JP2002534100A - 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法 - Google Patents

標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法

Info

Publication number
JP2002534100A
JP2002534100A JP2000593170A JP2000593170A JP2002534100A JP 2002534100 A JP2002534100 A JP 2002534100A JP 2000593170 A JP2000593170 A JP 2000593170A JP 2000593170 A JP2000593170 A JP 2000593170A JP 2002534100 A JP2002534100 A JP 2002534100A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
probe
clamp
specific portion
binary composition
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000593170A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4644370B2 (ja
Inventor
ケネス ジェイ． リバック，
マイケル エゴルム，
マイケル ダブリュー． ハンカピラー，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Applied Biosystems Inc
Original Assignee
PE Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PE Corp filed Critical PE Corp
Publication of JP2002534100A publication Critical patent/JP2002534100A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4644370B2 publication Critical patent/JP4644370B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Abstract

(57)【要約】 プローブおよびクランプのバイナリー組成物は、標的ハイブリダイゼーション検出のための方法を実行する。プローブがエキソヌクレアーゼ切断のための基質である場合、組成物は、リアルタイム測定および終点測定によって、ＰＣＲ産物の定量化および検出を提供する。プローブが増幅プライマーである場合、組成物はＰＣＲ産物の標識および検出のための改良された方法を提供する。プローブおよびクランプは、蛍光色素、消光剤、ハイブリダイゼーション安定化部分、化学発光色素、およびアフィニティーリガンドを用いて標識され得る。クランプは、２−アミノエチルグリシンＰＮＡのような核酸アナログであり得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、概して核酸ハイブリダイゼーションの分野に関し、より詳細には核
酸増幅の組成物および方法に関する。
【０００２】 （参考文献）
【０００３】
【化２】
【０００４】
【化３】
【０００５】
【化４】
【０００６】
【化５】
【０００７】
【化６】 （背景） 核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、遺伝疾患の診断、ヒトの同定、微生
物の同定、起源試験、ウイルス学、およびＤＮＡ配列決定における多様な適用を
有する、現代生物学における重要なクラスの技術を含む。プライマー伸長反応は
、多くの核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよび増幅方法の重要な成分であ
る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅方法は、クローニング、遺伝子発現の
分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝子マッピング、薬物発見などにおける進歩を可能に
してきた（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，１９９０；Ｂｅｖａｎ，１９９２；Ｇｒｅｅｎ
，１９９１；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９９５）。
【０００８】 Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋおよび非Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対によって
ハイブリダイズする２以上の鎖の核酸および核酸アナログ分子の特異性およびア
フィニティーは、効率的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイの重要なパラメ
ーターである。ハイブリダイゼーションを改善するかまたは安定化する共有結合
された標識または部分が所望される。
【０００９】 核酸ハイブリダイゼーションアッセイの別の重要な局面は、ハイブリダイゼー
ション事象の検出を容易にするために使用される方法である。蛍光法は、放射性
同位体に対して多くの利点を有し、ここで標的ポリヌクレオチドまたはプローブ
またはプライマーのいずれかが蛍光色素によって容易にかつ安全に標識され得る
。標識されたプローブおよびプライマー、またはそれらの官能性等価物のコスト
を低くする方法が、非常に所望される。核酸ハイブリダイゼーションアッセイの
特異性、親和性、および検出におけるさらなる改善のための必要性が存在したま
まである。
【００１０】 （要旨） 本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用であるプローブ
およびクランプの新規なバイナリー組成物、ならびにこのような組成物を使用す
る方法に関する。
【００１１】 第１の局面において、本発明は、プローブおよびクランプのバイナリー組成物
を含み、このプローブは、標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含む。こ
の標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に対して配列特異的に結合し得
る。クランプは、プローブ特異的部分および標識を含む。プローブのクランプ特
異的部分およびクランプのプローブ特異的部分は、プローブおよびクランプのバ
イナリー組成物において二本鎖構造を形成する。あるいは、プローブのクランプ
特異的部分およびクランプの２つのプローブ特異的部分は、三重鎖構造を形成す
る。
【００１２】
【化７】 核酸ハイブリダイゼーションアッセイの間、標的ポリヌクレオチド配列が検出
され得、バイナリー組成物上の標識の検出によってサンプル中で定量され得る。
プローブのクランプ特異的部分は、アッセイの検出段階の間、クランプのプロー
ブ特異的部分に結合される。
【００１３】 クランプは、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログであり得る。核酸アナロ
グは、ヌクレオチド間結合、糖、または核酸塩基部分の改変体から構成され得る
。好ましいクランプは、以下：
【００１４】
【化８】 の構造を有する、２−アミノエチルグリシン、ＰＮＡ、（Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９
９１）であり、ここでＢは核酸塩基または核酸塩基アナログである。
【００１５】 プローブは、核酸塩基アナログを含むオリゴヌクレオチドまたは核酸アナログ
、糖アナログ、および／またはヌクレオチド間アナログであり得る。
【００１６】 第２の局面において、バイナリー組成物中のプローブまたはクランプは、１つ
以上の標識を有する。このプローブ標識は、５’末端、３’末端、核酸塩基、ヌ
クレオチド間結合、または糖を含むがこれらに限定されない部位で結合され得る
。このクランプ標識は、末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖、アミノ基、
スルフィド基、およびカルボキシル基を含む部位において結合され得る。この標
識として、ハイブリダイゼーション安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、化学発
光色素、アミノ酸、およびアフィニティーリガンドが挙げられ得る。
【００１７】 第３の局面において、プローブおよびクランプのバイナリー組成物で標的ポリ
ヌクレオチド配列を検出するための方法が提供される。この方法において、プロ
ーブの標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そし
て標識されたクランプはプローブにハイブリダイズする。（ｉ）標的ポリヌクレ
オチド配列でプローブの標的特異的部分をハイブリダイズする工程；（ｉｉ）プ
ローブのクランプ特異的部分でクランプのプローブ特異的部分をハイブリダイズ
する工程；および（ｉｉｉ）バイナリープローブを検出する工程、が標的ポリヌ
クレオチドを検出するために実施される。
【００１８】 第４の局面において、プローブおよびクランプのバイナリー組成物でポリメラ
ーゼ連鎖反応産物を検出するための方法が提供される。この方法において、プロ
ーブは蛍光色素または消光剤を含み、そしてクランプは蛍光色素または消光剤を
含み、その結果、バイナリー組成物は１つの蛍光色素および１つの消光剤を含む
。プローブがクランプにハイブリダイズされる場合、バイナリー組成物はほとん
ど自己消光する。この方法は、（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列でプローブの標
的特異的部分をハイブリダイズする工程；（ｉｉ）プローブのクランプ特異的部
分でクランプのプローブ特異的部分をハイブリダイズする工程；（ｉｉｉ）５’
から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｌａｗｙｅｒ，
１９８９）、ＰＣＲプライマー、およびヌクレオシド５’トリホスフェートで標
的を増幅する工程、（ｉｖ）ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってプ
ローブを切断する工程、および（ｖ）蛍光色素を検出する工程、を介して実施さ
れる。本発明の１つの目的は、リアルタイムでまたは標的の増幅の終了点で発光
した蛍光をモニターすることによって標識を検出することである。
【００１９】 第５の局面において、プライマーおよび標識されたクランプのバイナリー組成
物でポリメラーゼ連鎖反応産物を標識するための方法が提供される。この方法に
おいて、プライマーは、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合し得る標
的特異的部分、ならびにクランプ特異的部分を有する。このクランプは、標識、
およびプライマーのクランプ特異的部分に配列特異的に結合し得るプライマー特
異的部分を含む。標識は検出可能な蛍光色素であり得る。プライマーのクランプ
特異的部分およびクランプのプライマー特異的部分は、プライマーおよびクラン
プのバイナリー組成物中の二本鎖構造を形成する。あるいは、プライマーのクラ
ンプ特異的部分およびクランプの２つのプライマー特異的塩基対部分は、プライ
マーおよびクランプのバイナリー組成物中の三重鎖構造を形成する。標的ポリヌ
クレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびクランプの１つ以上のバ
イナリー組成物、１つ以上の対向鎖プライマー、およびヌクレオシド５’トリホ
スフェートで増幅され、ここで１つ以上の標識されたポリメラーゼ連鎖反応産物
が生じる。
【００２０】 第６の局面において、ポリメラーゼ連鎖反応産物を検出するための方法が提供
され、ここで標的ポリヌクレオチドは、３’末端において標的特異的部分を含み
、５’末端においてホモピリミジン配列部分を含むプライマーで増幅される。標
的の５’末端と同じホモピリミジン配列および１つ以上の標識を含むクランプが
ＰＣＲ混合物中に存在する。このプライマーのホモピリミジン配列は、増幅され
、ＰＣＲ産物の末端部分を形成する。クランプは、ＰＣＲ産物によるハイブリダ
イゼーションによって二重鎖または三重鎖構造を形成し、標識が検出される。こ
の標識は蛍光色素であり得る。
【００２１】 （好ましい実施形態の詳細な説明） ここで、本発明の好ましい実施形態への参照が詳細になされ、これらの例は、
添付の図面に例示される。本発明を好ましい実施形態に関して記載するが、それ
らは、本発明をこれらの実施形態に制限する意図ではないことが理解される。反
対に、本発明は、代替物、改変物および等価物を含むことを意図し、これらは、
添付の請求項によって規定されるように、本発明内に含まれ得る。
【００２２】 （Ｉ．定義） 他であることが記載されていなければ、本明細書で用いられるとき、以下の用
語および語句は、以下の意味を有することが意図される： 用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、２本
鎖および１本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのαア
ノマー形態などを含む、ヌクレオチドモノマーまたはそのアナログのポリマーを
意味する。通常、これらのモノマーは、ホスホジエステル結合で連結されており
、ここで用語「ホスホジエステル結合」は、結合する対イオン、例えば、Ｈ+、
ＮＨ4 +、Ｎａ+を含む、ホスホジエステル結合またはそのリン酸アナログを含む
結合をいう。代表的には、ポリヌクレオチドは、数モノマーユニット、例えば、
５−４０から、数千モノマーユニットまでのサイズの範囲にある。ポリヌクレオ
チドが、例えば「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字の配列によって表されるときは
常に、これらのヌクレオチドは、左から右に５’から３’への順であること、そ
して他であることが記載されていなければ、「Ａ」はデオキシアデノシン、「Ｃ
」はデオキシシチジン、「Ｇ」はデオキシグアノシン、および「Ｔ」はデオキシ
チミジンを示すことが理解される。
【００２３】 「ヌクレオシド」は、１’位でペントースに結合した、プリン、デアザプリン
、またはピリミジン核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）、例えば、アデニン、グ
アニン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなどからなる化
合物をいう。このヌクレオシド塩基がプリンまたは７−デアザプリンであるとき
、ペントースは、プリンまたはデアザプリンの９位で核酸塩基に結合し、そして
この核酸塩基がピリミジンであるとき、ペントースは、ピリミジンの１位で核酸
塩基に結合する。
【００２４】 「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、３リン酸エス
テルをいい、ここで、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位
置に結合したヒドロキシル基である。ヌクレオチドは、３つの部分：糖、リン酸
、および核酸塩基から構成される（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６）。２重らせ
んの一部分であるとき、ヌクレオチドはまた「塩基」または「塩基対」と呼ばれ
る。最も一般的に天然に存在する核酸塩基、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、
ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）は、ワトソン／クリック
塩基対合を行う水素結合官能基をもつ。
【００２５】 用語「ワトソン／クリック塩基対合」は、配列特異的水素結合（例えば、Ａは
ＴおよびＵと対合し、そしてＧはＣと対合する）によって一緒に結合する、ヌク
レオチドおよびそのアナログの特異的な対のパターンをいう。
【００２６】 用語「核酸アナログ」は、モノマーヌクレオチドアナログ単位から作られる核
酸のアナログをいい、そして核酸に関連するいくつかの特性および性質を持って
いる。核酸アナログは、改変された（ｉ）核酸塩基部分、例えば、Ｃ−５−プロ
ピンピリミジン、プソイドイソシチジンおよびイソグアノシン、（ｉｉ）糖部分
、例えば、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、および／または（ｉｉｉ）ヌ
クレオチド間部分、例えば、３’−Ｎ−ホスホルアミデートを有し得る（Ｅｎｇ
ｌｉｓｃｈ、１９９１）。糖部分およびヌクレオチド間部分が、２−アミノエチ
ルグリシンアミド骨格ポリマーで置換されたアナログのクラスは、ペプチド核酸
ＰＮＡである（Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９１）。
【００２７】 「標的」は、プライマーまたはプローブによるハイブリダイゼーションのため
の配列を含むポリヌクレオチドをいう。
【００２８】 「付着部位」は、リンカーが付着するプローブまたはクランプ上の部位をいう
。 「リンカー」は、プローブまたはクランプを標識に結合する鎖を含む１つ以
上の原子をいう。
【００２９】 本明細書で用いるとき「キメラ」は、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上
のヌクレオチドアナログユニットを含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００３０】 「低級アルキル」、「低級アルキレン」および「低級置換アルキレン」は、１
−１２の炭素原子からなる、直鎖基、分岐基、または環状基をいう。
【００３１】 「標識」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログに共有結合した成分をい
う。１つの好ましいクラスの標識は、蛍光、化学的発光、および電気化学的発光
のような手段によって、分子の検出のための信号を提供する（Ｋｒｉｃｋａ、１
１９９２）。別の好ましいクラスの標識は、二重らせんのハイブリダイゼーショ
ンを増大し、安定化し、またはそれに影響するために供される、ハイブリダイゼ
ーション安定化成分（例えば、インターカレーター、マイナーグルーブ結合剤、
および架橋官能基）である。なお別の好ましいクラスの標識が、特異的または非
特異的捕獲手段によって分子の分離または固定化を行うために供される（Ａｎｄ
ｒｕｓ、１９９５）。
【００３２】 「検出」は、共有結合した検出標識の性質を基に分子を検出、観察または測定
することをいう。検出標識は、制限されずに、フルオレセインおよびローダミン
誘導体のような蛍光色素、シアニン色素（Ｋｕｂｉｓｔａ、１９９７）およびエ
ネルギー移動色素（Ｃｌｅｇｇ、１９９２；Ｃａｒｄｕｌｌｏ、１９８８）を含
む。
【００３３】 「プローブ」は、標的特異的部分およびクランプ特異的部分を有し得るオリゴ
ヌクレオチドまたは核酸アナログをいう。
【００３４】 「クランプ」は、プローブ特異的部分を有するオリゴヌクレオチドまたは核酸
アナログをいう。クランプは、標識、例えば、蛍光色素または消光剤を保有し得
、そして蛍光色素または消光剤部分を保有するプローブにハイブリダイズすると
き、蛍光エネルギー移動を行う。このクランプはまた、マイナーグルーブ結合剤
またはインターカレーターのような、標的ポリヌクレオチドとのバイナリープロ
ーブ組成物の結合を安定化するための他の標識を保有し得る。
【００３５】 「プライマー」は、特定の標的核酸に選択的にアニーリングし、そしてその後
、プライマーが５’から３’方向に伸長するプライマー伸長反応の開始点として
供され得るプローブをいう。
【００３６】 用語「プライマー伸長反応」は、標的／プライマー２重らせんと、付加された
ヌクレオチドが、標的の対応するヌクレオチドに相補的であるようにプライマー
の３’末端へのヌクレオチドの付加を生じるヌクレオチドとの間の反応をいう。
【００３７】 用語「５’→３’ヌクレアーゼ活性」は、ホスホジエステル結合で核酸を切断
する酵素活性をいう。この活性は、エンド（内部のホスホジエステル結合で切断
する）またはエキソ（核酸鎖の５’末端に最も近いホスホジエステル結合で切断
する）のいずれかであり得る。
【００３８】 用語「自己消光」は、分子間のエネルギー移動効果をいい、例えば、蛍光色素
および消光剤は、蛍光発色団から消光剤へのエネルギー移動を可能にし、蛍光色
素による蛍光の減少を生じる形態でプローブ上に結合されることをいう。
【００３９】 用語「終点分析」は、データ収集を反応が終了するときのみに行う方法をいう
。エキソヌクレアーゼアッセイの終点分析は、ＰＣＲが終了するとき蛍光色素信
号測定を行う。結果は、ＰＣＲ熱サイクリングの開始から終了までの蛍光色素信
号の蛍光変化（好ましくは、任意の内部コントロール信号を減じる）を報告する
。 用語「リアルタイム分析」は、ＰＣＲの間の周期的モニタリングをいう。エ
キソヌクレアーゼアッセイのリアルタイム分析は、サイクルからサイクルへの蛍
光色素信号変化（好ましくは、任意の内部コントロール信号を減じる）を測定す
る。 （ＩＩ．バイナリー組成物の設計および合成） （Ａ．プローブおよびプライマー） プローブまたはプライマーは、標的に対して配列特異的にハイブリダイズし得
る任意の構造であり得る。好ましくは、プローブおよびプライマーは、オリゴヌ
クレオチドおよび核酸アナログである。一般に、本発明のバイナリー組成物の設
計および合成は従来の教示に従う。好ましくは、オリゴヌクレオチドおよび核酸
アナログは、ホスホルアミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ、１９９２；Ｃａｒｕ
ｔｈｅｒｓ、１９９３）を用いる、自動化された、固相ＤＮＡ合成機上で合成さ
れる。このオリゴヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法は、その効率的かつ
迅速なカップリング、および開始ヌクレオチドモノマーの安定性のために好まし
い方法である。代表的には、合成は、固体支持体に結合した生長するポリヌクレ
オチド鎖を用いて実施され、その結果、液相中の過剰の試薬は、濾過により容易
に除去され、それによってサイクル間の精製工程の必要性を排除し得る。
【００４０】 ＤＮＡホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｏ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手され得、そして２’−Ｏ
Ｍｅ ＲＮＡモノマーは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖ
Ａ）から得られ得る。核酸塩基保護基は、ＤＮＡおよび２’−ＯＭｅ ＲＮＡヌ
クレオシドの両方に対して、ベンゾイル（ＡbzおよびＣbz）およびジメチルホル
ムアミジン（Ｇdmf）であり得る。非ヌクレオシドのＰＥＯリンカーは、以下の
構造を持つホスホルアミダイトシンソン（ｓｙｎｔｈｏｎ）として取り込まれ得
る。
【００４１】
【化９】 ０．２μモルスケールにおける合成の各カップリングサイクルには、アセトニ
トリル中の０．１Ｍホスホルアミダイトヌクレオシドの４０μｌ（約３．５ｍｇ
）を、アセトニトリル中の０．５Ｍ ５−Ｈテトラゾールの１２０μｌと同時に
加える。カップリング時間は、ＤＮＡホスホルアミダイトについては２５秒、そ
して２’−ＯＭｅ ＲＮＡホスホルアミダイトおよびＰＥＯホスホルアミダイト
については４分である。
【００４２】 合成の完了後、オリゴヌクレオチドは、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ2：Ｈ2Ｏ（１
：１：２）の混合物を用いる処理（Ｗｏｏ、１９９３）、またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機のＵｓｅ
ｒｓ Ｍａｎｕａｌに記載のように濃水酸化アンモニウムを室温にて１時間用い
る処理により、支持体から切断され得る。塩基保護基は、８５℃で１時間または
６５℃で３時間、この混合物を加熱することにより除去され得る。オリゴヌクレ
オチドは、逆相ＨＰＬＣ、アニオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリーゲル電気泳動、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびその他の従来技法（Ａｎｄｒｕｓ、１
９９５）により分析および精製され得る。
【００４３】 プローブおよびクランプのバイナリー組成物を設計することでは、好ましくは
、以下の一般的ガイドラインに従う：（ｉ）プローブは長さが６−１００ヌクレ
オチドである、（ｉｉ）標的核酸配列がＰＣＲアンプリコン内に位置する場合、
プローブ配列は、プローブがＰＣＲプライマー間の配列上の位置でハイブリダイ
ズするようであるべきである；および（ｉｉｉ）プローブ／クランプの親和性（
Ｔｍ、融解温度）は、プローブ／標的と同じまたはそれより高くあるべきである
（Ｃｌｅｇｇ、１９９２；Ｃａｒｄｕｌｌｏ、１９８８；Ｌｉｖａｋ、１９９５
）。
【００４４】 プローブが、蛍光色素および／または消光剤を含む標識を含む場合、好ましく
は、この色素および／または消光剤は、プローブおよびクランプのバイナリー組
成物中で十分緊密であり、その結果、この蛍光色素からの蛍光は、消光剤によっ
て実質的に消光される（図１）。この蛍光色素および／または消光剤は：（ｉ）
プローブおよびクランプの内部部位、（ｉｉ）内部部位、そして他方はプローブ
またはクランプの末端、または（ｉｉｉ）プローブまたはクランプの末端に付着
され得る。
【００４５】 （Ｂ．クランプ） クランプは：（ｉ）バイナリー組成物のプローブのクランプ特異的部分に配列
特異的なハイブリダイゼーションを行い、そして（ｉｉ）１つ以上の標識を保持
し得る、任意の構造であり得る。好ましくは、クランプは：（ｉ）高親和性、（
ｉｉ）高特異性、（ｉｉｉ）高溶解性、（ｉｖ）非伸長性、（ｖ）化学的安定性
、および（ｖｉ）増幅の非妨害性を有する。好ましくは、クランプは、オリゴヌ
クレオチドまたは核酸アナログ、例えばＰＮＡを含む。このプローブおよびクラ
ンプは、ワトソン／クリックおよびその他の塩基対合相互作用（Ｆｒｏｅｈｌｅ
ｒ、１９９７；Ｒｕｍｎｅｙ、１９９５）により結合して、２重らせんまたは３
重らせん構造のいずれかを形成し得る（図２）。このクランプは、１つ以上の共
有結合された標識を有する。このバイナリー組成物のクランプとプローブとの間
の親和性は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ条件に耐えるに十分強い。
【００４６】 好ましい実施形態では、クランプは、ポリメラーゼによっては伸長しない。ク
ランプ中の非伸長性の糖修飾の例は、３’リン酸、３’アセチル、２’−３’ジ
デオキシ、および３’アミノ、２’−３’デヒドロを含む。このクランプは、エ
チレンオキシまたはポリエチレンオキシのような、非塩基対合、非ヌクレオシド
リンカーを含み得る。好ましくは、バイナリー組成物中のクランプは、６−５０
ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなる。
【００４７】 特に好ましいクランプは、天然のホスホジエステル−デオキシリボース骨格が
ペプチド様単位であるＮ−（２−アミノエチル）−グリシンによって置換された
核酸アナログである、ペプチド−核酸オリゴマー（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎ、
１９９１）を含む。本発明のＰＮＡクランプは、ワトソン／クリック塩基対合に
よって、プローブのクランプ特異的部分中の相補的配列と塩基対合し得る。ＰＮ
Ａのプローブへの結合は、ＰＮＡの平行または逆平行配向（逆平行２重らせんが
かなりより安定（Ｅｇｈｏｌｍ、１９９３）であるが）のいずれかで生じ得る。
ＰＮＡクランプが、２つのプローブ特異的配列、またはプライマー特異的配列と
３重らせん構造を形成するように設計されたバイナリー組成物では、ヒンジ領域
は、プローブの３’末端にあるか、またはプローブの５’末端側であるかのいず
れかであり得る（図１３）。
【００４８】 クランプのプローブ特異的部分中の反復配列、およびプローブのクランプ特異
的部分中のそれらの相補物は、それらの：（ｉ）高親和性、（ｉｉ）高特異性、
および（ｉｉｉ）高溶解性のために好適である。２重らせん形成性クランプのプ
ローブ特異的部分中の特に好ましい反復配列は（ＣＡＧ）nであり、ここで３塩
基配列が１〜１０回繰り返される（Ｂｏｆｆａ、１９９５；Ｗｉｔｔｕｎｇ、１
９９７）。３重らせん形成性クランプのプローブ特異的部分中の好ましい反復配
列は、このプローブ配列（ＣＡＧ）nに結合する（ＴＣＣ）nおよびアナログであ
る。
【００４９】 ＰＮＡクランプは、市販の試薬を用いて市販の自動化合成機上で従来法を用い
て合成され得る（Ｄｕｅｈｏｌｍ、１９９４；Ｖｉｎａｙａｋ、１９９７；Ｖａ
ｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ、１９９７）。
【００５０】 （Ｃ．プローブおよびクランプのバイナリー組成物中の核酸アナログ） プローブおよびクランプは、核酸塩基、糖、および／またはヌクレオチド内部
分への改変を保持する種々の核酸アナログを含み得る。
【００５１】 好ましい核酸塩基アナログ改変は、Ｃ−５−アルキルピリミジン類、２−チオ
ピリミジン、２，６−ジアミノプリン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、７−デア
ザプリン、イソシチジン、プソイドイソシチジン、イソグアノシン、４（３Ｈ）
−ピリミドン、ヒポキサンチン、８−オキソプリン類およびユニバーサル塩基（
Ｍｅｙｅｒ、１９９４）を含むがこれらに限定されない。
【００５２】 １つ以上のヌクレオシド中の好ましい糖アナログ改変は、２’−改変または３
’−改変を含むがこれらに限定されず、ここで２’−または３’−位置は、水素
、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリロキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、
イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、ア
ルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモであり得る。
【００５３】 その他の好ましい糖アナログ改変は、４’−α−アノマーヌクレオチド類、１
’−α−アノマーヌクレオチド類、２’−分岐基−リボヌクレオチド類、および
２’−Ｏ−分岐基−リボヌクレオチド類を含む。以下の構造は、いくつかの好ま
しい２’−糖改変を例示する。
【００５４】
【化１０】 １つ以上のヌクレオチドの間の好ましいヌクレオチド間アナログは、以下を含
むが、これらに限定されない：（ｉ）ヌクレオチド間結合における酸素の、硫黄
、炭素、または窒素による置換、および（ｉｉ）サルフェート、カルボキシレー
ト、アミドのヌクレオチド間リン酸ジエステル結合。他の好ましいヌクレオチド
間アナログは、以下を含む；２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）、２’−５’
−結合、逆方向３’−３’結合、逆方向５’−５’結合、ホスホロチオエート、
ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホルアミデー
ト、アルキル化ホスホトリエステルの分枝構造、および３’−Ｎ−ホスホルアミ
デート。
【００５５】 （Ｄ．標識プローブおよびクランプ） バイナリー組成物のプローブおよびクランプ上での標識は、検出の簡易化、親
和性の増大、およびハイブリダイゼーションの安定化を含む種々の機能に貢献す
る。オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログに標識を連結するための方法は、周
知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６）。標識は、オリゴヌクレオチドおよ
び核酸アナログの場合では；（ｉ）末端、例えば、プローブの５’および３’末
端、（ｉｉ）ヌクレオチド間結合、（ｉｉｉ）糖類、および（ｉｖ）核酸塩基基
を含む種々の連結部位で連結され得る。
【００５６】 標識、例えば蛍光色素は、標識および／またはモノマー（例えば、ホスホルア
ミダイトヌクレオシド）の適切な機能付与によって、オリゴヌクレオチドまたは
核酸アナログに結合され得る。核酸およびアナログへの、標識の結合方法の詳細
な記載は、文献において多数見出され得る（Ｔｈｅｉｓｅｎ、１９９２；Ａｎｄ
ｒｕｓ、１９９５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６；Ｊｕ、１９９５）。蛍光色
素および／または消光剤を、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに共有結合
的に結合する１つの方法は、蛍光色素と、消光剤ホスホラミダイトモノマーの結
合によるものである（Ｔｈｅｉｓｅｎ、１９９２）。これらのモノマーは、自動
合成機上のアセトニトリル溶液中に導入され、そして最後に、モノマーが支持体
に結合したオリゴヌクレオチドにカップリングされる。あるいは、オリゴヌクレ
オチドの核酸塩基部分は、支持体から切断され、そして脱保護された後に、内部
的に標識され得る。第３の方法は、核酸塩基上の求核性反応性基（例えば、アミ
ノまたはチオール）が、活性エステルまたは標識上の他の活性基にカップリング
し得ることである。例として、シチジンまたはチミンの５−位に結合したアミノ
リンカーは、カルボキシ−ＦＡＭ色素のＮＨＳ−エステルにカップリングし、オ
リゴヌクレオチド内の任意の所定のヌクレオチドの位置でのオリゴヌクレオチド
の標識において、アミド結合を形成し得る（Ｒｕｔｈ、１９９０；Ｍｅｙｅｒ、
１９９４）。オリゴヌクレオチドの５’末端もまた、このような様式において標
識され得る（Ａｎｄｒｕｓ、１９９５）。ホスフェートおよびホスフェートアナ
ログもまた、同様の方法によって標識され得る（Ａｇｒａｗａｌ、１９９０）。
固相合成支持体は、３’標識されたオリゴヌクレオチドを与えるために、標識（
例えば、蛍光色素）を備える（Ｗｏｏ、１９９６；Ｍｕｌｌａｈ、１９９７；Ｍ
ｕｌｌａｈ、１９９８）。プローブの３’末端ヌクレオチドは、さらにブロック
され得、そして核酸ポリマーによって伸展不可能にされ得る。このような３’ブ
ロッキングは、ホスフェート基の化学的結合によって都合よく行われる（Ｈｏｒ
ｎ、１９８６；ＰｈｏｓｐｈａＬｉｎｋとして市販、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）。
【００５７】 ＰＮＡクランプは、オリゴヌクレオチドに関する上記と同様の活性化エステル
法（ＮＨＳ−）、および他の簡便な方法によって、カルボキシルおよびアミノ末
端で、ならびに核酸塩基で標識され得る。
【００５８】 ハイブリダイゼーション安定化部分には、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：マイナーグルーブ結合剤、インターカレーター、ポリ−リジンおよびス
ペルミンのようなポリカチオン、ならびに架橋官能基。ハイブリダイゼーション
安定化部分は、塩基対の安定性またはハイブリダイゼーションの速度（すなわち
、親和性）を増大し得る。ハイブリダイゼーション安定化部分は、完全に相補的
なプローブ（Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の１つ以上のミスマッチを含
む）と標的配列との間の熱的溶解温度、Ｔmにおける大きな差によって体現化さ
れる塩基対形成の特異性の増加に役立つ。好ましいマイナーグルーブ結合剤には
、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＣＤＰＩ1-3、ＭＧＢ１、ネトロプシンおよび
ジスタマイシンが挙げられる（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６）。マイナーグル
ーブ結合剤の例は、以下の構造；
【００５９】
【化１１】 （ここで、Ｌは、プローブおよびクランプの標識のためのリンカーまたは結合部
位である）を有するＣＤＰＩ3（Ｋｕｔｙａｖｉｎ、１９９６；Ｌｕｋｈｔａｎ
ｏｖ、１９９５）である。
【００６０】 マイナーグルーブ結合剤（例えば、ＣＤＰＩ1-3、ＭＧＢ１（図１１））のカ
ルボキシル基は、アミノ基とカップリングするためのＮＨＳエステルとして活性
化され得るか、または自動合成によって直接標識するためのホスホルアミダイト
として活性化され得る。プローブおよびクランプのバイナリー組成物において、
プローブまたはクランプに標識される場合、マイナーグルーブ結合剤は、いくつ
かまたは実質的に大部分の標的配列への、ハイブリダイゼーションの親和性およ
び特異性を増加し得る（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６、ｐ．３３７−４６）（
図６）。
【００６１】 プローブおよびクランプの標識に有用な蛍光色素には、以下が挙げられる；Ｆ
ＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ジクロ
ロ−フルオレセイン、ジクロロ−ローダミン、およびシアニン（Ｂｅｒｇｏｔ、
１９９４、Ｍｅｎｃｈｅｎ、１９９３）。消光剤には、以下が挙げられる；ＴＡ
ＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、マラカイトグリーン、およびシ
アニン。シアニンは、以下の構造を有し得る；
【００６２】
【化１２】 （ここで、Ｒ1またはＲ2は、Ｈ、低級アルキル、低級アルキレン、置換された低
級アルキレン、フェニル、またはアリールであり；Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、または
Ｎ−Ｒであり；Ｒ3は、ニトロ、ハロ、スルホネート、ヒドロキシ、アミノ、低
級アルキル、またはトリハロメチルであり、そしてｎ＝１〜２である）（Ｋｕｂ
ｉｓｔａ、１９９７）。プローブまたはクランプの標識のための結合部位は、Ｒ 1 、Ｒ2、またはＲ3であり得る。
【００６３】 別の好ましい標識のクラスは、化学発光化合物を含む。以下の構造を有する化
学発光色素が、特に好ましい；
【００６４】
【化１３】 （ここで、Ｒ1は、水素またはハロゲンであり；Ｒ2は、ホスフェート、ガラクト
シド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、
または水素であり；Ｒ3は、メチル、エチル、および低級アルキルであり、そし
てＬは、バイナリー組成物へのリンカーである）（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ、１９９
４；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ、１９９０）。親和性リガンドには、以下が挙げられる
：ビオチン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレ
ンオキシ、およびペプチド。
【００６５】 蛍光色素には、以下が挙げられる：６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡ
Ｍ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４
’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’
−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、
２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ
−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）および２’−クロロ−７’−フェニ
ル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）（図９）。５
−カルボキシ異性体もまた、有用である。蛍光色素部分の他の実施形態は、シア
ニン色素、ダンシル誘導体などである。
【００６６】 別の好ましい標識のクラスは、消光剤部分を含む。以下を含むがこれらに限定
されない消光剤が、特に好ましい：（ｉ）以下からなる群より選択されるローダ
ミン色素：テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプ
ロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、および（ｉｉ）ＤＡＢＳＹＬ、
ＤＡＢＣＹＬ、ニトロチアゾールブルー（ＮＴＢ）を含むシアニン色素、アント
ラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾール
化合物など（図１０）。
【００６７】 本発明のフルオレセイン（左）およびローダミン（右）誘導体は、以下の一般
式および番号系を有し得（ここで、Ｌはリンカーである）、そして番号の位置の
１つ以上で置換され得る。
【００６８】
【化１４】 （ＩＩＩ．プローブおよびクランプのバイナリー組成物を使用する方法） 本発明のプローブおよびクランプのバイナリー組成物は、このプローブが相補
的標的にハイブリダイズする任意のハイブリダイゼーションアッセイで使用され
得る（図２）。
【００６９】 増幅なしのハイブリダイゼーションは、非標識プローブおよび蛍光標識クラン
プのバイナリー組成物からの蛍光によって、検出および測定され得る（図４）。
この方法は、以下を包含する：ｉ）プローブおよびクランプのバイナリー組成物
を標的にハイブリダイズする工程、ｉｉ）結合していない組成物を洗浄または除
去する工程、およびｉｉｉ）結合した組成物／標的二重鎖から蛍光を検出および
測定する工程。
【００７０】 特定の好ましい実施形態において、このプローブおよびクランプのバイナリー
組成物は標識され得、その結果、単一クランプ配列は、経済性、便利性、および
簡易化された販売および取扱いのための多くの異なるプローブ配列にハイブリダ
イズするために、選択され得る。単一クランプ特異的部分は、標的特異的な異な
る部分を含む多くのプローブに取り込まれ得る。次いで、単一の相補的なクラン
プ配列は、多くの核酸ハイブリダイゼーションアッセイに貢献し得る。例えば、
２μモルの規模で調製された標識クランプは、１００，０００より多くのアッセ
イ（アッセイあたり、約１０ｐモルが必要である）を提供し得る。標識クランプ
と共に組成物中で使用される場合、非標識プローブは、費用および単純性の利点
を有する。標識プローブは、高価かつ骨が折れるため、プローブおよびクランプ
のバイナリー組成物のこの汎用性のある有用性は、非常に望ましい特徴である。
さらに、単一反応容器中の標的サンプルの複数の遺伝子座は、各々の配列が、異
なるかつスペクトル的に分解できる蛍光色素で標識されている複数の組成物でプ
ローブすることでアッセイされ得る。反応容器内の蛍光色素部分からのそれぞれ
の発光スペクトルは、別個の発光の寄与が分解され得るように、十分に重ならな
いようにしなくてはならない。別個のピークは、定量化され得、標的配列（すな
わち、増幅産物）の相対量と関連する。
【００７１】 特に好ましい実施形態において、本発明のプローブおよびクランプは、ＰＣＲ
の間の増殖産物のリアルタイムの測定を提供する定量法および薬剤において使用
され得る（Ｈｏｌｌａｎｄ、１９９１；Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９９２；Ｈｉｇｕｃ
ｈｉ、１９９３；Ｇｅｌｆａｎｄ、１９９３；Ｌｉｖａｋ、１９９６）。蛍光色
素−消光剤プローブ（Ｌｉｖａｋ、１９９５）を使用するエキソヌクレアーゼア
ッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））は、ＰＣＲを実施するために必要であるサ
ンプルプロセシングなしで、閉管系におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産
物の直接検出を与える。Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて、プライマーの伸張を実
行し、そしてポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼもまた、５’から３’へ
のエキソヌクレアーゼ活性によって、標的へアニールされたプローブを変位（ｄ
ｉｓｐｌａｃｅ）および切断する。Ｔａｑｍａｎ型のアッセイにおいて、このプ
ローブは自己消光し、蛍光色素および消光部位を含む。スペクトルの重なりは、
プローブがインタクトな場合、効率的なエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能とす
る（Ｃｌｅｇｇ、１９９２）。標的にハイブリダイズされる場合、このプローブ
はＰＣＲの間に切断され、存在する標的プローブハイブリッドの量に比例した蛍
光シグナルを放出する（Ｌｉｖａｋ、１９９６；Ｌｉｖａｋ、１９９８）。
【００７２】 Ｔａｑｍａｎ型のアッセイにおいて、適切なエキソヌクレアーゼ活性を有する
ポリメラーゼは、増幅の間にバイナリー組成物のプローブを実質的に切断し、消
光色素から蛍光色素を分離する。本発明の自己消光するプローブおよびクランプ
のバイナリー組成物において、このプローブがクランプにハイブリダイズされる
場合、蛍光色素の消光剤への接近は、蛍光色素の蛍光の消光を引き起こす（図３
）。プローブがクランプにハイブリダイズされない場合、蛍光色素の蛍光は、消
光されない（図１）。このプローブのクランプ特異的部分は、切断後も、クラン
プのプローブ特異的部分への結合を維持する（図８）。
【００７３】 特定のプローブおよびクランプのバイナリー組成物についての蛍光色素−消光
剤の対は、蛍光色素の発光スペクトルが消光剤の吸収に重なるように選択される
。このプローブは、蛍光色素または消光剤のいずれかで標識され、次いで、この
クランプがもう片方で標識され得る。この消光剤は、この蛍光色素からのシグナ
ルがもはや消光されないように、切断時に、蛍光色素に対して近位から放出され
る。蛍光の増加は、ＰＣＲ産物のコピー数の増加に伴って、直接および比例的に
関連して起きる（図８）。リアルタイムアッセイまたは終点アッセイの使用によ
って、ＰＣＲ産物の検出および定量化は、切断され自己消光した蛍光プローブの
蛍光の増加を測定することで、得られ得る。プローブおよび異なる色素からなる
２つ以上の自己消光バイナリー組成物は、標的ポリヌクレオチドの異なる部位に
、同時的または経時的にハイブリダイズされ得る。
【００７４】 この様式において、ハイブリダイゼーション現象は、蛍光によって検出および
測定され得る。このハイブリダイゼーション現象は、可逆的であり、代表的には
塩基対化を融解または分裂する条件（例えば、変性剤または加熱）によって影響
され得る。特定の標的配列の存在または非存在は、サンプル中で検出され得る。
【００７５】 自己消光バイナリー組成物は、例えば、マイナーグルーブ結合剤のようなハイ
ブリダイゼーション安定化部分でさらに標識され得る（図５）。マイナーグルー
ブ結合剤は、標的とプローブとの間の結合の、特異性および親和性を増加し得る
。
【００７６】 明らかに、これらの方法は、多数の独立して検出可能な標識（例えば、スペク
トル分解可能な（例えば、単一反応におけるいくつかの標的核酸の同時の検出お
よび増幅をモニターするため）発光スペクトルを有する蛍光色素）を含むように
一般化され得、その結果、多数の検出シグナルがモニターされる。このような複
数標識系は、単一容器内で起こる複数プローブ実験および複数増幅の分析を必要
とする適用において有利である。このような系において、標識が蛍光色素である
場合、各々の色素は、スペクトル分解によって同定され得、従って複数標的同定
を可能にする（Ｌｉｖａｋ、１９９６；Ｍｅｎｃｈｅｎ、１９９３；Ｂｅｒｇｏ
ｔ、１９９４）。
【００７７】 自己消光蛍光色素−消光剤部分を有するプローブおよびクランプのバイナリー
組成物は、種々の核酸増幅法と組み合わせて使用され得る。本発明の系で使用さ
れ得る例示的な増幅模式図は、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ、１９
９１）のようなリガーゼに基づく増幅スキーム、Ｑ−βレプリカーゼ、および鎖
置換増幅スキーム（Ｗａｌｋｅｒ、１９９２）を含む。
【００７８】 プライマーおよび標識クランプのバイナリー組成物は、ＰＣＲによって標的配
列を増幅し、標識ＰＣＲ産物を産生するために使用され得る（図６および７）。
得られたＰＣＲ産物の標識は、ハイブリダイゼーションによって、プライマーの
クランプ特異的部分に結合され得る。これらの方法に従って、非標識プライマー
が使用され得、このプライマーは、５’蛍光色素標識プライマーのような標識プ
ライマーよりも、調製のために有意に費用が低く、そして労働集約的でない。非
標識プライマーの各々は、プライマー特異的配列ＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴを含み、
保存性配列クランプに結合するための、５’末端にＡＡＡＧＧＡＧＧＡ−３’の
ような保存性のクランプ特異的配列およびそのアナログを有し得る。あるいは、
この非標識 プライマーは、増幅時にＰＣＲ産物の部分となる保存性ホモピリミジン配列を５
’末端に有し得る。標識クランプは、同様のホモピリミジン配列を有し、ＰＣＲ
産物の３’末端にホモプリン相補配列を有する、検出可能な二重鎖または三重鎖
構造を特異的に形成する（図７）。従って、標識クランプの単一合成は、多くの
標識ＰＣＲ実験に十分であり得る。
【００７９】 （ＩＶ．実施例） 本発明はさらに、以下の実施例の考慮によって、明白にされる。この実施例は
、本発明の純粋な例示であると意図され、いかなる様式においてもその範囲を限
定するように意図されない。
【００８０】 （実施例１．標識プローブの合成） Ａ． ５’蛍光色素−プローブ
【００８１】
【化１５】 ＢＡＫ−ヒト血小板膜糖タンパク質ＩＩｂについての遺伝子中のＢａｋ多型性（
Ｌｙｍａｎ，１９９０）。 ＧＴＴ１−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、θクラスについてのヒト遺伝
子（Ｐｅｍｂｌｅ，１９９４） Ｂ． ３’消光剤−プローブ
【００８２】
【化１６】 Ｃ． ５’消光剤−２’−Ｏ−メチルＲＮＡ／ＤＮＡキメラプローブ
【００８３】
【化１７】 Ｄ． ３’蛍光色素、５−プロピニル含有プローブ
【００８４】
【化１８】 Ｅ． ２，６−ジアミノプリン（ＤＡＰ）含有プローブ
【００８５】
【化１９】 Ｆ． ２−チオピリミジン含有プローブ
【００８６】
【化２０】
【００８７】
【化２１】 プローブを、Ｍｏｄｅｌ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機において０．２μｍ
ｏｌのスケールで合成した。５’蛍光色素を、延長された１２０秒のカップリン
グ時間で、蛍光色素ホスホルミダイト（アセトニトリル中で、０．１Ｍ）として
付着させた。５’蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを、濃水酸化アンモニウム中
で、６５℃で２時間脱保護した。３’消光剤プローブを、以下の構造、および他
の構造的改変体を有する消光剤支持体を用いて、合成した（Ｍｕｌｌａｈ，１９
９７；Ｍｕｌｌａｓｈ，１９９８）。この標識を、固体支持体Ｓについての付着
部位およびオリゴヌクレオチド合成の開始のためのＤＭＴ保護ヒドロキシ部位を
有するリンカーに付着させた。この固体支持体は、コントロールドポアガラスま
たはポリスチレンであり得る。合成が完了した後、エステル結合を切断し、以下
の構造を有する固体支持体から３’標識オリゴヌクレオチドを分離する。
【００８８】
【化２２】 （実施例２． ＰＮＡクランプの合成） ＰＮＡの自動合成を、ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機ま
たは４３３Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）を用いて、
合成機製造業者の使用説明書およびＥｄｈｏｌｍ，１９９３に記載の一般的手順
に従って行った。
【００８９】 ＰＮＡクランプを、以前に報告された（Ｄｕｅｈｏｌｍ，１９９４）ように、
基本的に２〜５μｍｏｌのスケールで合成した。ＰＮＡのカルボキシ末端リジン
を、ｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いてプレロードしたＭＢＨＡ固体支持
体上で、調製した。カルボキシ末端アミドを有するＰＮＡを、ＭＢＨＡ支持体上
に直接的にか、またはｔ−Ｂｏｃ Ｔ ＰＮＡモノマーを用いてプレロードした
ＭＢＨＡ支持体上のいずれかで合成した。すべての樹脂を、０．１〜０．２５ｍ
ｍｏｌｅ／ｇまでロードした。内部リジン残基（Ｋ）を、内部標識を必要とせず
、かつｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いて調製される配列番号（ＳＥＱ．
ＩＤ．Ｎｏｓ．）２３のクランプの調製を除いて、ｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（ｃｌｂ
ｚ）として結合した。ピペリジン洗浄を、代表的にキャッピング工程の後に行っ
たが、ｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）をＰＮＡアセンブリに組み込んだ場合に
は、この洗浄を排除した。チミンＴ、シチジンＣ、およびプソイドイソシチジン
Ｊ核酸塩基を有する代表的なＰＮＡ構造の一部を示す（図１２）。スペーサーＯ
、２−［２−（２−アミノエトキシ）］酢酸を、Ｆｍｏｃ−アミノ保護シントン
として結合する。１以上のスペーサーＯ単位は、三重らせんを形成するクランプ
における可撓性の、非塩基対合のヒンジ領域として作用する（図１３）。ＰＮＡ
の合成を、ＭＢＨＡ（メチルベンズヒドリラミン）リンカー、高荷重型ポリスチ
レン支持体上で、工程の循環によって、２〜５０μｍｏｌのスケールで実施し得
る。このサイクルを、Ｂｏｃ−ＰＮＡモノマー付加の各々について実施し（Ｋｏ
ｃｈ，１９９７；Ｄｕｅｈｏｌｍ，１９９４）、そして以下の表に要約する。
【００９０】
【表１】 ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 ＨＡＴＵ １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール−テトラメチルウラ
ニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート
ＤＣＭ ジクロロメタン ＤＭＡ ジメチルホルムアミド （表．Ｍｏｄｅｌ４３３Ａ合成機におけるＰＮＡ合成サイクル） ＰＮＡの合成を、標準合成技術ならびに核酸塩基（Ａbz、Ｃbz、Ｇibu、Ｔ）
および一級アミノ（ＭＭＴ、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ）保護基を用いて行った。３
ｍｌの反応容器を４４０μｌの総反応容積を有する５μｍｏｌｅスケールで使用
する。合成の終りで、このＰＮＡをＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸
）を用いて室温で１時間切断させ、続いて、粗ＰＮＡのエーテル沈殿をする。
【００９１】 （実施例３． ＰＮＡ／ＤＮＡキメラクランプの合成） ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの自動合成を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機または４３３Ａペプチド合成機を
用いて、使用説明書およびＵｈｌｍａｎｎ、１９９６；Ｖａｎ ｄｅｒ ｌａａ
ｎ、１９９７；Ｖｉｎａｙａｋ、１９９７に記載される一般的手順に従って行っ
た。
【００９２】 ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ合成のために使用した支持体は、ヒドロキシメチル安息
香酸リンカーを有する非膨潤性の高架橋型ポリスチレンビーズである（Ｖｉｎａ
ｙａｋ、１９９７）。キメラ合成のためのＰＮＡモノマーは、一級アミノ保護た
めにモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）基を使用する。第１工程において、このモ
ノマー、ＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡ（各々を、ＤＭＦ／アセトニトリル（１／１
）中に溶解する）を、反応カートリッジに同時に送達する。１６分後、キャッピ
ング試薬を送達する。ＰＮＡの一級アミノ酸官能基が転位および環化する傾向を
最小にするために、アミノ末端を最後のＭＭＴ基の除去の後アセチル化する。Ｄ
ＮＡ部位およびＰＮＡ部位を連結するため、およびキメラ合成、切断、脱保護、
および精製のための他の手順のための試薬は、記載される（Ｖａｎ ｄｅｒ ｌ
ａａｎ、１９９７）。このアプローチにおいて、このキメラを、単一のカートリ
ッジ中でかつ単一の合成機において、連続して作製し得る。
【００９３】 （実施例４．クランプの標識） Ａ． 消光剤−ＰＮＡクランプ
【００９４】
【化２３】 Ｂ． 蛍光色素−ＰＮＡクランプ
【００９５】
【化２４】 Ｃ． ＭＧＢ、標識−ＰＮＡクランプ
【００９６】
【化２５】 Ｄ． 消光剤およびマイナーグルーブ結合剤標識２’−Ｏ−メチルＲＮＡクラン
プ
【００９７】
【化２６】 Ｅ． ５−プロピニル含有ＰＮＡクランプ
【００９８】
【化２７】 ＰＮＡ配列は、左にアミノ末端、右にカルボキシ末端を書いた。 ２’−Ｏ−メチルＲＮＡ配列は、左に５’、右に３’を書いた。
【００９９】 クランプ配列（配列番号１９〜２１、２２、２３、２８、２９、３１〜３７）
）を、プローブの３’末端で配列：ＡＡＡＧＧＡＧＧＡ−３’をクランプするよ
うに設計した。クランプ配列番号２５、２７、３８、４０および２４、２６、３
０、３９は、それぞれＡＡＧＧＡＧＧＡおよびＡＧＧＡＧＧＡのより短い配列に
、結合する。クランプ配列番号２２〜２６、２８、２９、３５〜３９は、このプ
ローブの５’末端に対して方向付けられたヒンジ領域およびこのプローブの３’
末端に相補的な末端を含むが、クランプ配列番号１９〜２１、３１〜３４は、プ
ローブの３’末端で方向付けられたヒンジ領域およびこのプローブの５’末端に
対して相補的な末端を有する（図１３）。クランプ配列番号１９および２２は、
ＰＮＡ対ＤＮＡの最も安定な配向の代表である。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは
、ＰＮＡのアミノ末端をＤＮＡの３’末端と対合し、かつＰＮＡのカルボキシ末
端をＤＮＡの５’末端と対合にする場合、逆平行の配向にある。ＰＮＡクランプ
のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合部分のアミノ末端（（Ｃ）−ＴＴＴＣＣＴ
ＣＣＴ−（Ｎ））は、このプローブの３’末端に対して逆平行の配向で存在する
。ＰＮＡクランプのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合部分のカルボキシ末端（（Ｎ）
−ＴＴＴＪＪＴＪＪＴＣ−（Ｃ））は、このプローブの３’末端に対して平行の
配向にある。これらの配向は、（ＰＮＡ）2／ＤＮＡ三重鎖において、最も安定
であることが示されている（Ｅｇｈｏｌｍ、１９９５，Ｅｇｈｏｌｍ、１９９３
）。クランプ配列番号２７、３０、４０は、プローブと二重鎖構造を形成するが
、クランプ配列番号１９〜２６、２８、２９、３１〜３９、４１、４２は、プロ
ーブと三重鎖構造を形成する。
【０１００】 報告されようなクランプについてのすべての標識反応は、２μｍｏｌの合成的
調製物に関する反応である。内部標識およびアミノ末端標識の前に、Ｆｍｏｃ保
護基をＤＭＦ：ピペリジン（４：１）を用いる室温で３時間の支持体結合保護Ｐ
ＮＡの処理によって、リジン（Ｋ）側鎖から除去した。アミノ末端ｔ−Ｂｏｃ基
を、ＴＦＡ：メタクレゾール（１９：１）を用いる支持体結合ＰＮＡの１０分間
の処置によって除去した。この支持体を徹底的にＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、
続いて、脱保護した。カルボキシ末端標識および内部標識を、リジン側鎖に付着
させた。カルボキシ末端標識を、両方の末端の標識化を同時に行ったクランプ配
列番号２１を除き、アミノ末端脱保護および標識の前に行った。ＰＮＡを、カル
ボキシ末端に、ＭＧＢ１およびＣＤＰＩ３を用いて標識し、そしてアミノ末端に
はＮＴＢおよびＴＡＭＲＡを用いて標識した。
【０１０１】 （ＴＡＭＲＡおよびＮＴＢ標識） 標識を、１００μｌのＤＭＦまたはＮＭＰ中に溶解したＴＡＭＲＡまたはＮＴ
Ｂの５ｍｇのＮＨＳエステルおよび１０μｌのＤＩＥＡを支持体結合ＰＮＡに添
加し、そして、２〜１８時間（代表的に終夜）反応させることにより、行った。
この支持体をＤＭＦおよび引き続いてＤＣＭを用いる標識の後、切断の前に洗浄
した。
【０１０２】 （ＭＧＢ１標識） ＭＧＢ１のカルボン酸（Ｇｏｎｇ、１９９７）（５ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ
ｅ）を、１００μｌＤＭＦ中に溶解し（図１１）、そして０．９５当量のＨＡＴ
Ｕ（ＤＭＦ中０．２ｍ）および５μｌのＤＩＥＡの添加によって活性化した。こ
の活性化ＭＧＢ１溶液を、支持体結合ＰＮＡに添加し、そして室温で１時間カッ
プリングさせた。次いで、この樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭ中で洗浄し、続いて、
切断した。
【０１０３】 （ＣＤＰＩ標識） ＣＤＰＩ3（図１１）を、Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ、１９９
５）の３つの継続的なカップリングによってＰＮＡに付着させ、ＣＤＰＩ3標識
ＰＮＡを得た。Ｆｍｏｃ（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌｅ）で保護した、ＣＤＰ
Ｉモノマー単位、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドー
ル−７−カルボキシレートを、１００μｌのＮＭＰ中に溶解し、そして０．９５
当量のＨＡＴＵ（ＤＭＦ中０．２Ｍ）および２当量のＤＩＥＡ（ＤＭＦ中０．４
ｍ）によって活性化した。室温で１時間後、活性化Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩ溶液を、
この支持体結合ＰＮＡに添加し、そして室温でもう１時間カップリングさせた。
樹脂を、２０ｍｌのＤＭＦを用いるカップリングの後洗浄した。Ｆｍｏｃを、室
温で、ピペリジン：ＤＭＦ（１：４）を用いる１０分間の樹脂支持体処置によっ
て除去した。このカップリングサイクルおよび脱保護サイクルを、合計３回の手
動のカップリングのすべてについて、さらに２回繰り返した。
【０１０４】 （実施例５． プローブおよびクランプのハイブリダイゼーションの速度） ３つのクランプ（配列番号１９，２０，２１）のプローブ（配列番号１）への
ハイブリダイゼーションの速度を、消光の関数として測定した。ハイブリダイゼ
ーションおよびクランプ消光剤ＮＴＢによる消光の際のプローブのＦＡＭ色素か
らの蛍光強度［Ｆ］の減少を、６０℃でＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ７７００上で測定
した。当量の、クランプ（１００ｎＭ）およびプローブ（１００ｎＭ）を、９５
℃で１分間混合し、６０℃に冷却し、そして［Ｆ］を２９分間測定した（図１４
）。プローブの消光の有意な加速を、４倍過剰のクランプ（４００ｎＭ）を用い
て達成した（ここで、消光を、１５秒以内に３つのクランプの各々を用いて実質
的に完了させた）（図１５）。
【０１０５】 （実施例６． プローブおよびクランプのバイナリー組成物を用いるエキソヌ
クレアーゼ／増幅アッセイ） 以下の試薬を混合し、そして２５μｌをＰＣＲのために各々のサンプル容器に
分配した： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グリセロール、１０ｍｍ ＭｇＣｌ2、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ジアザｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、０．１ｕ／μｌのＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｍｐｅｒａｓｅ ＵＮＧおよび受動的参照物を含む１２
．５μｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＰＥ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐ／Ｎ ４３０４４３７） ９００ｎＭ（最終濃度）：ＧＴＴ１順方向標的プライマー： ５’ＧＣＡＡＡＴＡＴＡＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡ３’ （配列
番号４４） ９００ｎＭ（最終濃度）：ＧＴＴ１逆方向標的プライマー： ５’ＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴ３’ （配列番号４５） １００ｎＭ プローブおよび４００ ｎＭ クランプ組成物 １０μｌ（約２０ｎｇ） ゲノム標的ＤＮＡ 標的サンプルを熱サイクリング条件（５０℃にて２分間で開始し、９５℃で１
０分維持し、次いで９５℃で１５秒の変性ならびに６０℃での１分間のアニーリ
ングならびに伸張の４０サイクルによって増幅させた。熱サイクリングおよびリ
アルタイム蛍光検出を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM７７００配列検出システム（Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）において行った。好ましい終点検出システムは
、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM７２００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙ
ｓｔｅｍである。
【０１０６】 エキソヌクレアーゼアッセイの結果を、２つのパラメーター（Ｒｎ値およびＣ t 値）を用いて分析し得る。Ｒｎ値は、ＰＣＲの間の蛍光における増大、すなわ
ちより正確には、蛍光色素の蛍光とＰＣＲ実験の終りでの受動的蛍光参照色素の
蛍光との比（すなわち、Ｒｎ（標的）＝標的プローブの発光強度÷受動的参照の
発光強度）である。Ｃt値すなわち闘サイクル数は、この蛍光比がバックグラウ
ンドから区別可能であるＰＣＲサイクルの数である。所与の蛍光色素および標的
の固定濃度に関して、ＲｎおよびＣｔ値の両方は、消光剤の効果を反映する。用
語ΔＲｎとは、バックグラウンドまたは初期の蛍光の減算を伴うＰＣＲの間の蛍
光の増大である。
【０１０７】 ＰＣＲの産物を、プローブおよびクランプのバイナリー組成物の切断のリアル
タイムの検出を用いて測定した。ＢＡＫ標的を、プローブおよびクランプのバイ
ナリー組成物（ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ７７００（図１６）において４００ｎＭの
クランプ（配列番号１９、２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）
）の存在下で引き続いて増幅させた。蛍光の変化（ΔＲｎ）を、増幅サイクルに
対してプロットした。蛍光の変化がバックグラウンドから区別可能であるサイク
ル（Ｃt）は、標的配列の存在を示す。バックグラウンドの蛍光が減算されない
場合、３つのクランプの消光効率の差異（Ｒｎ）が、著しい（図１７）。２つの
ＮＴＢ標識を有するクランプ（配列番号２１）は、クランプ（配列番号１９）よ
り良好に消光する。３つのリジン標識を有するクランプ（配列番号２０）は、１
つのリジンを有するクランプ（配列番号１９）より良好に消光する。
【０１０８】 ＧＴＴ１標的を、連続して、１）プローブおよびクランプのバイナリー組成物
：１００ｎＭ プローブ（配列番号２）および４００ｎＭ クランプ（配列番号
２０、２１）、および２）蛍光色素および消光剤を有するＴａｑｍａｎプローブ
： ５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ３’ 配列
番号４３ の存在下で増幅した。リアルタイムのＰＣＲ検出をバックグラウンド蛍光の減算
（ΔＲｎ）（図１８）を用いて、およびバックグラウンド蛍光の減算を使用せず
に（Ｒｎ）（図１９）、ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ７７００において測定した。ＣT
における有意な差異は、バイナリープローブ／クランプ組成物とＴａｑｍａｎプ
ローブとを比較する場合、測定されなかった。
【０１０９】 すべての刊行物およびすべての特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各
々が参考として援用されことを詳細にかつ個々に示されるかのように同程度まで
、本明細書中で参考として援用される。
【０１１０】 少数の実施形態のみを、詳細に記載してきたが、分子生物学および化学の分野
の当業者は、多くの改変が、好ましい実施形態においてその技術から逸脱するこ
となく可能であることを明白に、理解する。すべてのこのような改変は、添付の
特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ハイブリダイズした蛍光色素（Ｆ）−プローブおよび消光剤（Ｑ）−
クランプのバイナリー組成物ならびにハイブリダイズしていない蛍光色素（Ｆ）
−プローブおよび消光剤（Ｑ）−クランプのバイナリー組成物を示す。
【図２】 図２は、バイナリープローブおよび三重鎖組成物（上）ならびにバイナリープ
ローブおよび二重鎖組成物（下）の、標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダ
イゼーションを示す。
【図３】 図３は、蛍光色素−標識プローブおよび消光剤−クランプの組成物の、標的ポ
リヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを示す。
【図４】 図４は、プローブおよび蛍光色素−標識クランプの、標的ポリヌクレオチドに
対するハイブリダイゼーションを示す。
【図５】 図５は、蛍光色素−標識プローブの、消光剤／マイナーグルーブ結合剤（ＭＧ
Ｂ）−標識クランプに対するハイブリダイゼーション、およびプローブの、標的
ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション（標的に結合するプローブの
ＭＧＢによる安定化）を示す。
【図６】 図６は、非標識プライマーおよび蛍光色素−標識クランプの、ＰＣＲ標的に対
するハイブリダイゼーションを示す。
【図７】 図７は、標的ポリヌクレオチドの、５’ホモプリン配列を用いた増幅、および
ＰＣＲ産物の３’ホモプリン配列に結合する、三重鎖を形成する蛍光標識クラン
プを示す。
【図８】 図８は、エキソヌクレアーゼアッセイを示し、このアッセイによって、三重ら
せんを形成する自己消光バイナリープローブ、ならびにクランプの組成物１（蛍
光色素および消光剤を含む）、ならびに標的プライマー２ａおよび２ｂが、標的
ポリヌクレオチド３にハイブリダイズされる。増幅の重合段階の間、プライマー
２ａおよび２ｂは、ポリメラーゼ酵素を用いて伸長され、それによって伸長され
たプライマー４ａおよび４ｂを形成する。プライマー伸長反応の間、ポリメラー
ゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性は、蛍光色素−プローブフラグメント５および
クランプ特異的プローブフラグメント６を有する消光剤標識クランプを含む、プ
ローブフラグメントを形成するように、プローブ１を切断するように作用する。
【図９】 図９は、フルオレセイン蛍光色素の構造：ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、
ＶＩＣ、ＮＥＤを示し、ここで、Ｌはリンカーである。
【図１０】 図１０は、消光剤の構造：ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ
、ＮＴＢを示す。
【図１１】 図１１は、マイナーグルーブ結合剤の構造：ＭＧＢＩ、Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩ、
ＣＤＰＩ3を示す。
【図１２】 図１２は、モノマー単位：Ｔ、Ｃ、プソイドイソシトシンＪ、およびエチレン
オキシスペーサーＯを含むＰＮＡクランプを示す。
【図１３】 図１３は、プローブおよびクランプのバイナリー組成物を示す。三重鎖を形成
するクランプ（配列番号１９、配列番号２２）を標識なしで示す。
【図１４】 図１４は、時間に対する、プローブおよびクランプのバイナリー組成物のハイ
ブリダイゼーションの速度、すなわち蛍光強度［Ｆ］を示す。１００ｎＭのクラ
ンプ（配列番号１９、２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）、６
０℃；ＡＢＩモデル７７００。
【図１５】 図１５は、プローブおよびクランプのバイナリー組成物のハイブリダイゼーシ
ョンの速度、すなわち時間に対する蛍光強度［Ｆ］を示す。４００ｎＭのクラン
プ（配列番号１９、２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）、６０
℃；ＡＢＩモデル７７００。
【図１６】 図１６は、ＢＡＫ標的のリアルタイムＰＣＲ検出（サイクル数に対するΔＲｎ
、ＣTの測定、バックグラウンド蛍光を引いた場合）を示す。プローブおよびク
ランプのバイナリー組成物：４００ｎＭのクランプ（配列番号１９、２０、２１
）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）。
【図１７】 図１７は、ＢＡＫ標的のリアルタイムＰＣＲ検出（サイクル数に対するＲｎ、
ＣTの測定、バックグラウンド蛍光を引かない場合）を示す。プローブおよびク
ランプのバイナリー組成物：４００ｎＭのクランプ（配列番号１９、２０、２１
）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）。
【図１８】 図１８は、ＧＴＴ１標的のリアルタイムＰＣＲ検出（サイクル数に対するΔ
Ｒｎ、ＣTの測定、バックグラウンド蛍光を引いた場合）を示す。プローブおよ
びクランプのバイナリー組成物：４００ｎＭのクランプ（配列番号２０、２１）
、１００ｎＭのプローブ（配列番号２）。Ｔａｑｍａｎプローブ：５’ＦＡＭ−
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ３’。
【図１９】 図１９は、ＧＴＴ１標的のリアルタイムＰＣＲ検出（サイクル数に対するΔＲ
ｎ、ＣTの測定、バックグラウンド蛍光を引かない場合）を示す。プローブおよ
びクランプのバイナリー組成物：４００ｎＭのクランプ（配列番号２０、２１）
、１００ｎＭのプローブ（配列番号２）。Ｔａｑｍａｎプローブ：５’ＦＡＭ−
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号４３）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ハンカピラー， マイケル ダブリュー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94070， サン カルロス， ペブル ドライブ 1333 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA80 FB02 FB07 FB12 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR43 QR54 QR56 QR63 QR66 QS03 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするためのバイ
    ナリー組成物であって、該バイナリー組成物は、以下： 標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含むプローブであって、ここで、
    該標的特異的部分が、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが
    可能である、プローブ；および プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖
    アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸
    アナログを含むクランプであって、ここで、該プローブ特異的部分が、該プロー
    ブの該クランプ特異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして該
    クランプは、該標的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能であ
    る、クランプ、 を含み、 ここで、該標識の検出の間、該プローブの該クランプ特異的部分は、該クラン
    プの該プローブ特異的部分に結合したままである、 バイナリー組成物。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、前記
    プローブの前記クランプ特異的部分および前記クランプの前記プローブ特異的な
    塩基対部分が二重鎖を形成する、バイナリー組成物。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、前記
    プローブの前記クランプ特異的部分および前記クランプの前記プローブ特異的な
    塩基対部分が三重鎖を形成する、バイナリー組成物。
  4. 【請求項４】 前記プローブが６〜１００のヌクレオチドを含む、請求項１
    に記載のバイナリー組成物。
  5. 【請求項５】 前記プローブの前記クランプ特異的部分がプリンヌクレオチ
    ドを含む、請求項１に記載のバイナリー組成物。
  6. 【請求項６】 前記クランプの前記プローブ特異的部分がピリミジン核酸塩
    基アナログを含む、請求項１に記載のバイナリー組成物。
  7. 【請求項７】 前記クランプが６〜５０のヌクレオチドアナログを含む、請
    求項１に記載のバイナリー組成物。
  8. 【請求項８】 前記クランプ配列が（ＣＡＧ）n（ここで、ｎ＝１〜１０）
    を含む、請求項１に記載のバイナリー組成物。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、前記
    クランプ配列が、（ＴＣＣ）nおよび前記プローブ配列（ＧＧＡ）n（ここで、ｎ
    ＝１〜１０）に結合する核酸アナログを含む、バイナリー組成物。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、前
    記プローブが、以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間ア
    ナログからなる群から選択される核酸アナログを含む、バイナリー組成物。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記核酸塩基アナログが、以下：Ｃ−５−アルキルピリミジン、２，６−ジアミ
    ノプリン、２−チオピリミジン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、７−デアザプリ
    ン、イソシチジン、プソイドイソシチジン、イソグアノシン、４（３Ｈ）−ピリ
    ミドン、ヒポキサンチン、８−オキソプリン、および万能塩基からなる群から選
    択される、バイナリー組成物。
  12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記糖アナログが、以下：２’−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−
    メチル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド、２’−アリ
    ルリボヌクレオチド、２’−ハロ−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチ
    ル−リボヌクレオチド、２’−分枝基−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−分枝基−
    リボヌクレオチド、４’−α−アノマーヌクレオチド、および１’−α−アノマ
    ーヌクレオチドからなる群から選択される、バイナリー組成物。
  13. 【請求項１３】 請求項１０に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記ヌクレオチド間アナログが、以下：２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）、
    ２’−５’−結合、逆方向３’−３’結合、逆方向５’−５’結合、ホスホロチ
    オエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホルアミデート、アルキル
    化ホスホトリエステル分枝構造、および３’−Ｎ−ホスホルアミデートからなる
    群から選択される、バイナリー組成物。
  14. 【請求項１４】 前記クランプが、非塩基対の、非ヌクレオシドリンカーを
    含む、請求項１に記載のバイナリー組成物。
  15. 【請求項１５】 前記クランプが、１つ以上の２−アミノエチルグリシン（
    ＰＮＡ）モノマー単位を含む、請求項１に記載のバイナリー組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、前
    記クランプが、以下：末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖、アミノ基、ス
    ルフィド基、およびカルボキシル基からなる部位に付着される１つ以上の標識を
    有する、バイナリー組成物。
  17. 【請求項１７】 前記プローブが１つ以上の標識を含む、請求項１に記載の
    バイナリー組成物。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記標識が以下：５’末端、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、および
    糖からなる群から選択される部位に付着される、バイナリー組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項１および１７に記載のバイナリー組成物であって、
    ここで、前記クランプ標識および前記プローブ標識が、以下：ハイブリダイゼー
    ション安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、化学発光色素、アミノ酸、およびア
    フィニティーリガンドからなる群から選択される、バイナリー組成物。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記ハイブリダイゼーション安定化部分が、以下：マイナーグルーブ結合剤、イ
    ンターカレーター、および架橋官能基からなる群から選択される、バイナリー組
    成物。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記マイナーグルーブ結合剤が、以下：Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＣＤＰＩ 1-3 、ＭＧＢ１、ネトロプシン、およびジスタマイシンからなる群から選択され
    る、バイナリー組成物。
  22. 【請求項２２】 請求項１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記蛍光色素が、以下：ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ
    、ＶＩＣ、ＮＥＤ、４，７−ジクロロ−フルオレセイン、４，７−ジクロロ−ロ
    ーダミン、およびシアニンからなる群から選択される、バイナリー組成物。
  23. 【請求項２３】 請求項１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記蛍光消光剤が、以下：ＴＡＭＲＡ、ＮＴＢ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢ
    ＳＹＬ、マラカイトグリーン、およびシアニンからなる群から選択される、バイ
    ナリー組成物。
  24. 【請求項２４】 請求項１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記化学発光色素が、以下の構造を有する化学発光前駆体からなる群から選択さ
    れ： 【化１】 ここで、Ｒ1は、水素またはハロゲンであり；Ｒ2は、ホスフェート、ガラクトシ
    ド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、ま
    たは水素であり；Ｒ3は、メチル、エチル、低級アルキルであり；そしてＬはリ
    ンカーである、バイナリー組成物。
  25. 【請求項２５】 請求項１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、
    前記リガンドが、以下：ビオチン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレス
    テロール、ポリエチレンオキシ、およびペプチドからなる群から選択される、バ
    イナリー組成物。
  26. 【請求項２６】 標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするためのバ
    イナリー組成物であって、以下： 標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含むプローブであって、ここで、
    該標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが
    可能である、プローブ；および ２つのプローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナロ
    グ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つ
    の核酸アナログを含むクランプであって、ここで、該２つのプローブ特異的部分
    は、該プローブの該クランプ特異的部分に配列特異的に結合し、三重鎖を形成し
    得る、クランプ、 を含む、バイナリー組成物。
  27. 【請求項２７】 標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするためのバ
    イナリー組成物であって、以下： 標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含むプローブであって、ここで、
    該標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが
    可能である、プローブ；および プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖
    アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸
    アナログを含むクランプであって、ここで、該プローブ特異的部分は、該プロー
    ブの該クランプ特異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして該
    クランプは、該標的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能であ
    る、クランプ、 を含み、 ここで該標識の１つは、該標的の該プローブへの結合を安定化するハイブリダ
    イゼーション安定化部分である、 バイナリー組成物。
  28. 【請求項２８】 標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法であって
    、以下の工程： プローブおよびクランプのバイナリー組成物を提供する工程であって、該プロー
    ブおよびクランプのバイナリー組成物が、以下： 標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含み、ここで、該標的特異的部分
    は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プロ
    ーブ；および プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖
    アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸
    アナログを含み、ここで、該プローブ特異的部分は、該プローブの該クランプ特
    異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして該クランプは、該標
    的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能である、クランプ； を含む、工程； 該プローブの該標的特異的部分を、該標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
    ズさせる工程； 該クランプの該プローブ特異的部分を該プローブの該クランプ特異的部分にハイ
    ブリダイズさせる工程；ならびに 該バイナリープローブを検出する工程、 を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出するための方法であっ
    て、以下の工程： プローブおよびクランプのバイナリー組成物を提供する工程であって、該プロー
    ブおよびクランプのバイナリー組成物が、以下： 標的特異的部分、クランプ特異的部分および１つ以上の標識を含み、ここで該
    標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可
    能である、プローブ；および プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖
    アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸
    アナログを含み、ここで、該プローブ特異的部分は、該プローブの該クランプ特
    異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして該クランプは、該標
    的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能である、クランプ； を含む、工程； 該プローブの該標的特異的部分を、該標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
    ズさせる工程； 該クランプの該プローブ特異的部分を該プローブの該クランプ特異的部分にハイ
    ブリダイズさせる工程；ならびに エキソヌクレアーゼ活性、ＰＣＲプライマー、およびヌクレオシド５’トリホス
    フェートを有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、該標的を増幅する工程、 該ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により、該プローブを切断する工程、
    ならびに 該標識を検出する工程、 を包含する、方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の方法であって、ここで前記標識が、リ
    アルタイムでか、または標的増幅の終点で、発せられる蛍光をモニターすること
    によって検出される、方法。
  31. 【請求項３１】 ポリメラーゼ連鎖反応生成物を標識するための方法であっ
    て、以下の工程： 標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含み、ここで該標的特異的部分は
    、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プライ
    マー；および プライマー特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、
    糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核
    酸アナログを含み、ここで、該プライマー特異的部分は、該プライマーの該クラ
    ンプ特異的部分に配列特異的に結合し得る、クランプ； を提供する工程；ならびに ＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上のバイナリープライマーおよびクランプの組成物
    、１つ以上の対向鎖プライマー、およびヌクレオシド５’トリホスフェートを用
    いて、該標的を増幅する工程であって、 ここで、１つ以上の標識ポリメラーゼ連鎖反応生成物が生じる、工程 を包含する、方法。
  32. 【請求項３２】 前記標識が検出可能な蛍光色素である、請求項３１に記載
    の方法。
  33. 【請求項３３】 ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出するための方法であっ
    て、以下の工程： ３’末端に標的特異的部分および５’末端にホモピリミジン配列部分を含み、
    ここで該標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合する
    ことが可能である、１つ以上のプライマー；および該ホモピリミジン配列、１つ
    以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチ
    ド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含むクランプ、を
    提供する工程； ＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の対向鎖プライマー、およびヌクレオシド５’ト
    リホスフェートを用いて、該標的を増幅する工程；ならびに 該標識を検出する工程であって、 ここで、該クランプの該ホモピリミジン配列が、該ポリメラーゼ連鎖反応生成物
    の３’末端で、該ホモピリミジン配列の相補体に結合する、工程 を包含する、方法。
  34. 【請求項３４】 前記標識が検出可能な蛍光色素である、請求項３３に記載
    の方法。
JP2000593170A 1999-01-15 2000-01-14 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法 Expired - Lifetime JP4644370B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/232,000 1999-01-15
US09/232,000 US6432642B1 (en) 1999-01-15 1999-01-15 Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
PCT/US2000/000972 WO2000041549A2 (en) 1999-01-15 2000-01-14 Binary probe and clamp composition and methods for target hybridization detection

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005047966A Division JP2005160489A (ja) 1999-01-15 2005-02-23 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002534100A true JP2002534100A (ja) 2002-10-15
JP4644370B2 JP4644370B2 (ja) 2011-03-02

Family

ID=22871476

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000593170A Expired - Lifetime JP4644370B2 (ja) 1999-01-15 2000-01-14 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法
JP2005047966A Withdrawn JP2005160489A (ja) 1999-01-15 2005-02-23 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法
JP2008195452A Pending JP2009017882A (ja) 1999-01-15 2008-07-29 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005047966A Withdrawn JP2005160489A (ja) 1999-01-15 2005-02-23 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法
JP2008195452A Pending JP2009017882A (ja) 1999-01-15 2008-07-29 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法

Country Status (8)

Country Link
US (4) US6432642B1 (ja)
EP (1) EP1141387B1 (ja)
JP (3) JP4644370B2 (ja)
AT (1) ATE329056T1 (ja)
AU (1) AU771650B2 (ja)
CA (1) CA2360543C (ja)
DE (1) DE60028534T2 (ja)
WO (1) WO2000041549A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008535518A (ja) * 2005-04-14 2008-09-04 アプレラ コーポレイション プソイドイソシトシン核酸塩基誘導体を含む３’改変オリゴヌクレオチド、およびプライマーまたはプローブとしてのその適用
JP2009506759A (ja) * 2005-09-01 2009-02-19 コーベット ライフ サイエンス ピーティーワイ リミテッド 核酸の増幅、定量化、及び同定の方法。

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6432642B1 (en) * 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
US6395486B1 (en) 1999-03-15 2002-05-28 Applera Corporation Probe/mobility modifier complexes for multiplexnucleic acid detection
US7118860B2 (en) * 1999-10-29 2006-10-10 Stratagene California Methods for detection of a target nucleic acid by capture
US6977161B2 (en) 2000-10-14 2005-12-20 Eragen Biosciences, Inc. Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases
WO2001090417A2 (en) * 2000-05-19 2001-11-29 Eragen Biosciences, Inc. Materials and methods for detection of nucleic acids
US20030082549A1 (en) * 2000-08-30 2003-05-01 Xiangjun Liu Method for determining alleles
US6818420B2 (en) 2002-02-27 2004-11-16 Biosource International, Inc. Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
WO2003100095A1 (fr) * 2002-05-08 2003-12-04 Arkray, Inc. Procede de detection d'un acide nucleique cible
WO2005001129A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Applera Corporation Mobility cassettes
GB0320235D0 (en) * 2003-08-29 2003-10-01 Molecular Light Tech Res Ltd Estimation of activity or inhibition of processes involved in nucleic acid modification using chemiluminescence quenching
US7575863B2 (en) 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
US7767834B2 (en) * 2004-08-13 2010-08-03 Elitech Holding B.V. Phosphonylated fluorescent dyes and conjugates
WO2006020947A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 Epoch Biosciences, Inc. Phosphonate fluorescent dyes and conjugates
EP1791982B1 (en) * 2004-09-21 2011-01-05 Life Technologies Corporation TWO-COLOR REAL-TIME/END-POINT QUANTITATION OF MICRORNAS (MIRNAs)
US7588921B1 (en) * 2004-09-22 2009-09-15 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Messenger RNA profiling: body fluid identification using multiplex real time-polymerase chain reaction (q-PCR)
US7700287B2 (en) 2005-01-28 2010-04-20 Life Technologies Corporation Compositions and methods for terminating a sequencing reaction at a specific location in a target DNA template
GB0510979D0 (en) * 2005-05-28 2005-07-06 Kbiosciences Ltd Detection system for PCR assay
FR2900158A1 (fr) * 2006-04-25 2007-10-26 Biomerieux Sa Nouvelle sonde de detection agissant par reconnaissance moleculaire
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
ATE538216T1 (de) * 2006-07-31 2012-01-15 Wanli Bi Nukleinsäureverstärkung mithilfe eines reversibel modifizierten oligonukleotids
US9045522B2 (en) 2006-07-31 2015-06-02 Wanli Bi Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide
WO2008021446A2 (en) * 2006-08-15 2008-02-21 Genetag Technology, Inc. Probe-antiprobe compositions and methods for dna or rna detection
FR2906532B1 (fr) * 2006-09-28 2008-12-12 Biomerieux Sa Nouvel oligonucleotide marque
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
EP1995327A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Humboldt Universität zu Berlin Probe for detecting a particular nucleic acid sequence
CN102007222A (zh) * 2007-08-13 2011-04-06 3M创新有限公司 用于检测耐药微生物的方法
LT2660336T (lt) * 2008-06-11 2017-10-10 Orion Pharma (Uk) Limited Izoterminė nukleorūgšties amplifkacija
FR2933410B1 (fr) * 2008-07-04 2010-08-20 Biomerieux Sa Nouvelle sonde de detection
US8346485B2 (en) 2008-11-25 2013-01-01 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods and apparatuses for estimating initial target nucleic acid concentration in a sample by modeling background signal and cycle-dependent amplification efficiency of a polymerase chain reaction
US9914963B2 (en) 2009-09-28 2018-03-13 Igor Kutyavin Methods and compositions for detection of nucleic acids based on stabilized oligonucleotide probe complexes
WO2012106668A2 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Fluidigm Corporation Multifunctional probe-primers
WO2013009070A2 (ko) * 2011-07-12 2013-01-17 주식회사 파나진 평행 결합 구조의 이중 혼성화 pna 프로브 시스템
US9133509B2 (en) 2012-03-22 2015-09-15 Lgc Genomics Limited Polymerase chain reaction detection system
EP2989212B1 (en) 2013-04-25 2018-07-18 Orion Diagnostica Oy Strand-invasion based dna amplification method
EP3726213A1 (en) 2013-08-19 2020-10-21 Singular Bio Inc. Assays for single molecule detection and use thereof
GB201410022D0 (en) 2014-06-05 2014-07-16 Orion Diagnostica Oy Method
CN106715768B (zh) 2014-07-30 2020-06-16 哈佛学院院长及董事 用于测定核酸的系统和方法
US11739371B2 (en) 2015-02-18 2023-08-29 Invitae Corporation Arrays for single molecule detection and use thereof
US11788123B2 (en) 2017-05-26 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for high-throughput image-based screening
KR101899371B1 (ko) * 2017-07-25 2018-10-29 (주)엔바이오텍 핵산 복합체 페어, 핵산 복합체 페어를 포함하는 pcr용 키트, 및 핵산 복합체 페어를 이용한 타겟 검출 방법
KR102262260B1 (ko) * 2018-02-08 2021-06-09 주식회사 시선테라퓨틱스 엔도좀 탈출능을 갖는 펩티드 핵산 복합체 및 이의 용도
CN110542674B (zh) * 2019-09-19 2021-10-22 济南大学 一种检测谷胱甘肽的生物传感器及其制备方法
WO2022261030A1 (en) * 2021-06-07 2022-12-15 Neubase Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogue modulators of oncogenes

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
GB8405437D0 (en) 1984-03-01 1984-04-04 Amersham Int Plc Detecting polynucleotide sequences
ATE65092T1 (de) 1985-05-31 1991-07-15 Amoco Corp Verstaerkung von hybridisierungssignalen durch verwendung von komplementarischen dns-straengen.
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4931223A (en) 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
US5656731A (en) 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
US5231191A (en) 1987-12-24 1993-07-27 Applied Biosystems, Inc. Rhodamine phosphoramidite compounds
US5175273A (en) * 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5366860A (en) 1989-09-29 1994-11-22 Applied Biosystems, Inc. Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination
US5188934A (en) 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
CA2039517C (en) * 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5627032A (en) * 1990-12-24 1997-05-06 Ulanovsky; Levy Composite primers for nucleic acids
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
JP3739785B2 (ja) 1991-11-26 2006-01-25 アイシス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形
US5424413A (en) * 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
FR2710075B1 (fr) * 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5602004A (en) * 1994-07-20 1997-02-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Thermophilic fungal expression system
US5552471A (en) 1994-08-17 1996-09-03 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the synthesis of 3'-Nitrogen containing polynucleotides
US5801155A (en) 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
WO1997019193A2 (en) * 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
US5736626A (en) 1996-01-29 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
CA2218440A1 (en) 1996-12-21 1998-06-21 Boehringer Mannheim Gmbh Method of analysis using signal amplification
EP0857791B1 (en) 1996-12-21 2004-03-31 PNA Diagnostics A/S Method of analysis using signal amplification
US6287772B1 (en) * 1998-04-29 2001-09-11 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences
US6435642B1 (en) * 1998-11-17 2002-08-20 Pitney Bowes Inc. Apparatus and method for real-time measurement of digital print quality
US6432642B1 (en) * 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008535518A (ja) * 2005-04-14 2008-09-04 アプレラ コーポレイション プソイドイソシトシン核酸塩基誘導体を含む３’改変オリゴヌクレオチド、およびプライマーまたはプローブとしてのその適用
JP2009506759A (ja) * 2005-09-01 2009-02-19 コーベット ライフ サイエンス ピーティーワイ リミテッド 核酸の増幅、定量化、及び同定の方法。

Also Published As

Publication number Publication date
US8067165B2 (en) 2011-11-29
ATE329056T1 (de) 2006-06-15
EP1141387A2 (en) 2001-10-10
CA2360543C (en) 2009-03-31
WO2000041549A2 (en) 2000-07-20
US20100291557A1 (en) 2010-11-18
US20060035217A1 (en) 2006-02-16
DE60028534T2 (de) 2007-06-06
US6432642B1 (en) 2002-08-13
JP4644370B2 (ja) 2011-03-02
AU2850400A (en) 2000-08-01
EP1141387B1 (en) 2006-06-07
WO2000041549A3 (en) 2000-11-30
JP2005160489A (ja) 2005-06-23
US7057025B2 (en) 2006-06-06
DE60028534D1 (de) 2006-07-20
JP2009017882A (ja) 2009-01-29
US20070026429A1 (en) 2007-02-01
AU771650B2 (en) 2004-04-01
CA2360543A1 (en) 2000-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4644370B2 (ja) 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法
AU763948B2 (en) Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders
CA2201756C (en) Self-quenching fluorescence probe and method
US8465921B2 (en) Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders
US6743905B2 (en) Mobility-modified nucleobase polymers and methods of using same
EP1220953B1 (en) Template-dependent ligation with pna-dna chimeric probes
JP2004509613A (ja) 非同調的刺激ｐｃｒ
US6063571A (en) Process for amplifying nucleic acids using DNA/PNA primers
AU695561C (en) Self-quenching fluorescence probe and method

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20040824

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20041012

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20041019

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050223

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20070809

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071203

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20071207

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20080111

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712

Effective date: 20090618

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100922

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101206

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4644370

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131210

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term