,2H),1.35–1.30(m,2H),1.25(dd,J＝12.0,4.4Hz,6H).
实施例22
linker的合成
linker 13的合成方法与实施例7-1类似。。MS[ES(-)],m/z 599.1.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),8.81(t,J＝5.5Hz,1H),8.05(s,1H),7.84(s,2H),5.17(q,J＝7.0Hz,1H),4.50–4.31(m,2H),3.84(s,2H),3.80–3.77(m,2H),3.55(d,J＝6.1Hz,2H),3.53(s,4H),3.49(t,J＝5.8Hz,2H),3.43(dd,J＝11.5,5.7Hz,2H),3.32(dd,J＝10.7,5.3Hz,2H),2.09(s,3H),1.67(d,J＝7.0Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1099.2.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.36(s,1H),8.43(s,1H),8.06(d,J＝7.9Hz,2H),7.92(d,J＝8.2Hz,1H),7.20(s,1H),6.45(s,2H),6.23(dd,J＝8.8,6.0Hz,1H),5.18(q,J＝7.1Hz,1H),4.90(d,J＝8.8Hz,1H),4.85(d,J＝8.8Hz,1H),4.53(d,J＝4.0Hz,1H),4.51–4.36(m,2H),4.14–4.05(m,4H),4.01(s,2H),3.90(dd,J＝11.1,6.1Hz,2H),3.85–3.80(m,2H),3.63–3.58(m,6H),3.54(s,4H),2.62–2.54(m,1H),2.28(dd,J＝12.9,5.5Hz,1H),2.09(d,J＝2.8Hz,3H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H).
合成方法与实施例7-3类似。13mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1738.4.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.55(s,1H),8.91(s,1H),8.45(t,J＝5.6Hz,1H),8.35(t,J＝13.0Hz,2H),8.04(s,1H),7.92–7.84(m,3H),7.80(d,J＝1.7Hz,2H),7.64(ddd,J＝8.2,3.7,1.5Hz,2H),7.31(dd,J＝8.3,3.0Hz,2H),7.22(s,1H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.46(s,2H),6.30(dd,J＝13.7,4.3Hz,2H),6.21(dd,J＝8.9,5.8Hz,1H),5.15(q,J＝6.9Hz,1H),4.90(d,J＝8.9Hz,1H),4.85(d,J＝8.9Hz,1H),4.53(d,J＝3.9Hz,1H),4.51–4.44(m,1H),4.44–4.38(m,1H),4.15–4.09(m,4H),4.09–4.03(m,2H),3.99(s,2H),3.97–3.87(m,2H),3.84–3.80(m,2H),3.76–3.72(m,2H),3.44–3.41(m,2H),3.38–3.34(m,4H),3.15(dd,J＝11.6,5.8Hz,2H),2.91–2.88(m,2H),2.66–2.60(m,1H),2.28(dd,J＝13.1,5.6Hz,1H),2.08(s,3H),2.07–2.02(m,2H),1.67(s,12H),1.65(d,J＝8.0Hz,3H),1.56–1.48(m,2H),1.35–1.29(m,2H),1.26-1.22(m,5H).
实施例23
linker的合成
合成路线与实施例19类似。
实施例24
合成路线与实施例7-3类似。
实施例25
合成路线与实施例7-3类似。
实施例26
linker 2的合成方法参见实施例2。
核苷与linker 2DCC缩合得到酯化产物，随后脱去TBS保护基、三磷酸化以及氨解后得到片段，片段与染料偶联得到产品。
实施例27
合成路线与实施例19类似。
实施例28
合成路线与实施例7-1类似。
实施例29
合成路线与实施例7-1类似。
实施例30
合成路线与实施例7-1类似。
实施例31
合成路线与实施例7-1类似。
实施例32
合成路线与实施例7-1类似。
实施例33
合成路线与实施例7-1类似。
实施例34
合成路线参考实施例19。
实施例35
合成路线与实施例22类似。
实施例36
合成路线与实施例19类似。
实施例37
合成路线与实施例8类似。
实施例38
合成路线与实施例7-2类似。
实施例39
合成路线与实施例6-2类似。
实施例40
合成路线与实施例19类似。
实施例41
合成路线与实施例22类似。
实施例42
linker 2的合成参见实施例2。
化合物缩合后得到TBS保护核苷，氨解去掉乙酰基后，与linker2 DCC缩合，脱去TBS保护基，三磷酸化后再氨基得到氨基化合物，最后标记荧光染料得到产品。
实施例43
linker的合成
Linker在DCC缩合条件下反应，脱去TBS保护基，三磷酸化后得到三磷酸。氨基脱去三氟乙酰基，最后与染料缩合得到产品。
实施例44
linker 2的合成
linker 2在DCC缩合条件下反应，脱去TBS保护基，三磷酸化后得到三磷酸。氨基脱去三氟乙酰基，最后与染料缩合得到产品。
实施例45
linker的合成
合成路线与实施例2类似。
实施例46
linker的合成
linker的合成参见实施例3。
实施例47
linker的合成
合成路线与实施例2类似。
实施例48
linker的合成
linker是2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸盐酸盐，直接购买自安耐吉化学，货号A012027。
合成路线与实施例19类似。
二、测序效果评估实施例
以下四种cold dNTP可以参照PCT/CN2021/125262中实施例三十、实施例三十一、实施例三十二、实施例三十三的制备方法进行合成。
具体地：
合成路线如下：
MW＝692。1H NMR(400MHz,D2O)δ7.90–7.82(m,2H),7.69–7.58(m,2H),7.46–7.39(m,1H),6.47–6.35(m,1H),5.73(s,1H),5.10-5.01(m,1H),4.57(dd,J＝13.6,3.0Hz,1H),4.41–4.24(m,2H),2.65–2.52(m,2H),1.98(d,J＝15.2Hz,3H),1.94(s,3H),1.68(d,J＝7.2Hz,3H).
合成路线如下：
MW＝717。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.14(t,J＝3.1Hz,1H),7.82(dd,J＝8.1,3.1Hz,1H),7.55(q,J＝3.2Hz,2H),7.38-7.34(m,1H),6.31-6.22(m,1H),5.76(d,J＝4.1Hz,1H),5.10–5.00(m,1H),4.65–4.55(m,1H),4.36-4.21(m,2H),3.02–2.94(m,1H),2.71–2.61(m,1H),1.94(dd,J＝22.2,3.2Hz,3H),1.62(dd,J＝7.2,3.3Hz,3H).
合成路线如下：
MW＝677。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.08–8.00(m,1H),7.91–7.84(m,1H),7.72–7.59(m,2H),7.49–7.40(m,1H),6.48–6.40(m,1H),6.19(dd,J＝7.7,2.3Hz,1H),5.73–5.64(m,1H),5.13–5.02(m,1H),4.60(d,J＝12.6Hz,1H),4.36-4.27(m,2H),2.71-2.64(m,1H),2.55–2.44(m,1H),2.00(dd,J＝9.5,2.2Hz,3H),1.69(dd,J＝7.2,2.1Hz,3H).
合成路线如下：
MW＝701。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.53(dd,J＝5.2,1.8Hz,1H),8.18–8.10(m,1H),7.83(d,J＝7.8Hz,1H),7.55-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,1H),6.49-6.40(m,1H),5.81–5.73(m,1H),5.07-5.00(m,1H),4.67–4.57(m,1H),4.39–4.18(m,2H),3.06–2.95(m,1H),2.75(ddd,J＝21.2,14.2,5.6Hz,1H),1.93(dd,J＝25.1,1.9Hz,3H),1.60(dd,J＝6.9,4.0Hz,3H).
测序例1
核苷酸底物
(1)hot dNTP：实施例7-1至7-4合成获得的四种终产物(命名为SSEB Hot Mix_V8)，结构如下。
(2)cold dNTP：如上所述方法合成以下四种cold dNTP，结构如下。
按照MGISEQ-2000测序仪操作规程，使用上述核苷酸底物以及MGISEQ-2000高通量测序试剂套装(FCL SE50)进行测序。
1.利用Ecoli测序文库制备DNA纳米球。
2.将DNA纳米球装载到BGISEQ2000测序芯片上。
3.将装载完成的测序芯片加载至BGISEQ2000测序仪上，设置测序流程，hot dNTP聚合：60℃2min；cold dNTP聚合：60℃2min；信号采集；切除阻断基团：65℃2min。
4.下机数据进行basecall分析，输出测序指标、比对率、错误率、Q30等，结果见表1。
结果表明，此类核苷酸类似物在高通量测序中起到良好的可逆阻断效果，可实现逐个检测测序中掺入的核苷酸类型。
表1 Basecall分析结果
| 核苷酸类似物hot dNTP Mix | SSEB Hot Mix_V8 |
| 参考基因(Reference) | Ecoli |
| 循环数(Cycle Number) | 51 |
| Q30(％) | 92.67 |
| Lag(％) | 0.43 |
| Runon(％) | 0.31 |
| ESR(％) | 82.60 |
| 比对率(Mapping Rate,％) | 98.15 |
| 平均错误率(AvgError Rate,％) | 0.50 |
注：
1、Q30(％)指Basecall结果错误率低于0.001(准确性高于99.9％)的base占有比率；
2、Lag(％)指测序滞后所占比率；
3、Runon(％)指测序超前所占比率；
4、ESR(％)指经过过滤最终测序所得的reads数(Total Reads)占Basecall能识别出来的DNB数量(DNB Number)的比率。
测序例2
核苷酸底物
(1)hot dNTP：实施例7-1、7-4、11、15-2合成获得的四种终产物(命名为SSEB HotMix-V8V9V11)，结构如下。
(2)cold dNTP：通过常规方法合成四种cold dNTP，结构如下。
按照MGISEQ-2000测序仪操作规程，使用上述核苷酸底物以及MGISEQ-2000高通量测序试剂套装(FCL PE100)进行测序。
1.利用Ecoli测序文库制备DNA纳米球；
2.将DNA纳米球装载到BGISEQ2000测序芯片上；
3.将装载完成的测序芯片加载至BGISEQ2000测序仪上，设置测序流程，hot dNTP聚合：55℃30s；cold dNTP聚合：55℃60s；信号采集；切除阻断基团：55℃8s。
4.下机数据进行basecall分析，输出测序指标、比对率、错误率、Q30等，结果见表2。
结果表明，此类核苷酸类似物在高通量测序中起到良好的可逆阻断效果，可实现逐个检测测序中掺入的核苷酸类型。
表2 Basecall分析结果
| 核苷酸类似物hot dNTP Mix | SSEB Hot Mix-V8V9V11 |
| 参考基因(Reference) | Ecoli |
| 循环数(Cycle Number) | 212 |
| Q30(％) | 95.79 |
| Lag 1(％) | 0.08 |
| Lag 2(％) | 0.11 |
| Runon 1(％) | 0.12 |
| Runon 2(％) | 0.26 |
| ESR(％) | 76.81 |
| 比对率(Mapping Rate,％) | 99.89 |
| 平均错误率(AvgError Rate,％) | 0.15 |
测序例3
核苷酸底物
(1)hot dNTP：实施例10-1、10-2、10-3、10-4合成获得的四种终产物(命名为SSEBHot Mix-N3)，结构如下。
(2)cold dNTP：通过常规方法合成四种cold dNTP，结构如下。
按照MGISEQ-2000测序仪操作规程，使用上述核苷酸底物以及MGISEQ-2000高通量测序试剂套装(FCL PE100)进行测序。
1.利用Ecoli测序文库制备DNA纳米球；
2.将DNA纳米球装载到BGISEQ2000测序芯片上；
3.将装载完成的测序芯片加载至BGISEQ2000测序仪上，设置测序流程，hot dNTP聚合：60℃2min；cold dNTP聚合：60℃2min；信号采集；切除阻断基团：65℃2min。
4.下机数据进行basecall分析，输出测序指标、比对率、错误率、Q30等，结果见表3。
结果表明，此类核苷酸类似物在高通量测序中起到良好的可逆阻断效果，可实现逐个检测测序中掺入的核苷酸类型。
表3 Basecall分析结果
| 核苷酸类似物hot dNTP Mix | SSEB Hot Mix-N<sub>3</sub> |
| 参考基因(Reference) | Ecoli |
| 循环数(Cycle Number) | 53 |
| Q30(％) | 95.45 |
| Lag 1(％) | 0.20 |
| Lag 2(％) | 0.22 |
| Runon 1(％) | 0.43 |
| Runon 2(％) | 0.45 |
| ESR(％) | 80.29 |
| 比对率(Mapping Rate,％) | 96.82 |
| 平均错误率(AvgError Rate,％) | 0.57 |
Claims (22)
1.一种核苷酸类似物，其由核糖或脱氧核糖、可逆阻断基团、碱基或脱氮碱基或其互变异构体、用于连接可检测标记的连接子和任选的磷酸基团形成，其中，所述连接子包含如下式A或式A’所示的结构：
其中：
Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx、-S-SO2Rx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
优选地，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
更优选地，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me、-SS-Et，另一个为甲基；
最优选地，Rb、Rc中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基；
Ra选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
优选地，Ra选自H、C1-C6烷基；
更优选地，Ra为甲基；
X选自O、S、NH；
优选地，X选自O、S；
更优选地，X为O；
M1选自直接键、NH、O、S、CH2；
优选地，M1选自直接键、NH、O；
优选地，所述可逆阻断基团与所述核糖或脱氧核糖的3’-OH相连，所述碱基或脱氮碱基或其互变异构体与所述核糖或脱氧核糖的1’-C相连，所述任选的磷酸基团与所述核糖或脱氧核糖的5’-OH相连，所述连接子与所述碱基或脱氮碱基或其互变异构体相连。
2.权利要求1所述的核苷酸类似物，其中，式A所示的结构如式A-1、式A-2、式A-3、式A-4或式A-5所示，优选如式A-1、式A-2或式A-5所示；或者，式A’所示的结构如式A’-1、式A’-2或式A’-3所示，优选如式A’-1所示；
其中：
Ra、Rb、Rc、X、M1的定义如前所述。
3.权利要求1-2任一项所述的核苷酸类似物，其中，式A所示的结构选自以下：
或者，式A’所示的结构式为
4.权利要求1-3任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述核苷酸类似物具有如下式B所示的结构：
Lx具有权利要求1-3任一项所述的式A、式A’、式A-1、式A-2、式A-3、式A-4、式A-5、式A’-1、式A’-2或式A’-3所示的结构式，且Lx的M1端或S端与Lb相连，Lx的O端与La相连；
base1表示碱基或脱氮碱基或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团；
R0表示H或磷酸基团；
La表示所述连接子中用于连接碱基或脱氮碱基或其互变异构体的部分；
Lb表示所述连接子中用于连接可检测标记的部分。
5.权利要求1-4任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述核苷酸类似物具有如下式B所示的结构：
其中：
Lx具有如权利要求1-3任一项的式A、式A’、式A-1、式A-2、式A-3、式A-4、式A-5、式A’-1、式A’-2或式A’-3所示的结构式，且Lx的M1端或S端与Lb相连，Lx的O端与La相连；
La选自
优选地，La选自
或者优选地，La选自:
或者更优选地，La选自:
或者进一步优选地，La选自：
或者最优选地，La选自:
r1、r2、r3a、r3b、r4各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r1选自1、2、3；
更优选地，r1为1；
优选地，r2选自1、2、3；
更优选地，r2为1；
优选地，r3a、r3b各自独立地选自0、1、2、3、4、5，且r3a、r3b不同时为0；
更优选地，r3a、r3b各自独立地选自0、1、2、3，且r3a、r3b不同时为0；
进一步优选地，r3a选自0、1，r3b选自0、2，且r3a、r3b不同时为0；
最优选地，r3a为1；
最优选地，r3b为2；
优选地，r4选自1、2、3；
更优选地，r4为1；
M选自直接键、CH2、NH、O、S；
优选地，M选自直接键、CH2、O；
更优选地，M选自CH2、O；
Lb选自
优选地，Lb选自
更优选地，Lb选自
最优选地，Lb选自：
Lc选自直接键、
优选地，Lc中的NH端与Lb中的H相连接，Lc中的＝O端与Lb中的NH相连接；
优选地，Lc选自直接键、
优选地，Lc中的NH端与Lb中的H相连接，Lc中的＝O端与Lb中的NH相连接；
rm选自0-6之间的任意整数；
优选地，rm选自0、1、2、3；
更优选地，rm选自0、1；
r5、r6、r7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r5选自1、2、3；
更优选地，r5为2；
优选地，r6选自1、2、3；
更优选地，r6为1或2；
优选地，r7选自1、2、3；
更优选地，r7为2；
r10选自1-10之间的任意整数；
优选地，r10选自2-6之间的任意整数；
更优选地，r10为2或6；
r11选自1-6之间的任意整数；
优选地，r11选自1、2、3；
更优选地，r11为1；
M1、M2、M3各自独立地选自直接键、NH、O、S、CH2；
优选地，M1选自直接键、NH、O；
优选地，M2为NH；
优选地，M3选自直接键、NH；
base1表示碱基或脱氮碱基；
R’表示可逆阻断基团；
R0表示H或磷酸基团。
6.权利要求4-5任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述base1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
优选地，base1选自
7.权利要求4-6任一项所述的核苷酸类似物，其中，R0选自H、单磷酸基团
二磷酸基团
三磷酸基团
四磷酸基团
优选地，R0为三磷酸基团
各Z独立地选自O，S，BH；
优选地，Z为O。
8.权利要求4-7任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
NH2、-ONH2、-OCORz、-OCONHRz，其中，各Rz独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
优选地，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
NH2；
更优选地，所述可逆阻断基团R’选自N3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
最优选地，所述可逆阻断基团R’选自N3-CH2-、CH3-CH2-S-S-CH2-、
R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)，
优选地，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
另一个(如R3’)选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H，
更优选地，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，任意一个(如R1’或R5’)为
其余为H，
最优选地，R1’、R2’、R3’、R4’、R5’中，R1’为
其余为H，
Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH2、-OCORx、-OCONHRx，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各Rx独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)，
优选地，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
更优选地，Rb’、Rc’中，任意一个选自-N3、-SS-Me，另一个为甲基。
9.权利要求1-8任一项所述的核苷酸类似物，其选自：
10.权利要求1-9任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述核苷酸类似物携带额外的可检测标记，且所述可检测标记与连接子(优选Lb)连接；
优选地，所述核苷酸类似物携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物、结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述核苷酸类似物的表位；优选地，所述可检测标记与所述Lb的末端氨基连接；
优选地，所述可检测标记中的羧基与所述Lb的末端氨基通过形成酰胺键进行连接；
优选地，base1不同，所述核苷酸类似物携带的额外的可检测标记不同；
优选地，所述可检测标记为荧光标记；
优选地，所述可检测标记选自以下：iF700、
11.权利要求10所述的核苷酸类似物，其中，所述核苷酸类似物选自：
所述化合物选自以下：
12.终止核酸合成的方法，其包括：将权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子中；
优选地，所述核苷酸类似物的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子中；
优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子的3'端。
13.制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述核苷酸类似物的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中；
优选地，所述核苷酸类似物的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸；
优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
14.核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，
所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物；
或者，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物。
15.测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物，以及，
2)确定掺入的核苷酸的类型；
优选地，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去；
优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去；
优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
16.权利要求15所述的方法，其包括以下步骤：
(a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是权利要求10-11任一项所述的核苷酸类似物，任选地其余的核苷酸是权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物；
(b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
(c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
(d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
(e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
17.权利要求15所述的方法，其包括以下步骤：
(1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是权利要求10-11任一项所述的核苷酸类似物，任选地其余的核苷酸是权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物；
(2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
18.权利要求15所述的方法，其包括以下步骤：
(a)提供包含双链体、包含至少一种权利要求10-11任一项所述的核苷酸类似物的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
(b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
步骤(i)：使用聚合酶，使所述核苷酸类似物掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记切除；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
19.权利要求18所述的方法，其中，所述双链体连接于支持物上；
优选地，所述生长的核酸链为引物；
优选地，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体；
优选地，所述双链体、所述核苷酸类似物、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系；
优选地，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述核苷酸类似物掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体；
优选地，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KODPOL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)；
优选地，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体；
优选地，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中接触；
优选地，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的核苷酸类似物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键；
优选地，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相；
优选地，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作；
优选地，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的核苷酸类似物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
20.试剂盒，其包含至少一个权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物；
优选地，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物；
优选地，所述第一化合物中，base1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
)；所述第二化合物中，base1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
）；所述第三化合物中，base1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
)；所述第四化合物中，base1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
)；
优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base1互不相同；
优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
21.权利要求20所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
22.权利要求1-11任一项所述的核苷酸类似物或者权利要求20-21任一项所述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
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