CN102516337B - 3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体及其合成方法和应用，其结构为： 。本发明的最大优点是作为核酸固相合成的基本原料可以很方便地在寡核苷酸片段中引入一个或者多个硫-磷桥键，合成新型的寡核苷酸序列及其探针。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体及其合成方法和应用，化学基团修饰的硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺分子可以用于固相核酸合成的单体原料，其固相合成寡核苷酸产物除了具有传统寡核苷酸的生物学性能外，还具有被化学切割的性能，可以用于核酸、蛋白质等生物大分子的检测。
技术背景
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，对生命科学至关重要。随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。在基础研究方面，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。通过DNA序列信息的分析可以为理解生命的起源、疾病发生、以及个体化医疗等提供有用的相关核酸序列信息。
对DNA序列的分析包括位点(如单碱基多态性、甲基化、突变等)，片段序列(如片段重复、缺失等)、全基因组序列分析和DNA蛋白质相互作用。针对这些不同的分析对象，目前已有各种不同的方法相应方法被广泛应用，而这些方法中有许多涉及到核酸需要被切割的手段。如在桥式PCR扩增中需要对一条链进行切除，以获得单链DNA模板用来进行核酸分析；在DNA与蛋白质的序列特异性识别和相互作用检测中，需要借助核酸片段是否能够切割来判断双链DNA是否与蛋白质发生了结合，从而达到非标记检测蛋白的目的；在基于标记荧光的高通量测序过程中，需要将每次测序中的标识荧光分子切除，以便顺利进行下一个位置碱基的序列测定等。要实现这些不同的切割的手段，目前需要针对核酸片段进行特殊的修饰，或者采用特定的酶切或者化学切割方法，这些方法中要么合成难度大，或者难于找到合适的切割试剂而给研究工作带来困难。
本发明制备的是3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺分子可以作为固相核酸合成的基本原料，通过广泛使用的核酸合成仪在合成的序列片段中很方便的引入硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯来实现核酸序列分析中切割方法的实现。由于引入的硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯(简写成“M”)具有通用碱基的性能，能很好的和4种碱基配对，在任何位置均能满足与四个碱基的杂交效果，且比其它通用碱基具有更平均的杂交温度(Bergstrom，D.E.，et al. Synthesis，structure，and deoxyribonucleic acid sequencing with a universal nucleoside：1-(2’-Deoxy-β-D-rinbofuranosyl)-3-nitropyrrole.J.Am.Chem.SOC.1995，117，1201-1209)，能够在核酸分析中得到广泛的应用。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是提供3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体及其合成方法和应用，为新的核酸序列分析技术所能利用的试剂，为新核酸序列分析技术的低成本、高速度和高通量奠定基础。
技术方案：3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体，结构为：
该分子由硝基吡咯基团、3’硫代脱氧核糖基团和亚磷酸基团构成，亚磷酸基团中连接R1和R2基团构成亚磷酰胺基团，脱氧核糖基团的5’羟基位置上连接着基团R3，R1选自于：
R2选自于：
-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CN、-OC(CH3)2CH2CN、-OC(CH3)2CCl3、
R3选自于：
3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体的合成方法，具有如下结构：
具体合成步骤为：
式2化合物1-(2’-脱氧-3’，5’-二-O-甲苯酰基-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯的合成：将2.20g，19.62mmol的3-硝基吡咯溶解于245mL乙睛中，在氮气气氛搅拌下加入0.66g，27.5mmol的氢化钠，当反应液变成清晰时，加入式1化合物：1-氯-2-脱氧-3’，5’-二-O-甲苯酰基-α-D-呋喃核糖7.62g，19.62mmol；将上述混合物搅拌1小时，过滤，固体物用乙睛洗涤，滤液蒸发至干，然后经硅胶柱色谱纯化，正己烷-丙酮作为洗提液，最后得到白色固体式2化合物；
式3化合物1-(2’-脱氧-3’，5’-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯的合成：将6.0g，12.92mmol的式2化合物放入溶解于甲醇的浓氨水溶液的压力容器中，55℃过夜，氨水和甲醇通过真空蒸发清除，固体物经硅胶柱色谱纯化分离，正己烷-丙酮作为洗提液，得到白色固体式3化合物3；
式4化合物1-(2’-脱氧-5’-二甲氧基三苯基-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯的合成：1.32g，5.80mmol的式3化合物和2.0g，5.92mmol的氯化对甲氧基三苯甲烷一同溶解在12mL吡啶中，室温放置1小时，然后不断加入氯化对甲氧基三苯甲烷，直到反应完全，然后将反应液倒入水中，产物用乙醚萃取，并用水洗涤3次，硫酸钠干燥，并用硅胶柱色谱纯化分离，正己烷-丙酮作为洗提液，得到白色泡沫式4化合物4；
2.50g，4.71mmol的式4化合物和17.7g，65.5mmol的硫代苯甲酸铯，溶于16.35mL无水二甲DMF中，加热到110℃反应5小时，反应完成后，溶剂真空脱出，用200毫升乙酸乙酯悬浮残余物，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，有机相用硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂得到浓缩物；750mg，2.67mmol硫代苯甲酸铯和200mg，0.77mmol的18-冠醚-6悬浮，在真空脱气、搅拌下溶于5毫升无水乙腈中，将浓缩物分批加入到上述乙腈溶液中搅拌反应2小时，产物冷着至室温后转移到分液漏斗中，用20mL体积比1∶1的乙酸乙酯和水萃取，有机相用硫酸钠干燥，过虑，并在减压下蒸发溶剂得到式5化合物：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’苯甲酰-硫代-次黄嘌呤脱氧核苷；
1.98g，3.04mmol式5化合物在搅拌，同时伴随氩气鼓泡的作用下加入到400毫升乙醇和18.7mL，187mmol的NaOH混合溶液中室温反应1小时，然后将800mL，1M KH2PO4加入到反应液，沉淀物通过过虑、蒸馏水洗涤，并经用P2O5干燥48小时，得到式6化合物5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’巯基-次黄嘌呤脱氧核苷；
700mg，1.28mmol的式6化合物溶解在40毫升四氢呋喃、30mL甲醇和10mL水的溶剂中，在氩气保护下用冰的盐和甲醇冷着液冷至-10℃，加入脱气的0.5M，10mL氢氧化钠溶液，在0℃下搅拌10分钟，反应产物经减压浓缩至5毫升，加200毫升乙酸乙酯，用10％wt碳酸钠水溶液萃取3次，有机相用硫化钠干燥，过虑，真空干燥得到泡沫状固体，20毫升乙酸乙酯溶解上述泡沫状固体，并在搅拌下加入到250毫升正己烷中，放置于冷冻柜中冷至-78℃，沉淀物过虑分离，并在真空下干燥，得到纯度大约95％的式7化合物3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酰胺分子。
上述3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体在核酸、蛋白质生物大分子检测中的应用。
具体来说，本发明以3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺为基本原料，并用该基本原料合成寡核苷酸序列及其探针用于核酸新测序技术以及相关技术领域，所述修饰3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体具有以下基本结构：
该分子由硝基吡咯基团、3′硫代脱氧核糖基团和亚磷酸基团构成，亚磷酸基团中连接R1和R2基团构成亚磷酰胺基团，脱氧核糖基团的5′羟基位置上连接着基团R3。R1选自但不限于，等；R2选自但不限于，
-OCH3，-OCH2CH3-OCH2CH2CN，-OC(CH3)2CH2CN，-OC(CH3)2CCl3，
等；R3选自但不限于，
(简写成MMT)，
(简写成DMT)，等。
制备的是3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺分子化合物，该分子由硝基吡咯基团、3′硫代脱氧核糖基团和亚磷酰胺基团构成。该化合物分子是核酸固相合成的单体原料，在核酸固相合成的寡核苷酸片段中可以由它引入一个或者多个硫-磷桥键，该化合物分子及其包含由该化合物分子合成的寡核苷酸中的硫-磷桥键可以在包括无机重金属离子(如银离子、汞离子等)，非金属单质(溴、碘等)及其它氧化试剂的作用下可以被断裂。3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酸胺分子作为原料合成的寡核苷酸序列及其探针可以用于核酸检测技术相关领域。
以下三类取代基修饰的3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酰胺是本发明的优选化合物：
结构为：
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1、本发明的最大优点是作为核酸固相合成的基本原料可以很方便地在寡核苷酸片段中引入一个或者多个硫-磷桥键，合成新型的寡核苷酸序列及其探针。
2、本发明化合物合成的寡核苷酸测序及其探针的硫-磷桥键在包括无机重金属离子(如银离子、汞离子等)，非金属单质(溴、碘等)及其它氧化试剂作用下可以被断裂，这个特性可广泛应用于多种核酸检测方法，而这些检测方法可以在医药、医疗、农业生产以及生命科学研究等多个方面应用。
附图说明
图1为3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺分子合成路线；
图2为3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺分子的质谱；
图3为固相合成含3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯寡核苷酸序探针Cy3-GAMCATGA序列质谱图，其含量为97.4％的主峰与探针摩尔质量理论值2941.4相一致；
图4为固相合成含3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯寡核苷酸序列Cy3-GAMCATGA探针(I)和探针被切割试剂处理(II)的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，(III)为指示剂二甲基苯氰和溴芬兰的条带。
具体实施方式
实施例1：优选化合物HCW-1的化学合成
参见附图1
1-(2’-脱氧-3’，5’-二-O-甲苯酰基-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(化合物2)的合成：将3-硝基吡咯(2.20g，19.62mmol)溶解于245mL乙睛中，在氮气气氛搅拌下加入(0.66g，27.5mmol)氢化钠，当反应液变成清晰时，加入1-氯-2-脱氧-3’，5’-二-O-甲苯酰基-α-D-呋喃核糖(7.62g，19.62mmol)(化合物1)。将上述混合物搅拌1小时，过滤，固体物用乙睛洗涤，滤液蒸发至干，然后经硅胶柱色谱纯化(正己烷-丙酮作为洗提液)，最后得到白色固体化合物2(8.0g，88％)。
1-(2’-脱氧-3’，5’-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(化合物3)的合成：将化合物2(6.0g，12.92mmol)放入溶解于甲醇的浓氨水溶液的压力容器中，55℃过夜。氨水和甲醇通过真空蒸发清除，固体物经硅胶柱色谱纯化(正己烷-丙酮作为洗提液)分离，得到白色固体化合物3(2.45g，83％)。
1-(2’-脱氧-5’-二甲氧基三苯基-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(化合物4)的合成：化合物3(1.32g，5.80mmol)和氯化对甲氧基三苯甲烷(2.0g，5.92mmol)一同溶解在吡啶(12mL)中，室温放置1小时，然后不断加入小量的氯化对甲氧基三苯甲烷，直到反应完全(经过薄层色谱分析证实反应原料已消失)，然后将反应液倒入水中，产物用乙醚萃取，并用水洗涤3次，硫酸钠干燥，并用硅胶柱色谱纯化(正己烷-丙酮作为洗提液)分离，得到白色泡沫化合物4(2.69g，88％)。
化合物4(2.50g，4.71mmol)和硫代苯甲酸铯(17.7g，65.5mmol)，溶于无水二甲DMF(16.35mL)中，加热到110℃反应5小时。反应完成后，溶剂真空脱出，用200毫升乙酸乙酯悬浮残余物，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次(每次100毫升)，有机相用硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂得到浓缩物(1)。硫代苯甲酸铯(750mg，2.67mmol)和18-冠醚-6(200mg，0.77mmol)悬浮，在真空脱气、搅拌下溶于5毫升无水乙腈中。将浓缩物(1)分批迅速加入到上述乙腈溶液中搅拌反应2小时，产物冷着至室温后转移到分液漏斗中，用20mL乙酸乙酯和水(体积比1∶1)萃取，有机相用硫酸钠干燥，过虑，并在减压下蒸发溶剂得到5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’苯甲酰-硫代-次黄嘌呤脱氧核苷，即化合物5，产率67％。
化合物5(1.98g，3.04mmol)在搅拌，同时伴随氩气鼓泡的作用下加入到乙醇(400毫升)和NaOH(18.7mL，187mmol)混合溶液中室温反应1小时，然后将1M KH2PO4(800mL)缓慢加入到反应液(15分钟加完)，沉淀物通过过虑、蒸馏水洗涤(4×200mL)，并经用P2O5干燥48小时，得到5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’巯基-次黄嘌呤脱氧核苷，即化合物6，产率85％。
化合物6(700mg，1.28mmol)溶解在四氢呋喃(40毫升)、甲醇(30mL)和水(10mL)的溶剂中，在氩气保护下用冰的盐和甲醇冷着液冷至-10℃。加入脱气的氢氧化钠溶液(0.5M，10mL)，在0℃下搅拌10分钟。反应产物经减压浓缩至5毫升，加200毫升乙酸乙酯，用10％碳酸钠水溶液(冰冷)萃取3次，有机相用硫化钠干燥，过虑，真空干燥得到泡沫状固体。20毫升乙酸乙酯溶解上述泡沫状固体，并在搅拌下加入到250毫升正己烷中，放置于冷冻柜中冷着至-78℃，沉淀物过虑分离，并在真空下干燥，得到纯度大约95％的3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酰胺分子，即化合物7，产率为68％。
合成的3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺质谱为746.3，与理论值746相符(参见图2)。
实施例2：含3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯寡核苷酸序列的合成及其切割性能
将3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺按照0.1M浓度用无水乙腈(水含量小于0.003％)均匀溶解，然后在DNA自动合成仪上按照编辑的序列或者探针自动合成(文献)。在3’硫代-脱氧次黄嘌呤核苷单体的合成过程中，需要使用低浓度的氧化剂(0.01M I2)以避免单体中的硫-磷化学键断裂。序列或者探针合成后，按照DNA固相合成的切割、脱保护和纯化步骤(J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社(2002)，538-575)，得到所需要的序列或者探针。附图4为用3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酰胺单体合成寡核苷酸探针序列Cy3-GAXCATGA(其中X为3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷碱基)探针质谱图，其含量为96.7％的主峰与理论值2966.4相一致。
用0.1MI2室温处理探针Cy3-GAMCATGA序列20分钟，然后将处理和未处理的样本用30％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。附图5为其电泳分析结果：未做处理(I)和处理(II)的样本呈现出长度不同的染料条带，表明含3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯M的寡核苷酸序列探针用切割试剂处理后变成了2个片段，一个片段含有染料分子，在丙烯酰胺凝胶电泳分析中表现出染料条带，而另一个片段不含有染料分子，在丙烯酰胺凝胶电泳分析中不出现染料条带。
实施例3：杂交-连接荧光标记序列法测定包含人全基因组
1、按照实例2合成含有3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯的寡核苷酸测序探针(见下表，序列中M即为3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯，I为次黄嘌呤脱氧核苷(M和I均为通用碱基，与A、G、C、T均能形成互补)，N为混合核苷(即碱基A、G、C、T各含有25％的含量)，德克萨斯红(Texas Red)、花青素5(Cy5)、花青素3(Cy3)、异硫氰荧光素(FITC)为四种不同染料，分别标识探针距离3端第5个碱基位置的碱基A、G、C、T)。
| 探针名称 | 序列内容(5’-3’) |
| Probe 1 | 5′-FITC-IIMANNNN |
| Probe 2 | 5′-Texas Red-IIMGNNNN |
| Probe 3 | 5′-Cy3-IIMCNNNN |
| Probe 4 | 5′-Cy3-IIMTNNNN |
2、按照实施例4的方法制备人的全基因组测序模板。
3、将测序定位引物与人全基因组测序模板杂交，然后将4种寡核苷酸测序探针的化合物与人全基因组测序模板完成杂交-连接(Drmanac，R.et al.Reads on self-assembling DNAnanoarrays human genome sequencing using unchained base，Science，2009 327，78-81)，并在清除未连接的标记硫代核苷测序引物后，进行扫描分析，确定哪些位置的模板进行了哪些碱基的连接反应，从而确定基因组序列上第5个位置上碱基的序列。用0.2M碘溶液将连接引物中含有3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯碱基连同荧光分子一同切除。
4、重复3过程，每重复一次便增加一个碱基的序列测定，直到因每个碱基的延伸效率导致不能准确碱基序列为止，这样便可以知道位置5、10、15、20、...、等位置的碱基序列(Shendure，J.et al.Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome.Science，2005，309，1728-1732)。
5、停止上个引物的测序，将延伸上述测定若干个碱基序列的测序引物变性掉，并重新杂交3端比原来少一个碱基的测序定位引物，按照步骤3、4同样的操作可以测定4、9、14、19、...、等位置的碱基序列。
6、重复步骤3、4、5，便可以将未知DNA模板的序列确定。
实施例4：序列特异的DNA结合蛋白的非标记检测
1、探针与引物合成
根据待检测的DNA结合蛋白NF-kB的特异性结合序列，按照实例2合成含有3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯的寡核苷酸序列或者探针：
Probe：5’NH2-TTTTTAGTTGAGGGGANTTTCCCAACTAGG-Cy3-3’
Anti-probe：3’-TCAACTCCCCTCAAAGGGTTGATCCA-5’
其中Probe中N为3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯碱基(为能导入序列表，此处的M修改为N)。下划线部分为双链DNA与蛋白NF-kB的结合区域。
2、微阵列的制备
将合成的氨基标记的寡核苷酸探针Probe以80μM的浓度稀释到碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中，然后通过自动化芯片点样仪将稀释好的探针点在氨基硅烷化的基底上；其互补链Anti-probe则以50μM的浓度溶解到灭菌去离子蒸馏水中。点样结束后，将玻片置于潮湿的培养皿中于37℃下水化2小时。溶解好的Anti-probe与制备好的芯片与50℃避光杂交2小时。杂交结束后分别用2×SSC(0.3M NaCl，35mM柠檬酸钠，pH7.0)、0.2×SSC/0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)及去离子蒸馏水各洗涤5分钟，用氮气流吹干玻片。
3、待检测的NF-kB蛋白与芯片的杂交
杂交前，将制备好的DNA芯片分别与10％牛血清蛋白(BSA)/PBS(磷酸盐缓冲液)(0.01M pH7.4)在37℃下孵育1小时，封闭玻片表面可能与蛋白质进行非特异性结合的活性基团。然后分别用0.01M PBS/0.1％Tween-20(pH7.4)、0.01M PBS(pH7.4)和去离子蒸馏水洗涤一次，每次5分钟。将不同体积的rhNF-κB蛋白稀释到20μL的结合缓冲液(10mMHEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM苏糖醇(DTT)，0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.05％NP-40，10％丙三醇(Glycerol)和5％BSA)中，其终浓度分别为0ng/μL、3ng/μL、6ng/μL、12ng/μL。
稀释的蛋白质充分混匀后，分别加到芯片不同探针区域，然后在杂交液上盖上排斥硅烷处理过的盖玻片，最后用保鲜膜封住培养皿，置于室温下孵育1小时。杂交结束后，分别用0.01M pH7.4PBS/0.1％Tween-20、0.01M PBS(pH7.4)和去离子蒸馏水个洗涤一次，每次5分钟。然后用氮气流吹干。
4、切割反应
在杂交上不同浓度的NF-kB蛋白之后，立即用25mM的硝酸银在45℃下反应15分钟：在人工合成的NF-kB蛋白结合位点序列中引入一个碱基X的探针5’端标记一个能与芯片表面醛基结合的氨基基团，3’标记一个Cy3荧光基团，将该探针固定于芯片表面并与其互补序列杂交形成双链DNA芯片，如果该双链位点有NF-kB蛋白结合，由于空间位阻作用，切割反应无法进行，从而使该探针的3’荧光基团保留在芯片上，否则在没有蛋白质结合的情况下，则可以从X为点处将该探针切割断，从而将该探针的3’荧光基团从芯片上除去掉。保留在芯片上的荧光分子数与结合的蛋白质分指数成正比。
5、信号检测
将切割处理的芯片在95℃变性5min，除去由于没有NF-kB蛋白结合保护的X位点切割后的片段，然后在ScanArray芯片扫描仪上对杂交后芯片进行荧光信号检测。芯片在片延伸掺入的荧光信号通过芯片扫描仪
Lite(Packard Biochip Technologies)在Cy3波长下进行扫描，扫描条件为85％laser power，80％PMT gain，5μm分辨率。
6、标准曲线的建立
用已知浓度的DNA结合蛋白来建立不同浓度与荧光信号的标准曲线。
7、结果分析
根据与待测蛋白相对应的点的荧光信号的强弱，结合标准曲线，确定该蛋白质在待检测物中的含量。
序列表
<110> 东南大学
<120> 3'硫代-2'脱氧核糖-3'硝基吡咯亚磷酰胺单体及其合成方法和应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcaactcccc tcaaagggtt gatcca 26
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
tttttagttg agggganttt cccaactagg 30
Claims (1)
1.3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体的合成方法，其特征在于具体合成步骤为：
式2化合物的合成：将19.62mmol的3-硝基吡咯溶解于245mL乙腈中，在氮气气氛搅拌下加入27.5mmol的氢化钠，当反应液变成清晰时，加入式1化合物：1-氯-2-脱氧-3’,5’-二-O-甲苯酰基-α-D-呋喃核糖19.62mmol；将上述混合物搅拌1小时，过滤，固体物用乙腈洗涤，滤液蒸发至干，然后经硅胶柱色谱纯化，正己烷-丙酮作为洗提液，最后得到白色固体式2化合物；
式3化合物的合成：将12.92mmol的式2化合物放入溶解于甲醇的浓氨水溶液的压力容器中，55℃过夜，氨水和甲醇通过真空蒸发清除，固体物经硅胶柱色谱纯化分离，正己烷-丙酮作为洗提液，得到白色固体式3化合物3；
式4化合物的合成：5.80mmol的式3化合物和5.92mmol的氯化对甲氧基三苯甲烷一同溶解在12mL吡啶中，室温放置1小时，然后不断加入氯化对甲氧基三苯甲烷，直到反应完全，然后将反应液倒入水中，产物用乙醚萃取，并用水洗涤3次，硫酸钠干燥，并用硅胶柱色谱纯化分离，正己烷-丙酮作为洗提液，得到白色泡沫式4化合物4；
4.71mmol的式4化合物和65.5mmol的硫代苯甲酸铯，溶于16.35mL无水DMF中，加热到110℃反应5小时，反应完成后，溶剂真空脱出，用200毫升乙酸乙酯悬浮残余物，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，有机相用硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂得到浓缩物；2.67mmol硫代苯甲酸铯和0.77mmol的18-冠醚-6悬浮，在真空脱气、搅拌下溶于5毫升无水乙腈中，将浓缩物分批加入到上述乙腈溶液中搅拌反应2小时，产物冷着至室温后转移到分液漏斗中，用20mL体积比1:1的乙酸乙酯和水萃取，有机相用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂得到式5化合物；
3.04mmol式5化合物在搅拌，同时伴随氩气鼓泡的作用下加入到400毫升乙醇和18.7mL,187mmol的NaOH混合溶液中室温反应1小时，然后将800mL，1M KH2PO4加入到反应液，沉淀物通过过滤、蒸馏水洗涤，并经用P2O5干燥48小时，得到式6化合物；
1.28mmol的式6化合物溶解在40毫升四氢呋喃、30mL甲醇和10mL水的溶剂中，在氩气保护下用冰的盐和甲醇冷着液冷至-10℃，加入脱气的0.5M,10mL氢氧化钠溶液，在0℃下搅拌10分钟。反应产物经减压浓缩至5毫升，加200毫升乙酸乙酯，用10%碳酸钠水溶液萃取3次，有机相用硫酸钠干燥，过滤，真空干燥得到泡沫状固体，20毫升乙酸乙酯溶解上述泡沫状固体，并在搅拌下加入到250毫升正己烷中，放置于冷冻柜中冷至-78℃，沉淀物过滤分离，并在真空下干燥，得到式7化合物；反应式如下所示：
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| Bergstrom，D.E. et al..Synthesis，structure，and deoxyribonucleic acid sequencing with a universal nucleoside：1-(2’-Deoxy-β-D-rinbofuranosyl)-3-nitropyrrole.《J.Am.Chem.SOC.》.1995,第117卷(第4期),1201-1209. * |
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