WO2022206922A1 - 用于测序的核苷酸类似物 - Google Patents

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WO2022206922A1
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徐讯
滕波
章文蔚
沈亮
卓世添
鄢胜壹
高南风
张泳辉
赵杰
廖莎
王明
张少桥
陈奥
李汉东
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深圳华大生命科学研究院
深圳华大智造控股有限公司
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    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/186—Modifications characterised by incorporating a non-extendable or blocking moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing

Definitions

  • the present invention relates to the field of nucleic acid sequencing.
  • the present invention relates to nucleotide analogs for sequencing.
  • NGS sequencing has overcome the disadvantages of high cost and long sequencing time of Sanger sequencing, and has greatly promoted the application of gene sequencing technology.
  • NGS sequencing has been deeply applied in prenatal screening, tumor diagnosis, tumor treatment, animal and plant breeding and other fields, driving the progress of science and technology and medicine.
  • Nucleoside triphosphate (dNTP) analogs with reversible blocking groups are key raw materials in NGS sequencing. Due to the introduction of the reversible blocking group, the 3'-OH group in dNTP can be retained, which overcomes the shortcomings of Sanger sequencing and ensures the accuracy of base recognition. It can be said that nucleoside triphosphate analogs (dNTPs) with reversible blocking groups are the most critical technology in NGS sequencing. Nucleotides with cleavable linkers and detectable labels in NGS sequencing are the key to base detection.
  • the present invention aims to develop a class of dNTP analogs with cleavable and detectable labels on the base or the 3'-OH of the nucleotide sugar ring for NGS sequencing.
  • the general structural formula of the first class of dNTP analogs is shown in Figure 1.
  • the bases have nucleotides that can be cleaved and detectably labeled, including 2'deoxyuridine triphosphate, 2'deoxycytidine triphosphate, 7-deoxyuridine triphosphate, and 7-deoxyuridine triphosphate.
  • the sugar ring 3'-OH is connected with any reversible blocking group that is conventionally used in the art and has an excellent effect of being connected to the 3'-OH.
  • the general structural formula of the second class of dNTP analogs is shown in Figure 2, and the 3'-OH of the sugar ring is reversibly blocked with detectably labeled nucleotides.
  • the present invention provides a compound represented by formula I or formula II or a salt thereof,
  • L1 is selected from
  • r 1 , r 2 , r 3a , r 3b , r 4 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M is selected from direct bond, CH2 , NH, O, S;
  • L2 is Preferably, W is connected to R;
  • L3 is Preferably, W is connected to R;
  • each X is independently selected from O, S, NH;
  • Y is selected from direct bond, O, S, NH;
  • each W is independently selected from direct bond, O, S, NH;
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , and R 5 are independently selected from H, Azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic alkyl (such as phenyl-C1 -C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (such as C1-C6 alkoxy);
  • r 5 , r 6 , and r 7 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • r 8 and r 9 are each independently selected from 0 and 1, and r 8 and r 9 are not 0 at the same time;
  • M 1 , M 2 , M 3 are each independently selected from direct bond, NH, O, S;
  • R a is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3 -C6 cycloalkyl);
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH 2 , -OCOR x , -OCONHR x , the other is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), wherein each R x is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl) ) or aromatic alkyl (such as phenyl C1-C6 alkyl);
  • R 0 is selected from H, a monophosphate group diphosphate group triphosphate group tetraphosphate group
  • Each Z is independently selected from O, S, BH;
  • base 1 and base 2 are each independently selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7- Deazaguanine or its tautomer;
  • R' represents a reversible blocking group
  • in formula II Indicates a reversible blocking group
  • L 1 is selected from
  • L 1 is selected from
  • L 1 is selected from
  • L 1 is selected from
  • r 1 is selected from 1, 2, 3.
  • r 1 is 1.
  • r 2 is selected from 1, 2, 3.
  • r 2 is 1.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3.
  • r 3a is 1.
  • r 3b is 2.
  • r4 is selected from 1, 2, 3.
  • r4 is 1.
  • M is selected from CH2 , O.
  • each X is independently selected from O, S.
  • X is O.
  • Y is a direct bond
  • W is a direct bond
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 is The rest are independently selected from H,
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 is Another (such as R 1 or R 5 ) is selected from H, The remaining three are H.
  • r 5 is selected from 1, 2, 3.
  • r5 is 2.
  • r 6 is selected from 1, 2, 3.
  • r 6 is 1 or 2.
  • r7 is selected from 1 , 2, 3.
  • r7 is 2.
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O.
  • M 2 is NH
  • M 3 is selected from direct bonds, NH.
  • Ra is selected from H, C1-C6 alkyl.
  • Ra is methyl
  • any one of R b , R c is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t -Bu), the other is selected from C1-C6 alkyl.
  • any one of Rb , Rc is selected from -N3 , -SS-Me, -SS-Et, and the other is methyl.
  • any one of R b , R c is selected from -N 3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • R is selected from
  • R 0 is a triphosphate group
  • Z is O.
  • base 1 is selected from
  • base 2 is selected from
  • the present invention provides a compound represented by formula I-1 or a salt thereof,
  • L1 is selected from
  • r 1 , r 2 , r 3a , r 3b are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M is selected from direct bond, CH2 , NH, O, S;
  • X is selected from O, S, NH;
  • Y is selected from direct bond, O, S, NH;
  • W is selected from direct bond, O, S, NH;
  • any one (such as R 2 , R 3 or R 4 ) is The rest are independently selected from H, Azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic alkyl (such as phenyl-C1 -C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (such as C1-C6 alkoxy);
  • r 5 and r 6 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M 1 , M 3 are each independently selected from direct bond, NH, O, S;
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH 2 , -OCOR x , -OCONHR x , the other is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), wherein each R x is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl) ) or aromatic alkyl (such as phenyl C1-C6 alkyl);
  • Z is selected from O, S, BH;
  • base 1 is selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine or its tautomer;
  • R' represents a reversible blocking group
  • L 1 is selected from
  • L 1 is selected from
  • r 1 is selected from 1, 2, 3.
  • r 1 is 1.
  • r 2 is selected from 1, 2, 3.
  • r 2 is 1.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3.
  • r 3a is 1.
  • r 3b is 2.
  • M is selected from CH2 , O.
  • X is selected from O, S.
  • X is O.
  • Y is a direct bond
  • W is a direct bond
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 (eg R 2 , R 3 or R 4 ) is The rest are independently selected from H,
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 (eg R 2 , R 3 or R 4 ) is Another (eg R 1 or R 5 ) is The remaining three are H.
  • R1 is the remaining three are H.
  • R is selected from
  • r 5 is selected from 1, 2, 3.
  • r5 is 2.
  • r 6 is selected from 1, 2, 3.
  • r 6 is 1 or 2.
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O.
  • M 3 is selected from direct bonds, NH.
  • M 3 when M 1 is NH, O, or S, M 3 is a direct bond, and when M 3 is NH, O, or S, M 1 is a direct bond.
  • any one of R b , R c is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t -Bu), the other is selected from C1-C6 alkyl.
  • any one of R b , R c is selected from -N 3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • Z is O.
  • base 1 is selected from
  • the present invention provides a compound represented by formula I-2 or a salt thereof,
  • L1 is selected from
  • r 1 , r 2 , r 3a , r 3b are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M is selected from direct bond, CH2 , NH, O, S;
  • X is selected from O, S, NH;
  • Y is selected from direct bond, O, S, NH;
  • W is selected from direct bond, O, S, NH;
  • any one (such as R 1 or R 5 ) is The rest are each independently selected from H, azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic Alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (such as C1-C6 alkoxy);
  • r 5 , r 6 , and r 7 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • r 8 is selected from 0, 1,
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O, S;
  • R a is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3 -C6 cycloalkyl);
  • Z is selected from O, S, BH;
  • base 1 is selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine or its tautomer;
  • R' represents a reversible blocking group
  • L 1 is selected from
  • L 1 is selected from
  • r 1 is selected from 1, 2, 3.
  • r 1 is 1.
  • r 2 is selected from 1, 2, 3.
  • r 2 is 1.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3.
  • r 3a is 1.
  • r 3b is 2.
  • M is selected from CH2 , O.
  • X is selected from O, S.
  • X is O.
  • Y is a direct bond
  • W is a direct bond
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 (eg R 1 or R 5 ) is The rest are H.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 1 is The rest are H.
  • R is selected from
  • r 5 is selected from 1, 2, 3.
  • r5 is 2.
  • r 6 is selected from 1, 2, 3.
  • r 6 is 1.
  • r7 is selected from 1 , 2, 3.
  • r7 is 2.
  • M 1 is a direct bond.
  • Ra is selected from C1-C6 alkyl.
  • Ra is methyl
  • Z is O.
  • base 1 is selected from
  • the present invention provides a compound represented by formula II-1 or a salt thereof,
  • X is selected from O, S, NH;
  • W is selected from direct bond, O, S, NH;
  • any one (such as R 3 or R 4 ) is The rest are independently selected from H, Azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic alkyl (such as phenyl-C1 -C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (such as C1-C6 alkoxy);
  • r 5 and r 6 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M 1 , M 3 are each independently selected from direct bond, NH, O, S;
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH 2 , -OCOR x , -OCONHR x , the other is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), wherein each R x is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl) ) or aromatic alkyl (such as phenyl C1-C6 alkyl);
  • Z is selected from O, S, BH;
  • base 2 is selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine or its tautomer;
  • X is selected from O, S.
  • X is O.
  • W is a direct bond
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 (eg R 3 or R 4 ) is The rest are independently selected from H,
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 (eg R 3 or R 4 ) is Another (eg R 1 or R 5 ) is The remaining three are H.
  • R1 is the remaining three are H.
  • R is selected from
  • r 5 is selected from 1, 2, 3.
  • r5 is 2.
  • r 6 is selected from 1, 2, 3.
  • r 6 is selected from 1, 2.
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O.
  • M 3 is selected from direct bonds, NH.
  • any one of R b , R c is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t -Bu), the other is selected from C1-C6 alkyl.
  • either one of Rb , Rc is -N3 or -SS-Me and the other is methyl.
  • Z is O.
  • base 2 is selected from
  • the present invention provides a compound represented by formula II-2 or a salt thereof,
  • X is selected from O, S, NH;
  • W is selected from direct bond, O, S, NH;
  • any one (such as R 1 or R 5 ) is The rest are each independently selected from H, azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic Alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (such as C1-C6 alkoxy);
  • r 5 , r 6 , and r 7 are selected from any integer between 1-6;
  • r 8 is selected from 0, 1;
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O, S;
  • R a is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3 -C6 cycloalkyl);
  • Z is selected from O, S, BH;
  • base 2 is selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine or its tautomer;
  • X is selected from O, S.
  • X is O.
  • W is a direct bond
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 (eg R 1 or R 5 ) is The rest are H.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 1 is The rest are H.
  • R is selected from
  • r 5 is selected from 1, 2, 3.
  • r5 is 2.
  • r 6 is selected from 1, 2, 3.
  • r 6 is 1.
  • r7 is selected from 1 , 2, 3.
  • r7 is 2.
  • M 1 is a direct bond.
  • Ra is selected from C1-C6 alkyl.
  • Ra is methyl
  • Z is O.
  • base 2 is selected from
  • the aforementioned reversible blocking group R' is selected from N3 - C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl, NH 2 , -ONH 2 , -OCOR z , -OCONHR z , wherein each R z is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl) or Aromatic alkyl (eg phenyl C1-C6 alkyl).
  • the reversible blocking group R' is selected from N3 - C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl, NH2 .
  • the reversible blocking group R' is selected from N3 - C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl,
  • the reversible blocking group R' is selected from N3-CH2-, CH3 - CH2 - SS - CH2-,
  • any one of R 1' , R 2' , R 3' , R 4' , R 5' is The rest are each independently selected from H, azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic Alkyl (eg phenyl-C1-C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (eg C1-C6 alkoxy).
  • any one of R 1' , R 2' , R 3' , R 4' , R 5' is The rest are H.
  • R 1' , R 2' , R 3' , R 4' , R 5' , R 1' is The rest are H.
  • any one of R b' , R c' is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS -t-Bu), -ONH2 , -OCORx , -OCONHRx , another selected from H, aliphatic alkyl (eg C1-C6 alkyl, eg Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), wherein each R x is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (eg C3-C6 cycloalkyl) or aromatic alkyl (eg phenyl C1-C6 alkyl).
  • aliphatic alkyl e
  • any one of R b' , R c' is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS -t-Bu), the other is selected from C1-C6 alkyl.
  • any one of Rb' , Rc' is selected from -N3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • the present invention also provides a compound represented by formula III or a salt thereof,
  • L1 is selected from
  • r 2 is selected from 1, 2, and 3;
  • r 3a is selected from 1, 2, 3;
  • r 3b is selected from 0, 1, 2, 3;
  • M is selected from direct bond, O;
  • any one is Another (eg R 1 or R 2 ) is selected from The remaining three are H;
  • r m is selected from 0, 1, 2, 3;
  • r 5 is selected from 1, 2, 3;
  • r 6 is selected from 1, 2, and 3;
  • r 10 is selected from any integer between 1-10;
  • r 11 is selected from any integer between 1-6;
  • M 1 is selected from NH, O;
  • M 1 is selected from NH, O;
  • M 3 is selected from direct bond, NH
  • any one is selected from -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), and the other is selected from C1- C6 alkyl;
  • R 0 is selected from H, a monophosphate group diphosphate group triphosphate group tetraphosphate group
  • Each Z is independently selected from O, S, BH;
  • base 1 is selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine or its tautomer;
  • R' represents a reversible blocking group.
  • L 1 is selected from
  • r 2 is 1.
  • r 3a is 1.
  • r 3b is selected from 0, 2.
  • L c is selected from a direct bond
  • the NH terminal in Lc is connected to H
  • rm is selected from 0, 1.
  • r5 is 2.
  • r 6 is 1 or 2.
  • r 10 is selected from any integer between 2-6.
  • r 10 is 2 or 6.
  • r 11 is selected from 1, 2, 3.
  • r 11 is 1.
  • either of R b , R c is -SS-Me and the other is methyl.
  • R is selected from
  • R 0 is a triphosphate group
  • Z is O.
  • base 1 is selected from
  • the reversible blocking group R' is Of R 1' , R 2' , R 3' , R 4' , and R 5' , any one (such as R 1' or R 5' ) is The other (such as R 3' ) is selected from H, C1-C6 alkoxy (such as methoxy), and the rest are H; any one of R b' and R c' is selected from -N 3 , -SS-C1 -C6 alkyl (eg -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), another selected from C1-C6 alkyl.
  • R 1' is R 2' , R 3' , R 4' , R 5' , R 1' is R 3' is selected from H, C1-C6 alkoxy (eg, methoxy), and the rest are H.
  • any one of Rb' , Rc' is -N3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • the aforementioned compounds are selected from Table A below:
  • the aforementioned compounds or salts thereof carry additional detectable labels.
  • the additional detectable label carried by the compound or salt thereof is introduced by an affinity reagent (eg, antibody, aptamer, affinity desmin) that carries the detectable label label, and the affinity reagent can specifically recognize and bind to the epitope of the compound or its salt.
  • an affinity reagent eg, antibody, aptamer, affinity desmin
  • the detectable label corresponds to R in the compound of formula I, formula II, formula I-1, formula I-2, formula II-1 or formula II-2 or in the aforementioned specific compounds
  • the structural part of R is connected.
  • the detectable label is associated with Or linked to the terminal amino group in its corresponding moiety.
  • the carboxyl group in the detectable label is associated with Alternatively, the terminal amino group in the corresponding moiety is linked by forming an amide bond.
  • the detectable label is attached to R in the compound of Formula III or to the moiety corresponding to R in the aforementioned specific compounds.
  • the detectable label is associated with Or linked to the terminal amino group in its corresponding moiety.
  • the detectable label is associated with Alternatively, the terminal amino group in the corresponding moiety is linked by forming an amide bond.
  • the base 1 is different and the additional detectable label carried by the compound of formula I is different.
  • the base 2 is different and the additional detectable label carried by the compound of formula II is different.
  • the detectable label is a fluorescent label.
  • the detectable label is selected from the group consisting of iF700,
  • the aforementioned compounds are selected from the following Table B:
  • the present invention provides a method for terminating nucleic acid synthesis, comprising: incorporating the aforementioned compound or a salt thereof into a nucleic acid molecule to be terminated.
  • incorporation of the compound or salt thereof is accomplished by a terminal transferase, terminal polymerase, or reverse transcriptase.
  • the method comprises incorporating the compound or salt thereof into the nucleic acid molecule to be terminated using a polymerase.
  • the method comprises: using a polymerase to polymerize nucleotides under conditions that allow the polymerase to polymerize the nucleotides, thereby incorporating the compound or salt thereof into the nucleic acid molecule to be terminated 3' end.
  • the present invention provides a method for preparing a growing polynucleotide complementary to a target single-stranded polynucleotide in a sequencing reaction, comprising incorporating the aforementioned compound or a salt thereof into said growing complementary A polynucleotide wherein incorporation of the compound or salt thereof prevents the introduction of any subsequent nucleotides into the growing complementary polynucleotide.
  • incorporation of the compound or salt thereof is accomplished by a terminal transferase, terminal polymerase, or reverse transcriptase.
  • the method comprises incorporating the compound or salt thereof into the grown complementary polynucleotide using a polymerase.
  • the method comprises: using a polymerase to polymerize nucleotides under conditions that allow the polymerase to polymerize the nucleotides, thereby incorporating the compound or salt thereof into the growing complement 3' end of the polynucleotide.
  • the present invention provides a nucleic acid intermediate formed in determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide, wherein the nucleic acid intermediate is formed by the following steps:
  • the nucleic acid intermediate is formed by incorporating a nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide into the growing nucleic acid strand, wherein the incorporated complementary nucleotide is the aforementioned compound or a salt thereof.
  • the present invention provides a nucleic acid intermediate formed in determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide, wherein the nucleic acid intermediate is formed by the following steps:
  • a nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide is incorporated into the growing nucleic acid strand to form the nucleic acid intermediate, wherein the incorporated one complementary nucleotide is the aforementioned compound or a salt thereof, and the The growing nucleic acid chain is pre-incorporated with at least one nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide, and the pre-incorporated at least one nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide is a reversible blocking group that has been removed and an optionally detectably labeled compound of the foregoing or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide, comprising:
  • nucleotide complementary to a target single-stranded polynucleotide in a growing nucleic acid strand wherein at least one complementary nucleotide incorporated is the aforementioned compound or a salt thereof, and,
  • the reversible blocking group and optional detectable label are removed prior to introduction of the next complementary nucleotide.
  • the reversible blocking group and the detectable label are removed simultaneously.
  • the reversible blocking group and the detectable label are removed sequentially; eg, the reversible blocking group is removed after the detectable label is removed, or, After the reversible blocking group is removed, the detectable label is removed.
  • the method of determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide comprises the steps of:
  • nucleotides (a) providing a plurality of different nucleotides, wherein at least one of the nucleotides is the aforementioned compound or salt thereof, and optionally the remaining nucleotides are the aforementioned compound or salt thereof;
  • sequence of the target single-stranded polynucleotide is determined.
  • the method of determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide comprises the steps of:
  • nucleotide (1) providing a first nucleotide, a second nucleotide, a third nucleotide and a fourth nucleotide, at least one of the four nucleotides is the aforementioned compound or a salt thereof, optionally the rest
  • the nucleotide is the aforementioned compound or a salt thereof;
  • the method of determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide comprises the steps of:
  • the cleavage of the reversible blocking group and the cleavage of the detectable label are performed simultaneously, or alternatively, the cleavage of the reversible blocking group and the cleavage of the detectable label are separated (eg, the reversible blocking group is cleaved first, or the detectable label is cleaved first).
  • the cleavage reagent used for cleavage of the reversible blocking group and cleavage of the detectable label is the same reagent.
  • the cleavage reagents used for cleavage of the reversible blocking group and cleavage of the detectable label are different reagents.
  • the duplex is attached to a support.
  • the growing nucleic acid strand is a primer.
  • the primers form the duplex by annealing to the nucleic acid strand to be sequenced.
  • the duplex, the compound or salt thereof, and the polymerase together form a reaction system comprising a solution phase and a solid phase.
  • the compound or salt thereof is incorporated into a growing nucleic acid strand using a polymerase under conditions that allow the polymerase to polymerize nucleotides, forming a compound comprising a reversible blocking group and optionally a reversible blocking group. Detection of labeled nucleic acid intermediates.
  • the polymerase is selected from KOD polymerases or mutants thereof (eg, KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391).
  • the solution phase of the reaction system of the previous step is removed, and the duplex attached to the support is retained.
  • the excision reagent is contacted with the duplex or the growing nucleic acid strand in a reaction system comprising a solution phase and a solid phase.
  • the cleavage reagent is capable of cleaving the reversible blocking group and optionally the detectable label carried by the compound incorporated into the growing nucleic acid strand without affecting the phosphate dibasic on the duplex backbone ester bond.
  • the solution phase of the reaction system for this step is removed.
  • a washing operation is performed.
  • step (ii) after step (ii), it further comprises: according to the signal detected in step (ii), determining the type of compound incorporated into the growing nucleic acid strand in step (i), and based on the principle of complementary base pairing, Determine the type of nucleotide at the corresponding position in the nucleic acid strand to be sequenced.
  • the present invention provides a kit comprising at least one of the aforementioned compounds or salts thereof.
  • the kit comprises first, second, third and fourth compounds, each of which is independently the aforementioned compound or a salt thereof.
  • base 1 in the first compound, is selected from adenine, 7-deazaadenine, or a tautomer thereof (eg ); in the second compound, base 1 is selected from thymine, uracil or its tautomer (for example ); in the third compound, base 1 is selected from cytosine or its tautomer (for example ); in the fourth compound, base 1 is selected from guanine, 7-deazaguanine or its tautomer (for example ).
  • base 2 in the first compound, is selected from adenine, 7-deazaadenine or a tautomer thereof (eg ); in the second compound, base 2 is selected from thymine, uracil or its tautomer (for example ); in the third compound, base 2 is selected from cytosine or its tautomer (for example ); in the fourth compound, base 2 is selected from guanine, 7-deazaguanine or its tautomer (for example ).
  • the first, second, third and fourth compounds comprise base 1 or base 2 that are different from each other.
  • the additional detectable labels carried by the first, second, third and fourth compounds are different from each other.
  • the kit further comprises: reagents for pretreating nucleic acid molecules; a support for ligating nucleic acid molecules to be sequenced; valence or non-covalent linkage) reagents; primers for initiating nucleotide polymerization; polymerases for carrying out nucleotide polymerization; one or more buffer solutions; one or more washing solutions; or any combination thereof.
  • the present invention provides the use of the aforementioned compound or a salt thereof or the aforementioned kit for determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide.
  • the present invention also provides a compound represented by formula I-1 or a salt thereof,
  • L1 is selected from
  • r 1 , r 2 , r 3a , r 3b are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M is selected from direct bond, CH2 , NH, O, S;
  • X is selected from O, S, NH;
  • Y is selected from direct bond, O, S, NH;
  • W is selected from direct bond, O, S, NH;
  • any one (such as R 2 , R 3 or R 4 ) is The rest are independently selected from H, Azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic alkyl (such as phenyl-C1 -C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (such as C1-C6 alkoxy);
  • r 5 and r 6 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M 1 , M 3 are each independently selected from direct bond, NH, O, S;
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH 2 , -OCOR x , -OCONHR x , the other is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), wherein each R x is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl) ) or aromatic alkyl (such as phenyl C1-C6 alkyl);
  • Z is selected from O, S, BH;
  • base 1 is selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine or its tautomer;
  • R' represents a reversible blocking group
  • L 1 is selected from
  • L 1 is selected from
  • r 1 is selected from 1, 2, 3.
  • r 1 is 1.
  • r 2 is selected from 1, 2, 3.
  • r 2 is 1.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3.
  • r 3a is 1.
  • r 3b is 2.
  • M is selected from CH2 , O.
  • X is selected from O, S.
  • X is O.
  • Y is a direct bond
  • W is a direct bond
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 (eg R 2 , R 3 or R 4 ) is The rest are independently selected from H,
  • any one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 (eg R 2 , R 3 or R 4 ) is Another (eg R 1 or R 5 ) is The remaining three are H.
  • R1 is the remaining three are H.
  • R is selected from
  • r 5 is selected from 1, 2, 3.
  • r5 is 2.
  • r 6 is selected from 1, 2, 3.
  • r 6 is 1 or 2.
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O.
  • M 3 is selected from direct bonds, NH.
  • M 3 when M 1 is NH, O, or S, M 3 is a direct bond, and when M 3 is NH, O, or S, M 1 is a direct bond.
  • any one of R b , R c is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t -Bu), the other is selected from C1-C6 alkyl.
  • any one of R b , R c is selected from -N 3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • Z is O.
  • base 1 is selected from
  • L1 is selected from
  • r 1 , r 2 , r 3a , r 3b are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M is selected from direct bond, CH2 , NH, O, S;
  • X is selected from O, S, NH;
  • Y is selected from direct bond, O, S, NH;
  • W is selected from direct bond, O, S, NH;
  • any one (such as R 2 , R 3 or R 4 ) is Another (eg R 1 or R 5 ) is The remaining three are H;
  • r 5 and r 6 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • M 1 , M 3 are each independently selected from direct bond, NH, O, S;
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), the other is selected from C1-C6 alkyl;
  • Z is selected from O, S, BH;
  • base 1 is selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine or its tautomer;
  • R' represents a reversible blocking group
  • L 1 is selected from
  • r 1 is selected from 1, 2, and 3.
  • r 1 is 1.
  • r 2 is selected from 1, 2, and 3.
  • r 2 is 1.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5.
  • r 3a , r 3b are each independently selected from 1, 2, 3.
  • r 3a is 1.
  • r 3b is 2.
  • M is selected from CH2 , O.
  • X is selected from O, S.
  • X is O.
  • Y is a direct bond
  • W is a direct bond
  • R1 is the remaining three are H.
  • r 5 is selected from 1, 2, 3.
  • r5 is 2.
  • r 6 is selected from 1, 2, and 3.
  • r 6 is 1 or 2.
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O.
  • M 3 is selected from direct bonds, NH.
  • M 3 when M 1 is NH, O, or S, M 3 is a direct bond, and when M 3 is NH, O, or S, M 1 is a direct bond.
  • any one of R b , R c is selected from -N 3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • Z is O
  • base 1 is selected from
  • the aforementioned reversible blocking group R' is selected from N3 - C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl, NH 2 , -ONH 2 , -OCOR z , -OCONHR z , wherein each R z is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl) or Aromatic alkyl (eg phenyl C1-C6 alkyl).
  • the reversible blocking group R' is selected from N3 - C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl, NH2 .
  • the reversible blocking group R' is selected from N3 - C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl,
  • the reversible blocking group R' is selected from N3-CH2-, CH3 - CH2 - SS - CH2-,
  • any one of R 1' , R 2' , R 3' , R 4' , R 5' is The rest are each independently selected from H, azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic Alkyl (eg phenyl-C1-C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (eg C1-C6 alkoxy).
  • any one of R 1' , R 2' , R 3' , R 4' , R 5' is The rest are H.
  • R 1' , R 2' , R 3' , R 4' , R 5' , R 1' is The rest are H.
  • any one of R b' , R c' is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS -t-Bu), -ONH2 , -OCORx , -OCONHRx , another selected from H, aliphatic alkyl (eg C1-C6 alkyl, eg Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), wherein each R x is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (eg C3-C6 cycloalkyl) or aromatic alkyl (eg phenyl C1-C6 alkyl).
  • aliphatic alkyl e
  • any one of R b' , R c' is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS -t-Bu), the other is selected from C1-C6 alkyl.
  • any one of Rb' , Rc' is selected from -N3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • the present invention provides a compound represented by formula I-1 or a salt thereof,
  • L1 is selected from
  • L 1 is selected from
  • r 1 , r 2 , r 3a , r 3b are each independently selected from any integer between 1-6;
  • r 1 is selected from 1, 2, 3;
  • r 1 is 1;
  • r 2 is selected from 1, 2, 3;
  • r 2 is 1;
  • r 3a and r 3b are each independently selected from 1, 2, 3, 4, and 5;
  • r 3a and r 3b are each independently selected from 1, 2, and 3;
  • r 3a is 1;
  • r 3b is 2;
  • M is selected from direct bond, CH2 , NH, O, S;
  • M is selected from CH 2 , O;
  • X is selected from O, S, NH;
  • X is selected from O, S;
  • X is O
  • Y is selected from direct bond, O, S, NH;
  • Y is a direct bond
  • W is selected from direct bond, O, S, NH;
  • W is a direct bond
  • any one (such as R 2 , R 3 or R 4 ) is Another (eg R 1 or R 5 ) is The remaining three are H;
  • R1 is The remaining three are H;
  • r 5 and r 6 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • r 5 is selected from 1, 2, 3;
  • r 5 is 2;
  • r 6 is selected from 1, 2, 3;
  • r 6 is 1 or 2;
  • M 1 , M 3 are each independently selected from direct bond, NH, O, S;
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O;
  • M is selected from direct bond, NH;
  • M 3 is a direct bond
  • M 1 is a direct bond
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), the other is selected from C1-C6 alkyl;
  • any one is selected from -N 3 , -SS-Me, and the other is methyl;
  • Z is selected from O, S, BH;
  • Z is O
  • base 1 is selected from bases, deaza bases or tautomers thereof, such as adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine or its tautomer;
  • base 1 is selected from
  • R' represents a reversible blocking group
  • the reversible blocking group R' is selected from N3-CH2-, CH3 - CH2 - SS - CH2-,
  • R 1' , R 2' , R 3' , R 4' , and R 5' any one (such as R 1' or R 5' ) is The rest are H,
  • R 1' is The rest are H,
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), The other is selected from C1-C6 alkyl,
  • any one of R b' and R c' is selected from -N 3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • the aforementioned compounds are selected from the following Table C:
  • the aforementioned compounds or salts thereof carry additional detectable labels.
  • the additional detectable label carried by the compound or salt thereof is introduced by an affinity reagent (eg, antibody, aptamer, avidin, desmin) that carries the detectable label
  • an affinity reagent eg, antibody, aptamer, avidin, desmin
  • the label is detected, and the affinity reagent can specifically recognize and bind to the epitope of the compound or salt thereof.
  • the detectable label is attached to R in the compound of Formula I-1 or a moiety corresponding to R in the aforementioned specific compounds.
  • the detectable label is associated with terminal amino linkage in .
  • the carboxyl group in the detectable label is associated with The terminal amino group in is linked by forming an amide bond.
  • the base 1 is different and the additional detectable label carried by the compound of formula 1-1 is different.
  • the detectable label is a fluorescent label.
  • the detectable label is selected from the group consisting of iF700,
  • the detectable label is selected from the group consisting of iF700,
  • the aforementioned compounds are selected from the following Table D:
  • the present invention provides a method for terminating nucleic acid synthesis, comprising: incorporating the aforementioned compound or a salt thereof into a nucleic acid molecule to be terminated.
  • incorporation of the compound or salt thereof is accomplished by a terminal transferase, terminal polymerase, or reverse transcriptase.
  • the method comprises incorporating the compound or salt thereof into the nucleic acid molecule to be terminated using a polymerase.
  • the method comprises: using a polymerase to polymerize nucleotides under conditions that allow the polymerase to polymerize the nucleotides, thereby incorporating the compound or salt thereof into the nucleic acid molecule to be terminated 3' end.
  • the present invention provides a method for preparing a growing polynucleotide complementary to a target single-stranded polynucleotide in a sequencing reaction, comprising incorporating the aforementioned compound or a salt thereof into the growing polynucleotide A complementary polynucleotide wherein incorporation of the compound or salt thereof prevents the introduction of any subsequent nucleotides into the growing complementary polynucleotide.
  • incorporation of the compound or salt thereof is accomplished by a terminal transferase, terminal polymerase, or reverse transcriptase.
  • the method comprises incorporating the compound or salt thereof into the grown complementary polynucleotide using a polymerase.
  • the method comprises: using a polymerase to polymerize nucleotides under conditions that allow the polymerase to polymerize the nucleotides, thereby incorporating the compound or salt thereof into the growing complement 3' end of the polynucleotide.
  • the present invention provides a nucleic acid intermediate formed in determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide, wherein the nucleic acid intermediate is formed by the following steps:
  • the nucleic acid intermediate is formed by incorporating a nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide into the growing nucleic acid strand, wherein the incorporated complementary nucleotide is the aforementioned compound or a salt thereof.
  • the present invention provides a nucleic acid intermediate formed in determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide, wherein the nucleic acid intermediate is formed by the following steps:
  • a nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide is incorporated into the growing nucleic acid strand to form the nucleic acid intermediate, wherein the incorporated one complementary nucleotide is the aforementioned compound or a salt thereof, and the The growing nucleic acid chain is pre-incorporated with at least one nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide, and the pre-incorporated at least one nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide is a reversible blocking group that has been removed and an optionally detectably labeled compound of the foregoing or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide, comprising:
  • nucleotide complementary to a target single-stranded polynucleotide in a growing nucleic acid strand wherein at least one complementary nucleotide incorporated is the aforementioned compound or a salt thereof, and,
  • the reversible blocking group and optional detectable label are removed prior to introduction of the next complementary nucleotide.
  • the reversible blocking group and the detectable label are removed simultaneously.
  • the reversible blocking group and the detectable label are removed sequentially; eg, the reversible blocking group is removed after the detectable label is removed, or, After the reversible blocking group is removed, the detectable label is removed.
  • the method of determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide comprises the steps of:
  • nucleotides (a) providing a plurality of different nucleotides, wherein at least one of the nucleotides is the aforementioned compound or salt thereof, and optionally the remaining nucleotides are the aforementioned compound or salt thereof;
  • sequence of the target single-stranded polynucleotide is determined.
  • the method of determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide comprises the steps of:
  • nucleotide (1) providing a first nucleotide, a second nucleotide, a third nucleotide and a fourth nucleotide, at least one of the four nucleotides is the aforementioned compound or a salt thereof, optionally the rest
  • the nucleotide is the aforementioned compound or a salt thereof;
  • the method of determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide comprises the steps of:
  • the cleavage of the reversible blocking group and the cleavage of the detectable label are performed simultaneously, or alternatively, the cleavage of the reversible blocking group and the cleavage of the detectable label are separated (eg, the reversible blocking group is cleaved first, or the detectable label is cleaved first).
  • the cleavage reagent used for cleavage of the reversible blocking group and cleavage of the detectable label is the same reagent.
  • the cleavage reagents used for cleavage of the reversible blocking group and cleavage of the detectable label are different reagents.
  • the duplex is attached to a support.
  • the growing nucleic acid strand is a primer.
  • the primers form the duplex by annealing to the nucleic acid strand to be sequenced.
  • the duplex, the compound or salt thereof, and the polymerase together form a reaction system comprising a solution phase and a solid phase.
  • the compound or salt thereof is incorporated into a growing nucleic acid strand using a polymerase under conditions that allow the polymerase to polymerize nucleotides, forming a compound comprising a reversible blocking group and optionally a reversible blocking group. Detection of labeled nucleic acid intermediates.
  • the polymerase is selected from KOD polymerases or mutants thereof (eg, KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391).
  • the solution phase of the reaction system of the previous step is removed, and the duplex attached to the support is retained.
  • the excision reagent is contacted with the duplex or the growing nucleic acid strand in a reaction system comprising a solution phase and a solid phase.
  • the cleavage reagent is capable of cleaving the reversible blocking group and optionally the detectable label carried by the compound incorporated into the growing nucleic acid strand without affecting the phosphate dibasic on the duplex backbone ester bond.
  • the solution phase of the reaction system for this step is removed.
  • a washing operation is performed.
  • step (ii) after step (ii), it further comprises: according to the signal detected in step (ii), determining the type of compound incorporated into the growing nucleic acid strand in step (i), and based on the principle of complementary base pairing, Determine the type of nucleotide at the corresponding position in the nucleic acid strand to be sequenced.
  • the present invention provides a kit comprising at least one of the aforementioned compounds or salts thereof.
  • the kit comprises first, second, third and fourth compounds, each of which is independently the aforementioned compound or a salt thereof.
  • base 1 in the first compound, is selected from adenine, 7-deazaadenine, or a tautomer thereof (eg ); in the second compound, base 1 is selected from thymine, uracil or its tautomer (for example ); in the third compound, base 1 is selected from cytosine or its tautomer (for example ); in the fourth compound, base 1 is selected from guanine, 7-deazaguanine or its tautomer (for example ).
  • the first, second, third and fourth compounds comprise base 1 that are different from each other.
  • the additional detectable labels carried by the first, second, third and fourth compounds are different from each other.
  • the kit further comprises: reagents for pretreating nucleic acid molecules; a support for ligating nucleic acid molecules to be sequenced; valence or non-covalent linkage) reagents; primers for initiating nucleotide polymerization; polymerases for carrying out nucleotide polymerization; one or more buffer solutions; one or more washing solutions; or any combination thereof.
  • the present invention provides the use of the aforementioned compound or a salt thereof or the aforementioned kit for determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide.
  • the present invention further provides a nucleotide analog composed of ribose or deoxyribose, a reversible blocking group, a base or a deaza base or its interconversion Isomers, linkers for linking detectable labels and optional phosphate groups are formed, wherein the linkers comprise the structure shown in the following formula A or formula A':
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH 2 , -OCOR x , -OCONHR x , -S-SO 2 R x , the other is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), wherein each R x is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl) or aromatic alkyl (such as phenyl C1-C6 alkyl
  • any one of R b and R c is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu) , the other is selected from C1-C6 alkyl;
  • any one is selected from -N 3 , -SS-Me, -SS-Et, and the other is methyl;
  • any one is selected from -N 3 , -SS-Me, and the other is methyl;
  • R a is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3 -C6 cycloalkyl);
  • R a is selected from H, C1-C6 alkyl
  • R a is methyl
  • X is selected from O, S, NH;
  • X is selected from O, S;
  • X is O
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O, S, CH 2 ;
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O;
  • the reversible blocking group is linked to the 3'-OH of the ribose or deoxyribose, and the base or deaza base or its tautomer is linked to the 1' of the ribose or deoxyribose -C is attached, the optional phosphate group is attached to the 5'-OH of the ribose or deoxyribose, and the linker is attached to the base or deaza base or its tautomer.
  • the structure represented by formula A is represented by formula A-1, formula A-2, formula A-3, formula A-4 or formula A-5, preferably as formula A-1, formula A- 2 or shown in formula A-5; or, the structure shown in formula A' is shown in formula A'-1, formula A'-2 or formula A'-3, preferably as shown in formula A'-1;
  • R a , R b , R c , X and M 1 are as described above.
  • the structure of Formula A is selected from the group consisting of:
  • nucleotide analog has the structure shown in Formula B below:
  • L x has the aforementioned formula A, formula A', formula A-1, formula A-2, formula A-3, formula A-4, formula A-5, formula A'-1, formula A'-2 or formula
  • base 1 represents a base or deaza base or its tautomer
  • R' represents a reversible blocking group
  • R 0 represents H or a phosphate group
  • L a represents the part of the linker used to link the base or deaza base or its tautomer
  • L b represents the portion of the linker for attaching a detectable label.
  • nucleotide analog has the structure shown in Formula B below:
  • Lx has formula A, formula A', formula A-1, formula A-2, formula A-3, formula A-4, formula A-5, formula A'-1, formula A'- 2 or the structural formula shown in formula A'-3, and the M 1 end or S end of L x is connected to L b , and the O end of L x is connected to L a ;
  • L a is selected from
  • La is selected from
  • L a is selected from:
  • L a is selected from:
  • L a is selected from:
  • L a is selected from:
  • r 1 , r 2 , r 3a , r 3b , r 4 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • r 1 is selected from 1, 2, 3;
  • r 1 is 1;
  • r 2 is selected from 1, 2, 3;
  • r 2 is 1;
  • r 3a and r 3b are each independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, and 5, and r 3a and r 3b are not 0 at the same time;
  • r 3a and r 3b are each independently selected from 0, 1, 2, and 3, and r 3a and r 3b are not 0 at the same time;
  • r 3a is selected from 0, 1
  • r 3b is selected from 0, 2
  • r 3a and r 3b are not 0 at the same time;
  • r 3a is 1;
  • r 3b is 2;
  • r 4 is selected from 1, 2, 3;
  • r 4 is 1;
  • M is selected from direct bond, CH2 , NH, O, S;
  • M is selected from direct bond, CH 2 , O;
  • M is selected from CH 2 , O;
  • L b is selected from
  • L b is selected from
  • L b is selected from
  • L b is selected from:
  • L c is selected from direct bond,
  • the NH end in L c is connected with H in L b
  • r m is selected from any integer between 0-6;
  • rm is selected from 0, 1, 2, 3;
  • rm is selected from 0, 1;
  • r 5 , r 6 , and r 7 are each independently selected from any integer between 1-6;
  • r 5 is selected from 1, 2, 3;
  • r 5 is 2;
  • r 6 is selected from 1, 2, 3;
  • r 6 is 1 or 2;
  • r 7 is selected from 1, 2, 3;
  • r 7 is 2;
  • r 10 is selected from any integer between 1-10;
  • r 10 is selected from any integer between 2-6;
  • r 10 is 2 or 6;
  • r 11 is selected from any integer between 1-6;
  • r 11 is selected from 1, 2, 3;
  • r 11 is 1;
  • M 1 , M 2 , and M 3 are each independently selected from direct bond, NH, O, S, CH 2 ;
  • M 1 is selected from direct bond, NH, O;
  • M 2 is NH
  • M is selected from direct bond, NH;
  • base 1 means base or deaza base
  • R' represents a reversible blocking group
  • R 0 represents H or a phosphate group.
  • the base 1 is selected from adenine, 7-deazaadenine, thymine, uracil, cytosine, guanine, 7-deazaguanine, or a tautomer thereof;
  • base 1 is selected from
  • R 0 is selected from H, a monophosphate group diphosphate group triphosphate group tetraphosphate group
  • R 0 is a triphosphate group
  • Each Z is independently selected from O, S, BH;
  • Z is O.
  • the reversible blocking group R' is selected from N3 - C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl, NH 2 , -ONH 2 , -OCOR z , -OCONHR z , wherein each R z is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl) or Aromatic alkyl (such as phenyl C1-C6 alkyl);
  • the reversible blocking group R' is selected from N 3 -C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl, NH 2 ;
  • the reversible blocking group R' is selected from N 3 -C1-C6 alkyl, C1-C6 alkyl-SS-C1-C6 alkyl,
  • the reversible blocking group R' is selected from N 3 -CH 2 -, CH 3 -CH 2 -SS-CH 2 -,
  • any one (such as R 1' or R 5' ) is The rest are each independently selected from H, azido, nitro, amino, sulfo, carboxyl, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), aromatic Alkyl (such as phenyl-C1-C6 alkyl), F, I, Br, Cl, alkoxy (such as C1-C6 alkoxy),
  • any one of R 1' , R 2' , R 3' , R 4' and R 5' is Another (such as R 3' ) is selected from H, C1-C6 alkoxy (such as methoxy), the rest are H,
  • any one of R 1' , R 2' , R 3' , R 4' and R 5' (such as R 1' or R 5' ) is The rest are H,
  • R 1' is The rest are H
  • any one is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t-Bu), -ONH 2 , -OCOR x , -OCONHR x , the other is selected from H, aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl, such as Me, Et, iPr, tBu), aromatic alkyl (such as phenyl-C1 -C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 cycloalkyl), wherein each R x is independently selected from aliphatic alkyl (such as C1-C6 alkyl), cycloalkyl (such as C3-C6 ring alkyl) or aromatic alkyl (such as phenyl C1-C6 alkyl),
  • any one of R b' and R c' is selected from -N 3 , -SS-C1-C6 alkyl (such as -SS-Me, -SS-Et, -SS-iPr, -SS-t- Bu), another is selected from C1-C6 alkyl,
  • any one of R b' and R c' is selected from -N 3 , -SS-Me, and the other is methyl.
  • nucleotide analogs are selected from the compounds in Table A and Table C above.
  • the nucleotide analog carries an additional detectable label, and the detectable label is attached to a linker (preferably L b );
  • the additional detectable label carried by the nucleotide analog is introduced by an affinity reagent (eg, antibody, aptamer, avidin, desmin) that carries the detectable label , and the affinity reagent can specifically recognize and bind to the epitope of the nucleotide analog; preferably, the detectable label is linked to the terminal amino group of the L b ;
  • an affinity reagent eg, antibody, aptamer, avidin, desmin
  • the carboxyl group in the detectable label is connected to the terminal amino group of the L b by forming an amide bond;
  • the base 1 is different and the additional detectable label carried by the nucleotide analogs is different;
  • the detectable label is a fluorescent label
  • the detectable label is selected from the following: iF700,
  • the nucleotide analog is selected from the compounds in Table B and Table D above.
  • the present invention provides a method for terminating nucleic acid synthesis, comprising: incorporating the aforementioned nucleotide analogs into the nucleic acid molecule to be terminated;
  • the incorporation of the nucleotide analog is achieved by terminal transferase, terminal polymerase or reverse transcriptase;
  • the method comprises: using a polymerase, incorporating the nucleotide analog into the nucleic acid molecule to be terminated;
  • the method comprises: using a polymerase to polymerize nucleotides under conditions that allow the polymerase to polymerize the nucleotides, thereby incorporating the nucleotide analog into 3 of the nucleic acid molecule to be terminated 'end.
  • the present invention provides a method of preparing a growing polynucleotide complementary to a target single-stranded polynucleotide in a sequencing reaction, comprising incorporating the aforementioned nucleotide analog into the a grown complementary polynucleotide, wherein incorporation of the nucleotide analog prevents the introduction of any subsequent nucleotides into the grown complementary polynucleotide;
  • the incorporation of the nucleotide analog is achieved by terminal transferase, terminal polymerase or reverse transcriptase;
  • the method comprises: using a polymerase, incorporating the nucleotide analog into the growing complementary polynucleotide;
  • the method comprises: using a polymerase to polymerize nucleotides under conditions that allow the polymerase to polymerize the nucleotides, thereby incorporating the nucleotide analog into the growing complementary polynucleoside the 3' end of the acid.
  • the present invention provides a nucleic acid intermediate formed in determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide, wherein,
  • the nucleic acid intermediate is formed by the following steps:
  • nucleic acid intermediate is formed by the following steps:
  • a nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide is incorporated into the growing nucleic acid strand to form the nucleic acid intermediate, wherein the incorporated one complementary nucleotide is the aforementioned nucleotide analog, and the At least one nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide is pre-incorporated into the growing nucleic acid chain, and the pre-incorporated at least one nucleotide complementary to the target single-stranded polynucleotide is a reversible blocking group that has been removed.
  • the present invention provides a method for determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide, comprising:
  • nucleotides complementary to the target single-stranded polynucleotide in the growing nucleic acid strand wherein at least one complementary nucleotide incorporated is an analog of the aforementioned nucleotides, and,
  • the reversible blocking group and optional detectable label are removed prior to the introduction of the next complementary nucleotide
  • the reversible blocking group and the detectable label are removed simultaneously;
  • the reversible blocking group and the detectable label are removed sequentially; for example, the reversible blocking group is removed after the detectable label is removed, or, after the reversible blocking After the group is removed, the detectable label is removed.
  • the method includes the steps of:
  • nucleotides (a) providing a plurality of different nucleotides, wherein at least one of the nucleotides is an analog of the aforementioned nucleotides, optionally the remaining nucleotides are analogs of the aforementioned nucleotides;
  • sequence of the target single-stranded polynucleotide is determined.
  • the method includes the steps of:
  • nucleotide analogs (1) providing a first nucleotide, a second nucleotide, a third nucleotide and a fourth nucleotide, at least one of the four nucleotides being the aforementioned nucleotide analogs, optionally The remaining nucleotides are the aforementioned nucleotide analogs;
  • the method includes the steps of:
  • the cleavage of the reversible blocking group and the cleavage of the detectable label are performed simultaneously, or the cleavage of the reversible blocking group and the cleavage of the detectable label are performed in steps ( For example, the reversible blocking group is cleaved first, or the detectable label is cleaved first);
  • the cleavage reagent used for the cleavage of the reversible blocking group and the cleavage of the detectable label is the same reagent;
  • the cleavage reagents used for the cleavage of the reversible blocking group and the detectable label are different reagents.
  • the duplex is attached to a support
  • the growing nucleic acid strand is a primer
  • the primer is annealed to the nucleic acid strand to be sequenced to form the duplex;
  • the duplex, the nucleotide analog, and the polymerase together form a reaction system comprising a solution phase and a solid phase;
  • the nucleotide analog is incorporated into a growing nucleic acid strand using a polymerase under conditions that allow the polymerase to polymerize the nucleotides, forming a formation comprising a reversible blocking group and optionally a detectable label nucleic acid intermediates;
  • the polymerase is selected from KOD polymerases or mutants thereof (eg KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391);
  • the solution phase of the reaction system of the previous step is removed, and the duplex connected to the support is retained;
  • the excision reagent is contacted with the duplex or the growing nucleic acid strand in a reaction system comprising a solution phase and a solid phase;
  • the excision reagent is capable of excising the reversible blocking group and optionally the detectable label carried by the nucleotide analog incorporated into the growing nucleic acid strand, and does not affect the phosphates on the duplex backbone diester bond;
  • the solution phase of the reaction system in this step is removed;
  • a washing operation is performed after any one of the steps comprising a removal operation
  • step (ii) it further comprises: according to the signal detected in step (ii), determining the type of nucleotide analog incorporated into the growing nucleic acid chain in step (i), and based on the principle of complementary base pairing , to determine the type of nucleotide at the corresponding position in the nucleic acid strand to be sequenced.
  • the present invention provides a kit comprising at least one of the aforementioned nucleotide analogs
  • the kit comprises first, second, third and fourth compounds, each of which is independently the aforementioned nucleotide analog;
  • base 1 is selected from adenine, 7-deazaadenine or its tautomer (eg ); in the second compound, base 1 is selected from thymine, uracil or its tautomer (for example ); in the third compound, base 1 is selected from cytosine or its tautomer (for example ); in the fourth compound, base 1 is selected from guanine, 7-deazaguanine or its tautomer (for example );
  • the base 1 contained in the first, second, third and fourth compounds are different from each other;
  • the additional detectable labels carried by the first, second, third and fourth compounds are different from each other.
  • the kit further comprises: reagents for pretreating nucleic acid molecules; a support for ligating nucleic acid molecules to be sequenced; valence or non-covalent linkage) reagents; primers for initiating nucleotide polymerization; polymerases for carrying out nucleotide polymerization; one or more buffer solutions; one or more washing solutions; or any combination thereof.
  • the present invention provides the use of the aforementioned nucleotide analog or the aforementioned kit for determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide.
  • Figure 1 shows that the bases of the embodiments of the present invention carry cleavable (fluorescent) labeled nucleotide analogs
  • Figure 2 shows a 3'-OH reversible blocking group with a (fluorescent) labeled nucleotide analog of an embodiment of the present invention.
  • C1-C6 alkyl specifically refers to the independently disclosed methyl, ethyl, C3 alkyl, C4 alkyl, C5 alkyl and C6 alkyl groups.
  • aliphatic alkyl refers to any straight or branched chain saturated group containing 1 to 20 carbon atoms, eg, C1 -C12 alkyl, preferably C1 - C6 alkyl.
  • C 1 -C 6 alkyl refers to any straight or branched chain saturated group containing 1-6 carbon atoms, such as methyl (Me), ethyl (Et), n-propyl, isopropyl Propyl (iPr), n-butyl, isobutyl, tert-butyl (tBu), sec-butyl, n-pentyl, tert-amyl, n-hexyl, etc.
  • alkoxy refers to any of the aforementioned alkyl groups (eg, C1 - C6 alkyl groups, etc.), which are attached to the remainder of the molecule through an oxygen atom (-O-).
  • cycloalkyl refers to a hydrocarbon having a 3-10 membered monocyclic ring system with saturated rings, eg, C3 - C8 cycloalkyl, preferably C3 - C6 cycloalkyl.
  • C 3 -C 6 cycloalkyl refers to a hydrocarbon having a 3-6 membered monocyclic ring system with saturated rings, and the C 3 -C 6 cycloalkyl can be cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclo Hexy etc.
  • aromatic alkyl refers to arylalkyl or heteroarylalkyl, wherein alkyl is as defined above.
  • heteroaryl refers to an aromatic heterocycle, typically a 5-, 6-, 7-, 8-membered heterocycle having 1 to 3 heteroatoms selected from N, O or S; heteroaryl
  • the base ring can optionally be further fused or attached to aromatic and non-aromatic carbocyclic and heterocyclic rings.
  • Non-limiting examples of such heteroaryl groups are eg pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, indolyl, imidazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thioxazolyl, pyrrolyl, benzene yl-pyrrolyl, furyl, phenyl-furyl, oxazolyl, isoxazolyl, pyrazolyl, thienyl, benzofuranyl, benzothienyl, benzol,3-dioxolane (benzodioxin), isoindoline, benzimidazolyl, indazolyl, quinolinyl, isoquinolinyl, 1,2,3-triazolyl, 1-phenyl-1, 2,3-triazolyl, 2,3-indoline, 2,3-dihydrobenzofuranyl, 2,3-dihydrobenz
  • aryl refers to a group of a carbocyclic aromatic system having 6-14 carbon atoms, such as C6-C10 aryl, preferably phenyl.
  • any group whose name is a compound name, such as "phenyl C1-C6 alkyl”, should refer to the moiety from which it is conventionally derived, such as from benzene C1-C6 alkyl group substituted with C1-C6 alkyl group, wherein C1-C6 alkyl group is as defined above.
  • an example of the term "salt of a compound of formula I, formula I-1, formula I-2, formula II, formula II-1, formula II-2, formula III” is an anion-forming organic Organic acid addition salts formed by acids, including but not limited to formate, acetate, propionate, benzoate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, citrate , ascorbate, ⁇ -ketoglutarate, ⁇ -glycerophosphate, alkylsulfonate or arylsulfonate; preferably, the alkylsulfonate is methylsulfonate or ethylsulfonate acid salt; the aryl sulfonate is benzene sulfonate or p-toluene sulfonate.
  • Suitable inorganic salts may also be formed including, but not limited to, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, nitrate, bicarbonate and carbonate,
  • direct bond means that the groups on either side of it are directly attached, for example, the formula , if M 3 is a direct bond, its structural formula becomes For another example, the formula , if M 3 is a direct bond, its structural formula becomes For another example, the formula , if M3 is a direct bond, its structural formula becomes
  • the detectable label is associated with
  • the terminal amino group in is connected, which includes the following two cases: 1) when r 8 is not 0, "terminal amino group” refers to the amino group at the end of the structural formula; 2) When r 8 is 0, the structural formula becomes M 2 may be NH. In this case, it can be understood that the "terminal amino group” refers to the last amino group of the modified structural formula.
  • the detectable label is associated with The terminal amino group in is connected, wherein "terminal amino group” refers to the last amino group of the structural formula.
  • the detectable label is linked to the terminal amino group of the L b , and the L b is, for example, "terminal amino group” refers to the last amino group of the formula.
  • the substance is composed of the two chains of the growing nucleic acid chain and the nucleic acid chain to be sequenced, it is called a "duplex", and it is the same as the growing nucleic acid chain or the nucleic acid chain to be sequenced. Regardless of chain length, the nucleic acid chain to be sequenced can be longer than the chain length of the growing nucleic acid chain.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced can be any nucleic acid molecule of interest.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced comprises deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified deoxyribonucleotides, modified ribonucleotides, or any combination thereof.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced is not limited by its type.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced is DNA or RNA.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced may be genomic DNA, mitochondrial DNA, chloroplast DNA, mRNA, cDNA, miRNA, or siRNA.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced is linear or circular. In certain preferred embodiments, the nucleic acid molecule to be sequenced is double-stranded or single-stranded.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced can be single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA), single-stranded RNA (ssRNA), double-stranded RNA (dsRNA), or a hybrid of DNA and RNA.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced is single-stranded DNA. In certain preferred embodiments, the nucleic acid molecule to be sequenced is double-stranded DNA.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced is not limited by its origin.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced can be obtained from any source, eg, any cell, tissue, or organism (eg, viruses, bacteria, fungi, plants, and animals).
  • the nucleic acid molecules to be sequenced are derived from mammals (eg, humans, non-human primates, rodents, or canines), plants, birds, reptiles, fish, Fungi, bacteria or viruses.
  • nucleic acid molecules from cells, tissues or organisms are well known to those skilled in the art. Suitable methods include, but are not limited to, ethanol precipitation, chloroform extraction, and the like. Detailed descriptions of such methods can be found, for example, in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and F.M. Ausubel et al., An In-depth Molecular Biology Laboratory Guide , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995. In addition, various commercial kits can be used to extract nucleic acid molecules from various sources (eg, cells, tissues, or organisms).
  • the nucleic acid molecule to be sequenced is not limited by its length.
  • the length of the nucleic acid molecule to be sequenced can be at least 10 bp, at least 20 bp, at least 30 bp, at least 40 bp, at least 50 bp, at least 100 bp, at least 200 bp, at least 300 bp, at least 400 bp, at least 500 bp, at least 1000 bp in length , or at least 2000bp.
  • the length of the nucleic acid molecule to be sequenced can be 10-20bp, 20-30bp, 30-40bp, 40-50bp, 50-100bp, 100-200bp, 200-300bp, 300-400bp, 400-500bp, 500-1000bp, 1000-2000bp, or more than 2000bp.
  • nucleic acid molecules to be sequenced may have a length of 10-1000 bp to facilitate high-throughput sequencing.
  • a suitable polymerase can be used to carry out the nucleotide polymerization reaction.
  • the polymerase is capable of synthesizing new DNA strands using DNA as a template (eg, a DNA polymerase).
  • the polymerase is capable of synthesizing new DNA strands using RNA as a template (eg, reverse transcriptase).
  • the polymerase is capable of synthesizing new RNA strands using DNA or RNA as a template (eg, RNA polymerase).
  • the polymerase is selected from the group consisting of DNA polymerases, RNA polymerases, and reverse transcriptases. According to actual needs, a suitable polymerase can be selected to carry out the nucleotide polymerization reaction.
  • the polymerization reaction is a polymerase chain reaction (PCR). In certain preferred embodiments, the polymerization reaction is a reverse transcription reaction.
  • KOD polymerase or a mutant thereof can be used to carry out nucleotide polymerization.
  • KOD polymerase or mutants thereof eg, KOD POL151, KOD POL157, KOD POL171, KOD POL174, KOD POL376, KOD POL391
  • KOD POL391 and KOD POL171 have acceptable polymerization efficiencies for the modified nucleotides of the present invention.
  • the polymerization efficiency of KOD POL391 or KOD POL171 for the modified nucleotides of the invention is above 70%, eg, 70%-80%, 80%-90%, or 90%-100%.
  • the polymerization reaction of nucleotides is carried out under suitable conditions.
  • suitable polymerization conditions include the composition of the solution phase and the concentration of each component, the pH of the solution phase, the polymerization temperature, and the like. Carrying out the polymerization under suitable conditions is beneficial to obtain acceptable, even high, polymerization efficiencies.
  • the hydroxyl group (-OH) at the 3' position of deoxyribose is protected (protected by R'), therefore, they Capable of terminating the polymerization of polymerases such as DNA polymerases.
  • polymerases such as DNA polymerases.
  • the compounds of formula I, formula II, formula III, and formula B are introduced into the 3' end of the growing nucleic acid chain, since there is no free hydroxyl group (-OH) at the 3' position of the deoxyribose sugar of the compound, The polymerase will not be able to proceed to the next round of polymerization and the polymerization will be terminated. In this case, in each round of polymerization, one and only one base will be incorporated into the growing nucleic acid strand.
  • the protective group (R') of the hydroxyl group (-OH) at the 3' position of the deoxyribose sugar of the compounds represented by the formula I, formula II, formula III and formula B can be removed and converted into a free hydroxyl group (- OH). Subsequently, a polymerase and compounds of formula I, formula II, formula III, and formula B can be used to perform the next round of polymerization on the growing nucleic acid chain, and a base is introduced again.
  • the hydroxyl group (-OH) at the 3' position of the deoxyribose sugar of the compounds of formula I, formula II, formula III, and formula B can be reversibly blocked: when formula I, formula II, formula III, and formula B are shown in formula B
  • the compounds When the compounds are incorporated into the 3' end of the growing nucleic acid chain, they will stop the polymerase from continuing to polymerize and terminate the further extension of the growing nucleic acid chain; After the contained blocking group is removed, the polymerase will be able to continue polymerizing the growing nucleic acid chain and continue to extend the nucleic acid chain.
  • Detection can be performed by any suitable method, including fluorescence spectroscopy or other optical means.
  • Preferred labels are fluorescent labels or fluorophores that emit radiation of defined wavelengths after absorbing energy.
  • Many suitable fluorescent labels are known.
  • Welch et al. (Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999) disclose dansyl-functionalized fluorescent moieties, which can be used in the present invention.
  • Zhu et al. (Cytometry 28:206-211, 1997) describe the use of fluorescent labels Cy3 and Cy5, which can also be used in the present invention.
  • Prober et al. Science 238:336-341, 1987
  • iF700 fluorescein, rhodamine (including TMR, Texas Red and Rox), alexa, fluoroboron, acridine, coumarin, pyrene, benzo Anthracene and anthocyanins.
  • iF700 is a fluorescent marker commonly used in the art, for example, see Table 7 of US20180223358A1, and the fluorescent marker is commercially available.
  • multiple labels can also be used in this application, such as a dual-fluorophore FRET cassette (Tet. Let. 46:8867-8871, 2000), a multi-fluorophore dendrimer system (J.Am.Chem.Soc.123:8101) -8108, 2001).
  • fluorescent labels are preferred, other forms of detectable labels will be apparent to those of ordinary skill in the art.
  • microparticles including quantum dots (Empodocles et al., Nature 399:126-130, 1999), gold nanoparticles (Reichert et al., Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000) and microbeads (Lacoste et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA 97(17):9461-9466, 2000) can also be used.
  • Multicomponent labels can also be used in this application.
  • Multicomponent labels are labels that rely on interaction with additional compounds for detection.
  • the most commonly used multicomponent labeling in biology is the biotin-streptavidin system. Biotin is used as a label attached to nucleotides or modified nucleotides. Streptavidin alone was then added to allow detection to occur.
  • Other multi-component systems can be used. For example, dinitrophenol has commercially available fluorescent antibodies for detection.
  • modified nucleotide or nucleoside molecules can be made to carry the above-described detectable label, the affinity reagent can specifically recognize and bind to the epitope of the modified nucleotide or nucleoside molecule.
  • the affinity reagent can specifically recognize and bind to the epitope of the modified nucleotide or nucleoside molecule.
  • modified nucleotide or nucleoside molecules can be linked to the detectable labels described above.
  • the linking group used is cleavable. The use of a cleavable linking group ensures that the label can be removed after detection if desired, which avoids any interfering signals with any subsequently incorporated labeled nucleotides or nucleosides.
  • the linking group can be cleaved by any suitable method, including exposure to acids, bases, nucleophiles, electrophiles, free radicals, metals, reducing or oxidizing agents, light, temperature, enzymes, and the like. Linking groups discussed herein can also be cleaved using the same catalysts used to cleave protecting groups at bases. Suitable linking groups can be modified from standard chemical protecting groups as disclosed in Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons. Suitable cleavable linking groups for solid phase synthesis are also disclosed in Guillier et al. (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000).
  • nucleoside cleavage site can be located at a position on the linking group that ensures that a portion of the linking group remains attached to the nucleoside after cleavage Acids or modified nucleotides remain attached.
  • nucleotides in this application have utility in Sanger sequencing, second-generation high-throughput sequencing (NGS sequencing), and third-generation sequencing (single-molecule sequencing) because by using the methods described herein Reversible blocking nucleotide analogs allow for the individual detection of nucleotide types incorporated in sequencing.
  • TBAF After condensation of the nucleoside with the acid DCC, TBAF removes the protecting group, and then uses the triphosphorylated triphosphate. After aminolysis, it is coupled with linker1, the trifluoroacetyl group is removed, and finally it is coupled with a fluorescent dye to obtain the product.
  • Linker 2 was obtained by condensing p-aminoazidobenzoic acid with a trifluoroacetyl-protected PEG linker.
  • the amino group is deacetylated, and then DCC is condensed.
  • Deprotection was performed using TBAF, followed by triphosphorylated triphosphate.
  • the trifluoroacetyl group is removed by ammonia cleavage, and finally the product is obtained by coupling with a fluorescent dye.
  • the amino group is deacetylated, and then DCC is condensed.
  • Deprotection was performed using TBAF, followed by triphosphorylated triphosphate.
  • the trifluoroacetyl group is removed by ammonia cleavage, and finally the product is obtained by coupling with a fluorescent dye.
  • the protecting groups are removed using TBAF, and the triphosphorylated triphosphates are then used.
  • the trifluoroacetyl group is removed by ammonia cleavage, coupled with linker 4, then the trifluoroacetyl group in the linker is removed, and finally the product is obtained by coupling with a fluorescent dye.
  • the protecting groups are removed using TBAF, and the triphosphorylated triphosphates are then used.
  • the trifluoroacetyl group is removed by ammonia cleavage, coupled with linker 5, then the trifluoroacetyl group in the linker is removed, and finally the product is obtained by coupling with a fluorescent dye.
  • step 4 300 mg of the substrate nucleoside obtained in step 4 was dissolved in 10 mL of THF, TBAF (2eq, 1M in THF) was added at 0 degrees, and the reaction was stirred at 0 degrees for 30 minutes, then warmed to room temperature and stirred for 4 hours. The reaction was directly column-separated to obtain 200 mg of white solid. MS[ES(-)], m/z 587.2.
  • the synthetic method was similar to Example 7-1, except that the iodo-A nucleoside substrate (OKeanos Tech, Cat. No. OK-N-16003) was used instead of the iodo-U nucleoside substrate. MS[ES(-)], m/z 513.2.
  • the synthetic method is similar to that of Example 7-1, except that the dyestuff is replaced by AF532 (purchased from OKeanos Tech, item number OKF 532). 13 mg solid, HPLC purity >99%.
  • the synthesis method was similar to Example 7-1, except that the iodo G nucleoside substrate (OKeanos Tech, Cat. No. OK-N-16004) was used instead of the iodo U nucleoside substrate.
  • Example 7-1 The synthetic method was similar to that of Example 7-1, except that the dye was replaced by CY5 (purchased from OKeanos Tech, item number OK-F-13103). 18 mg solid, HPLC purity >99%.
  • the synthetic method was similar to Example 7-1, except that the iodo C nucleoside substrate (OKeanos Tech, Cat. No. OK-N-16002) was used instead of the iodo U nucleoside substrate.
  • Example 7-1 The synthetic method was similar to that of Example 7-1, except that the dye was replaced by a commercial product of iF700 (iFluor TM 700 succinimidyl ester, available from AAT Bioquest). 16 mg solid, HPLC purity >99%. MS[ES(-)], m/z 1962.8.

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Abstract

本发明涉及核酸测序领域。特别地，本发明提供了用于测序的核苷酸类似物，所述核苷酸类似物的碱基上或者糖环3'-OH带有连接物，可用于NGS测序。本发明还涉及包含所述核苷酸类似物的试剂盒，以及基于所述核苷酸类似物的测序方法。

Description

用于测序的核苷酸类似物 技术领域
本发明涉及核酸测序领域。具体地，本发明涉及用于测序的核苷酸类似物。
背景技术
NGS测序的出现克服了Sanger测序成本高、测序时间长等缺点，极大地推动了基因测序技术的应用。目前，NGS测序已经在产前筛查、肿瘤诊断、肿瘤治疗、动植物育种等领域深度应用，带动了科技与医学的进步。
带有可逆阻断基团的核苷三磷酸(dNTP)类似物是NGS测序中关键原材料。由于可逆阻断基团的引入，使得dNTP中3’-OH基团可以保留，克服了Sanger测序中的缺点，同时保证了碱基识别的准确性。可以说带有可逆阻断基团的核苷三磷酸类似物(dNTP)是NGS测序中最为关键的技术。而NGS测序中带有可切断linker与可检测标记的核苷酸更是实现碱基检测的关键所在。
发明内容
本发明旨在开发一类在碱基上或者核苷酸糖环3’-OH带有可切断可检测标记的酯基、碳酸酯等dNTP类似物用于NGS测序。
第一类dNTP类似物的结构通式如图1所示，碱基带有可切断可检测标记的核苷酸，包括2’脱氧尿苷三磷酸、2’脱氧胞苷三磷酸、7-脱氮-2’脱氧腺苷三磷酸与7-脱氮--2’脱氧鸟苷三磷酸的主体结构。第一类dNTP类似物中，糖环3’-OH上连接有本领域常规使用的连接在3’-OH上效果优良的任意可逆阻断基团。第二类dNTP类似物的结构通式如图2所示，糖环3’-OH可逆阻断基团上带有可检测标记的核苷酸。
为此，在本发明的第一方面，本发明提供了式I或式II所示的化合物或其盐，
Figure PCTCN2022084601-appb-000001
其中：
L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000002
r 1、r 2、r 3a、r 3b、r 4各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
L 2为
Figure PCTCN2022084601-appb-000003
优选地，W与R相连；
L 3为
Figure PCTCN2022084601-appb-000004
优选地，W与R相连；
各X独立地选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
各W独立地选自直接键、O、S、NH；
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000005
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个为
Figure PCTCN2022084601-appb-000006
其余各自独立地选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000007
叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r 5、r 6、r 7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
r 8、r 9各自独立地选自0、1，且r 8、r 9不同时为0；
M 1、M 2、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
R a选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
R 0选自H、单磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000008
二磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000009
三磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000010
四磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000011
各Z独立地选自O，S，BH；
base 1、base 2各自独立地选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
式I中，R’表示可逆阻断基团，式II中，
Figure PCTCN2022084601-appb-000012
表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000013
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000014
Figure PCTCN2022084601-appb-000015
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000016
Figure PCTCN2022084601-appb-000017
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000018
Figure PCTCN2022084601-appb-000019
在一些实施方案中，r 1选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 1为1。
在一些实施方案中，r 2选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 2为1。
在一些实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 3a为1。
在一些实施方案中，r 3b为2。
在一些实施方案中，r 4选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 4为1。
在一些实施方案中，M选自CH 2、O。
在一些实施方案中，各X独立地选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，Y为直接键。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个为
Figure PCTCN2022084601-appb-000020
其余各自独立地选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000021
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个为
Figure PCTCN2022084601-appb-000022
另一个(如R 1或R 5)选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000023
剩余三个为H。
在一些实施方案中，r 5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 5为2。
在一些实施方案中，r 6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 6为1或2。
在一些实施方案中，r 7选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 7为2。
在一些实施方案中，M 1选自直接键、NH、O。
在一些实施方案中，M 2为NH。
在一些实施方案中，M 3选自直接键、NH。
在一些实施方案中，R a选自H、C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R a为甲基。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me、-SS-Et，另一个为甲基。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，R选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000024
Figure PCTCN2022084601-appb-000025
Figure PCTCN2022084601-appb-000026
在一些实施方案中，R 0为三磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000027
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000028
在一些实施方案中，base 2选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000029
在本发明的第二方面，本发明提供了式I-1所示的化合物或其盐，
Figure PCTCN2022084601-appb-000030
其中：
L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000031
r 1、r 2、r 3a、r 3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
X选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000032
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000033
其余各自独立地选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000034
叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r 5、r 6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M 1、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
Z选自O，S，BH；
base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000035
Figure PCTCN2022084601-appb-000036
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000037
Figure PCTCN2022084601-appb-000038
在一些实施方案中，r 1选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 1为1。
在一些实施方案中，r 2选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 2为1。
在一些实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 3a为1。
在一些实施方案中，r 3b为2。
在一些实施方案中，M选自CH 2、O。
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，Y为直接键。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000039
其余各自独立地选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000040
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000041
另一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000042
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 3或R 4为
Figure PCTCN2022084601-appb-000043
R 1为
Figure PCTCN2022084601-appb-000044
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000045
Figure PCTCN2022084601-appb-000046
在一些实施方案中，r 5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 5为2。
在一些实施方案中，r 6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 6为1或2。
在一些实施方案中，M 1选自直接键、NH、O。
在一些实施方案中，M 3选自直接键、NH。
在一些实施方案中，M 1为NH、O或S时，M 3为直接键，且M 3为NH、O或S时，M 1为直接键。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000047
在本发明的第三方面，本发明提供了式I-2所示的化合物或其盐，
Figure PCTCN2022084601-appb-000048
其中：
L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000049
r 1、r 2、r 3a、r 3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
X选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000050
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000051
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r 5、r 6、r 7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
r 8选自0、1，
M 1选自直接键、NH、O、S；
R a选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
Z选自O，S，BH；
base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000052
Figure PCTCN2022084601-appb-000053
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000054
Figure PCTCN2022084601-appb-000055
在一些实施方案中，r 1选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 1为1。
在一些实施方案中，r 2选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 2为1。
在一些实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 3a为1。
在一些实施方案中，r 3b为2。
在一些实施方案中，M选自CH 2、O。
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，Y为直接键。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000056
其余为H。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 1为
Figure PCTCN2022084601-appb-000057
其余为H。
在一些实施方案中，R选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000058
Figure PCTCN2022084601-appb-000059
在一些实施方案中，r 5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 5为2。
在一些实施方案中，r 6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 6为1。
在一些实施方案中，r 7选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 7为2。
在一些实施方案中，M 1为直接键。
在一些实施方案中，R a选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R a为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000060
在本发明的第四方面，本发明提供了式II-1所示的化合物或其盐，
Figure PCTCN2022084601-appb-000061
其中：
X选自O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000062
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000063
其余各自独立地选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000064
叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r 5、r 6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M 1、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
Z选自O，S，BH；
base 2选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
Figure PCTCN2022084601-appb-000065
表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000066
其余各自独立地选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000067
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000068
另一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000069
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 3或R 4为
Figure PCTCN2022084601-appb-000070
R 1为
Figure PCTCN2022084601-appb-000071
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000072
Figure PCTCN2022084601-appb-000073
在一些实施方案中，r 5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 5为2。
在一些实施方案中，r 6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 6选自1、2。
在一些实施方案中，M 1选自直接键、NH、O。
在一些实施方案中，M 3选自直接键、NH。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个为-N 3或-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base 2选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000074
在本发明的第五方面，本发明提供了式II-2所示的化合物或其盐，
Figure PCTCN2022084601-appb-000075
其中：
X选自O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000076
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000077
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、 芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r 5、r 6、r 7选自1-6之间的任意整数；
r 8选自0、1；
M 1选自直接键、NH、O、S；
R a选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
Z选自O，S，BH；
base 2选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
Figure PCTCN2022084601-appb-000078
表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000079
其余为H。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 1为
Figure PCTCN2022084601-appb-000080
其余为H。
在一些实施方案中，R选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000081
在一些实施方案中，r 5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 5为2。
在一些实施方案中，r 6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 6为1。
在一些实施方案中，r 7选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 7为2。
在一些实施方案中，M 1为直接键。
在一些实施方案中，R a选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R a为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base 2选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000082
在一些实施方案中，前述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000083
NH 2、-ONH 2、-OCOR z、-OCONHR z，其中，各R z独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6 烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000084
NH 2。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000085
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-CH 2-、CH 3-CH 2-S-S-CH 2-、
Figure PCTCN2022084601-appb-000086
在一些实施方案中，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000087
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)。
在一些实施方案中，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000088
其余为H。
在一些实施方案中，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
Figure PCTCN2022084601-appb-000089
其余为H。
在一些实施方案中，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)。
在一些实施方案中，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在本发明的第六方面，本发明还提供了式III所示的化合物或其盐，
Figure PCTCN2022084601-appb-000090
其中：
L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000091
r 2选自1、2、3；
r 3a选自1、2、3；
r 3b选自0、1、2、3；
M选自直接键、O；
L 2为
Figure PCTCN2022084601-appb-000092
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000093
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 3)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000094
另一个(如R 1或R 2)选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000095
剩余三个为H；
L c选自直接键、
Figure PCTCN2022084601-appb-000096
优选地，L c中的NH端与H相连，L c中的＝O端与NH相连；
r m选自0、1、2、3；
r 5选自1、2、3；
r 6选自1、2、3；
r 10选自1-10之间的任意整数；
r 11选自1-6之间的任意整数；
M 1选自NH、O；
M 1选自NH、O；
M 3选自直接键、NH；
R b、R c中，任意一个选自-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
R 0选自H、单磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000097
二磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000098
三磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000099
四磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000100
各Z独立地选自O，S，BH；
base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
式III中，R’表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000101
在一些实施方案中，r 2为1。
在一些实施方案中，r 3a为1。
在一些实施方案中，r 3b选自0、2。
在一些实施方案中，L c选自直接键、
Figure PCTCN2022084601-appb-000102
Figure PCTCN2022084601-appb-000103
优选地，L c中的NH端与H相连，L c中的＝O端与NH相连。
在一些实施方案中，r m选自0、1。
在一些实施方案中，r 5为2。
在一些实施方案中，r 6为1或2。
在一些实施方案中，r 10选自2-6之间的任意整数。
在一些实施方案中，r 10为2或6。
在一些实施方案中，r 11选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 11为1。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个为-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，R选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000104
Figure PCTCN2022084601-appb-000105
在一些实施方案中，R 0为三磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000106
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000107
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’为
Figure PCTCN2022084601-appb-000108
R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000109
另一个(如R 3’)选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H；R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
Figure PCTCN2022084601-appb-000110
R 3’选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H。
在一些实施方案中，R b’、R c’中，任意一个为-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，前述化合物选自以下表A：
表A：
Figure PCTCN2022084601-appb-000111
Figure PCTCN2022084601-appb-000112
Figure PCTCN2022084601-appb-000113
Figure PCTCN2022084601-appb-000114
Figure PCTCN2022084601-appb-000115
Figure PCTCN2022084601-appb-000116
Figure PCTCN2022084601-appb-000117
Figure PCTCN2022084601-appb-000118
Figure PCTCN2022084601-appb-000119
Figure PCTCN2022084601-appb-000120
Figure PCTCN2022084601-appb-000121
Figure PCTCN2022084601-appb-000122
Figure PCTCN2022084601-appb-000123
Figure PCTCN2022084601-appb-000124
Figure PCTCN2022084601-appb-000125
Figure PCTCN2022084601-appb-000126
Figure PCTCN2022084601-appb-000127
Figure PCTCN2022084601-appb-000128
Figure PCTCN2022084601-appb-000129
Figure PCTCN2022084601-appb-000130
Figure PCTCN2022084601-appb-000131
Figure PCTCN2022084601-appb-000132
Figure PCTCN2022084601-appb-000133
Figure PCTCN2022084601-appb-000134
Figure PCTCN2022084601-appb-000135
Figure PCTCN2022084601-appb-000136
Figure PCTCN2022084601-appb-000137
Figure PCTCN2022084601-appb-000138
Figure PCTCN2022084601-appb-000139
Figure PCTCN2022084601-appb-000140
Figure PCTCN2022084601-appb-000141
Figure PCTCN2022084601-appb-000142
Figure PCTCN2022084601-appb-000143
Figure PCTCN2022084601-appb-000144
Figure PCTCN2022084601-appb-000145
Figure PCTCN2022084601-appb-000146
Figure PCTCN2022084601-appb-000147
Figure PCTCN2022084601-appb-000148
Figure PCTCN2022084601-appb-000149
Figure PCTCN2022084601-appb-000150
Figure PCTCN2022084601-appb-000151
Figure PCTCN2022084601-appb-000152
Figure PCTCN2022084601-appb-000153
Figure PCTCN2022084601-appb-000154
Figure PCTCN2022084601-appb-000155
在一些实施方案中，前述化合物或其盐携带额外的可检测标记。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述化合物或其盐的表位。
在一些实施方案中，所述可检测标记与式I、式II、式I-1、式I-2、式II-1或式II-2所示化合物中的R或前述具体化合物中对应于R的结构部分连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与
Figure PCTCN2022084601-appb-000156
或者与其对应的结构部分中的末端氨基连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记中的羧基与
Figure PCTCN2022084601-appb-000157
或者与其对应的结构部分中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与式III所示化合物中的R连接或前述具体化合物中对应于R的结构部分连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与
Figure PCTCN2022084601-appb-000158
或者与其对应的结构部分中的末端氨基连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与
Figure PCTCN2022084601-appb-000159
或者与其对应的结构部分中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接。
在一些实施方案中，base 1不同，式I所示化合物携带的额外的可检测标记不同。
在一些实施方案中，base 2不同，式II所示化合物携带的额外的可检测标记不同。
在一些实施方案中，所述可检测标记为荧光标记。
在一些实施方案中，所述可检测标记选自以下：iF700、
Figure PCTCN2022084601-appb-000160
Figure PCTCN2022084601-appb-000161
在一些实施方案中，前述化合物选自以下表B：
表B：
Figure PCTCN2022084601-appb-000162
Figure PCTCN2022084601-appb-000163
Figure PCTCN2022084601-appb-000164
Figure PCTCN2022084601-appb-000165
Figure PCTCN2022084601-appb-000166
Figure PCTCN2022084601-appb-000167
Figure PCTCN2022084601-appb-000168
Figure PCTCN2022084601-appb-000169
Figure PCTCN2022084601-appb-000170
Figure PCTCN2022084601-appb-000171
Figure PCTCN2022084601-appb-000172
Figure PCTCN2022084601-appb-000173
Figure PCTCN2022084601-appb-000174
Figure PCTCN2022084601-appb-000175
Figure PCTCN2022084601-appb-000176
Figure PCTCN2022084601-appb-000177
Figure PCTCN2022084601-appb-000178
Figure PCTCN2022084601-appb-000179
Figure PCTCN2022084601-appb-000180
Figure PCTCN2022084601-appb-000181
Figure PCTCN2022084601-appb-000182
Figure PCTCN2022084601-appb-000183
Figure PCTCN2022084601-appb-000184
Figure PCTCN2022084601-appb-000185
Figure PCTCN2022084601-appb-000186
Figure PCTCN2022084601-appb-000187
Figure PCTCN2022084601-appb-000188
Figure PCTCN2022084601-appb-000189
Figure PCTCN2022084601-appb-000190
Figure PCTCN2022084601-appb-000191
Figure PCTCN2022084601-appb-000192
Figure PCTCN2022084601-appb-000193
Figure PCTCN2022084601-appb-000194
Figure PCTCN2022084601-appb-000195
Figure PCTCN2022084601-appb-000196
Figure PCTCN2022084601-appb-000197
Figure PCTCN2022084601-appb-000198
Figure PCTCN2022084601-appb-000199
Figure PCTCN2022084601-appb-000200
Figure PCTCN2022084601-appb-000201
Figure PCTCN2022084601-appb-000202
Figure PCTCN2022084601-appb-000203
在本发明的第七方面，本发明提供了终止核酸合成的方法，其包括：将前述的化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中。
在一些实施方案中，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用 聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子的3'端。
在本发明的第八方面，本发明提供了制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将前述的化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述化合物或其盐的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸。
在一些实施方案中，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
在本发明的第九方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐。
在本发明的第十方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的前述的化合物或其盐。
在本发明的第十一方面，本发明提供了测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐，以及，
2)确定掺入的核苷酸的类型。
在一些实施方案中，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是前述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是前述的化合物或其盐；
(b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
(c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
(d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
(e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是前述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是前述的化合物或其盐；
(2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(a)提供包含双链体、包含至少一种前述的化合物或其盐的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
(b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
步骤(i)：使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的所述可检测标记切除。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
在一些实施方案中，所述双链体连接于支持物上。
在一些实施方案中，所述生长的核酸链为引物。
在一些实施方案中，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体。
在一些实施方案中，所述双链体、所述化合物或其盐、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系。
在一些实施方案中，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体。
在一些实施方案中，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)。
在一些实施方案中，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体。
在一些实施方案中，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中接触。
在一些实施方案中，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的化合物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键。
在一些实施方案中，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相。
在一些实施方案中，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作。
在一些实施方案中，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的化合物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
在本发明的第十二方面，本发明提供了试剂盒，其包含至少一个前述的化合物或其盐。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为前述的化合物或其盐。
在一些实施方案中，所述第一化合物中，base 1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000204
)；所述第二化合物中，base 1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000205
)；所述第三化合物中，base 1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000206
)；所述第四化合物中，base 1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例 如
Figure PCTCN2022084601-appb-000207
)。
在一些实施方案中，所述第一化合物中，base 2选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000208
)；所述第二化合物中，base 2选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000209
)；所述第三化合物中，base 2选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000210
)；所述第四化合物中，base 2选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000211
)。
在一些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base 1或base 2互不相同。
在一些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
在本发明的第十三方面，本发明提供了前述的化合物或其盐或者前述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
另外，在本发明的第十四方面，本发明还提供了式I-1所示的化合物或其盐，
Figure PCTCN2022084601-appb-000212
其中：
L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000213
r 1、r 2、r 3a、r 3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
X选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000214
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000215
其余各自独立地选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000216
叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
r 5、r 6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M 1、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
Z选自O，S，BH；
base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团。
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000217
Figure PCTCN2022084601-appb-000218
在一些实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000219
Figure PCTCN2022084601-appb-000220
在一些实施方案中，r 1选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 1为1。
在一些实施方案中，r 2选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 2为1。
在一些实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 3a为1。
在一些实施方案中，r 3b为2。
在一些实施方案中，M选自CH 2、O。
在一些实施方案中，X选自O、S。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，Y为直接键。
在一些实施方案中，W为直接键。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000221
其余各自独立地选自H、
Figure PCTCN2022084601-appb-000222
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000223
另一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000224
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 3或R 4为
Figure PCTCN2022084601-appb-000225
R 1为
Figure PCTCN2022084601-appb-000226
剩余三个为H。
在一些实施方案中，R选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000227
Figure PCTCN2022084601-appb-000228
在一些实施方案中，r 5选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 5为2。
在一些实施方案中，r 6选自1、2、3。
在一些实施方案中，r 6为1或2。
在一些实施方案中，M 1选自直接键、NH、O。
在一些实施方案中，M 3选自直接键、NH。
在一些实施方案中，M 1为NH、O或S时，M 3为直接键，且M 3为NH、O或S时，M 1为直接键。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，Z为O。
在一些实施方案中，base 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000229
在一些具体实施方案中，式I-1所示的化合物中：
L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000230
r 1、r 2、r 3a、r 3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
X选自O、S、NH；
Y选自直接键、O、S、NH；
W选自直接键、O、S、NH；
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000231
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000232
另一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000233
剩余三个为H；
r 5、r 6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
M 1、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
Z选自O，S，BH；
base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团。
在一些具体实施方案中，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000234
Figure PCTCN2022084601-appb-000235
在一些具体实施方案中，r 1选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r 1为1。
在一些具体实施方案中，r 2选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r 2为1。
在一些具体实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5。
在一些具体实施方案中，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r 3a为1。
在一些具体实施方案中，r 3b为2。
在一些具体实施方案中，M选自CH 2、O。
在一些具体实施方案中，X选自O、S。
在一些具体实施方案中，X为O。
在一些具体实施方案中，Y为直接键。
在一些具体实施方案中，W为直接键。
在一些具体实施方案中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 3或R 4为
Figure PCTCN2022084601-appb-000236
R 1为
Figure PCTCN2022084601-appb-000237
剩余三个为H。
在一些具体实施方案中，r 5选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r 5为2。
在一些具体实施方案中，r 6选自1、2、3。
在一些具体实施方案中，r 6为1或2。
在一些具体实施方案中，M 1选自直接键、NH、O。
在一些具体实施方案中，M 3选自直接键、NH。
在一些具体实施方案中，M 1为NH、O或S时，M 3为直接键，且M 3为NH、O或S时，M 1为直接键。
在一些具体实施方案中，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些具体实施方案中，Z为O。
在一些具体实施方案中，base 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000238
在一些实施方案中，前述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000239
NH 2、-ONH 2、-OCOR z、-OCONHR z，其中，各R z独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000240
NH 2。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000241
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-CH 2-、CH 3-CH 2-S-S-CH 2-、
Figure PCTCN2022084601-appb-000242
在一些实施方案中，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000243
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)。
在一些实施方案中，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000244
其余为H。
在一些实施方案中，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
Figure PCTCN2022084601-appb-000245
其余为H。
在一些实施方案中，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)。
在一些实施方案中，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些具体实施方案中，本发明提供了式I-1所示的化合物或其盐，
Figure PCTCN2022084601-appb-000246
其中：
L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000247
优选地，L 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000248
Figure PCTCN2022084601-appb-000249
r 1、r 2、r 3a、r 3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r 1选自1、2、3；
更优选地，r 1为1；
优选地，r 2选自1、2、3；
更优选地，r 2为1；
优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5；
更优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3；
最优选地，r 3a为1；
最优选地，r 3b为2；
M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
优选地，M选自CH 2、O；
X选自O、S、NH；
优选地，X选自O、S；
更优选地，X为O；
Y选自直接键、O、S、NH；
优选地，Y为直接键；
W选自直接键、O、S、NH；
优选地，W为直接键；
R为
Figure PCTCN2022084601-appb-000250
R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000251
另一个(如R 1或R 5)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000252
剩余三个为H；
优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 3或R 4为
Figure PCTCN2022084601-appb-000253
R 1为
Figure PCTCN2022084601-appb-000254
剩余三个为H；
r 5、r 6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r 5选自1、2、3；
更优选地，r 5为2；
优选地，r 6选自1、2、3；
更优选地，r 6为1或2；
M 1、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
优选地，M 1选自直接键、NH、O；
优选地，M 3选自直接键、NH；
更优选地，M 1为NH、O或S时，M 3为直接键，且M 3为NH、O或S时，M 1为直接键；
R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基；
Z选自O，S，BH；
优选地，Z为O；
base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
优选地，base 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000255
R’表示可逆阻断基团。
在一些具体实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-CH 2-、CH 3-CH 2-S-S-CH 2-、
Figure PCTCN2022084601-appb-000256
R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000257
其余为H，
优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
Figure PCTCN2022084601-appb-000258
其余为H，
R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
优选地，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，前述化合物选自以下表C：
表C：
Figure PCTCN2022084601-appb-000259
Figure PCTCN2022084601-appb-000260
Figure PCTCN2022084601-appb-000261
在一些实施方案中，前述化合物或其盐携带额外的可检测标记。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物、结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述化合物或其盐的表位。
在一些实施方案中，所述可检测标记与式I-1所示化合物中的R或前述具体化合物中对应于R的结构部分连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记与
Figure PCTCN2022084601-appb-000262
中的末端氨基连接。
在一些实施方案中，所述可检测标记中的羧基与
Figure PCTCN2022084601-appb-000263
中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接。
在一些实施方案中，base 1不同，式I-1所示化合物携带的额外的可检测标记不同。
在一些实施方案中，所述可检测标记为荧光标记。
在一些实施方案中，所述可检测标记选自以下：iF700、
Figure PCTCN2022084601-appb-000264
Figure PCTCN2022084601-appb-000265
Figure PCTCN2022084601-appb-000266
在一些实施方案中，所述可检测标记选自以下：iF700、
Figure PCTCN2022084601-appb-000267
Figure PCTCN2022084601-appb-000268
在一些实施方案中，前述化合物选自以下表D：
表D：
Figure PCTCN2022084601-appb-000269
Figure PCTCN2022084601-appb-000270
Figure PCTCN2022084601-appb-000271
Figure PCTCN2022084601-appb-000272
Figure PCTCN2022084601-appb-000273
在本发明的第十五方面，本发明提供了终止核酸合成的方法，其包括：将前述的化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中。
在一些实施方案中，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子的3'端。
在本发明的第十六方面，本发明提供了制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将前述的化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述化合物或其盐的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中。
在一些实施方案中，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸。
在一些实施方案中，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
在本发明的第十七方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐。
在本发明的第十八方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的前述的化合物或其盐。
在本发明的第十九方面，本发明提供了测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是前述的化合物或其盐，以及，
2)确定掺入的核苷酸的类型。
在一些实施方案中，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是前述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是前述的化合物或其盐；
(b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
(c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
(d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
(e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是前述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是前述的化合物或其盐；
(2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
在一些实施方案中，所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括以下步骤：
(a)提供包含双链体、包含至少一种前述的化合物或其盐的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
(b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
步骤(i)：使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的所述可检测标记切除。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂。
在一些实施方案中，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
在一些实施方案中，所述双链体连接于支持物上。
在一些实施方案中，所述生长的核酸链为引物。
在一些实施方案中，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体。
在一些实施方案中，所述双链体、所述化合物或其盐、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系。
在一些实施方案中，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体。
在一些实施方案中，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)。
在一些实施方案中，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体。
在一些实施方案中，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中接触。
在一些实施方案中，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的化合物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键。
在一些实施方案中，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相。
在一些实施方案中，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作。
在一些实施方案中，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的化合物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
在本发明的第二十方面，本发明提供了试剂盒，其包含至少一个前述的化合物或其盐。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为前述的化合物或其盐。
在一些实施方案中，所述第一化合物中，base 1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000274
)；所述第二化合物中，base 1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构 体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000275
)；所述第三化合物中，base 1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000276
)；所述第四化合物中，base 1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000277
)。
在一些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base 1互不相同。
在一些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
在本发明的第二十一方面，本发明提供了前述的化合物或其盐或者前述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
另外，在本发明的第二十二方面，本发明还进一步提供了一种核苷酸类似物，其由核糖或脱氧核糖、可逆阻断基团、碱基或脱氮碱基或其互变异构体、用于连接可检测标记的连接子和任选的磷酸基团形成，其中，所述连接子包含如下式A或式A’所示的结构：
Figure PCTCN2022084601-appb-000278
其中：
R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x、-S-SO 2R x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
更优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me、-SS-Et，另一个为甲基；
最优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基；
R a选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
优选地，R a选自H、C1-C6烷基；
更优选地，R a为甲基；
X选自O、S、NH；
优选地，X选自O、S；
更优选地，X为O；
M 1选自直接键、NH、O、S、CH 2；
优选地，M 1选自直接键、NH、O；
优选地，所述可逆阻断基团与所述核糖或脱氧核糖的3’-OH相连，所述碱基或脱氮碱基或其互变异构体与所述核糖或脱氧核糖的1’-C相连，所述任选的磷酸基团与所述核糖或 脱氧核糖的5’-OH相连，所述连接子与所述碱基或脱氮碱基或其互变异构体相连。
在一些实施方案中，式A所示的结构如式A-1、式A-2、式A-3、式A-4或式A-5所示，优选如式A-1、式A-2或式A-5所示；或者，式A’所示的结构如式A’-1、式A’-2或式A’-3所示，优选如式A’-1所示；
Figure PCTCN2022084601-appb-000279
其中：
R a、R b、R c、X、M 1的定义如前所述。
在一些实施方案中，式A所示的结构选自以下：
Figure PCTCN2022084601-appb-000280
Figure PCTCN2022084601-appb-000281
或者，式A’所示的结构式为
Figure PCTCN2022084601-appb-000282
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物具有如下式B所示的结构：
Figure PCTCN2022084601-appb-000283
L x具有前述的式A、式A’、式A-1、式A-2、式A-3、式A-4、式A-5、式A’-1、式A’-2或式A’-3所示的结构式，且L x的M 1端或S端与L b相连，L x的O端与L a相连；
Figure PCTCN2022084601-appb-000284
表示用于连接可检测标记的连接子；
base 1表示碱基或脱氮碱基或其互变异构体；
R’表示可逆阻断基团；
R 0表示H或磷酸基团；
L a表示所述连接子中用于连接碱基或脱氮碱基或其互变异构体的部分；
L b表示所述连接子中用于连接可检测标记的部分。
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物具有如下式B所示的结构：
Figure PCTCN2022084601-appb-000285
其中：
L x具有如前所述的式A、式A’、式A-1、式A-2、式A-3、式A-4、式A-5、式A’-1、式A’-2或式A’-3所示的结构式，且L x的M 1端或S端与L b相连，L x的O端与L a相连；
L a选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000286
优选地，L a选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000287
或者优选地，L a选自:
Figure PCTCN2022084601-appb-000288
或者更优选地，L a选自:
Figure PCTCN2022084601-appb-000289
或者进一步优选地，L a选自：
Figure PCTCN2022084601-appb-000290
或者最优选地，L a选自:
Figure PCTCN2022084601-appb-000291
r 1、r 2、r 3a、r 3b、r 4各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r 1选自1、2、3；
更优选地，r 1为1；
优选地，r 2选自1、2、3；
更优选地，r 2为1；
优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自0、1、2、3、4、5，且r 3a、r 3b不同时为0；
更优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自0、1、2、3，且r 3a、r 3b不同时为0；
进一步优选地，r 3a选自0、1，r 3b选自0、2，且r 3a、r 3b不同时为0；
最优选地，r 3a为1；
最优选地，r 3b为2；
优选地，r 4选自1、2、3；
更优选地，r 4为1；
M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
优选地，M选自直接键、CH 2、O；
更优选地，M选自CH 2、O；
L b选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000292
Figure PCTCN2022084601-appb-000293
优选地，L b选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000294
Figure PCTCN2022084601-appb-000295
更优选地，L b选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000296
Figure PCTCN2022084601-appb-000297
最优选地，L b选自：
Figure PCTCN2022084601-appb-000298
L c选自直接键、
Figure PCTCN2022084601-appb-000299
优选地，L c中的NH端与L b中的H相连接，L c中的＝O端与L b中的NH相连接；
优选地，L c选自直接键、
Figure PCTCN2022084601-appb-000300
Figure PCTCN2022084601-appb-000301
优选地，L c中的NH端与L b中的H相连接，L c中的＝O端与L b中的NH相连接；
r m选自0-6之间的任意整数；
优选地，r m选自0、1、2、3；
更优选地，r m选自0、1；
r 5、r 6、r 7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
优选地，r 5选自1、2、3；
更优选地，r 5为2；
优选地，r 6选自1、2、3；
更优选地，r 6为1或2；
优选地，r 7选自1、2、3；
更优选地，r 7为2；
r 10选自1-10之间的任意整数；
优选地，r 10选自2-6之间的任意整数；
更优选地，r 10为2或6；
r 11选自1-6之间的任意整数；
优选地，r 11选自1、2、3；
更优选地，r 11为1；
M 1、M 2、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S、CH 2；
优选地，M 1选自直接键、NH、O；
优选地，M 2为NH；
优选地，M 3选自直接键、NH；
base 1表示碱基或脱氮碱基；
R’表示可逆阻断基团；
Figure PCTCN2022084601-appb-000302
表示用于连接可检测标记的连接子；
R 0表示H或磷酸基团。
在一些实施方案中，所述base 1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
优选地，base 1选自
Figure PCTCN2022084601-appb-000303
在一些实施方案中，R 0选自H、单磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000304
二磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000305
三磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000306
四磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000307
优选地，R 0为三磷酸基团
Figure PCTCN2022084601-appb-000308
各Z独立地选自O，S，BH；
优选地，Z为O。
在一些实施方案中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000309
NH 2、-ONH 2、-OCOR z、-OCONHR z，其中，各R z独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000310
NH 2；
更优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
Figure PCTCN2022084601-appb-000311
最优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-CH 2-、CH 3-CH 2-S-S-CH 2-、
Figure PCTCN2022084601-appb-000312
R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000313
其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)，
优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000314
另一个(如R 3’)选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H，
更优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
Figure PCTCN2022084601-appb-000315
其余为H，
最优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
Figure PCTCN2022084601-appb-000316
其余为H，
R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、 iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)，
优选地，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
更优选地，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
在一些实施方案中，所述的核苷酸类似物选自前述表A、表C中的化合物。
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物携带额外的可检测标记，且所述可检测标记与连接子(优选L b)连接；
优选地，所述核苷酸类似物携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物、结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述核苷酸类似物的表位；优选地，所述可检测标记与所述L b的末端氨基连接；
优选地，所述可检测标记中的羧基与所述L b的末端氨基通过形成酰胺键进行连接；
优选地，base 1不同，所述核苷酸类似物携带的额外的可检测标记不同；
优选地，所述可检测标记为荧光标记；
优选地，所述可检测标记选自以下：iF700、
Figure PCTCN2022084601-appb-000317
Figure PCTCN2022084601-appb-000318
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物选自前述表B、表D中的化合物。
在本发明的第二十三方面，本发明提供了终止核酸合成的方法，其包括：将前述的核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子中；
优选地，所述核苷酸类似物的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子中；
优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子的3'端。
在本发明的第二十四方面，本发明提供了制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将前述的核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述核苷酸类似物的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中；
优选地，所述核苷酸类似物的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸；
优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
在本发明的第二十五方面，本发明提供了核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，
所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的核苷酸类似物；
或者，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是前述的核苷酸类似物，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的前述的核苷酸类似物。
在本发明的第二十六方面，本发明提供了测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少 一个互补核苷酸是前述的核苷酸类似物，以及，
2)确定掺入的核苷酸的类型；
优选地，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去；
优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去；
优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是前述的核苷酸类似物，任选地其余的核苷酸是前述的核苷酸类似物；
(b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
(c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
(d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
(e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是前述的核苷酸类似物，任选地其余的核苷酸是前述的核苷酸类似物；
(2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含双链体、包含至少一种前述的核苷酸类似物的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
(b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
步骤(i)：使用聚合酶，使所述核苷酸类似物掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记切除；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂；
优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
在一些实施方案中，所述双链体连接于支持物上；
优选地，所述生长的核酸链为引物；
优选地，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体；
优选地，所述双链体、所述核苷酸类似物、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系；
优选地，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述核苷酸类似物掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体；
优选地，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)；
优选地，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体；
优选地，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应 体系中接触；
优选地，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的核苷酸类似物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键；
优选地，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相；
优选地，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作；
优选地，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的核苷酸类似物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
在本发明的第二十七方面，本发明提供了试剂盒，其包含至少一个前述的核苷酸类似物；
优选地，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为前述的核苷酸类似物；
优选地，所述第一化合物中，base 1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000319
)；所述第二化合物中，base 1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000320
)；所述第三化合物中，base 1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000321
)；所述第四化合物中，base 1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
Figure PCTCN2022084601-appb-000322
)；
优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base 1互不相同；
优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
在本发明的第二十八方面，本发明提供了前述的核苷酸类似物或者前述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
附图说明
图1表示本发明实施例的碱基带有可切断(荧光)标记核苷酸类似物；
图2表示本发明实施例的3’-OH可逆阻断基团带有(荧光)标记核苷酸类似物。
具体实施方式
下面通过具体实施例详细描述本发明的实施方式，但是无论如何它们不能解释为对本发明的限制。
除非特殊说明，上述基团和取代基具有药物化学领域的普通含义。
在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-C6烷基”特别指独立公开的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本文中通篇采用的描述方式“各…独立地为/选自”和“…各自独立地为/选自”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同或不同的符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同或不同的符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
术语“脂肪族烷基”指的是任意的含有1-20个碳原子的直链或支链饱和基团，例如，C 1-C 12烷基，优选C 1-C 6烷基。
术语“C 1-C 6烷基”指的是任意的含有1-6个碳原子的直链或支链饱和基团，例如甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基、异丙基(iPr)、正丁基、异丁基、叔丁基(tBu)、仲丁基、正戊基、叔戊基、正己基等。
术语“烷氧基”指的是任意上述烷基(例如C 1-C 6烷基等)，其通过氧原子(-O-)连接到分子的其余部分。
术语“环烷基”是指具有饱和环的3-10元单环系统的烃，例如，C 3-C 8环烷基，优选C 3-C 6环烷基。
术语“C 3-C 6环烷基”是指具有饱和环的3-6元单环系统的烃，C 3-C 6环烷基可以为环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
术语“芳香族烷基”指的是芳基烷基或杂芳基烷基，其中烷基如上文所定义。
术语“杂芳基”是指芳族的杂环，通常为具有1至3个选自N、O或S的杂原子的5-、6-、7-、8-元的杂环；杂芳基环可以任选地进一步稠合或连接于芳族和非芳族的碳环和杂环。所述杂芳基的非限制性的实例为例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻噁唑基、吡咯基、苯基-吡咯基、呋喃基、苯基-呋喃基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并1,3-二氧戊环(苯并二噁茂)、异二氢吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、1,2,3-三唑基、1-苯基-1,2,3-三唑基、2,3-二氢吲哚基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3-二氢苯并噻吩基、苯并吡喃基、2,3-二氢苯并噁嗪基、2,3-二氢喹喔啉基等。
术语“芳基”指的是具有6-14个碳原子的碳环芳族体系的基团，例如C6-C10芳基，优选苯基。
从所有上述描述中，对本领域技术人员显而易见的是，其名称是复合名称的任意基团，例如“苯基C1-C6烷基”，应该指的是常规地从其衍生的部分例如从被苯基取代的C1-C6烷基来构建，其中C1-C6烷基如上文所定义。
如本文所使用，术语“式I、式I-1、式I-2、式II、式II-1、式II-2、式III所示的化合物的盐”的例子是由形成阴离子的有机酸形成的有机酸加合盐，包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-甘油磷酸盐、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；优选地，所述烷基磺酸盐为甲基磺酸盐或乙基磺酸盐；所述芳基磺酸盐为苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。也可形成合适的无机盐，包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐等。
术语“直接键”表示其两侧的基团直接相连，例如，式
Figure PCTCN2022084601-appb-000323
中，若M 3为直接键，则其结构式变成
Figure PCTCN2022084601-appb-000324
又例如，式
Figure PCTCN2022084601-appb-000325
中，若M 3为直接键，则其结构式变成
Figure PCTCN2022084601-appb-000326
又例如，式
Figure PCTCN2022084601-appb-000327
中，若M3为直接键，则其结构式变成
Figure PCTCN2022084601-appb-000328
本发明中，所述可检测标记与
Figure PCTCN2022084601-appb-000329
中的 末端氨基连接，其包含以下两种情况：1)当r 8不为0时，“末端氨基”指的是该结构式最末尾的氨基；2)当r 8为0时，该结构式变为
Figure PCTCN2022084601-appb-000330
M 2可以为NH，此时，可以理解的是，“末端氨基”指的是该变更后的结构式最末尾的氨基。
本发明中，所述可检测标记与
Figure PCTCN2022084601-appb-000331
中的末端氨基连接，其中，“末端氨基”指的是该结构式最末尾的氨基。
本发明中，所述可检测标记与与所述L b的末端氨基连接，且所述L b例如为
Figure PCTCN2022084601-appb-000332
时，“末端氨基”指的是该结构式最末尾的氨基。
在本发明的方法中，只要是由生长的核酸链和待测序的核酸链这两条链组成的物质，均称其为“双链体”，与生长的核酸链或待测序的核酸链的链长无关，待测序的核酸链可以比生长的核酸链的链长更长。
在本发明的方法中，待测序的核酸分子可以是任何目的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、或其任何组合。在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其类型的限制。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为DNA或RNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子可以为基因组DNA，线粒体DNA，叶绿体DNA，mRNA，cDNA，miRNA，或siRNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为线性的或者环状的。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为双链的或者单链的。例如，所述待测序的核酸分子可以为单链DNA(ssDNA)，双链DNA(dsDNA)，单链RNA(ssRNA)，双链RNA(dsRNA)，或者DNA和RNA的杂合体。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为单链DNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为双链DNA。
在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其来源的限制。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子可以获自任何来源，例如，任何细胞、组织或生物体(例如，病毒，细菌，真菌，植物和动物)。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子源自哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、啮齿类动物或犬科动物)、植物、鸟类、爬行类、鱼类、真菌、细菌或病毒。
从细胞、组织或生物体中提取或获得核酸分子的方法是本领域技术人员公知的。合适的方法包括但不限于乙醇沉淀法，氯仿抽提法等。关于此类方法的详细描述可参见例如，J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995。另外，还可使用各种商业化的试剂盒来从各种来源(例如细胞、组织或生物体)提取核酸分子。
在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其长度的限制。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的长度可以为至少10bp，至少20bp，至少30bp，至少40bp，至少50bp，至少100bp，至少200bp，至少300bp，至少400bp，至少500bp，至少1000bp，或者至少2000bp。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的长度可以为10-20bp，20-30bp，30-40bp，40-50bp，50-100bp，100-200bp，200-300bp，300-400bp，400-500bp，500-1000bp，1000-2000bp，或者超过2000bp。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子可具有10-1000bp的长度，以利于进行高通量测序。
在本发明的制备多核苷酸的方法或测序方法中，可使用合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以DNA为模板合成新的DNA链(例如DNA聚合酶)。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以RNA为模板合成新的DNA链(例如反转录酶)。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以DNA或RNA为模板合成新的RNA链(例如RNA聚合酶)。因此，在某些优选的实施方案中，所述聚合酶选自DNA聚合酶，RNA聚合酶，和反转录酶。可根据实际需要，选择合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应。在某些优选的实施方案中，所述聚合反应为聚合酶链式反应(PCR)。在某些优选的实施方案中，所述聚合反应为反转录反应。
在本发明的方法中，可以使用KOD聚合酶或其突变体进行核苷酸聚合反应。KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)对本发明的修饰的核苷或核苷酸具有可接受的聚合效率。KOD POL391和KOD POL171对本发明的修饰的核苷酸的具有可接受的聚合效率。在某些实施方案中，KOD POL391或KOD POL171对本发明的修饰的核苷酸的聚合效率在70％以上，例如70％-80％、80％-90％或90％-100％。
在本发明的制备多核苷酸的方法或测序方法中，核苷酸的聚合反应在适宜的条件下进行。适宜的聚合条件包括溶液相的组成以及各成分的浓度、溶液相的pH、聚合温度等。在适宜的条件下进行聚合，有利于获得可接受的、甚至高的聚合效率。
在本发明的一些实施方案中，式I、式II、式III、式B所示化合物中，脱氧核糖3'位置处的羟基(-OH)受保护(被R’所保护)，因此，它们能够终止聚合酶(例如DNA聚合酶)的聚合作用。例如，当式I、式II、式III、式B所示化合物被引入生长的核酸链的3'端时，由于该化合物的脱氧核糖的3'位置处不存在游离的羟基(-OH)，聚合酶将无法继续进行下一轮的聚合反应，从而聚合反应将被终止。在这种情况下，在每一轮的聚合反应中，将有且只有一个碱基被掺入生长的核酸链。
此外，所述式I、式II、式III、式B所示化合物的脱氧核糖3'位置处羟基(-OH)的保护基团(R’)能够被去除，并转变为游离的羟基(-OH)。随后，可使用聚合酶和式I、式II、式III、式B所示化合物对生长的核酸链进行下一轮的聚合反应，并再次引入一个碱基。
因此，所述式I、式II、式III、式B所示化合物的脱氧核糖3'位置处羟基(-OH)可以被可逆阻断：当式I、式II、式III、式B所示化合物被掺入生长的核酸链的3'端时，它们将终止聚合酶继续进行聚合作用，终止生长的核酸链的进一步延伸；并且，在式I、式II、式III、式B所示化合物所包含的阻断基团被去除后，聚合酶将能够继续对生长的核酸链进行聚合作用，继续延伸核酸链。
本文描述的某些实施方案涉及常规可检测标记的使用。可通过任何适合的方法进行检测，包括荧光光谱学或其他光学手段。优选的标记为荧光标记即荧光团，该荧光团在吸收能量后发出限定波长的辐射。已知许多种适合的荧光标记。例如，Welch等人(Chem.Eur.J.5(3):951-960,1999)公开了丹酰基-功能化的荧光部分，其可在本发明中使用。Zhu等人(Cytometry28:206-211,1997)描述了荧光标记Cy3和Cy5的使用，其也可以在本发明中使用。Prober等人(Science238:336-341,1987)、Connell等人(BioTechniques5(4):342-384,1987)、Ansorge等人(Nucl.AcidsRes.15(11):4593-4602,1987)和Smith等人(Nature321:674,1986)也公开了适合使用的标记。其他可商业购得的荧光标记包括但不限于iF700、荧光素、若丹明(包括TMR、德克萨斯红和Rox)、alexa、氟硼荧、吖啶、香豆素、芘、苯并蒽和花青苷。特别说明的是，iF700是本领域常规使用的荧光标记，例如参见US20180223358A1的Table 7，该荧光标记可以市购获得。
本申请中也可以使用多重标记，例如双荧光团FRET盒(Tet.Let.46:8867-8871,2000)、也可以使用多荧光体树枝状系统(J.Am.Chem.Soc.123:8101-8108,2001)。虽然优选荧光标记，对于本领域的普通技术人员来说其他形式的可检测标记也明显适用。例如微颗粒，包括量子点(Empodocles等人,Nature 399:126-130,1999)、金纳米颗粒(Reichert等人,Anal.Chem.72:6025-6029,2000)和微珠(Lacoste等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA 97(17):9461-9466,2000)也都可以使用。
本申请也可以使用多组分标记。多组分标记是依赖于与用于检测的另外化合物的相互作用的标记。在生物学中最常用的多组分标记是生物素-链霉亲和素系统。生物素用作与核苷酸或修饰的核苷酸相连接的标记。然后单独加入链霉亲和素使检测发生。可以使用其他多组分系统。例如，二硝基苯酚具有可商业购得的可用于检测的荧光抗体。
在本文描述的某些实施方案中，可以通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物Affimer、结蛋白Knottin)的引入使得修饰的核苷酸或核苷分子携带上文描述的可检测标记，所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述修饰的核苷酸或核苷分子的表位，具体原理详见WO2018129214A1。WO2018129214A1中的全部相关内容引入本申请中。
在本文描述的另外一些实施方案中，可以将修饰的核苷酸或核苷分子与上文描述的可检测标记相连接。在某些这类实施方案中，所用的连接基团可裂解。使用可裂解的连接基团确保了在需要时所述标记能够在检测后被除去，这避免了与随后并入的任何标记的核苷 酸或核苷的任何干扰信号。
可通过任何适合的方法裂解所述连接基团，包括暴露于酸、碱、亲核试剂、亲电试剂、自由基、金属、还原剂或氧化剂、光、温度、酶等。还可以使用用于断裂碱基处的保护基的相同催化剂裂解本文中讨论的连接基团。如Greene&Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基),John Wiley&Sons中所公开的，合适的连接基团可修改自标准的化学保护基。Guillier等人(Chem.Rev.100:2092-2157,2000)中还公开了用于固相合成的合适的可裂解的连接基团。
使用术语“可裂解的连接基团”并非意味着需要除去整个连接基团，例如，从核苷酸或修饰的核苷酸中除去。当可检测标记与核苷酸或修饰的核苷酸相连接时，核苷裂解位点可位于连接基团上的位置，该位置能够确保在裂解后一部分的连接基团仍与所述核苷酸或修饰的核苷酸保持连接。
本领域技术人员可知，本申请中的核苷酸在Sanger法测序、第二代高通量测序(NGS测序)和第三代测序(单分子测序)中均具有效用，因为通过使用本文描述的可逆阻断核苷酸类似物可实现逐个检测测序中掺入的核苷酸类型。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。需要说明的是，以下各实施例仅列举了四种碱基中的一种碱基的核苷酸类似物的制备方法，本领域技术人员可以参照该方法，制备合成剩余三种碱基的核苷酸类似物。而且，以下各实施例化合物在最后一步与染料相连接时，可以与任意已知的染料进行连接，以下实施例各列举了一种染料，仅为示例，并非对染料选择范围的限制。另外，除非特别说明，否则各原料均可以市购获得。
一、化合物制备实施例
实施例1
linker1的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000333
Figure PCTCN2022084601-appb-000334
核苷与酸DCC缩合后，TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解后与linker1偶联，在脱去三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例2
linker2的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000335
对氨基叠氮苯甲酸与三氟乙酰基保护的PEG linker缩合得到linker 2。
Figure PCTCN2022084601-appb-000336
核苷与酸DCC缩合后，氨基脱去乙酰基，然后再DCC缩合。利用TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解脱去三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例3
linker 3的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000337
合成路线与鉴定结果参见实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000338
核苷与酸DCC缩合后，氨基脱去乙酰基，然后再DCC缩合。利用TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解脱去三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例4
linker 4的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000339
Figure PCTCN2022084601-appb-000340
核苷与酸DCC缩合后，利用TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解脱去三氟乙酰基，与linker 4偶联，再脱去linker中三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例5
linker 5的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000341
Figure PCTCN2022084601-appb-000342
核苷与酸DCC缩合后，利用TBAF脱去保护基，再利用三磷酸化的三磷酸。氨解脱去三氟乙酰基，与linker 5偶联，再脱去linker中三氟乙酰基，最后与荧光染料偶联得到产品。
实施例6-1
linker 6的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000343
合成方法与实施例7-2类似。15mg固体，HPLC纯度＞99％。MS[ES(-)],m/z1861.4. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.27(s,1H),8.63-8.58(m,1H),8.36(t,J＝13.1Hz,2H),8.09(d,J＝6.3Hz,1H),8.00(s,1H),7.92-7.88(m,2H),7.84(d,J＝4.5Hz,1H),7.81(s,2H),7.78(d,J＝8.6Hz,1H),7.71–7.67(m,1H),7.65-7.62(m,4H),7.49–7.43(m,1H),7.31(dd,J＝8.3,3.1Hz,2H),6.67–6.54(m,2H),6.31(dd,J＝13.8,5.3Hz,2H),5.68(s,1H),5.30(q,J＝6.9Hz,1H),5.26–5.17(m,1H),4.34(dt,J＝22.7,3.7Hz,1H),4.22(t,J＝4.8Hz,2H),4.13(s,2H),4.11(d,J＝5.0Hz,2H),4.08–4.00(m,2H),3.67-3.65(m,1H),3.59–3.56(m,2H),3.22–3.15(m,2H),2.21(t,J＝6.6Hz,2H),2.11(d,J＝2.3Hz,4H),2.09–2.04(m,4H),1.66(s,3H), 1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.52(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.37–1.29(m,2H),1.26(t,J＝7.1Hz,4H).
实施例6-2
linker的合成
linker 6的合成方法同实施例6-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000344
合成方法与实施例7-1类似，16mg固体，HPLC纯度＞99％。MS[ES(-)],m/z 1809.3. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.16(s,1H),8.95(d,J＝8.2Hz,1H),8.85(t,J＝5.5Hz,1H),8.80(s,2H),8.23(d,J＝8.2Hz,1H),8.14(d,J＝8.4Hz,2H),7.99(d,J＝1.7Hz,1H),7.86(d,J＝7.6Hz,1H),7.82(d,J＝8.5Hz,1H),7.69(dd,J＝8.7,1.6Hz,1H),7.62(d,J＝3.5Hz,2H),7.52(d,J＝7.9Hz,2H),7.45–7.37(m,1H),6.72(s,2H),6.30–6.20(m,1H),5.57-5.54(m,1H),5.31(q,J＝6.9Hz,1H),5.22–5.13(m,1H),4.36(d,J＝20.9Hz,1H),4.24–4.19(m,2H),4.14(s,2H),4.08(d,J＝4.0Hz,1H),4.06–4.00(m,2H),3.80(dd,J＝13.1,6.8Hz,2H),3.73–3.69(m,2H),3.67(dd,J＝7.0,4.1Hz,2H),3.63(d,J＝5.6Hz,2H),2.22(t,J＝7.0Hz,2H),2.13(s,3H),2.07(t,J＝7.8Hz,5H),1.73–1.66(m,2H),1.65(d,J＝6.9Hz,3H),1.60(d,J＝7.0Hz,3H),1.17(d,J＝6.7Hz,12H),1.00(d,J＝2.0Hz,6H).
实施例7-1
(1)步骤1
linker 7的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000345
PEG-CF3底物(OKeanos Tech，货号OK20A409)1g溶解在DMF中，加入TSTU(2eq)与N,N二异丙基乙胺(3eq)，反应在室温搅拌2h后，加入苯胺底物(OKeanos Tech，货号OK20A408)(1.2eq)。反应4h后，加入水淬灭反应。利用二氯甲烷萃取，浓缩干燥后利用柱分离提纯得到无色油状化合物。MS[ES(-)],m/z 484.3. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 12.92(s,1H),9.98(s,1H),9.53(t,J＝5.2Hz,1H),7.88(d,J＝2.0Hz,1H),7.81(d,J＝8.4Hz,1H),7.69(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),5.48(q,J＝6.8Hz,1H),4.11(s,2H),3.68–3.66(m,2H),3.62–3.60(m,2H),3.55(t,J＝5.6Hz,2H),3.37(q,J＝5.6Hz,2H),2.15(s,3H),1.60(d,J＝6.8Hz,3H).
(2)步骤2
Figure PCTCN2022084601-appb-000346
将步骤1获得的底物100mg溶解在3mL的DMF中，加入DCC(1.2eq)与DMAP(10％mol)，反应搅拌30分钟后，加入羟基酸底物(毕得医药，货号BD628858)(2eq)。反应搅拌12小时后，直接利用制备HPLC进行分离(C18反相柱，250*30mm，)得到白色固体(linker 7)85mg。MS[ES(-)],m/z 585.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.06(s,1H),9.53(t,J＝5.2Hz,1H),7.92(d,J＝2.0Hz,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),5.31(q,J＝6.8Hz,1H),4.40–4.30(m,3H),4.11(s,2H),3.88(s,2H),3.78(t,J＝4.8Hz,2H),3.68–3.66(m,2H),3.62–3.60(m,2H),3.55(t,J＝5.6Hz,2H),3.37(q,J＝5.6Hz,2H),2.13(s,3H),1.61(d,J＝6.8Hz,3H).
(3)步骤3
Figure PCTCN2022084601-appb-000347
碘代U核苷底物(OKeanos Tech，货号OK-N-16001)1g溶解于DMF中，加入Pd(PPh 3) 4(10mol％)，CuI(15mol％)，三乙胺(3eq)与底物炔丙胺(OKeanos Tech，货号OK20A410)(1.5eq)在60度条件下反应12h。加入水淬灭反应，DCM萃取。浓缩后柱分离得到白色固体产品1.1g。MS[ES(-)],m/z 491.1.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.67(s,1H),10.00(t,J＝5.5Hz,1H),7.94(s,1H),6.12(dd,J＝7.6,5.9Hz,1H),5.28(d,J＝4.1Hz,1H),4.26-4.12(m,3H),3.88(q,J＝2.8Hz,1H),3.81(dd,J＝11.5,2.6Hz,1H),3.73(dd,J＝11.5,3.1Hz,1H),2.17(ddd,J＝13.2,6.0,2.8Hz,1H),2.05(ddd,J＝13.3,7.7,5.8Hz,1H),0.87(s,9H),0.08(d,J＝1.8Hz,6H).
(4)步骤4
Figure PCTCN2022084601-appb-000348
将步骤3获得的底物核苷300mg溶解在10mL的DMF中，加入DCC(1.2eq)与DMAP(10％mol)，反应搅拌30分钟后，加入二硫羧酸底物(OKeanos Tech，货号OK20A420)(1.5eq)。反应搅拌12小时后，直接柱分离得到白色固体359mg。MS[ES(-)],m/z 700.3. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.74(s,1H),10.03(t,J＝5.5Hz,1H),7.98(s,1H),7.90–7.82(m,1H),7.68–7.58(m,2H),7.47-7.40(m,1H),6.23-6.18(m,1H),5.45-5.42(m,1H),5.20-5.12(m,1H),4.38–4.16(m,3H),3.98–3.87(m,2H),2.60-2.53(m,1H),2.40-2.31(m,1H),2.06(d,J＝0.6Hz,3H),1.65(dd,J＝7.0,1.0Hz,3H),0.90(s,9H),0.13(d,J＝1.2Hz,6H).
(5)步骤5
Figure PCTCN2022084601-appb-000349
将步骤4获得的底物核苷300mg溶解在10mL的THF中，在0度下加入TBAF(2eq,1M in THF)，反应在0度搅拌30分钟后，升至室温搅拌4小时。反应直接柱分离得到白色固体200mg。MS[ES(-)],m/z 587.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.68(d,J＝3.2Hz,1H),10.06(t,J＝5.6Hz,1H),8.23(d,J＝3.2Hz,1H),7.88–7.78(m,1H),7.66–7.56(m,2H),7.43–7.39(m,1H),6.25–6.13(m,1H),5.48–5.45(m,1H),5.31(t,J＝5.2Hz,1H),5.18–5.12(m,1H),4.28–4.16(m,3H),3.76–3.67(m,2H),2.50–2.40(m,2H),2.04(d,J＝9.2Hz,3H),1.68–1.59(m,3H).
(6)步骤6
Figure PCTCN2022084601-appb-000350
将步骤5获得的底物核苷200mg溶解在5mL的磷酸三甲酯中，在0度下加入三氯氧磷(1.5eq)，反应在0度搅拌120分钟后，将反应液加入到三丁基焦磷酸铵(2eq)的DMF(5mL)溶液中，反应在0度继续搅拌3h后，加入0.1M TEAB缓冲液淬灭。反应利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离，浓缩后直接加入浓氨水3mL，反应2h后利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离得到白色固体120mg。MS[ES(-)],m/z 745.5. 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.51(s,1H),7.90(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),7.73(d,J＝7.8Hz,1H),7.67(td,J＝7.6,1.4Hz,1H),7.48(t,J＝7.5Hz,1H),6.45(td,J＝9.2,5.7Hz,1H),5.75(t,J＝4.7Hz,1H),5.15–5.07(m,1H),4.72–4.64(m,1H),4.39(d,J＝3.3Hz,2H),4.07(s,2H),2.82-2.76(m,1H),2.64–2.54(m,1H),2.02(d,J＝6.4Hz,3H),1.73(dd,J＝7.1,2.2Hz,3H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ-9.79(dd,J＝20.3,9.6Hz,1P),-11.68(d,J＝19.2Hz,1P),-22.82(td,J＝19.2,6.1Hz,1P).
(7)步骤7
Figure PCTCN2022084601-appb-000351
将步骤2获得的linker 7底物20mg溶解在1mL的DMF中，加入TSTU(1.5eq)与二异丙基乙基胺(3eq)，反应在室温搅拌120分钟后，加入步骤6获得的核苷酸底物(2eq)，反应在室温继续搅拌3h后，加入0.1M TEAB缓冲液淬灭。反应利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离，浓缩后直接加入浓氨水3mL，反应2h后利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离得到白色固体15mg。MS[ES(-)],m/z 1201.7. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.91(s,1H),8.96–8.84(m,1H),8.28(d,J＝2.0Hz,1H),8.18(d,J＝11.6Hz,1H),7.92(dd,J＝8.6,1.5Hz,1H),7.86(d,J＝7.1Hz,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.63–7.57(m,2H),7.46–7.38(m,1H),6.21(ddd,J＝14.8,8.4,6.2Hz,1H),5.57(s,1H),5.35(q,J＝6.8Hz,1H),5.21-5.13(m,1H),4.39(d,J＝12.5Hz,2H),4.32(s,2H),4.22(s,2H),4.14(d,J＝6.3Hz,2H),4.09(d,J＝3.7Hz,2H),4.05(s,2H),3.82–3.79(m,4H),3.68–3.64(m,2H),3.63–3.59(m,2H),2.99–2.93(m,2H),2.60-2.52(m,1H),2.47–2.36(m,1H),2.15(s,3H),2.05(d,J＝21.1Hz,3H),1.64(d,J＝7.0Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
(8)步骤8
Figure PCTCN2022084601-appb-000352
将染料(北京澄道科技有限公司，货号CD0014)10mg溶解在0.5mL的DMF中，加入TNTU(1.5eq)与二异丙基乙基胺(3eq)，反应在室温搅拌120分钟后，加入步骤7获得的核苷酸底物(2eq)，反应在室温继续搅拌3h后，加入0.1M TEAB缓冲液淬灭。反应利用制备HPLC反相柱(C18，流动相：0.1M TEAB-乙腈)分离得到红色固体8mg。HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1938.7. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.39(brs,1H),9.15–9.10(m,1H),8.28(d,J＝8.8Hz,1H),8.03–8.00(m,1H),7.88–7.79(m,3H),7.76–7.67(m,3H),7.66–7.60(m,3H),7.58–7.39(m,3H),6.99(s,2H),6.80(s,2H),6.27–6.20(m,1H),5.59(d,J＝5.6Hz,1H),5.34–5.29(m,1H),5.18(p,J＝6.8Hz,1H),4.44–4.29(m,4H),4.14–4.04(m,9H),3.81(t,J＝4.8Hz,2H),3.77–3.61(m,7H),3.59–3.51(m,6H),3.40(t,J＝6.0Hz,2H),3.19–3.14(m,2H),3.11(t,J＝7.6Hz,2H),2.69–2.65(d,J＝6.5Hz,4H),2.59–2.55(m,5H),2.46– 2.35(m,1H),2.14(d,J＝3.5Hz,3H),2.08(s,1H),2.04(s,1H),2.00–1.91(m,4H),1.87–1.80(m,4H),1.70(t,J＝7.6Hz,2H),1.65(d,J＝7.2Hz,3H),1.60(d,J＝6.8Hz,3H).31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ-11.24(d,J＝22.7Hz,1P),-12.05(d,J＝22.9Hz,1P),-23.63(t,J＝22.7Hz,1P).
实施例7-2
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000353
合成方法与实施例7-1类似，使用碘代A核苷底物(OKeanos Tech，货号OK-N-16003)替代碘代U核苷底物。MS[ES(-)],m/z 513.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.04(t,J＝5.5Hz,1H),8.09(s,1H),7.67(s,1H),6.85(s,2H),6.47(t,J＝6.7Hz,1H),5.29(d,J＝4.2Hz,1H),4.33–4.29(m,1H),4.27(d,J＝5.4Hz,2H),3.81(q,J＝3.9Hz,1H),3.75(dd,J＝11.1,4.1Hz,1H),3.67(dd,J＝11.1,4.1Hz,1H),2.43–2.36(m,1H),2.24–2.18(m,1H),0.85(s,9H),0.03(d,J＝1.8Hz,6H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000354
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 723.1. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.05(s,1H),8.10(d,J＝4.4Hz,1H),7.91–7.83(m,1H),7.74(d,J＝3.6Hz,1H),7.65–7.56(m,2H),7.46–7.40(m,1H),6.84(brs,2H),6.64–6.48(m,1H),5.58–5.52(m,1H),5.24–5.10(m,1H),4.37–4.15(m,3H),3.95–3.74(m,2H),2.84–2.75(m,1H),2.70–2.54(m,1H),2.06(d,J＝1.2Hz,3H),1.64(d,J＝7.0Hz,3H),1.28–1.17(m,1H),0.87(s,9H),0.07(dd,J＝4.8,2.7Hz,6H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000355
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 609.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.10(t,J＝5.2Hz,1H),8.12(d,J＝4.8Hz,1H),7.90(dd,J＝7.4,5.0Hz,1H),7.85(s,1H),7.66– 7.61(m,2H),7.48–7.43(m,1H),6.82(brs,2H),6.60–6.51(m,1H),5.59(d,J＝4.4Hz,1H),5.36(td,J＝5.5,1.5Hz,1H),5.21(qd,J＝7.0,4.1Hz,1H),4.32(d,J＝5.3Hz,2H),4.26–4.20(m,1H),3.75–3.64(m,2H),2.90–2.77(m,1H),2.65–2.51(m,1H),2.09(d,J＝8.6Hz,3H),1.67(d,J＝7.0Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000356
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 753.0. 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.04(d,J＝7.1Hz,1H),7.95–7.83(m,2H),7.72–7.56(m,2H),7.49–7.44(m,1H),6.70–6.48(m,1H),5.71(dd,J＝17.3,4.9Hz,1H),5.12–5.00(m,1H),4.62(d,J＝10.7Hz,1H),4.41–4.21(m,2H),4.18(d,J＝8.9Hz,2H),2.78–2.31(m,2H),2.03–1.83(m,3H),1.70(dd,J＝10.3,7.1Hz,3H)； 31P NMR(162MHz,D 2O)δ-7.18(dd,J＝20.1,13.4Hz,1P),-11.24(d,J＝19.0Hz,1P),-22.25(td,J＝19.6,11.0Hz,1P).
Figure PCTCN2022084601-appb-000357
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 1225.1. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.18(d,J＝6.1Hz,1H),8.37(t,J＝5.4Hz,1H),8.21(dd,J＝7.4,1.7Hz,1H),8.09(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,1H),7.69–7.58(m,3H),7.47–7.40(m,1H),7.29(s,1H),6.40(s,2H),6.30(dd,J＝9.4,5.7Hz,1H),5.66(s,1H),5.35(q,J＝6.9Hz,1H),5.20(q,J＝6.9Hz,1H),4.41(d,J＝12.9Hz,1H),4.34(dd,J＝8.4,4.2Hz,1H),4.30(s,2H),4.13–4.08(m,2H),4.06-4.03(m,2H),4.01(s,2H),3.83–3.80(m,2H),3.67(d,J＝2.8Hz,2H),3.63-3.61(m,6H),2.98–2.93(m,2H),2.60-2.52(m,1H),2.47–2.36(m,1H),2.13(s,3H),2.07(s,3H),1.64(d,J＝7.0Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000358
合成方法与实施例7-1类似，将染料替换为AF532(购自OKeanos Tech，货号OKF 532)。13mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1833.0. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.43(t,J＝4.8Hz,1H),8.91(t,J＝5.6Hz,1H),8.80(s,2H),8.50(t,J＝5.6Hz,1H),8.15(d,J＝8.8Hz,2H),8.07(d,J＝6.4Hz,1H),8.03(s,1H),7.90(dd,J＝7.6,2.4Hz,1H),7.84–7.79(m,2H),7.69(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝4.4Hz,2H),7.49–7.42(m,3H),6.70(s,2H),6.65–6.58(m,1H),5.69(d,J＝2.8Hz,1H),5.33–5.27(m,1H),5.21(qd,J＝7.2,2.0Hz,1H),4.45–4.34(m,3H),4.32–4.30(m,1H),4.18(s,2H),4.14(d,J＝5.6Hz,3H),4.01(s,3H),3.81–3.77(m,7H),3.73–3.69(m,4H),3.68–3.63(m,7H),3.52(q,J＝5.6Hz,4H),2.12(d,J＝2.4Hz,3H),2.10(s,1H),2.05(s,1H),1.65(d,J＝6.8Hz,3H),1.59(d,J＝7.2Hz,3H),0.99(d,J＝2.8Hz,5H). 31P NMR(162MHz,DMSO-d 6)δ-10.99(d,J＝20.6Hz,1P),-12.48(d,J＝24.0Hz,1P),-23.41(t,J＝22.5Hz,1P).
实施例7-3
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000359
合成方法与实施例7-1类似，使用碘代G核苷底物(OKeanos Tech，货号OK-N-16004)替代碘代U核苷底物。MS[ES(-)],m/z 529.3. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.48(s,1H),9.98(t,J＝5.6Hz,1H),7.21(s,1H),6.38–6.21(m,3H),5.23(d,J＝3.8Hz,1H),4.26(s,1H),4.18(d,J＝5.6Hz,2H),3.78(q,J＝4.0Hz,1H),3.73–3.60(m,2H),2.32–2.19(m,1H),2.13–2.08(m,1H),2.04(s,1H),0.85(s,9H),0.03(d,J＝1.8Hz,6H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000360
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 739.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.53(s,1H),10.00(t,J＝5.6Hz,1H),7.83(dd,J＝7.5,3.6Hz,1H),7.61–7.58(m,2H),7.48–7.39(m,1H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),6.42–6.25(m,3H),5.72(s,1H),5.58–5.46(m,1H),5.16(p,J＝7.2Hz,1H),4.25–4.14(m,3H),3.82(t,J＝3.6Hz,2H),2.71–2.60(m,1H),2.50–2.45(m,1H),2.07(s,3H),1.75–1.55(m,4H),1.29–0.96(m,2H),0.88(s,9H),0.13–0.02(m,6H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000361
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 625.7. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.53(s,1H),10.00(t,J＝5.6Hz,1H),7.83(dd,J＝7.5,3.6Hz,1H),7.61–7.58(m,2H),7.48–7.39(m,1H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),6.42–6.25(m,3H),5.72(s,1H),5.58–5.46(m,1H),5.16(p,J＝7.2Hz,1H),4.25–4.14(m,3H),3.82(t,J＝3.6Hz,2H),2.71–2.60(m,1H),2.50–2.45(m,1H),2.07(s,3H),1.75–1.55(m,4H),1.29–0.96(m,2H),0.88(s,9H),0.13–0.02(m,6H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000362
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 769.2. 1H NMR(400MHz,D 2O)δ7.81–7.74(m,1H),7.51–7.40(m,3H),7.31(q,J＝6.9Hz,1H),6.38–6.19(m,1H),5.65(dd,J＝11.2,5.2Hz,1H),5.07–4.96(m,1H),4.53(d,J＝20.8Hz,1H),4.35–4.18(m,2H),4.10(s,2H),2.87–2.70(m,1H),2.54–2.40(m,1H),1.97–1.76(m,3H),1.59–1.54(m,3H)； 31P NMR(162MHz,D 2O)δ-9.27(d,J＝19.6Hz,1P),-11.36(d,J＝18.5Hz,1P),-22.79(td,J＝19.2,4.7Hz,1P).
Figure PCTCN2022084601-appb-000363
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 1241.6. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.25(s,1H),8.29(d,J＝7.7Hz,2H),7.87(d,J＝7.0Hz,2H),7.69–7.58(m,3H),7.47–7.40(m,1H),7.29(s,1H),6.40(s,2H),6.30(dd,J＝9.4,5.7Hz,1H),5.66(s,1H),5.35(q,J＝6.9Hz,1H),5.20(q,J＝6.9Hz,1H),4.41(d,J＝12.9Hz,1H),4.34(dd,J＝8.4,4.2Hz,1H),4.30(s,2H),4.13–4.08(m,2H),4.06-4.03(m,2H),4.01(s,2H),3.83–3.80(m,2H),3.67(d,J＝2.8Hz,2H),3.63-3.61(m,6H),2.98–2.93(m,2H),2.47–2.42(m,1H),2.41–2.30(m,1H),2.13(s，3H)，2.07(s，3H)，1.66(d J＝7.0Hz，3H)，1.62(d，J＝6.9Hz，3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000364
合成方法与实施例7-1类似，将染料替换为CY5(购自OKeanos Tech，货号OK-F-13103)。18mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1878.9. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.66(brs,1H),10.43(s,1H),8.43–8.32(m,2H),8.03(s,1H),7.92–7.82(m,2H),7.82(d,J＝1.6Hz,2H),7.72(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),7.66–7.60(m,3H),7.46–7.42(m,1H),7.31(dd,J＝8.0,3.6Hz,2H),6.59(t,J＝12.4Hz,1H),6.58–6.47(m,1H),6.35–6.27(m,2H),5.66(t,J＝5.2Hz,1H),5.31(q,J＝7.2Hz,1H),5.20(q,J＝7.2Hz,1H),4.45–4.34(m,2H),4.31(t,J＝5.2Hz,1H),4.25(t,J＝5.2Hz,1H),4.14(s,2H),4.12–4.05(m,5H),4.00(s,2H),3.81(t,J＝4.4Hz,2H),3.66–3.64(m,2H),3.58–3.55(m,2H),3.41(t,J＝5.6Hz,2H),3.19(q,J＝5.6Hz,2H),2.13(d,J＝3.6Hz,3H),2.08–2.05(m,2H),1.68(s,9H),1.65(d,J＝7.2Hz,2H),1.61(d,J＝7.2Hz,2H),1.56–1.49(m,2H),1.35–1.30(m,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H). 31P NMR(162MHz,DMSO-d 6)δ-11.33(d,J＝22.6Hz,1P),-11.92(d,J＝22.8Hz,1P),-23.68(t,J＝22.6Hz,1P).
实施例7-4
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000365
合成方法与实施例7-1类似，使用碘代C核苷底物(OKeanos Tech，货号OK-N-16002)替代碘代U核苷底物。MS[ES(-)],m/z 678.1. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ7.97(s,1H),7.94–7.79(m,2H),7.65–7.54(m,2H),7.46–7.33(m,1H),6.68(s,1H),6.18–6.14(m,1H),5.40(d,J＝6.1Hz,1H),5.16(qd,J＝7.0,2.1Hz,1H),4.35–4.24(m,1H),3.97–3.85(m,2H),2.55–2.47(m,1H),2.24–2.16(m,1H),2.04(d,J＝3.2Hz,3H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H),0.89(s,9H),0.12(s,6H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000366
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 700.4. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ9.93(t,J＝5.2Hz,1H),7.99(s,1H),7.91(s,1H),7.85(d,J＝7.6Hz,1H),7.62(d,J＝5.3Hz,2H),7.47–7.40(m,1H),6.97(s,1H),6.25–6.20(m,1H),5.42(d,J＝5.9Hz,1H),5.17(qd,J＝7.0,2.2Hz,1H),4.36–4.29(m,1H),4.27(d,J＝5.2Hz,2H),3.95–3.87(m,2H),2.65–2.52(m,1H),2.27–2.17(m,1H),2.06(d,J＝2.8Hz,3H),1.65(d,J＝7.0Hz,3H),0.88(s,9H),0.11(d,J＝0.8Hz,6H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000367
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 580.5. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ9.94(s,1H),8.18(s,1H),7.89(s,1H),7.82(d,J＝7.6Hz,1H),7.61(q,J＝4.1,3.0Hz,2H),7.41(t,J＝8.1Hz,1H),6.91(s,1H),6.26–6.17(m,1H),5.45(d,J＝6.0Hz,1H),5.28(t,J＝5.2Hz,1H),5.15(qd,J＝7.0,3.6Hz,1H),4.35–4.16(m,3H),3.70(dt,J＝5.6,3.3Hz,2H),2.54–2.44(m,1H),2.33–2.26(m,1H),2.04(d,J＝5.7Hz,3H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000368
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 745.3. 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.51(s,1H),7.91(d,J＝7.7Hz,1H),7.74(d,J＝7.9Hz,1H),7.68(t,J＝7.7Hz,1H),7.48(t,J＝7.5Hz,1H),6.47-6.42(m,1H),5.73(d,J＝5.6Hz,1H),5.18–5.06(m,1H),4.71(d,J＝9.0Hz,1H),4.39(q,J＝12.5Hz,2H),4.09(d,J＝1.6Hz,2H),2.83-2.79(m,1H),2.58-2.50(m,1H),2.03(dd,J＝3.0,1.5Hz,3H),1.74(d,J＝7.0Hz,3H)； 31P NMR(162MHz,D 2O)δ-9.99(d,J＝19.4Hz,1P),-11.68(d,J＝19.1Hz,1P),-22.93(t,J＝19.4Hz,1P).
Figure PCTCN2022084601-appb-000369
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 1201.6. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.99(s,1H),8.75(d,J＝7.2Hz,1H),8.23(s,1H),8.07(d,J＝7.3Hz,1H),7.87-7.84(m,3H),7.70–7.58(m,3H),7.47–7.37(m,1H),6.95(s,1H),6.23(dd,J＝16.7,8.2Hz,1H),5.55(s,1H),5.33(q,J＝6.8Hz,1H),5.21-5.14(m,1H),4.44–4.36(m,2H),4.32(dd,J＝7.8,4.1Hz,2H),4.24(s,2H),4.13(d,J＝3.3Hz,4H),4.04(s,2H),3.82(s,2H),3.68–3.55(m,6H),2.97(s,2H),2.46–2.34(m,2H),2.13(d,J＝2.1Hz,3H),2.05(d,J＝16.9Hz,3H),1.64(d,J＝6.7Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000370
合成方法与实施例7-1类似，其中，将染料替换为iF700商品(iFluor TM 700 succinimidyl ester，购自AAT Bioquest)。16mg固体，HPLC纯度＞99％。MS[ES(-)],m/z 1962.8. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.30(s,1H),8.91–8.84(m,1H),8.80–8.74(m,1H),8.41–8.35(m, 3H),8.25(t,J＝13.2Hz,1H),8.13(d,J＝6.4Hz,1H),7.99(s,1H),7.90–7.78(m,4H),7.71(d,J＝8.8Hz,1H),7.65–7.60(m,2H),7.53(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.48–7.37(m,3H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),6.65(d,J＝8.0z,2H),6.54(t,J＝12.6Hz,1H),6.38(d,J＝13.6Hz,1H),6.28–6.22(m,1H),6.08(d,J＝13.6Hz,1H),5.55(s,1H),5.31(q,J＝6.8Hz,1H),5.18(p,J＝7.2Hz,1H),4.64(s,2H),4.44–4.30(m,4H),4.14–4.04(m,8H),3.82(t,J＝4.4Hz,2H),3.68–3.63(m,3H),3.60–3.43(m,8H),3.39–3.31(m,4H),3.17(s,3H),2.56(t,J＝7.2Hz,2H),2.46–2.41(m,1H),2.31–2.25(m,2H),2.12(s,2H),2.08(s,1H),2.04(s,1H),1.80(s,2H),1.65(d,J＝6.8Hz,2H),1.60(d,J＝7.2Hz,2H),1.47(s,5H). 31P NMR(162MHz,DMSO-d 6)δ-11.13(d,J＝22.3Hz,1P),-11.90(d,J＝22.6Hz,1P),-23.56(t,J＝22.3Hz,1P).
实施例8
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000371
合成方法与实施例7-1类似。15mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1968.4. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.31(d,J＝18.9Hz,1H),9.00(s,1H),8.23(d,J＝8.9Hz,1H),8.05–7.88(m,3H),7.87–7.77(m,2H),7.72-7.67(m,3H),7.63(dd,J＝5.2,3.6Hz,1H),7.57–7.43(m,1H),7.09(s,1H),6.99(s,3H),6.79(d,J＝5.3Hz,2H),6.27-6.20(m,1H),5.51(s,1H),5.34–5.28(m,2H),4.44–4.36(m,2H),4.32(d,J＝16.2Hz,2H),4.13(s,2H),4.09(s,2H),4.03(s,2H),3.84(s,3H),3.82–3.79(m,2H),3.67–3.64(m,2H),3.42–3.38(m,2H),3.19–3.14(m,2H),3.13–3.08(m,2H),2.89(d,J＝3.8Hz,2H),2.70–2.64(m,4H),2.59–2.53(m,6H),2.13(s,5H),2.08(d,J＝11.3Hz,2H),1.97(dt,J＝10.7,7.0Hz,5H),1.83(dt,J＝12.2,6.0Hz,4H),1.71(t,J＝7.2Hz,2H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.23(s,3H).
实施例9
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000372
linker 8的合成方法同实施例7-1。MS[ES(-)],m/z 548.2. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ10.08(s,1H),9.51(s,1H),7.94(d,J＝2.0Hz,1H),7.86(d,J＝8.6Hz,1H),7.77(dd,J＝8.6,2.0Hz,1H),5.70(q,J＝6.6Hz,1H),4.41–4.32(m,2H),4.12(s,2H),3.96(s,2H),3.79(t,J＝4.6Hz,2H),3.67(dd,J＝5.7,3.2Hz,2H),3.61(dd,J＝5.7,3.1Hz,2H),3.55(t,J＝5.7Hz,2H),3.37(dd,J＝11.3,5.6Hz,2H),2.07(s,1H),1.44(d,J＝6.7Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000373
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1203.2. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ11.18(s,1H),8.28(d,J＝6.3Hz,2H),7.92(d,J＝8.5Hz,1H),7.87(d,J＝7.7Hz,1H),7.69(d,J＝7.1Hz,1H),7.65–7.58(m,2H),7.43(t,J＝5.3Hz,1H),7.27(d,J＝4.3Hz,1H),6.47–6.32(m,2H),6.32–6.24(m,1H),5.70(q,J＝6.5Hz,1H),5.63(s,1H),5.22-5.18(m,1H),4.41-4.37(m,2H),4.32(t,J＝4.9Hz,1H),4.28(s,2H),4.26(s,1H),4.11(d,J＝5.9Hz,2H),4.04(s,2H),4.01(s,2H),3.82(s,2H),3.66(d,J＝13.7Hz,2H),3.63–3.59(m,4H),2.97(s,2H),2.10(d,J＝32.7Hz,3H),1.65(d,J＝6.9Hz,3H),1.44(d,J＝6.6Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000374
合成方法与实施例7-3类似。20mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1842.4. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ10.55(s,1H),10.38(s,1H),8.42(s,1H),8.35(t,J＝13.1Hz,2H),8.03(s,1H),7.88(dd,J＝10.9,6.8Hz,3H),7.81(s,2H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.68–7.58(m,4H),7.47–7.40(m,1H),7.35–7.25(m,3H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.40(s,2H),6.30(dd,J＝13.7,7.2Hz,3H),5.69(q,J＝6.6Hz,1H),5.63(s,1H),5.20(q,J＝6.8Hz,1H),4.44-4.36(m,2H),4.32(t,J＝4.7Hz,1H),4.25(t,J＝4.4Hz,1H),4.16–4.09(m,6H),4.06(s,2H),4.00(s,2H),3.84–3.79(m,2H),3.65(dd,J＝5.4,3.5Hz,2H),3.59–3.55(m,2H),3.43–3.39(m,2H),3.19(dd,J＝11.5,5.8Hz,2H),2.45(dd,J＝11.6,6.5Hz,1H),2.38(dd,J＝13.6,5.4Hz,1H),2.10(d,J＝29.1Hz,3H),2.04(dd,J＝12.6,6.9Hz,2H),1.68(s,12H),1.65(d,J＝7.0Hz,3H),1.56–1.49(m,2H),1.43(d,J＝6.6Hz,3H),1.32(dd,J＝14.2,7.8Hz,2H),1.26(d,J＝7.0Hz,3H),1.23(s,2H).
实施例10-1
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000375
合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 1047.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.06(s,1H),8.81(d,J＝5.8Hz,1H),8.32(s,1H),8.04(s,1H),7.92(d,J＝8.6Hz,1H),7.65(d,J＝8.7Hz,1H),6.10(t,J＝7.0Hz,1H),5.36(q,J＝6.9Hz,1H),4.92(d,J＝8.9Hz,1H),4.81(d,J＝8.9Hz,1H),4.49–4.43(m,1H),4.41–4.35(m,1H),4.33–4.26(m,1H),4.24(s,2H),4.10(dd,J＝10.1,3.4Hz,2H),4.04(s,2H),4.00(dd,J＝11.0,5.5Hz,2H),3.83–3.78(m,2H),3.66(d,J＝4.8Hz,2H),3.64–3.57(m,6H),2.99–2.91(m,2H),2.37-2.27(m,2H),2.15(d,J＝1.1Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000376
合成方法与实施例7-1类似。16mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1783.4. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.39(d,J＝18.2Hz,1H),9.00(t,J＝5.0Hz,1H),8.13(s,1H),8.03–7.98(m,1H),7.82(d,J＝8.6Hz,2H),7.75–7.66(m,3H),7.66–7.60(m,1H),7.58–7.41(m,1H),6.99(s,2H),6.79(d,J＝5.6Hz,2H),6.11(t,J＝6.9Hz,1H),5.30(q,J＝6.9Hz,1H),4.91(d,J＝8.9Hz,1H),4.83(d,J＝8.9Hz,1H),4.49–4.45(m,1H),4.44–4.32(m,2H),4.14(s,2H),4.11–4.07(m,2H),4.03(s,4H),3.81(t,J＝4.4Hz,2H),3.70(d,J＝7.8Hz,2H),3.68–3.63(m,2H),3.56(dd,J＝9.5,5.3Hz,6H),3.40(t,J＝5.9Hz,2H),3.20–3.14(m,2H),3.13–3.06(m,2H),2.67(s,3H),2.58(t,J＝7.1Hz,4H),2.40–2.26(m,2H),2.13(s,3H),2.02–1.91(m,4H),1.84(d,J＝5.0Hz,4H),1.70(t,J＝7.2Hz,1H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.28–1.16(m,3H),1.01–0.92(m,1H)； 31P NMR(162MHz,DMSO-d 6)δ-11.29(d,J＝23.1Hz),-12.09(d,J＝23.0Hz),-23.70(t,J＝22.7Hz).
实施例10-2
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000377
合成方法与实施例7-2类似。MS[ES(-)],m/z 1069.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.18(d,J＝6.1Hz,1H),8.37(t,J＝5.4Hz,1H),8.21(dd,J＝7.4,1.7Hz,1H),8.09(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,1H),7.74(d,J＝2.4Hz,1H),7.68–7.60(m,1H),6.50(dd,J＝8.5,6.1Hz,1H),5.31(q,J＝6.9Hz,1H),4.93(d,J＝8.9Hz,1H),4.87(d,J＝8.9Hz,1H),4.60(d,J＝4.3Hz,1H),4.43–4.32(m,2H),4.29(s,2H),4.16–4.09(m,4H),4.01(s,2H),3.98–3.93(m,2H),3.83–3.79(m,2H),3.67(d,J＝3.0Hz,2H),3.62(d,J＝7.5Hz,4H),2.95(t,J＝4.9Hz,2H),2.69–2.62(m,1H),2.39(dd,J＝13.0,6.0Hz,1H),2.11(d,J＝5.6Hz,3H),1.59(d,J＝6.8Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000378
合成方法与实施例7-2类似。18mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1678.3. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.52(d,J＝4.9Hz,1H),8.94(t,J＝5.0Hz,1H),8.80(s,2H),8.48(t,J＝5.3Hz,1H),8.16(d,J＝8.4Hz,2H),8.08(s,1H),8.04(s,1H),7.82–7.74(m,2H),7.70(d,J＝8.5Hz,1H),7.49(d,J＝7.9Hz,2H),6.71(s,2H),6.49(dd,J＝8.7,5.9Hz,1H),5.29(q,J＝7.0Hz,1H),4.92(d,J＝8.9Hz,1H),4.87(d,J＝8.9Hz,1H),4.60(d,J＝4.8Hz,1H),4.44–4.34(m,2H),4.19(s,2H),4.13(d,J＝5.4Hz,2H),4.00(s,2H),3.97–3.92(m,2H),3.82–3.77(m,4H),3.74–3.70(m,2H),3.68-3.63(m,4H),3.53(dd,J＝10.6,5.0Hz,2H),2.68–2.63(m,1H),2.39(dd,J＝13.1,6.1Hz,1H),2.12(d,J＝1.4Hz,3H),1.58(d,J＝6.9Hz,3H),1.16(d,J＝6.5Hz,6H),1.13(s,6H),0.99(d,J＝2.0Hz,6H)； 31P NMR(162MHz,DMSO-d 6)δ-11.12(d,J＝22.8Hz),-12.12(d,J＝23.4Hz),-23.53(t,J＝22.7Hz).
实施例10-3
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000379
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1085.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.24(s,1H),8.25(s,2H),7.86(d,J＝8.5Hz,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.18(d,J＝2.3Hz, 1H),6.49(s,2H),6.23(dd,J＝8.9,5.8Hz,1H),5.34(q,J＝6.9Hz,1H),4.91(d,J＝8.8Hz,1H),4.85(d,J＝8.8Hz,1H),4.54(d,J＝3.8Hz,1H),4.42-4.31(m,2H),4.29(s,2H),4.12–4.06(m,2H),4.00(s,2H),3.92(s,2H),3.84–3.78(m,2H),3.66(s,2H),3.61(d,J＝4.9Hz,4H),2.98–2.89(m,2H),2.61–2.54(m,1H),2.28(dd,J＝13.1,5.1Hz,1H),2.13(d,J＝1.6Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000380
合成方法与实施例7-3类似。14mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1724.4.1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.56(s,1H),10.35(s,1H),8.43–8.29(m,3H),8.01(d,J＝1.7Hz,1H),7.89(t,J＝5.5Hz,1H),7.86–7.79(m,3H),7.74–7.68(m,1H),7.67–7.59(m,2H),7.31(dd,J＝8.3,2.9Hz,2H),7.21(s,1H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.47(s,2H),6.30(dd,J＝13.8,5.2Hz,2H),6.22(dd,J＝8.9,5.8Hz,1H),5.31(q,J＝6.9Hz,1H),4.91(d,J＝8.9Hz,1H),4.86(d,J＝8.9Hz,1H),4.53(d,J＝4.5Hz,1H),4.44–4.35(m,2H),4.16–4.09(m,4H),4.09–4.04(m,2H),3.99(s,2H),3.97–3.88(m,2H),3.83–3.79(m,2H),3.65(dd,J＝5.7,3.4Hz,2H),3.59–3.55(m,2H),3.41(t,J＝5.8Hz,2H),3.19(dd,J＝11.6,5.9Hz,2H),2.62(dd,J＝14.8,5.7Hz,1H),2.29(dd,J＝13.3,6.0Hz,1H),2.13(s,3H),2.06(dd,J＝9.4,5.0Hz,2H),1.60(d,J＝7.0Hz,3H),1.52(dt,J＝14.8,7.3Hz,2H),1.33(d,J＝6.7Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H)； 31P NMR(162MHz,DMSO-d 6)δ-11.06(d,J＝21.0Hz),-12.40(d,J＝23.7Hz),-23.60(t,J＝22.2Hz).
实施例10-4
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000381
合成方法与实施例7-4类似。MS[ES(-)],m/z 1047.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.15(s,1H),8.66(d,J＝3.9Hz,1H),8.29(dd,J＝4.5,1.8Hz,1H),7.94(s,1H),7.88(d,J＝8.6Hz,1H),7.78(s,1H),7.69–7.62(m,1H),6.90(s,1H),6.11(t,J＝6.3Hz,1H),5.35(q,J＝6.9Hz,1H),4.91(d,J＝8.9Hz,1H),4.81(d,J＝8.9Hz,1H),4.46–4.36(m,2H),4.26(s,2H),4.11(d,J＝3.7Hz,4H),4.04(s,2H),4.02–3.91(m,2H),3.84–3.78(m,2H),3.69–3.64(m,2H),3.64–3.56(m,4H),2.94(t,J＝4.9Hz,2H),2.31(dd,J＝12.2,4.5Hz,1H),2.18-2.15(m,1H),2.14(s,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000382
合成方法与实施例7-4类似。20mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1807.2. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.28(s,1H),8.89(s,1H),8.76(d,J＝5.9Hz,2H),8.39(d,J＝18.8Hz,3H),8.25(t,J＝12.6Hz,1H),7.99(d,J＝9.1Hz,2H),7.87(s,1H),7.82(d,J＝8.6Hz,1H),7.78(s,1H),7.71(d,J＝9.7Hz,1H),7.56–7.51(m,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,2H),6.99–6.87(m,2H),6.65(d,J＝8.2Hz,2H),6.54(t,J＝12.6Hz,1H),6.38(d,J＝12.7Hz,1H),6.10(t,J＝6.0Hz,1H),5.30(q,J＝6.9Hz,1H),4.90(d,J＝8.9Hz,1H),4.82(d,J＝8.9Hz,1H),4.64(s,1H),4.44–4.34(m,2H),4.11(d,J＝9.2Hz,4H),4.02(s,2H),3.81(t,J＝4.3Hz,2H),3.66–3.62(m,2H),3.59–3.52(m,4H),3.52–3.46(m,2H),3.35(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),3.17(s,2H),2.55(d,J＝7.2Hz,1H),2.35–2.22(m,3H),2.21–2.15(m,1H),2.12(s,3H),1.80(s,2H),1.59(d,J＝6.9Hz,3H),1.47(s,5H)； 31P NMR(162MHz,DMSO-d 6)δ-11.10(d,J＝21.6Hz),-12.24(d,J＝23.1Hz),-23.61(t,J＝22.4Hz).
实施例11
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000383
向50mL干燥的圆底烧瓶中依次加入染料AF532(63mg,0.1mmol,1.0eq)，TSTU(1.5eq,45.2mg),加毕，加入3ml DMF溶解，最后加入DIPEA(2.5eq,52uL)，然后置于45℃油浴搅拌3h，加入PEG linker 2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)acetic acid(40mg,2.0eq)，45℃反应过夜，加入水淬灭反应。使用制备液相纯化得目标产物(65.6mg,85％产率)，产物通过MS鉴定。MS[ES(-)],m/z 771.2.
(3)终产物的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000384
合成方法与实施例7-2类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。21mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1978.4. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.46(s,1H),8.88(t,J＝5.2Hz,1H),8.80(s,2H),8.52(t,J＝5.1Hz,1H),8.14(d,J＝8.4Hz,2H),8.06(d,J＝6.6Hz,1H),8.04(s,1H),7.90(dd,J＝7.7,3.0Hz,1H),7.84(dd,J＝11.5,6.6Hz,2H),7.74(t,J＝5.7Hz,1H),7.69(d,J＝8.7Hz,1H),7.64(d,J＝3.8Hz,2H),7.49(d,J＝8.0Hz,2H),7.47–7.41(m,1H),6.70(s,2H),6.66–6.56(m,1H),5.70(d,J＝4.2Hz,1H),5.30(q,J＝7.0Hz,1H),5.21(qd,J＝6.9,2.1Hz,1H),4.45–4.38(m,2H),4.36–4.28(m,2H),4.14(s,4H),4.09-4.05(m,2H),4.02(s,2H),3.89(s,2H),3.83–3.76(m,4H),3.65-3.63(m,2H),3.61(s,2H),3.58-3.56(m,2H),3.53–3.49(m,2H),3.48–3.44(m,2H),3.30-3.26(m,2H),2.12(d,J＝2.0Hz,3H),2.08(d,J＝19.2Hz,3H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.16(d,J＝6.6Hz,6H),1.13(s,6H),1.00(s,6H).
实施例12
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000385
合成方法与实施例11类似。
实施例13
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
染料合成方法与实施例11类似。
(3)终产物的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000386
合成方法与实施例11类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。23mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 2154.5. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ8.94(s,1H),8.88–8.83(m,1H),8.80(s,2H),8.56(s,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,2H),8.10-8.06(m,2H),7.94–7.83(m,4H),7.82(d,J＝4.5Hz,1H),7.63(d,J＝3.9Hz,2H),7.51(d,J＝8.2Hz,2H),7.47-7.43(m,1H),6.71(s,2H),6.65–6.57(m,1H),5.67(s,1H),5.26–5.11(m,2H),4.53–4.41(m,2H),4.40–4.28(m,2H),4.15(d,J＝5.2Hz,2H),4.12–4.05(m,2H),4.02(s,4H),3.83(dd,J＝8.2,4.3Hz,4H),3.80–3.75(m,2H),3.59(s,4H),3.56(d,J＝5.9Hz,4H),2.10(d,J＝7.5Hz,5H),2.06(s,2H),1.66(d,J＝6.3Hz,6H),1.17(s,6H),0.99(s,6H).
实施例14
linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
Figure PCTCN2022084601-appb-000387
染料以及终产物的合成方法与实施例11类似。
实施例15-1
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
染料合成方法与实施例15-2类似，使用染料AF532替代CY5。
(3)终产物的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000388
合成方法与实施例7-2类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。18mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1983.3. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.42(d,J＝144.3Hz,1H),8.97-8.80(m,2H),8.50(d,J＝30.7Hz,1H),8.14–8.05(m,3H),7.91(d,J＝7.8Hz,1H),7.84(dd,J＝12.3,8.6Hz,2H),7.75–7.60(m,3H),7.55(d,J＝8.3Hz,1H),7.49–7.42(m,1H),7.39–7.25(m,2H),6.97–6.89(m,1H),6.71(s,1H),6.64-6.58(m,1H),5.70–5.64(m,1H),5.34–5.26(m,1H),5.22(qd,J＝7.0,1.8Hz,1H),4.58-4.30(m,4H),4.19(s,1H),4.14(s,2H),4.02(s,2H),3.84–3.79(m,2H),3.68–3.65(m,2H),3.60(d,J＝4.6Hz,2H),3.27(d,J＝4.5Hz,2H),3.15(d,J＝8.9Hz,2H),2.74(s,6H),2.12(s,3H),2.09(d,J＝19.8Hz,3H),1.67(d,J＝6.9Hz,3H),1.60(dd,J＝6.6,2.4Hz,3H),1.23(s,2H),1.18–1.13(m,6H),1.00(d,J＝1.8Hz,3H).
实施例15-2
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000389
向50mL干燥的圆底烧瓶中依次加入染料CY5(250mg,0.38mmol,1.0eq)，TSTU(1.2eq,110mg),加毕，加入5ml DMF溶解，最后加入DIPEA(3.0eq,200uL)，然后室温搅拌3h，随后，加入带磺酸的片段(114mg,2.0eq)，室温搅拌6h，反应完全后，加入水淬灭反应。使用制备液相纯化获得目标产物(325mg,产率89％)，产物通过MS鉴定。MS[ES(-)],m/z 807.2.
(3)终产物的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000390
合成方法与实施例7-3类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。25mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 2030.4. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.52(s,1H),10.28(s,1H),8.43(d,J＝2.5Hz,1H),8.34(t,J＝13.0Hz,2H),8.00(s,1H),7.97(d,J＝6.3Hz,1H),7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.86–7.81(m,2H),7.80(s,2H),7.73(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H),7.67–7.58(m,4H),7.47–7.41(m,1H),7.34(d,J＝8.4Hz,1H),7.30(dd,J＝5.8,2.4Hz,2H),6.70(t,J＝12.4Hz,1H),6.39(s,2H),6.37–6.24(m,3H),5.64(t,J＝4.0Hz,1H),5.31(q,J＝6.8Hz,1H),5.24–5.16(m,1H),4.42–4.34(m,3H),4.33–4.23(m,2H),4.13(s,2H),4.12(d,J＝5.4Hz,2H),4.08–4.02(m,2H),4.00(s,2H),3.83–3.79(m,2H),3.66–3.62(m,2H),3.58–3.55(m,2H),3.43–3.39(m,2H),3.23-3.16(m,2H),2.76(dd,J＝13.9,7.9Hz,2H),2.41–2.32(m,1H),2.13(d,J＝1.9Hz,5H),2.08(s,1H),1.66(d,J＝7.1Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H),1.59–1.50(m,2H),1.40(dd,J＝16.1,9.0Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,4H).
实施例16
(1)linker的合成
linker 7的合成方法以及产物鉴定结果同实施例7-1。
(2)染料的合成
染料合成方法与实施例15-2类似，使用染料AF532替代CY5。
(3)终产物的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000391
合成方法与实施例7-2类似，其中，将染料替换为步骤(2)获得的染料。22mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1984.3. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.28(s,1H),8.81(s,3H),8.51(s,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,2H),8.08(d,J＝6.2Hz,1H),8.00(s,1H),7.96–7.88(m,2H),7.82(dd,J＝12.3,6.3Hz,2H),7.67(dd,J＝12.5,6.7Hz,2H),7.64(s,2H),7.52(d,J＝8.0Hz,2H),7.48–7.41(m,1H),6.72(s,2H),6.64–6.57(m,1H),5.67-5,64(m,1H),5.30(q,J＝6.4Hz,1H),5.21(t,J＝6.1Hz,1H),4.47–4.27(m,4H),4.13(s,4H),4.11–4.06(m,2H),4.02(s,2H),3.89(s,2H),3.80(dd,J＝12.6,5.7Hz,4H),3.68–3.64(m,2H),3.62(s,2H),3.57(dd,J＝11.3,5.1Hz,2H),3.49(s,4H),3.47(d,J＝2.6Hz,4H),3.25(d,J＝5.7Hz,2H),3.21(dd,J＝11.6,5.8Hz,2H),2.69–2.65(m,1H),2.57(dd,J＝5.7,2.7Hz,1H),2.31(t,J＝6.5Hz,3H),2.12(s,2H),2.11(d,J＝3.4Hz,3H),2.07(s,2H),2.06(s,2H),1.66(d,J＝7.1Hz,3H),1.60(d,J＝7.1Hz,3H),1.17(d,J＝6.6Hz,6H),1.14(s,6H),1.01(d,J＝1.9Hz,6H).
实施例17
linker的合成
linker 9的合成方法与实施例7-1类似。
Figure PCTCN2022084601-appb-000392
合成方法与实施例7-2类似，25mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1934.3. 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.21(d,J＝3.5Hz,1H),9.05(d,J＝4.9Hz,1H),8.85(t,J＝5.5Hz,1H),8.81(s,2H),8.13(d,J＝8.4Hz,2H),8.09(d,J＝6.6Hz,1H),7.99(s,1H),7.95–7.88(m,3H),7.72(dd,J＝13.2,7.5Hz,2H),7.66–7.59(m,2H),7.51-7.43(m,3H),6.71(s,2H),6.67–6.58(m,1H),5.70(d,J＝3.4Hz,1H),5.30(q,J＝6.6Hz,1H),5.25–5.17(m,1H),4.82-4.70(m,2H),4.38–4.28(m,2H),4.21(d,J＝4.3Hz,3H),4.12(s,2H),4.09–4.01(m,2H),3.89(s,2H),3.82–3.77(m,2H),3.64(dd,J＝4.7,2.1Hz,2H),3.61(s,2H),3.58(dd,J＝5.4,2.9Hz,2H),3.53–3.49(m,2H),3.49–3.43(m,2H),3.29(dd,J＝11.8,5.9Hz,2H),2.62–2.52(m,2H),2.16(s,3H),2.08(d,J＝17.6Hz,3H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H),1.59(d,J＝6.9Hz,3H),1.16(d,J＝6.5Hz,6H),1.14(d,J＝1.2Hz,6H),1.00(d,J＝2.1Hz,6H).
实施例18
linker的合成
linker 9的合成方法与实施例7-1类似。
Figure PCTCN2022084601-appb-000393
实施例19
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000394
乙基苯甲酸在酸的条件下酯化，然后利用NBS溴代得到溴代产物。随后利用硫酸盐制备得到中间体，再利用硫醇胺制备二硫键化合物，水解后与PEG片段缩合得到linker 10。MS[ES(-)],m/z 599.1. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ9.59(s,1H),7.80(dd,J＝14.3,6.9Hz,2H),7.59(q,J＝8.1Hz,2H),7.42–7.36(m,1H),5.13(q,J＝6.9Hz,1H),4.44-4.33(m,2H),3.89(s,2H),3.85(s,2H),3.81–3.75(m,2H),3.61(s,2H),3.55(s,4H),3.51(t,J＝5.7Hz,2H), 3.35(dd,J＝10.6,5.2Hz,2H),3.30–3.23(m,2H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000395
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1254.2. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ8.54(s,1H),7.95(s,1H),7.89–7.83(m,1H),7.76(d,J＝5.1Hz,1H),7.63(d,J＝6.0Hz,2H),7.58(d,J＝6.7Hz,2H),7.46–7.37(m,2H),7.30–7.18(m,1H),6.69–6.63(m,1H),6.35(s,2H),5.56(dd,J＝6.2,5.2Hz,1H),5.32(t,J＝4.8Hz,1H),5.20(dd,J＝9.6,4.7Hz,1H),5.14–5.07(m,1H),4.44(s,2H),4.37–4.25(m,2H),4.12(dd,J＝3.2,2.3Hz,2H),4.01(s,4H),3.89–3.84(m,2H),3.83(dd,J＝6.8,4.4Hz,2H),3.63(d,J＝7.7Hz,2H),3.56(s,4H),3.45–3.42(m,2H),2.45(d,J＝1.9Hz,1H),2.36(d,J＝0.6Hz,1H),2.02-1.96(m,6H),1.66–1.60(m,6H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000396
合成方法与实施例7-3类似。16mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1893.4. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ10.53(s,1H),8.46–8.30(m,2H),7.87(d,J＝6.8Hz,2H),7.81(s,2H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H),7.65-7.62(m,3H),7.58(q,J＝7.8Hz,2H),7.46–7.36(m,2H),7.31(d,J＝8.2Hz,2H),7.29(s,1H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.40(s,2H),6.34–6.20(m,3H),5.63(s,1H),5.22-5.18(m,1H),5.13(q,J＝6.9Hz,1H),4.49-4.44(m,1H),4.41-4.37(m,1H),4.32(s,1H),4.26(s,1H),4.12(d,J＝5.0Hz,2H),4.07(t,J＝8.0Hz,2H),4.00(s,2H),3.85(s,2H),3.82(t,J＝4.0Hz,,3H),3.53(s,4H),3.52(s,2H),3.40–3.35(m,2H),3.29–3.24(m,2H),3.17(d,J＝5.7Hz,2H),2.13(s,1H),2.06(d,J＝4.0Hz,1H),1.67(s,12H),1.65(d,J＝6.9Hz,3H),1.62(d,J＝6.9Hz,3H),1.56–1.49(m,2H),1.35-1.29(m,2H),1.26-1.23(m,6H).
实施例20-1
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000397
linker 11的合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 585.1. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ9.97(s,1H),9.59(s,1H),8.04(d,J＝2.1Hz,1H),7.89(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),7.55(d,J＝8.6Hz,1H),5.13(q,J＝6.9Hz,1H),4.44–4.34(m,2H),4.09(s,2H),3.87(s,2H),3.78(s,2H),3.66(dd,J＝5.7,3.1Hz,2H),3.61(dd,J＝5.6,3.1Hz,2H),3.55(t,J＝5.7Hz,2H),3.37(dd,J＝11.0,5.4Hz,2H),2.10(s,3H),1.62(d,J＝7.0Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000398
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1240.2. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ10.83(s,1H),8.44–8.36(m,1H),8.25(s,1H),8.03–7.91(m,1H),7.87(d,J＝7.8Hz,1H),7.66–7.58(m,2H),7.52(d,J＝8.7Hz,1H),7.48–7.40(m,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),7.30–7.23(m,1H),7.07(d,J＝8.3Hz,1H),6.41-6.37(m,2H),6.35–6.27(m,1H),5.64(s,1H),5.22-5.16(m,2H),4.51–4.41(m,1H),4.41–4.35(m,1H),4.34(d,J＝4.7Hz,1H),4.26(s,1H),4.25(s,2H),4.15–4.10(m,2H),4.05(s,4H),3.82(s,2H),3.68–3.58(m,6H),3.55–3.51(m,2H),2.63(t,J＝7.1Hz,1H),2.37(d,J＝13.0Hz,1H),2.11(d,J＝18.7Hz,3H),2.08(s,3H),1.66(d,J＝6.9Hz,3H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000399
合成方法与实施例7-3类似。18mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1779.4. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ10.51(s,1H),10.21(s,1H),8.43–8.29(m,3H),8.12(s,1H),7.91(dd,J＝10.0,3.2Hz,2H),7.87(d,J＝7.4Hz,1H),7.81(s,2H),7.64-7.62(m,4H),7.53(d,J＝8.6Hz,1H),7.44(td,J＝7.2,1.8Hz,1H),7.35–7.28(m,3H),7.27(d,J＝4.8Hz,1H),7.07(d,J＝8.5Hz,1H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.37(s,1H),6.31(dd,J＝14.2,6.9Hz,3H),5.63(s,1H),5.23–5.16(m,1H),5.13(q,J＝7.0Hz,1H),4.48–4.39(m,2H),4.33(t,J＝4.2Hz,1H),4.26(t,J＝3.5Hz,1H),4.13(s,2H),4.11(s,2H),4.06(s,2H),4.00(s,2H),3.83–3.80(m,2H),3.65-3.63(m,2H),3.56(dd,J＝7.8,3.4Hz,2H),3.53(d,J＝7.3Hz,2H),3.40(d,J＝5.4Hz,2H),3.19(dd,J＝11.3,5.7Hz,2H),2.63(t,J＝5.4Hz,1H),2.41–2.34(m,1H),2.13(s,1H),2.10–2.06(m,6H),1.68(s,12H),1.65(d,J＝7.0Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H),1.54–1.49(m,2H),1.32(dd,J＝12.2,6.8Hz,2H),1.25(dd,J＝11.3,4.5Hz,9H).
实施例20-2
linker的合成
linker的合成方法与实施例20-1类似。
Figure PCTCN2022084601-appb-000400
合成路线与实施例20-1类似。
实施例21
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000401
linker 12的合成方法与实施例7-1类似。MS[ES(-)],m/z 629.2. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ9.53(s,1H),8.22(t,J＝5.7Hz,1H),7.85(d,J＝8.7Hz,1H),7.14(d,J＝2.5Hz,1H),6.96(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),5.33(q,J＝6.8Hz,1H),4.63–4.53(m,2H),4.40-4.30(m,2H),3.94(s,2H),3.79(t,J＝4.5Hz,2H),3.52–3.48(m,4H),3.46–3.43(m,2H),3.36–3.32(m,4H),3.29(dd,J＝11.8,5.9Hz,2H),2.13(s,3H),1.62(d,J＝7.0Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000402
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1284.2. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ8.77(s,1H),8.46(dd,J＝14.7,6.2Hz,1H),7.89(dd,J＝17.9,8.1Hz,2H),7.66–7.60(m,2H),7.47–7.41(m,1H),7.30(d,J＝4.2Hz,1H),7.09(d,J＝1.9Hz,1H),7.07–6.99(m,1H),6.51–6.35(m,2H),6.35–6.23(m,1H),5.64(s,1H),5.35(d,J＝6.9Hz,1H),5.20(dd,J＝6.9,2.8Hz,1H),4.66(s,2H),4.44–4.38(m,1H),4.37–4.33(m,1H),4.32(d,J＝4.8Hz,1H),4.25(t,J＝4.2Hz,1H),4.11(d,J＝5.2Hz,2H),4.05–4.02(m,2H),4.01(s,2H),3.83–3.80(m,2H),3.62(s,2H),3.51(d,J＝7.5Hz,4H),3.45(d,J＝5.5Hz,4H),3.29–3.25(m,2H),2.49–2.43(m,1H),2.41-2.36(m,1H),2.10(d,J＝26.1Hz,6H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H),1.62(d,J＝6.9Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000403
合成方法与实施例7-3类似。21mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1924.4. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ10.55(s,1H),8.49(d,J＝6.0Hz,1H),8.36(t,J＝12.9Hz,2H),7.89–7.84(m,2H),7.81(s,2H),7.65–7.59(m,3H),7.47–7.40(m,1H),7.31(dd,J＝8.2,1.4Hz,2H),7.12(d,J＝2.2Hz,1H),7.01–6.94(m,1H),6.59(t,J＝12.2Hz,1H),6.40(s,2H),6.30(dd,J＝13.2,4.5Hz,2H),5.60(d,J＝58.2Hz,1H),5.33(q,J＝6.9Hz,1H),5.20(dd,J＝12.8,5.8Hz,1H),4.58(s,2H),4.44–4.33(m,2H),4.33–4.28(m,1H),4.28–4.22(m,1H),4.13(dd,J＝11.7,5.6Hz,2H),4.09–4.05(m,2H),4.00(s,2H),3.82–3.79(m,2H),3.48(s,2H),3.45–3.42(m,2H),3.38–3.34(m,2H),3.28(dd,J＝11.5,5.8Hz,2H),3.16(dd,J＝11.3,5.5Hz,2H),2.13(s,1H),2.12(s,2H),2.08–2.03(m,3H),1.68(s,9H),1.65(d,J＝6.2Hz,3H),1.61(d,J＝6.9Hz,3H),1.55–1.49(m,2H),1.35–1.30(m,2H),1.25(dd,J＝12.0,4.4Hz,6H).
实施例22
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000404
Figure PCTCN2022084601-appb-000405
linker 13的合成方法与实施例7-1类似。。MS[ES(-)],m/z 599.1. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ9.53(s,1H),8.81(t,J＝5.5Hz,1H),8.05(s,1H),7.84(s,2H),5.17(q,J＝7.0Hz,1H),4.50–4.31(m,2H),3.84(s,2H),3.80–3.77(m,2H),3.55(d,J＝6.1Hz,2H),3.53(s,4H),3.49(t,J＝5.8Hz,2H),3.43(dd,J＝11.5,5.7Hz,2H),3.32(dd,J＝10.7,5.3Hz,2H),2.09(s,3H),1.67(d,J＝7.0Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000406
合成方法与实施例7-3类似。MS[ES(-)],m/z 1099.2. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ9.36(s,1H),8.43(s,1H),8.06(d,J＝7.9Hz,2H),7.92(d,J＝8.2Hz,1H),7.20(s,1H),6.45(s,2H),6.23(dd,J＝8.8,6.0Hz,1H),5.18(q,J＝7.1Hz,1H),4.90(d,J＝8.8Hz,1H),4.85(d,J＝8.8Hz,1H),4.53(d,J＝4.0Hz,1H),4.51–4.36(m,2H),4.14–4.05(m,4H),4.01(s,2H),3.90(dd,J＝11.1,6.1Hz,2H),3.85–3.80(m,2H),3.63–3.58(m,6H),3.54(s,4H),2.62–2.54(m,1H),2.28(dd,J＝12.9,5.5Hz,1H),2.09(d,J＝2.8Hz,3H),1.66(d,J＝7.0Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000407
合成方法与实施例7-3类似。13mg固体，HPLC纯度＞99％。
MS[ES(-)],m/z 1738.4. 1H NMR(500MHz,DMSO-d 6)δ10.55(s,1H),8.91(s,1H),8.45(t,J＝5.6Hz,1H),8.35(t,J＝13.0Hz,2H),8.04(s,1H),7.92–7.84(m,3H),7.80(d,J＝1.7Hz,2H),7.64(ddd,J＝8.2,3.7,1.5Hz,2H),7.31(dd,J＝8.3,3.0Hz,2H),7.22(s,1H),6.59(t,J＝12.3Hz,1H),6.46(s,2H),6.30(dd,J＝13.7,4.3Hz,2H),6.21(dd,J＝8.9,5.8Hz,1H),5.15(q,J＝6.9Hz,1H),4.90(d,J＝8.9Hz,1H),4.85(d,J＝8.9Hz,1H),4.53(d,J＝3.9Hz,1H),4.51–4.44(m,1H),4.44–4.38(m,1H),4.15–4.09(m,4H),4.09–4.03(m,2H),3.99(s,2H),3.97–3.87(m,2H),3.84–3.80(m,2H),3.76–3.72(m,2H),3.44–3.41(m,2H),3.38–3.34(m,4H),3.15(dd,J＝11.6,5.8Hz,2H),2.91–2.88(m,2H),2.66–2.60(m,1H),2.28(dd,J＝13.1,5.6Hz,1H),2.08(s,3H),2.07–2.02(m,2H),1.67(s,12H),1.65(d,J＝8.0Hz,3H),1.56–1.48(m,2H),1.35–1.29(m,2H),1.26-1.22(m,5H).
实施例23
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000408
合成路线与实施例19类似。
实施例24
Figure PCTCN2022084601-appb-000409
Figure PCTCN2022084601-appb-000410
合成路线与实施例7-3类似。
实施例25
Figure PCTCN2022084601-appb-000411
合成路线与实施例7-3类似。
实施例26
Figure PCTCN2022084601-appb-000412
linker 2的合成方法参见实施例2。
核苷与linker 2 DCC缩合得到酯化产物，随后脱去TBS保护基、三磷酸化以及氨解后得到片段，片段与染料偶联得到产品。
实施例27
Figure PCTCN2022084601-appb-000413
Figure PCTCN2022084601-appb-000414
合成路线与实施例19类似。
实施例28
Figure PCTCN2022084601-appb-000415
Figure PCTCN2022084601-appb-000416
合成路线与实施例7-1类似。
实施例29
Figure PCTCN2022084601-appb-000417
合成路线与实施例7-1类似。
实施例30
Figure PCTCN2022084601-appb-000418
合成路线与实施例7-1类似。
实施例31
Figure PCTCN2022084601-appb-000419
Figure PCTCN2022084601-appb-000420
合成路线与实施例7-1类似。
实施例32
Figure PCTCN2022084601-appb-000421
合成路线与实施例7-1类似。
实施例33
Figure PCTCN2022084601-appb-000422
Figure PCTCN2022084601-appb-000423
合成路线与实施例7-1类似。
实施例34
Figure PCTCN2022084601-appb-000424
合成路线参考实施例19。
实施例35
Figure PCTCN2022084601-appb-000425
Figure PCTCN2022084601-appb-000426
合成路线与实施例22类似。
实施例36
Figure PCTCN2022084601-appb-000427
合成路线与实施例19类似。
实施例37
Figure PCTCN2022084601-appb-000428
Figure PCTCN2022084601-appb-000429
合成路线与实施例8类似。
实施例38
Figure PCTCN2022084601-appb-000430
合成路线与实施例7-2类似。
实施例39
Figure PCTCN2022084601-appb-000431
Figure PCTCN2022084601-appb-000432
合成路线与实施例6-2类似。
实施例40
Figure PCTCN2022084601-appb-000433
合成路线与实施例19类似。
实施例41
Figure PCTCN2022084601-appb-000434
Figure PCTCN2022084601-appb-000435
合成路线与实施例22类似。
实施例42
Figure PCTCN2022084601-appb-000436
linker 2的合成参见实施例2。
化合物缩合后得到TBS保护核苷，氨解去掉乙酰基后，与linker2DCC缩合，脱去TBS保护基，三磷酸化后再氨基得到氨基化合物，最后标记荧光染料得到产品。
实施例43
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000437
Linker在DCC缩合条件下反应，脱去TBS保护基，三磷酸化后得到三磷酸。氨基脱去三氟乙酰基，最后与染料缩合得到产品。
实施例44
linker 2的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000438
linker 2在DCC缩合条件下反应，脱去TBS保护基，三磷酸化后得到三磷酸。氨基脱去三氟乙酰基，最后与染料缩合得到产品。
实施例45
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000439
Figure PCTCN2022084601-appb-000440
合成路线与实施例2类似。
实施例46
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000441
Figure PCTCN2022084601-appb-000442
linker的合成参见实施例3。
实施例47
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000443
Figure PCTCN2022084601-appb-000444
合成路线与实施例2类似。
实施例48
linker的合成
Figure PCTCN2022084601-appb-000445
linker是2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸盐酸盐，直接购买自安耐吉化学，货号A012027。
Figure PCTCN2022084601-appb-000446
合成路线与实施例19类似。
二、 测序效果评估实施例
作为对照的以下四种cold dNTP可以参照PCT/CN2021/125262中实施例三十、实施例三十一、实施例三十二、实施例三十三的制备方法进行合成。
Figure PCTCN2022084601-appb-000447
Figure PCTCN2022084601-appb-000448
具体地：
Figure PCTCN2022084601-appb-000449
合成路线如下：
Figure PCTCN2022084601-appb-000450
MW＝692。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ7.90–7.82(m,2H),7.69–7.58(m,2H),7.46–7.39(m,1H),6.47–6.35(m,1H),5.73(s,1H),5.10-5.01(m,1H),4.57(dd,J＝13.6,3.0Hz,1H),4.41–4.24(m,2H),2.65–2.52(m,2H),1.98(d,J＝15.2Hz,3H),1.94(s,3H),1.68(d,J＝7.2Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000451
合成路线如下：
Figure PCTCN2022084601-appb-000452
MW＝717。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.14(t,J＝3.1Hz,1H),7.82(dd,J＝8.1,3.1Hz,1H),7.55(q,J＝3.2Hz,2H),7.38-7.34(m,1H),6.31-6.22(m,1H),5.76(d,J＝4.1Hz,1H),5.10–5.00(m,1H),4.65–4.55(m,1H),4.36-4.21(m,2H),3.02–2.94(m,1H),2.71–2.61(m,1H),1.94(dd,J＝22.2,3.2Hz,3H),1.62(dd,J＝7.2,3.3Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000453
合成路线如下：
Figure PCTCN2022084601-appb-000454
MW＝677。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.08–8.00(m,1H),7.91–7.84(m,1H),7.72–7.59(m,2H),7.49–7.40(m,1H),6.48–6.40(m,1H),6.19(dd,J＝7.7,2.3Hz,1H),5.73–5.64(m,1H),5.13–5.02(m,1H),4.60(d,J＝12.6Hz,1H),4.36-4.27(m,2H),2.71-2.64(m,1H),2.55–2.44(m,1H),2.00(dd,J＝9.5,2.2Hz,3H),1.69(dd,J＝7.2,2.1Hz,3H).
Figure PCTCN2022084601-appb-000455
合成路线如下：
Figure PCTCN2022084601-appb-000456
MW＝701。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.53(dd,J＝5.2,1.8Hz,1H),8.18–8.10(m,1H),7.83(d,J＝7.8Hz,1H),7.55-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,1H),6.49-6.40(m,1H),5.81–5.73(m,1H),5.07-5.00(m,1H),4.67–4.57(m,1H),4.39–4.18(m,2H),3.06–2.95(m,1H),2.75(ddd,J＝21.2,14.2,5.6Hz,1H),1.93(dd,J＝25.1,1.9Hz,3H),1.60(dd,J＝6.9,4.0Hz,3H).
测序例1
核苷酸底物
(1)hot dNTP：实施例7-1至7-4合成获得的四种终产物(命名为SSEB Hot Mix_V8)，结构如下。
Figure PCTCN2022084601-appb-000457
Figure PCTCN2022084601-appb-000458
(2)cold dNTP：如上所述方法合成以下四种cold dNTP，结构如下。
Figure PCTCN2022084601-appb-000459
Figure PCTCN2022084601-appb-000460
按照MGISEQ-2000测序仪操作规程，使用上述核苷酸底物以及MGISEQ-2000高通量测序试剂套装(FCL SE50)进行测序。
1.利用Ecoli测序文库制备DNA纳米球。
2.将DNA纳米球装载到BGISEQ2000测序芯片上。
3.将装载完成的测序芯片加载至BGISEQ2000测序仪上，设置测序流程，hot dNTP聚合：60℃ 2min；cold dNTP聚合：60℃ 2min；信号采集；切除阻断基团：65℃ 2min。
4.下机数据进行basecall分析，输出测序指标、比对率、错误率、Q30等，结果见表1。
结果表明，此类核苷酸类似物在高通量测序中起到良好的可逆阻断效果，可实现逐个检测测序中掺入的核苷酸类型。
表1 Basecall分析结果
核苷酸类似物hot dNTP Mix SSEB Hot Mix_V8
参考基因(Reference) Ecoli
循环数(Cycle Number) 51
Q30(％) 92.67
Lag(％) 0.43
Runon(％) 0.31
ESR(％) 82.60
比对率(Mapping Rate,％) 98.15
平均错误率(AvgError Rate,％) 0.50
注：
1、Q30(％)指Basecall结果错误率低于0.001(准确性高于99.9％)的base占有比率；
2、Lag(％)指测序滞后所占比率；
3、Runon(％)指测序超前所占比率；
4、ESR(％)指经过过滤最终测序所得的reads数(Total Reads)占Basecall能识别出来的DNB数量(DNB Number)的比率。
测序例2
核苷酸底物
(1)hot dNTP：实施例7-1、7-4、11、15-2合成获得的四种终产物(命名为SSEB Hot Mix-V8V9V11)，结构如下。
Figure PCTCN2022084601-appb-000461
(2)cold dNTP：通过常规方法合成四种cold dNTP，结构如下。
Figure PCTCN2022084601-appb-000462
按照MGISEQ-2000测序仪操作规程，使用上述核苷酸底物以及MGISEQ-2000高通量测序试剂套装(FCL PE100)进行测序。
1.利用Ecoli测序文库制备DNA纳米球；
2.将DNA纳米球装载到BGISEQ2000测序芯片上；
3.将装载完成的测序芯片加载至BGISEQ2000测序仪上，设置测序流程，hot dNTP聚合：55℃30s；cold dNTP聚合：55℃60s；信号采集；切除阻断基团：55℃8s。
4.下机数据进行basecall分析，输出测序指标、比对率、错误率、Q30等，结果见表2。
结果表明，此类核苷酸类似物在高通量测序中起到良好的可逆阻断效果，可实现逐个检测测序中掺入的核苷酸类型。
表2 Basecall分析结果
核苷酸类似物hot dNTP Mix SSEB Hot Mix-V8V9V11
参考基因(Reference) Ecoli
循环数(Cycle Number) 212
Q30(％) 95.79
Lag 1(％) 0.08
Lag 2(％) 0.11
Runon 1(％) 0.12
Runon 2(％) 0.26
ESR(％) 76.81
比对率(Mapping Rate,％) 99.89
平均错误率(AvgError Rate,％) 0.15
测序例3
核苷酸底物
(1)hot dNTP：实施例10-1、10-2、10-3、10-4合成获得的四种终产物(命名为SSEB Hot Mix-N 3)，结构如下。
Figure PCTCN2022084601-appb-000463
(2)cold dNTP：通过常规方法合成四种cold dNTP，结构如下。
Figure PCTCN2022084601-appb-000464
按照MGISEQ-2000测序仪操作规程，使用上述核苷酸底物以及MGISEQ-2000高通量测序试剂套装(FCL PE100)进行测序。
1.利用Ecoli测序文库制备DNA纳米球；
2.将DNA纳米球装载到BGISEQ2000测序芯片上；
3.将装载完成的测序芯片加载至BGISEQ2000测序仪上，设置测序流程，hot dNTP聚合：60℃ 2min；cold dNTP聚合：60℃ 2min；信号采集；切除阻断基团：65℃ 2min。
4.下机数据进行basecall分析，输出测序指标、比对率、错误率、Q30等，结果见表3。
结果表明，此类核苷酸类似物在高通量测序中起到良好的可逆阻断效果，可实现逐个检测测序中掺入的核苷酸类型。
表3 Basecall分析结果
核苷酸类似物hot dNTP Mix SSEB Hot Mix-N 3
参考基因(Reference) Ecoli
循环数(Cycle Number) 53
Q30(％) 95.45
Lag 1(％) 0.20
Lag 2(％) 0.22
Runon 1(％) 0.43
Runon 2(％) 0.45
ESR(％) 80.29
比对率(Mapping Rate,％) 96.82
平均错误率(AvgError Rate,％) 0.57

Claims (60)

  1. 式I或式II所示的化合物或其盐，
    Figure PCTCN2022084601-appb-100001
    其中：
    L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100002
    优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100003
    或者优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100004
    Figure PCTCN2022084601-appb-100005
    或者更优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100006
    Figure PCTCN2022084601-appb-100007
    或者最优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100008
    Figure PCTCN2022084601-appb-100009
    r 1、r 2、r 3a、r 3b、r 4各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 1选自1、2、3；
    更优选地，r 1为1；
    优选地，r 2选自1、2、3；
    更优选地，r 2为1；
    优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5；
    更优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3；
    最优选地，r 3a为1；
    最优选地，r 3b为2；
    优选地，r 4选自1、2、3；
    更优选地，r 4为1；
    M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
    优选地，M选自CH 2、O；
    L 2为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100010
    优选地，W与R相连；
    L 3为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100011
    优选地，W与R相连；
    各X独立地选自O、S、NH；
    优选地，各X独立地选自O、S；
    更优选地，X为O；
    Y选自直接键、O、S、NH；
    优选地，Y为直接键；
    各W独立地选自直接键、O、S、NH；
    优选地，W为直接键；
    R为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100012
    R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100013
    其余各自独立地选自H、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100014
    叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
    优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100015
    其余各自独立地选自H、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100016
    更优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100017
    另一个(如R 1或R 5)选自H、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100018
    剩余三个为H；
    r 5、r 6、r 7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 5选自1、2、3；
    更优选地，r 5为2；
    优选地，r 6选自1、2、3；
    更优选地，r 6为1或2；
    优选地，r 7选自1、2、3；
    更优选地，r 7为2；
    r 8、r 9各自独立地选自0、1，且r 8、r 9不同时为0；
    M 1、M 2、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
    优选地，M 1选自直接键、NH、O；
    优选地，M 2为NH；
    优选地，M 3选自直接键、NH；
    R a选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
    优选地，R a选自H、C1-C6烷基；
    更优选地，R a为甲基；
    R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
    优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
    更优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me、-SS-Et，另一个为甲基；
    最优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基；
    优选地，R选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100019
    Figure PCTCN2022084601-appb-100020
    Figure PCTCN2022084601-appb-100021
    R 0选自H、单磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100022
    二磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100023
    三磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100024
    四磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100025
    优选地，R 0为三磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100026
    各Z独立地选自O，S，BH；
    优选地，Z为O；
    base 1、base 2各自独立地选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
    优选地，base 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100027
    优选地，base 2选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100028
    式I中，R’表示可逆阻断基团，式II中，
    Figure PCTCN2022084601-appb-100029
    表示可逆阻断基团。
  2. 权利要求1的化合物或其盐，其中，所述化合物具有式I-1所示结构，
    Figure PCTCN2022084601-appb-100030
    其中：
    L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100031
    优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100032
    Figure PCTCN2022084601-appb-100033
    更优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100034
    Figure PCTCN2022084601-appb-100035
    r 1、r 2、r 3a、r 3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 1选自1、2、3；
    更优选地，r 1为1；
    优选地，r 2选自1、2、3；
    更优选地，r 2为1；
    优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5；
    更优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3；
    最优选地，r 3a为1；
    最优选地，r 3b为2；
    M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
    优选地，M选自CH 2、O；
    X选自O、S、NH；
    优选地，X选自O、S；
    更优选地，X为O；
    Y选自直接键、O、S、NH；
    优选地，Y为直接键；
    W选自直接键、O、S、NH；
    优选地，W为直接键；
    R为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100036
    R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100037
    其余各自独立地选自H、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100038
    叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
    优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100039
    其余各自独立地选自H、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100040
    更优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100041
    另一个(如R 1或R 5)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100042
    剩余三个为H；
    进一步优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 3或R 4为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100043
    R 1为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100044
    剩余三个为H；
    最优选地，R选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100045
    Figure PCTCN2022084601-appb-100046
    Figure PCTCN2022084601-appb-100047
    r 5、r 6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 5选自1、2、3；
    更优选地，r 5为2；
    优选地，r 6选自1、2、3；
    更优选地，r 6为1或2；
    M 1、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
    优选地，M 1选自直接键、NH、O；
    优选地，M 3选自直接键、NH；
    更优选地，M 1为NH、O或S时，M 3为直接键，且M 3为NH、O或S时，M 1为直接键；
    R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
    优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
    更优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基；
    Z选自O，S，BH；
    优选地，Z为O；
    base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
    优选地，base 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100048
    R’表示可逆阻断基团。
  3. 权利要求1的化合物或其盐，其中，所述化合物具有式I-2所示结构，
    Figure PCTCN2022084601-appb-100049
    其中：
    L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100050
    优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100051
    Figure PCTCN2022084601-appb-100052
    更优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100053
    Figure PCTCN2022084601-appb-100054
    r 1、r 2、r 3a、r 3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 1选自1、2、3；
    更优选地，r 1为1；
    优选地，r 2选自1、2、3；
    更优选地，r 2为1；
    优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5；
    更优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3；
    最优选地，r 3a为1；
    最优选地，r 3b为2；
    M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
    优选地，M选自CH 2、O；
    X选自O、S、NH；
    优选地，X选自O、S；
    更优选地，X为O；
    Y选自直接键、O、S、NH；
    优选地，Y为直接键；
    W选自直接键、O、S、NH；
    优选地，W为直接键；
    R为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100055
    R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 1或R 5)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100056
    其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
    优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 1或R 5)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100057
    其余为H；
    更优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 1为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100058
    其余为H；
    最优选地，R选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100059
    Figure PCTCN2022084601-appb-100060
    r 5、r 6、r 7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 5选自1、2、3；
    更优选地，r 5为2；
    优选地，r 6选自1、2、3；
    更优选地，r 6为1；
    优选地，r 7选自1、2、3；
    更优选地，r 7为2；
    r 8选自0、1；
    M 1选自直接键、NH、O、S；
    优选地，M 1为直接键；
    R a选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
    优选地，R a选自C1-C6烷基；
    更优选地，R a为甲基；
    Z选自O，S，BH；
    优选地，Z为O；
    base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
    优选地，base 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100061
    R’表示可逆阻断基团。
  4. 权利要求1的化合物或其盐，其中，所述化合物具有式II-1所示结构，
    Figure PCTCN2022084601-appb-100062
    其中：
    X选自O、S、NH；
    优选地，X选自O、S；
    更优选地，X为O；
    W选自直接键、O、S、NH；
    优选地，W为直接键；
    R为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100063
    R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 3或R 4)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100064
    其余各自独立地选自H、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100065
    叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
    优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 3或R 4)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100066
    其余各自独立地选自H、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100067
    更优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 3或R 4)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100068
    另一个(如R 1或R 5)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100069
    剩余三个为H；
    进一步优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 3或R 4为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100070
    R 1为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100071
    剩余三个为H；
    最优选地，R选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100072
    Figure PCTCN2022084601-appb-100073
    r 5、r 6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 5选自1、2、3；
    更优选地，r 5为2；
    优选地，r 6选自1、2、3；
    更优选地，r 6选自1、2；
    M 1、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
    优选地，M 1选自直接键、NH、O；
    优选地，M 3选自直接键、NH；
    R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各 R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
    优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
    更优选地，R b、R c中，任意一个为-N 3或-SS-Me，另一个为甲基；
    Z选自O，S，BH；
    优选地，Z为O；
    base 2选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
    优选地，base 2选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100074
    Figure PCTCN2022084601-appb-100075
    表示可逆阻断基团。
  5. 权利要求1的化合物或其盐，其中，所述化合物具有式II-2所示结构，
    Figure PCTCN2022084601-appb-100076
    其中：
    X选自O、S、NH；
    优选地，X选自O、S；
    更优选地，X为O；
    W选自直接键、O、S、NH；
    优选地，W为直接键；
    R为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100077
    R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 1或R 5)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100078
    其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)；
    优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 1或R 5)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100079
    其余为H；
    更优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 1为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100080
    其余为H；
    最优选地，R选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100081
    r 5、r 6、r 7选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 5选自1、2、3；
    更优选地，r 5为2；
    优选地，r 6选自1、2、3；
    更优选地，r 6为1；
    优选地，r 7选自1、2、3；
    更优选地，r 7为2；
    r 8选自0、1；
    M 1选自直接键、NH、O、S；
    优选地，M 1为直接键；
    R a选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
    优选地，R a选自C1-C6烷基；
    更优选地，R a为甲基；
    Z选自O，S，BH；
    优选地，Z为O；
    base 2选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
    优选地，base 2选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100082
    Figure PCTCN2022084601-appb-100083
    表示可逆阻断基团。
  6. 权利要求1-3任一项所述的化合物或其盐，其中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100084
    NH 2、-ONH 2、-OCOR z、-OCONHR z，其中，各R z独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
    优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100085
    NH 2；
    更优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100086
    最优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-CH 2-、CH 3-CH 2-S-S-CH 2-、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100087
    R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100088
    其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)，
    优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100089
    其余为H，
    更优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100090
    其余为H，
    R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)，
    优选地，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
    更优选地，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
  7. 式III所示的化合物或其盐，
    Figure PCTCN2022084601-appb-100091
    其中：
    L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100092
    优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100093
    r 2选自1、2、3；
    优选地，r 2为1；
    r 3a选自1、2、3；
    优选地，r 3a为1；
    r 3b选自0、1、2、3；
    优选地，r 3b选自0、2；
    M选自直接键、O；
    L 2为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100094
    R为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100095
    R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 3)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100096
    另一个(如R 1或R 2)选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100097
    剩余三个为H；
    L c选自直接键、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100098
    优选地，L c中的NH端与H相连，L c中的＝O端与NH相连；
    优选地，L c选自直接键、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100099
    Figure PCTCN2022084601-appb-100100
    优选地，L c中的NH端与H相连，L c中的＝O端与NH相连；
    r m选自0、1、2、3；
    优选地，r m选自0、1；
    r 5选自1、2、3；
    优选地，r 5为2；
    r 6选自1、2、3；
    优选地，r 6为1或2；
    r 10选自1-10之间的任意整数；
    优选地，r 10选自2-6之间的任意整数；
    更优选地，r 10为2或6；
    r 11选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 11选自1、2、3；
    更优选地，r 11为1；
    M 1选自NH、O；
    M 3选自直接键、NH；
    R b、R c中，任意一个选自-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
    优选地，R b、R c中，任意一个为-SS-Me，另一个为甲基；
    优选地，R选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100101
    Figure PCTCN2022084601-appb-100102
    R 0选自H、单磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100103
    二磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100104
    三磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100105
    四磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100106
    优选地，R 0为三磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100107
    各Z独立地选自O，S，BH；
    优选地，Z为O；
    base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、 尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
    优选地，base 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100108
    式III中，R’表示可逆阻断基团。
  8. 权利要求7所述的化合物或其盐，其中，所述可逆阻断基团R’为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100109
    R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100110
    另一个(如R 3’)选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H，
    优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100111
    R 3’选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H，
    R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
    优选地，R b’、R c’中，任意一个为-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
  9. 权利要求1-8任一项所述的化合物或其盐，其中，所述化合物选自以下：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100112
    Figure PCTCN2022084601-appb-100113
    Figure PCTCN2022084601-appb-100114
    Figure PCTCN2022084601-appb-100115
    Figure PCTCN2022084601-appb-100116
    Figure PCTCN2022084601-appb-100117
    Figure PCTCN2022084601-appb-100118
    Figure PCTCN2022084601-appb-100119
    Figure PCTCN2022084601-appb-100120
    Figure PCTCN2022084601-appb-100121
    Figure PCTCN2022084601-appb-100122
    Figure PCTCN2022084601-appb-100123
    Figure PCTCN2022084601-appb-100124
    Figure PCTCN2022084601-appb-100125
    Figure PCTCN2022084601-appb-100126
    Figure PCTCN2022084601-appb-100127
    Figure PCTCN2022084601-appb-100128
    Figure PCTCN2022084601-appb-100129
    Figure PCTCN2022084601-appb-100130
    Figure PCTCN2022084601-appb-100131
    Figure PCTCN2022084601-appb-100132
    Figure PCTCN2022084601-appb-100133
    Figure PCTCN2022084601-appb-100134
    Figure PCTCN2022084601-appb-100135
    Figure PCTCN2022084601-appb-100136
    Figure PCTCN2022084601-appb-100137
    Figure PCTCN2022084601-appb-100138
    Figure PCTCN2022084601-appb-100139
    Figure PCTCN2022084601-appb-100140
    Figure PCTCN2022084601-appb-100141
    Figure PCTCN2022084601-appb-100142
    Figure PCTCN2022084601-appb-100143
    Figure PCTCN2022084601-appb-100144
    Figure PCTCN2022084601-appb-100145
    Figure PCTCN2022084601-appb-100146
    Figure PCTCN2022084601-appb-100147
    Figure PCTCN2022084601-appb-100148
    Figure PCTCN2022084601-appb-100149
    Figure PCTCN2022084601-appb-100150
    Figure PCTCN2022084601-appb-100151
    Figure PCTCN2022084601-appb-100152
    Figure PCTCN2022084601-appb-100153
    Figure PCTCN2022084601-appb-100154
    Figure PCTCN2022084601-appb-100155
    Figure PCTCN2022084601-appb-100156
    Figure PCTCN2022084601-appb-100157
  10. 权利要求1-9任一项所述的化合物或其盐，其中，所述化合物或其盐携带额外的可检测标记；
    优选地，所述化合物或其盐携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物、结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述化合物或其盐的表位；
    或者优选地，所述可检测标记与式I、式II、式I-1、式I-2、式II-1或式II-2所示化合物中的R或权利要求9的化合物中对应于R的结构部分连接；
    优选地，所述可检测标记与
    Figure PCTCN2022084601-appb-100158
    或者与其对应的结构部分中的 末端氨基连接；
    优选地，所述可检测标记中的羧基与
    Figure PCTCN2022084601-appb-100159
    或者与其对应的结构部分中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接；
    或者优选地，所述可检测标记与式III所示化合物中的R连接或权利要求9的化合物中对应于R的结构部分连接；
    或者优选地，所述可检测标记与
    Figure PCTCN2022084601-appb-100160
    或者与其对应的结构部分中的末端氨基连接；
    或者优选地，所述可检测标记与
    Figure PCTCN2022084601-appb-100161
    或者与其对应的结构部分中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接；
    优选地，base 1不同，式I所示化合物携带的额外的可检测标记不同；
    优选地，base 2不同，式II所示化合物携带的额外的可检测标记不同；
    优选地，所述可检测标记为荧光标记；
    优选地，所述可检测标记选自以下：iF700、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100162
    Figure PCTCN2022084601-appb-100163
  11. 权利要求10所述的化合物或其盐，其中，所述化合物选自以下：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100164
    Figure PCTCN2022084601-appb-100165
    Figure PCTCN2022084601-appb-100166
    Figure PCTCN2022084601-appb-100167
    Figure PCTCN2022084601-appb-100168
    Figure PCTCN2022084601-appb-100169
    Figure PCTCN2022084601-appb-100170
    Figure PCTCN2022084601-appb-100171
    Figure PCTCN2022084601-appb-100172
    Figure PCTCN2022084601-appb-100173
    Figure PCTCN2022084601-appb-100174
    Figure PCTCN2022084601-appb-100175
    Figure PCTCN2022084601-appb-100176
    Figure PCTCN2022084601-appb-100177
    Figure PCTCN2022084601-appb-100178
    Figure PCTCN2022084601-appb-100179
    Figure PCTCN2022084601-appb-100180
    Figure PCTCN2022084601-appb-100181
    Figure PCTCN2022084601-appb-100182
    Figure PCTCN2022084601-appb-100183
    Figure PCTCN2022084601-appb-100184
    Figure PCTCN2022084601-appb-100185
    Figure PCTCN2022084601-appb-100186
    Figure PCTCN2022084601-appb-100187
    Figure PCTCN2022084601-appb-100188
    Figure PCTCN2022084601-appb-100189
    Figure PCTCN2022084601-appb-100190
    Figure PCTCN2022084601-appb-100191
    Figure PCTCN2022084601-appb-100192
    Figure PCTCN2022084601-appb-100193
    Figure PCTCN2022084601-appb-100194
    Figure PCTCN2022084601-appb-100195
    Figure PCTCN2022084601-appb-100196
    Figure PCTCN2022084601-appb-100197
    Figure PCTCN2022084601-appb-100198
    Figure PCTCN2022084601-appb-100199
    Figure PCTCN2022084601-appb-100200
    Figure PCTCN2022084601-appb-100201
    Figure PCTCN2022084601-appb-100202
    Figure PCTCN2022084601-appb-100203
    Figure PCTCN2022084601-appb-100204
    Figure PCTCN2022084601-appb-100205
    Figure PCTCN2022084601-appb-100206
  12. 终止核酸合成的方法，其包括：将权利要求1-11任一项所述的化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中；
    优选地，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
    优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中；
    优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子的3'端。
  13. 制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将权利要求1-11中任一项所述的化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述化合物或其盐的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中；
    优选地，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
    优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸；
    优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
  14. 核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，
    所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
    向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是权利要求1-11中任一项所述的化合物或其盐；
    或者，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
    向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是权利要求1-11中任一项所述的化合物或其盐，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的权利要求1-11中任一项所述的化合物或其盐。
  15. 测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
    1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是权利要求1-11中任一项所述的化合物或其盐，以及，
    2)确定掺入的核苷酸的类型；
    优选地，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去；
    优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去；
    优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
  16. 权利要求15的方法，其包括以下步骤：
    (a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是权利要求10-11任一项所述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是权利要求1-11任一项所述的化合物或其盐；
    (b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
    (c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
    (d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
    (e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
    从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
  17. 权利要求15的方法，其包括以下步骤：
    (1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是权利要求10-11中任一项所述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是权利要求1-11任一项所述的化合物或其盐；
    (2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
    任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
  18. 权利要求15的方法，其包括以下步骤：
    (a)提供包含双链体、包含至少一种权利要求10-11中任一项所述的化合物或其盐的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
    (b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
    步骤(i)：使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
    步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
    步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记切除；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
  19. 权利要求18的方法，其中，所述双链体连接于支持物上；
    优选地，所述生长的核酸链为引物；
    优选地，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体；
    优选地，所述双链体、所述化合物或其盐、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系；
    优选地，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体；
    优选地，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)；
    优选地，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体；
    优选地，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中接触；
    优选地，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的化合物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键；
    优选地，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相；
    优选地，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作；
    优选地，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的化合物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
  20. 试剂盒，其包含至少一个权利要求1-11任一项所述的化合物或其盐；
    优选地，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为权利要求1-11任一项所述的化合物或其盐；
    优选地，所述第一化合物中，base 1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100207
    )；所述第二化合物中，base 1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100208
    )；所述第三化合物中，base 1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100209
    )；所述第四化合物中，base 1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100210
    )；
    优选地，所述第一化合物中，base 2选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100211
    )；所述第二化合物中，base 2选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100212
    )；所述第三化合物中，base 2选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100213
    )；所述第四化合物中，base 2选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100214
    )；
    优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base 1或base 2互不相同；
    优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
  21. 权利要求20的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
  22. 权利要求1-11任一项所述的化合物或其盐或者权利要求20-21任一项所述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
  23. 式I-1所示的化合物或其盐，
    Figure PCTCN2022084601-appb-100215
    其中：
    L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100216
    优选地，L 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100217
    Figure PCTCN2022084601-appb-100218
    r 1、r 2、r 3a、r 3b各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 1选自1、2、3；
    更优选地，r 1为1；
    优选地，r 2选自1、2、3；
    更优选地，r 2为1；
    优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3、4、5；
    更优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自1、2、3；
    最优选地，r 3a为1；
    最优选地，r 3b为2；
    M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
    优选地，M选自CH 2、O；
    X选自O、S、NH；
    优选地，X选自O、S；
    更优选地，X为O；
    Y选自直接键、O、S、NH；
    优选地，Y为直接键；
    W选自直接键、O、S、NH；
    优选地，W为直接键；
    R为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100219
    R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，任意一个(如R 2、R 3或R 4)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100220
    另一个(如R 1或R 5)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100221
    剩余三个为H；
    优选地，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5中，R 3或R 4为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100222
    R 1为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100223
    剩余三个为H；
    r 5、r 6各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 5选自1、2、3；
    更优选地，r 5为2；
    优选地，r 6选自1、2、3；
    更优选地，r 6为1或2；
    M 1、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S；
    优选地，M 1选自直接键、NH、O；
    优选地，M 3选自直接键、NH；
    更优选地，M 1为NH、O或S时，M 3为直接键，且M 3为NH、O或S时，M 1为直接键；
    R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
    优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基；
    Z选自O，S，BH；
    优选地，Z为O；
    base 1选自碱基、脱氮碱基或其互变异构体，例如腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
    优选地，base 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100224
    R’表示可逆阻断基团。
  24. 权利要求23所述的化合物或其盐，其中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-CH 2-、CH 3-CH 2-S-S-CH 2-、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100225
    R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100226
    其余为H，
    优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100227
    其余为H，
    R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
    优选地，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
  25. 权利要求23-24任一项所述的化合物或其盐，其中，所述化合物选自以下：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100228
    Figure PCTCN2022084601-appb-100229
  26. 权利要求23-25任一项所述的化合物或其盐，其中，所述化合物或其盐携带额外的可检测标记；
    优选地，所述化合物或其盐携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、Affimer、Knottin)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述化合物或其盐的表位；
    或者优选地，所述可检测标记与权利要求23-24任一项所述的式I-1所示化合物中的R或权利要求25的化合物中对应于R的结构部分连接；
    优选地，所述可检测标记与
    Figure PCTCN2022084601-appb-100230
    中的末端氨基连接；
    优选地，所述可检测标记中的羧基与
    Figure PCTCN2022084601-appb-100231
    中的末端氨基通过形成酰胺键进行连接；
    优选地，base 1不同，式I-1所示化合物携带的额外的可检测标记不同；
    优选地，所述可检测标记为荧光标记；
    优选地，所述可检测标记选自以下：iF700、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100232
    Figure PCTCN2022084601-appb-100233
  27. 权利要求26所述的化合物或其盐，其中，所述化合物选自以下：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100234
    Figure PCTCN2022084601-appb-100235
    Figure PCTCN2022084601-appb-100236
  28. 终止核酸合成的方法，其包括：将权利要求23-27任一项所述的化合物或其盐掺入 待终止的核酸分子中；
    优选地，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
    优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子中；
    优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入待终止的核酸分子的3'端。
  29. 制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将权利要求23-27中任一项所述的化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述化合物或其盐的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中；
    优选地，所述化合物或其盐的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
    优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸；
    优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述化合物或其盐掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
  30. 核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，
    所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
    向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是权利要求23-27中任一项所述的化合物或其盐；
    或者，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
    向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是权利要求23-27中任一项所述的化合物或其盐，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的权利要求23-27中任一项所述的化合物或其盐。
  31. 测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
    1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是权利要求23-27中任一项所述的化合物或其盐，以及，
    2)确定掺入的核苷酸的类型；
    优选地，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去；
    优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去；
    优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
  32. 权利要求31的方法，其包括以下步骤：
    (a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是权利要求26-27任一项所述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是权利要求23-27任一项所述的化合物或其盐；
    (b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
    (c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
    (d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
    (e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
    从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
  33. 权利要求31的方法，其包括以下步骤：
    (1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是权利要求26-27中任一项所述的化合物或其盐，任选地其余的核苷酸是权利要求23-27任一项所述的化合物或其盐；
    (2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的 所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
    任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
  34. 权利要求31的方法，其包括以下步骤：
    (a)提供包含双链体、包含至少一种权利要求26-27中任一项所述的化合物或其盐的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
    (b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
    步骤(i)：使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
    步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
    步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记切除；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
  35. 权利要求34的方法，其中，所述双链体连接于支持物上；
    优选地，所述生长的核酸链为引物；
    优选地，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体；
    优选地，所述双链体、所述化合物或其盐、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系；
    优选地，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述化合物或其盐掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体；
    优选地，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)；
    优选地，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体；
    优选地，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中接触；
    优选地，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的化合物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键；
    优选地，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相；
    优选地，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作；
    优选地，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的化合物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
  36. 试剂盒，其包含至少一个权利要求23-27任一项所述的化合物或其盐；
    优选地，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为权利要求23-27任一项所述的化合物或其盐；
    优选地，所述第一化合物中，base 1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100237
    )；所述第二化合物中，base 1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100238
    )；所述第三化合物中，base 1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100239
    )；所述第四化合物中，base 1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100240
    )；
    优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base 1互不相同；
    优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
  37. 权利要求36的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
  38. 权利要求23-27任一项所述的化合物或其盐或者权利要求36-37任一项所述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
  39. 一种核苷酸类似物，其由核糖或脱氧核糖、可逆阻断基团、碱基或脱氮碱基或其互变异构体、用于连接可检测标记的连接子和任选的磷酸基团形成，其中，所述连接子包含如下式A或式A’所示的结构：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100241
    其中：
    R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x、-S-SO 2R x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
    优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基；
    更优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me、-SS-Et，另一个为甲基；
    最优选地，R b、R c中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基；
    R a选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)；
    优选地，R a选自H、C1-C6烷基；
    更优选地，R a为甲基；
    X选自O、S、NH；
    优选地，X选自O、S；
    更优选地，X为O；
    M 1选自直接键、NH、O、S、CH 2；
    优选地，M 1选自直接键、NH、O；
    优选地，所述可逆阻断基团与所述核糖或脱氧核糖的3’-OH相连，所述碱基或脱氮碱 基或其互变异构体与所述核糖或脱氧核糖的1’-C相连，所述任选的磷酸基团与所述核糖或脱氧核糖的5’-OH相连，所述连接子与所述碱基或脱氮碱基或其互变异构体相连。
  40. 权利要求39所述的核苷酸类似物，其中，式A所示的结构如式A-1、式A-2、式A-3、式A-4或式A-5所示，优选如式A-1、式A-2或式A-5所示；或者，式A’所示的结构如式A’-1、式A’-2或式A’-3所示，优选如式A’-1所示；
    Figure PCTCN2022084601-appb-100242
    其中：
    R a、R b、R c、X、M 1的定义如前所述。
  41. 权利要求39-40任一项所述的核苷酸类似物，其中，式A所示的结构选自以下：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100243
    Figure PCTCN2022084601-appb-100244
    或者，式A’所示的结构式为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100245
  42. 权利要求39-41任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述核苷酸类似物具有如下式B所示的结构：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100246
    L x具有权利要求39-41任一项所述的式A、式A’、式A-1、式A-2、式A-3、式A-4、式A-5、式A’-1、式A’-2或式A’-3所示的结构式，且L x的M 1端或S端与L b相连，L x的O端与L a相连；
    Figure PCTCN2022084601-appb-100247
    表示用于连接可检测标记的连接子；
    base 1表示碱基或脱氮碱基或其互变异构体；
    R’表示可逆阻断基团；
    R 0表示H或磷酸基团；
    L a表示所述连接子中用于连接碱基或脱氮碱基或其互变异构体的部分；
    L b表示所述连接子中用于连接可检测标记的部分。
  43. 权利要求39-42任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述核苷酸类似物具有如下式B所示的结构：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100248
    其中：
    L x具有如权利要求39-41任一项的式A、式A’、式A-1、式A-2、式A-3、式A-4、式A-5、式A’-1、式A’-2或式A’-3所示的结构式，且L x的M 1端或S端与L b相连，L x的O端与L a相连；
    L a选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100249
    优选地，L a选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100250
    或者优选地，L a选自:
    Figure PCTCN2022084601-appb-100251
    或者更优选地，L a选自:
    Figure PCTCN2022084601-appb-100252
    或者进一步优选地，L a选自：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100253
    或者最优选地，L a选自:
    Figure PCTCN2022084601-appb-100254
    r 1、r 2、r 3a、r 3b、r 4各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 1选自1、2、3；
    更优选地，r 1为1；
    优选地，r 2选自1、2、3；
    更优选地，r 2为1；
    优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自0、1、2、3、4、5，且r 3a、r 3b不同时为0；
    更优选地，r 3a、r 3b各自独立地选自0、1、2、3，且r 3a、r 3b不同时为0；
    进一步优选地，r 3a选自0、1，r 3b选自0、2，且r 3a、r 3b不同时为0；
    最优选地，r 3a为1；
    最优选地，r 3b为2；
    优选地，r 4选自1、2、3；
    更优选地，r 4为1；
    M选自直接键、CH 2、NH、O、S；
    优选地，M选自直接键、CH 2、O；
    更优选地，M选自CH 2、O；
    L b选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100255
    Figure PCTCN2022084601-appb-100256
    优选地，L b选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100257
    Figure PCTCN2022084601-appb-100258
    更优选地，L b选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100259
    Figure PCTCN2022084601-appb-100260
    最优选地，L b选自：
    Figure PCTCN2022084601-appb-100261
    L c选自直接键、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100262
    优选地，L c中的NH端与L b中的H相连接，L c中的＝O端与L b中的NH相连接；
    优选地，L c选自直接键、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100263
    Figure PCTCN2022084601-appb-100264
    优选地，L c中的NH端与L b中的H相连接，L c中的＝O端与L b中的NH相连接；
    r m选自0-6之间的任意整数；
    优选地，r m选自0、1、2、3；
    更优选地，r m选自0、1；
    r 5、r 6、r 7各自独立地选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 5选自1、2、3；
    更优选地，r 5为2；
    优选地，r 6选自1、2、3；
    更优选地，r 6为1或2；
    优选地，r 7选自1、2、3；
    更优选地，r 7为2；
    r 10选自1-10之间的任意整数；
    优选地，r 10选自2-6之间的任意整数；
    更优选地，r 10为2或6；
    r 11选自1-6之间的任意整数；
    优选地，r 11选自1、2、3；
    更优选地，r 11为1；
    M 1、M 2、M 3各自独立地选自直接键、NH、O、S、CH 2；
    优选地，M 1选自直接键、NH、O；
    优选地，M 2为NH；
    优选地，M 3选自直接键、NH；
    base 1表示碱基或脱氮碱基；
    R’表示可逆阻断基团；
    Figure PCTCN2022084601-appb-100265
    表示用于连接可检测标记的连接子；
    R 0表示H或磷酸基团。
  44. 权利要求42-43任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述base 1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体；
    优选地，base 1选自
    Figure PCTCN2022084601-appb-100266
  45. 权利要求42-44任一项所述的核苷酸类似物，其中，R 0选自H、单磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100267
    二磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100268
    三磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100269
    四磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100270
    优选地，R 0为三磷酸基团
    Figure PCTCN2022084601-appb-100271
    各Z独立地选自O，S，BH；
    优选地，Z为O。
  46. 权利要求42-45任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100272
    NH 2、-ONH 2、-OCOR z、-OCONHR z，其中，各R z独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)；
    优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100273
    NH 2；
    更优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-C1-C6烷基、C1-C6烷基-SS-C1-C6烷基、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100274
    最优选地，所述可逆阻断基团R’选自N 3-CH 2-、CH 3-CH 2-S-S-CH 2-、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100275
    R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100276
    其余各自独立地选自H、叠氮基、硝基、氨基、磺基、羧基、脂肪族烷基(如C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、F、I、Br、Cl、烷氧基(如C1-C6烷氧基)，
    优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100277
    另一个(如R 3’)选自H、C1-C6烷氧基(如甲氧基)，其余为H，
    更优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，任意一个(如R 1’或R 5’)为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100278
    其余为H，
    最优选地，R 1’、R 2’、R 3’、R 4’、R 5’中，R 1’为
    Figure PCTCN2022084601-appb-100279
    其余为H，
    R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)、-ONH 2、-OCOR x、-OCONHR x，另一个选自H、脂肪族烷基(如C1-C6烷基，例如Me、Et、iPr、tBu)、芳香族烷基(如苯基-C1-C6烷基)、环烷基(如C3-C6环烷基)，其中，各R x独立地选自脂肪族烷基(如C1-C6烷基)，环烷基(如C3-C6环烷基)或芳香族烷基(如苯基C1-C6烷基)，
    优选地，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-C1-C6烷基(如-SS-Me,-SS-Et,-SS-iPr,-SS-t-Bu)，另一个选自C1-C6烷基，
    更优选地，R b’、R c’中，任意一个选自-N 3、-SS-Me，另一个为甲基。
  47. 权利要求39-46任一项所述的核苷酸类似物，其选自：权利要求9所述的化合物。
  48. 权利要求39-47任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述核苷酸类似物携带额外的可检测标记，且所述可检测标记与连接子(优选L b)连接；
    优选地，所述核苷酸类似物携带的额外的可检测标记是通过亲和试剂(如抗体、适体、亲和物、结蛋白)引入的，所述亲和试剂携带所述可检测标记，且所述亲和试剂可以特异性识别并结合所述核苷酸类似物的表位；优选地，所述可检测标记与所述L b的末端氨基连接；
    优选地，所述可检测标记中的羧基与所述L b的末端氨基通过形成酰胺键进行连接；
    优选地，base 1不同，所述核苷酸类似物携带的额外的可检测标记不同；
    优选地，所述可检测标记为荧光标记；
    优选地，所述可检测标记选自以下：iF700、
    Figure PCTCN2022084601-appb-100280
    Figure PCTCN2022084601-appb-100281
  49. 权利要求48所述的核苷酸类似物，其中，所述核苷酸类似物选自：权利要求11所述的化合物。
  50. 终止核酸合成的方法，其包括：将权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子中；
    优选地，所述核苷酸类似物的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
    优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子中；
    优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述核苷酸类似物掺入待终止的核酸分子的3'端。
  51. 制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸，其中，所述核苷酸类似物的掺入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中；
    优选地，所述核苷酸类似物的掺入通过末端转移酶、末端聚合酶或逆转录酶来实现；
    优选地，所述方法包括：使用聚合酶，将所述核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸；
    优选地，所述方法包括：在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述核苷酸类似物掺入所述生长的互补多核苷酸的3'端。
  52. 核酸中间体，其是在测定目标单链多核苷酸的序列中形成的，其中，
    所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
    向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物；
    或者，所述核酸中间体是通过以下步骤形成的：
    向生长的核酸链中掺入一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，形成所述核酸中间体，其中，掺入的一个互补核苷酸是权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物，且所述生长的核酸链中预先掺入至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸，预先掺入的至少一个与目标单链多核苷酸互补的核苷酸是已被除去可逆阻断基团和任选的可检测标记的权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物。
  53. 测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括：
    1)监测生长的核酸链中与目标单链多核苷酸互补的核苷酸的掺入，其中，掺入的至少一个互补核苷酸是权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物，以及，
    2)确定掺入的核苷酸的类型；
    优选地，在引入下一个互补核苷酸之前，将所述可逆阻断基团和任选的可检测标记除去；
    优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被同时除去；
    优选地，所述可逆阻断基团和所述可检测标记被先后除去；例如，在所述可检测标记被 除去之后，所述可逆阻断基团被除去，或者，在所述可逆阻断基团被除去之后，所述可检测标记被除去。
  54. 权利要求53所述的方法，其包括以下步骤：
    (a)提供多种不同的核苷酸，其中至少一种核苷酸是权利要求48-49任一项所述的核苷酸类似物，任选地其余的核苷酸是权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物；
    (b)将所述多种不同的核苷酸掺入目标单链多核苷酸的互补序列中，其中，所述多种不同的核苷酸在检测时可以相互区分开；
    (c)检测(b)的核苷酸，从而确定掺入的核苷酸的类型；
    (d)除去(b)的核苷酸中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记；和
    (e)任选地重复步骤(a)-(d)一次或多次；
    从而确定所述目标单链多核苷酸的序列。
  55. 权利要求53所述的方法，其包括以下步骤：
    (1)提供第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，四种核苷酸中的至少一种是权利要求48-49任一项所述的核苷酸类似物，任选地其余的核苷酸是权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物；
    (2)将所述四种核苷酸与目标单链多核苷酸进行接触；除去未掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；检测掺入生长的核酸链中的所述核苷酸；除去掺入生长的核酸链中的所述核苷酸中的所述可逆阻断基团和任选的其携带的所述可检测标记；
    任选地，还包括(3)：重复(1)-(2)一次或多次。
  56. 权利要求53所述的方法，其包括以下步骤：
    (a)提供包含双链体、包含至少一种权利要求48-49任一项所述的核苷酸类似物的核苷酸、聚合酶和切除试剂的混合物；所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸链；
    (b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应，任选地，重复一次或多次：
    步骤(i)：使用聚合酶，使所述核苷酸类似物掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体：
    步骤(ii)：对所述核酸中间体进行检测；
    步骤(iii)：使用切除试剂将所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记切除；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除同时进行，或者，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除分步进行(例如，先切除所述可逆阻断基团，或者先切除所述可检测标记)；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是同样的试剂；
    优选地，对所述可逆阻断基团的切除和对所述可检测标记的切除使用的切除试剂是不同的试剂。
  57. 权利要求56所述的方法，其中，所述双链体连接于支持物上；
    优选地，所述生长的核酸链为引物；
    优选地，所述引物通过退火至待测序的核酸链上，形成所述双链体；
    优选地，所述双链体、所述核苷酸类似物、以及所述聚合酶一起形成含有溶液相和固相的反应体系；
    优选地，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶，使所述核苷酸类似物掺入生长的核酸链，形成包含可逆阻断基团和任选的可检测标记的核酸中间体；
    优选地，所述聚合酶选自KOD聚合酶或其突变体(例如KOD POL151、KOD POL157、KOD POL171、KOD POL174、KOD POL376、KOD POL391)；
    优选地，在任意一个检测所述核酸中间体的步骤前，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体；
    优选地，所述切除试剂与所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应 体系中接触；
    优选地，所述切除试剂能够切除掺入生长的核酸链的核苷酸类似物中的可逆阻断基团和任选的其携带的可检测标记，并且不会影响双链体骨架上的磷酸二酯键；
    优选地，在任意一个切除所述核酸中间体所包含的可逆阻断基团和任选的可检测标记的步骤后，移除这一步骤反应体系的溶液相；
    优选地，在任意一个包含移除操作的步骤之后，进行洗涤操作；
    优选地，步骤(ii)之后，进一步包括：根据步骤(ii)检测得到的信号，确定步骤(i)中掺入生长的核酸链的核苷酸类似物的类型，并基于碱基互补配对原则，确定待测序的核酸链中相应位置处的核苷酸类型。
  58. 试剂盒，其包含至少一个权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物；
    优选地，所述试剂盒包含第一、第二、第三和第四化合物，所述第一、第二、第三和第四化合物各自独立地为权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物；
    优选地，所述第一化合物中，base 1选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100282
    )；所述第二化合物中，base 1选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100283
    )；所述第三化合物中，base 1选自胞嘧啶或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100284
    )；所述第四化合物中，base 1选自鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或其互变异构体(例如
    Figure PCTCN2022084601-appb-100285
    )；
    优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物包含的base 1互不相同；
    优选地，所述第一、第二、第三和第四化合物携带的额外的可检测标记互不相同。
  59. 权利要求58所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
  60. 权利要求39-49任一项所述的核苷酸类似物或者权利要求58-59任一项所述的试剂盒用于测定目标单链多核苷酸的序列的用途。
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