CN102180926A - 3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺单体及其应用 - Google Patents
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Abstract
3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺单体及其应用,本发明化合物合成的寡核苷酸测序及其探针的硫-磷桥键在包括无机重金属离子(如银离子、汞离子等),非金属单质(溴、碘等)及其它氧化试剂作用下可以被断裂,这个特性可广泛应用于多种核酸检测方法,而这些检测方法可以在医药、医疗、农业生产以及生命科学研究等多个方面应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及到化学基团修饰的3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺,3’硫代-脱氧核糖次黄嘌呤亚磷酸酰胺分子可以用于固相核酸合成的单体原料,其固相合成寡核苷酸产物除了具有传统寡核苷酸的生物学性能外,还具有被化学切割的性能,可以用于核酸、蛋白质等生物大分子的检测。
技术背景
在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础,对生命科学至关重要。随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成,使人类步入了后基因时代,分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异,疾病发生、发展的规律,以及药物与生命体的相互作用将成为可能。在基础研究方面,研究疾病基因的遗传规律,克隆致病基因;在应用方面,直接寻找疾病的易感基因突变位点,可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。通过DNA序列信息的分析可以为理解生命的起源、疾病发生、以及个体化医疗等提供有用的相关核酸序列信息。
对DNA序列的分析包括位点(如单碱基多态性、甲基化、突变等),片段序列(如片段重复、缺失等)、全基因组序列分析和DNA蛋白质相互作用。针对这些不同的分析对象,目前已有各种不同的方法相应方法被广泛应用,而这些方法中有许多涉及到核酸需要被切割的手段。如在桥式PCR扩增中需要对一条链进行切除,以获得单链DNA模板用来进行核酸分析;在DNA与蛋白质的序列特异性识别和相互作用检测中,需要借助核酸片段是否能够切割来判断双链DNA是否与蛋白质发生了结合,从而达到非标记检测蛋白的目的;在基于标记荧光的高通量测序过程中,需要将每次测序中的标识荧光分子切除,以便顺利进行下一个位置碱基的序列测定等。要实现这些不同的切割的手段,目前需要针对核酸片段进行特殊的修饰,或者采用特定的酶切或者化学切割方法,这些方法中要么合成难度大,或者难于找到合适的切割试剂而给研究工作带来困难。
本发明制备的是3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺分子可以作为固相核酸合成的基本原料,通过广泛使用的核酸合成仪在合成的序列片段中很方便的引入3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷(或者称为入3’硫代肌苷)来实现核酸序列分析中切割方法的实现。由于引入的3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷具有次黄嘌呤脱氧核苷通用碱基的性能,能很好的和4种碱基配对(Martin.F.H.,et al.Nucleic Acids Research,1985,13,8927-8938;Ohtsuka,E.,et al.The Journal of Biological Chemistry,1985,260,2605-2608;Kawase.Y.,et al.NucleicAcids Research,1986,14,7727-7736)。因此在任何位置均能满足与四个碱基的杂交效果、准确性(Stephen C.,et al.Nucleic Acids Research,1994,22,131-136),能够在核酸分析中得到广泛的应用。
发明内容
技术问题:本发明的目的是提供为新的核酸序列分析技术所能利用的试剂,为新核酸序列分析技术的低成本、高速度和高通量奠定基础。
技术方案:本发明以3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺单体为基本原料,并用该基本原料合成寡核苷酸序列及其探针用于核酸新测序技术以及相关技术领域,所述3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺单体,结构为:
该分子由次黄嘌呤碱基基团、3’硫代脱氧核糖基团和亚磷酸基团构成,亚磷酸基团中连接R1和R2基团构成亚磷酸酰胺基团,脱氧核糖基团的5’羟基位置上连接着基团R3;
上述3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺单体在核酸固相合成中的应用。
制备的是3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺3化合物,该分子由次黄嘌呤基团、3′硫代脱氧核糖基团和亚磷酸酰胺基团构成。该化合物分子是核酸固相合成的单体原料,在核酸固相合成的寡核苷酸片段中可以由它引入一个或者多个硫-磷桥键,该化合物分子及其包含由该化合物分子合成的寡核苷酸中的硫-磷桥键可以在包括无机重金属离子(如银离子、汞离子等),非金属单质(溴、碘等)及其它氧化试剂的作用下可以被断裂。3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺化合物分子作为原料合成的寡核苷酸序列及其探针可以用于核酸检测技术相关领域。
以下三类取代基修饰的3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺是本发明的优选化合物:
结构为:
有益效果:本发明与现有技术相比,具有如下优点:
1、本发明的最大优点是作为核酸固相合成的基本原料可以很方便地在寡核苷酸片段中引入一个或者多个硫-磷桥键,合成新型的寡核苷酸序列及其探针。
2、本发明化合物合成的寡核苷酸测序及其探针的硫-磷桥键在包括无机重金属离子(如银离子、汞离子等),非金属单质(溴、碘等)及其它氧化试剂作用下可以被断裂,这个特性可广泛应用于多种核酸检测方法,而这些检测方法可以在医药、医疗、农业生产以及生命科学研究等多个方面应用。
附图说明
图1为3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺分子合成路线;
图2为合成的3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺的色谱分析图,保留时间16.907,17.817分钟的物质为该分子的立体异构体;
图3为3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺质谱图:(A)图2中保留时间16.907分钟物质的质谱;(B)图2中保留时间17.817分钟物质的质谱;
图4为固相合成含3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷探针Cy3-GAXCATGA序列质谱图,其含量为96.7%的主峰与探针摩尔质量理论值2966.4相一致;
图5为固相合成含3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺序列Cy3-GAXCATGA探针(I)和探针被切割试剂处理(II)的聚丙烯酰胺凝胶电泳图,(III)为指示剂二甲基苯氰和溴芬兰的条带。
具体实施方式
实施例1:优选化合物HCW-1的化学合成
参见附图1
次黄嘌呤脱氧核苷,即化合物a(2.52g,10.0mmol)在无水吡啶溶剂中与氯化对甲氧基三苯甲烷在氮气保护下,室温反应过夜(大于12小时),得到5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-次黄嘌呤脱氧核苷,即化合物b,产率87%(Ti,G.S.;Gaffney,B.L.;Jones,R.A.J.Am.Chem.Soc.1982,104,13161319.)。
化合物b(3.61g,6.5mmol)和硫代苯甲酸铯(17.7g,65.5mmol),溶于无水二甲DMF(16.35ml)中,加热到110℃反应5小时。反应完成后,溶剂真空脱出,用200毫升乙酸乙酯悬浮残余物,并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次(每次100毫升),有机相用硫酸镁干燥,并在减压下蒸发溶剂得到浓缩物(1)。硫代苯甲酸铯(750mg,2.67mmol)和18-冠醚-6(200mg,0.77mmol)悬浮,在真空脱气、搅拌下溶于5毫升无水乙腈中。将浓缩物(1)分批迅速加入到上述乙腈溶液中搅拌反应2小时,产物冷着至室温后转移到分液漏斗中,用20ml乙酸乙酯和水(体积比1∶1)萃取,有机相用硫酸钠干燥,过虑,并在减压下蒸发溶剂得到5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’苯甲酰-硫代-次黄嘌呤脱氧核苷,即化合物c,产率69%。
化合物c(2.37g,3.5mmol)在搅拌,同时伴随氩气鼓泡的作用下加入到乙醇(500毫升)和NaOH(21.7ml,217mmol)混合溶液中室温反应1小时,然后将1M KH2PO4(900ml)缓慢加入到反应液(15分钟加完),沉淀物通过过虑、蒸馏水洗涤(3×200ml),并经用P2O5干燥48小时,得到5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’巯基-次黄嘌呤脱氧核苷,即化合物d,产率81%。
化合物d(1.4g,2.45mmol)溶解在四氢呋喃(50毫升)、甲醇(40ml)和水(10ml)的溶剂中,在氩气保护下用冰的盐和甲醇冷着液冷至-10℃。加入脱气的氢氧化钠溶液(0.5M,10ml),在0℃下搅拌10分钟。反应产物经减压浓缩至5毫升,加250毫升乙酸乙酯,用10%碳酸钠水溶液(冰冷)萃取2次,有机相用硫化钠干燥,过虑,真空干燥得到泡沫状固体。20毫升乙酸乙酯溶解上述泡沫状固体,并在搅拌下加入到250毫升正己烷中,放置于冷冻柜中冷着至-78℃,沉淀物过虑分离,并在真空下干燥,得到纯度大约95%的3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺分子,即化合物e,产率为70%。
合成的次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺分子分子具有立体异构体,其质谱结果表明这两个同分异构体化合物的质谱均为770.2,与理论值相符(参见图2和图3)。
实施例2:含3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷寡核苷酸序列的合成及其切割性能
将3’硫代-脱氧次黄嘌呤核苷亚磷酸酰胺按照0.1M浓度用无水乙腈(水含量小于0.003%)均匀溶解,然后在DNA自动合成仪上按照编辑的序列或者探针自动合成(文献)。在3’硫代-脱氧次黄嘌呤核苷单体的合成过程中,需要使用低浓度的氧化剂(0.01M碘氧化剂)以避免单体中的硫-磷化学键断裂。序列或者探针合成后,按照DNA固相合成的切割、脱保护和纯化步骤(J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(第二版),科学出版社(2002),538-575),得到所需要的序列或者探针。附图4为用3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺单体合成寡核苷酸探针序列Cy3-GAXCATGA(其中X为3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷碱基)探针质谱图,其含量为96.7%的主峰与理论值2966.4相一致。
用0.1MI2常温处理探针Cy3-GAXCATGA序列20分钟,然后将处理和未处理的样本用30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。附图5为其电泳分析结果:未做处理(I)和处理(II)的样本呈现出长度不同的染料条带,表明含3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷碱基X的寡核苷酸序列探针用切割试剂处理后变成了2个片段,一个片段含有染料分子,在丙烯酰胺凝胶电泳分析中表现出染料条带,而另一个片段不含有染料分子,在丙烯酰胺凝胶电泳分析中不出现染料条带。
实施例3:桥式PCR制备高通量DNA分析模板
1、按照实例2合成含有3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷的扩增引物1(其中X为有3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷),及其它扩增引物与连接子(见下列表)。
合成引物 | 序列 |
扩增引物1 | 5’-Bio-AAXCTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT |
扩增引物2 | 5’-Bio-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT |
连接子1 | 5’-PO4 3--AACCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT |
连接子1互补 | 3’-TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA |
连接子2 | 5’-PO4 3--AACTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT |
连接子2互补 | 3’-TTGACGGGGCCCAAGGAGTAAGAGA |
2、将扩增引物1和扩增引物2固定在亲和素修饰的玻璃片上
3、将扩增基因组用酶切割(或者超声破碎)成大小为50-1000碱基的片断,并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子(连接子1与连接子1互补,连接子2与连接子2互补)在T4连接酶的作用下,与片段化的双链DNA进行37℃连接反应4小时,琼脂糖凝胶电泳连接产物,取其100-500bp片段用做PCR模板,舍弃未连接的通用连接子和过长片段的双链DNA(Williams,R.et al.Amplification of complex genelibraries by emulsion PCR.Nature Methods,2006,3(7),545-550)。
4、将固定扩增引物1和扩增引物2玻璃片构成一个反应框,并将选取的连接通用连接子的DNA模板和PCR反应体系泵入反应框中,完成一次延伸反应:94℃起始变性5分钟,94℃变性30秒~55℃退火45秒~72℃延伸45秒,最后72℃再延伸7分钟。
5、在0.1M氢氧化钠变性条件下,将步骤4中未固定在玻璃片上的物质(包括DNA模板及其反应体系中的溶液)排除,并用无菌蒸馏水洗涤干净。重新加入PCR反应体系,以固定的扩增引物和步骤4产生的扩增引物延伸链为DNA模板,进行固相扩增:94℃起始变性5分钟,45个热循环:94℃变性30秒~55℃退火45秒~72℃延伸45秒,最后72℃再延伸7分钟。
6、将将步骤6中未固定在玻璃片上的物质(即反应体系中的溶液)排除,并用无菌蒸馏水洗涤干净。加入50毫摩尔的硝酸银溶液在50℃下反应15分钟,扩增引物1及其扩增引物1的扩增产物均被切除,并用无菌蒸馏水洗涤后,即得到可用于核酸分析的高通量DNA单链模板。
实施例4:杂交-连接荧光标记序列法测定包含人全基因组
1、按照实例2合成含有3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷的寡核苷酸测序探针(见下表,序列中X即为3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷,I为次黄嘌呤脱氧核苷(X和I均为通用碱基,与A、G、C、T均能形成互补),N为混合核苷(即碱基A、G、C、T各含有25%的含量),德克萨斯红(Texas Red)、花青素5(Cy5)、花青素3(Cy3)、异硫氰荧光素(FITC)为四种不同染料,分别标识探针距离3端第5个碱基位置的碱基A、G、C、T)。
探针名称 | 序列内容(5’-3’) |
Probe 1 | 5′-FITC-IIXANNNN |
Probe 2 | 5′-Texas Red-IIXGNNNN |
Probe 3 | 5′-Cy3-IIXCNNNN |
Probe 4 | 5′-Cy3-IIXTNNNN |
2、按照实施例4的方法制备人的全基因组测序模板。
3、将测序定位引物与人全基因组测序模板杂交,然后将4种寡核苷酸测序探针的化合物与人全基因组测序模板完成杂交-连接(Drmanac,R.et al.Reads on self-assemblingDNA nanoarrays human genome sequencing using unchained base,Science,2009 327,78-81),并在清除未连接的标记硫代核苷测序引物后,进行扫描分析,确定哪些位置的模板进行了哪些碱基的连接反应,从而确定基因组序列上第5个位置上碱基的序列。用0.2M碘溶液将连接引物中含有3’硫代-脱氧次黄嘌呤核苷碱基连同荧光分子一同切除。
4、重复3过程,每重复一次便增加一个碱基的序列测定,直到因每个碱基的延伸效率导致不能准确碱基序列为止,这样便可以知道位置5、10、15、20、...、等位置的碱基序列(Shendure,J.et al.Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome.Science,2005,309,1728-1732)。
5、停止上个引物的测序,将延伸上述测定若干个碱基序列的测序引物变性掉,并重新杂交3端比原来少一个碱基的测序定位引物,按照步骤3、4同样的操作可以测定4、9、14、19、...、等位置的碱基序列。
6、重复步骤3、4、5,便可以将未知DNA模板的序列确定。实施例5:序列特异的DNA结合蛋白的非标记检测
1、探针与引物合成
根据待检测的DNA结合蛋白NF-kB的特异性结合序列,按照实例2合成含有3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷的寡核苷酸序列或者探针:
Probe:5’NH2-TTTTTAGTTGAGGGGAXTTTCCCAACTAGG-Cy3-3’
Anti-probe:3’-TCAACTCCCCTCAAAGGGTTGATCCA-5’
其中Probe中X为3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷碱基。下划线部分为双链DNA与蛋白NF-kB的结合区域。
2、微阵列的制备
将合成的氨基标记的寡核苷酸探针Probe以80μM的浓度稀释到碳酸盐缓冲液(pH9.0)中,然后通过自动化芯片点样仪将稀释好的探针点在氨基硅烷化的基底上;其互补链Anti-probe则以50μM的浓度溶解到灭菌去离子蒸馏水中。点样结束后,将玻片置于潮湿的培养皿中于37℃下水化2小时。溶解好的Anti-probe与制备好的芯片与50℃避光杂交2小时。杂交结束后分别用2×SSC、0.2×SSC/0.5%SDS及去离子蒸馏水各洗涤5分钟,用氮气流吹干玻片。
3、待检测的NF-kB蛋白与芯片的杂交
杂交前,将制备好的DNA芯片分别与10%BSA/PBS(0.01M pH7.4)在37℃下孵育1小时,封闭玻片表面可能与蛋白质进行非特异性结合的活性基团。然后分别用0.01MpH7.4PBS/0.1%Tween-20、0.01M PBS(pH7.4)和去离子蒸馏水洗涤一次,每次5分钟。将不同体积的rhNF-κB蛋白稀释到20μl的结合缓冲液(10mM HEPES pH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol and 5%BSA)中,其终浓度分别为0ng/μl、3ng/μl、6ng/μl、12ng/μl。
稀释的蛋白质充分混匀后,分别加到芯片不同探针区域,然后在杂交液上盖上排斥硅烷处理过的盖玻片,最后用保鲜膜封住培养皿,置于室温下孵育1小时。杂交结束后,分别用0.01M pH7.4PBS/0.1%Tween-20、0.01M PBS(pH7.4)和去离子蒸馏水个洗涤一次,每次5分钟。然后用氮气流吹干。
4、切割反应
在杂交上不同浓度的NF-kB蛋白之后,立即用25mM的硝酸银在45℃下反应15分钟:在人工合成的NF-kB蛋白结合位点序列中引入一个碱基X的探针5’端标记一个能与芯片表面醛基结合的氨基基团,3’标记一个Cy3荧光基团,将该探针固定于芯片表面并与其互补序列杂交形成双链DNA芯片,如果该双链位点有NF-kB蛋白结合,由于空间位阻作用,切割反应无法进行,从而使该探针的3’荧光基团保留在芯片上,否则在没有蛋白质结合的情况下,则可以从X为点处将该探针切割断,从而将该探针的3’荧光基团从芯片上除去掉。保留在芯片上的荧光分子数与结合的蛋白质分指数成正比。
5、信号检测
将切割处理的芯片在95℃变性5min,除去由于没有NF-kB蛋白结合保护的X位点切割后的片段,然后在ScanArray芯片扫描仪上对杂交后芯片进行荧光信号检测。芯片在片延伸掺入的荧光信号通过芯片扫描仪Lite(Packard BiochipTechnologies)在Cy3波长下进行扫描,扫描条件为85%laser power,80%PMT gain,5μm分辨率。
6、标准曲线的建立
用已知浓度的DNA结合蛋白来建立不同浓度与荧光信号的标准曲线。
7、结果分析
根据与待测蛋白相对应的点的荧光信号的强弱,结合标准曲线,确定该蛋白质在待检测物中的含量。
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110914 |