KR100695123B1 - Ｔｍ에 따라 기판상에 고정화된 프로브 폴리뉴클레오티드군을 2이상 포함하는 폴리뉴클레오티드 어레이 및 그를이용하는 표적 핵산 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 Tm이 동일한 범위에 속하는 프로브 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 스팟의 군을 2이상 포함하는 폴리뉴클레오티드 어레이 및 그를 이용한 표적 핵산의 검출 방법을 제공한다.
폴리뉴클레오티드, 마이크로어레이, 혼성화 온도, 변성제
Description
도 1은 2 블록으로 이루어진 본 발명의 폴리뉴클레오티드 어레이의 일 형태를 도식적으로 나타낸 것이다.
본 발명은 Tm에 따라 고정화된 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드 어레이 및 이를 이용한 표적 핵산 검출방법에 관한 것이다.
종래 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있다. 또한, 상기 마이크로어레이의 제조방법에는 일반적으로 포토리소그래피를 이용하는 방법이 알려져 있다. 포토리소그래피를 이용하는 경우, 제거가능한 기로 보호된 단량체가 도포된 기판 표면 상의 일정한 영역을 에너지 원에 노출시켜 보호기를 제거하 고, 제거가능한 기로 보호된 단량체를 커플링시키는 단계를 반복함으로써, 폴리뉴클레오티드의 어레이를 제조할 수 있다. 이 경우, 폴리뉴클레오티드 어레이 상에 고정화되는 폴리뉴클레오티드는 단량체를 하나씩 연장시키는 방식으로 합성하거나, 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 일정한 위치에 고정화시키는 방법(스팟팅(spotting) 법이라고도 한다)에 의하여 고정화될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 어레이의 제조방법은 예를 들면, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오티드 어레이 및 그의 제조방법에 관한 상기 문헌은 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어진다.
그러나, 이러한 종래의 폴리뉴클레오티드 어레이에는 프로브 폴리뉴클레오티드가 무작위적으로 고정화되어 있다. 또한, 하나의 어레이는 하나의 혼성화 용액 주입구와 배출구가 구비된 덮개로 덮여 있어, 단일의 혼성화 반응만이 이루어질 수 있도록 구획되어 있었다. 따라서, 종래에는 Tm에 따라 프로브 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 있고, 다수의 블록을 포함하는 폴리뉴클레오티드 어레이는 개시되어 있지 않았다.
종래 표적 핵산을 검출하는 방법에는 다양한 방법이 알려져 있었다. 상기 검출 방법은 통상 표적 핵산을 검출가능한 표지로서 표지하고, 폴리뉴클레오티드 어레이 상의 프로브 폴리뉴클레오티드와 혼성화한 다음, 혼성화 결과를 분석하는 과정으로 이루어진다. 예를 들면, 미국특허 제5,871,928호에는 표적 폴리뉴클레오티드에 표지를 부착하는 단계; 상기 표지된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 기판의 알 려진 위치에 부착되어 있는 폴리뉴클레오티드 프로브의 집합체(collection)와 혼성화 조건하에서 접촉하는 단계 및 상기 표적과 혼성화하는 상기 프로브의 서열을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 프로브 집합체는 100 이상의 프로브/cm2을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와의 혼성화를 검출하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 종래의 표적 핵산 검출 방법은 폴리뉴클레오티드 프로브가 어레이 상에 고정화되어 있는 집합체를 사용하였으며, 표적 폴리뉴클레오티드와의 Tm에 따라 구분하여 고정화되어 있는 폴리뉴클레오티드 프로브의 블록을 이용하는 방법은 개시되어 있지 않았다.
따라서, 본 발명은 프로브 폴리뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드와의 Tm에 따라 구분되어 기판 상에 고정화되어 있는 폴리뉴클레오티드 어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 어레이를 이용하고, 각 프로브 폴리뉴클레오티드 블록에 따라 혼성화 용액을 달리하여 혼성화시키는 표적 핵산 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 Tm이 동일한 범위에 속하는 프로브 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 스팟의 군(이하 블록이라고도 한다)을 2이상 포함하는 폴리뉴클레오티드 어레이를 제공한다.
본 발명에 있어서, "폴리뉴클레오티드 어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 군이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 군은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있다. 또한, 상기 마이크로어레이의 제조방법에는 일반적으로 포토리소그래피를 이용하는 방법이 알려져 있다. 포토리소그래피를 이용하는 경우, 제거가능한 기로 보호된 단량체가 도포된 기판 표면 상의 일정한 영역을 에너지 원에 노출시켜 보호기를 제거하고, 제거가능한 기로 보호된 단량체를 커플링시키는 단계를 반복함으로써, 폴리뉴클레오티드의 어레이를 제조할 수 있다. 이 경우, 폴리뉴클레오티드 어레이 상에 고정화되는 폴리뉴클레오티드는 단량체를 하나씩 연장시키는 방식으로 합성하거나, 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 일정한 위치에 고정화시키는 방법(스팟팅(spotting) 법이라고도 한다)에 의하여 고정화될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 어레이의 제조방법은 예를 들면, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오티드 어레이 및 그의 제조방법에 관한 상기 문헌은 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어진다. 그러나, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 어레이 및 그의 제조방법이 이들 예들에 한정되는 것은 아니다. 본원 발명에 있어서, "스팟"이란 기판 상에 동일한 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 있는 일정한 영역을 말한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 어레이는 예를 들면, 먼저 표적 폴리뉴클레오티드를 선정하고, 그와 그를 프로브하기 위한 프로브 폴리뉴클레오티드간의 Tm을 계산한다. 그 결과, 얻어진 Tm 분포를 바탕으로 일정한 범위에 속하는 폴리뉴클레오티드의 군으로 나눈다. 예를 들면, 특정한 표적 폴리뉴클레오티드와 복수의 프로브 폴리뉴클레오티드 간의 Tm이 30 ℃ 내지 60 ℃의 범위에서 존재할 수 있으며, 이 경우 예를 들면, Tm 30 ℃ 내지 40 ℃, 40 ℃ 내지 50 ℃, 및 50 ℃ 내지 60 ℃의 3개의 군으로 나눌 수 있다. 다음으로, 상기와 같이 분류된 각 군의 프로브 폴리뉴클레오티드를 상기한 바와 같은 통상적인 고체 기판상의 폴리뉴클레오티드 합성 방법에 따라, 동일한 영역 내에 고정화한다. 다음으로, 각각 동일한 영역 내에 고정화된 프로브 폴리뉴클레오티드의 군은 각각 독립적으로 혼성화 용액에 노출될 수 있도록, 혼성화 용액 주입구와 배출구가 구비된 덮개에 의하여 폐쇄될 수 있다. 그 결과, 각 프로브 폴리뉴클레오티드 군이 고정화된 영역은 독립적인 혼성화 용액에 노출될 수 있는 구획(compartment)을 형성한다.
본 발명에 있어서, "Tm (용융 온도: melting temperature)"이란 혼성화 조건 또는 변성 조건하에서 용액 중의 이중가닥 폴리뉴클레오티드 중 반이 2 종의 단일가닥으로 변성되는 온도 또는 2종의 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 반이 혼성화되는 온도를 의미한다. Tm은 사용되는 용액, 뉴클레오티드 서열의 염기 조성, 길이, 변성제 및 안정화제의 농도 등에 따라 달라 수 있다. 이러한 Tm은 결정은 실험적으로 결정될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 Tm에 미치는 인자를 반영하는 관계식에 의하여 계산되어질 수 있다. 예를 들면, 상기 Tm은 하기와 같은 관계식에 의하여 계산되어 질 수 있다.
Tm = 81.5 + 16.6x log10 M + 0.41 (%GC) - 0.61 (%포름아미드) - 500/길이(bp)
식중 M = mM로 표시한 Na+의 몰농도, % 포름아미드 : % (v/v)이다 (Meinkoth, J. and Wahl, G. : (1984) Anal. Biochem. 138, 269 참조).
상기와 같은 Tm 관계식은 용액에 포함된 변성제 또는 안정화제에 따라 선택하여 사용할 수 있으며, 이러한 Tm 관계식은 당업자라면 용이하게 알 수 있다.
이렇게 제조된 폴리뉴클레오티드 어레이는, 민감도와 속도가 개선된 표적 핵산의 검출방법에 이용될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 검출하는 과정에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 어레이 상의 각 프로브 폴리뉴클레오티드 군에 대하여 사용되어지는 혼성화 용액 중에는 각각 다른 농도의 변성제(denaturation agent)를 포함하게 함으로써, 높은 Tm을 갖는 군의 Tm을 가장 낮은 Tm과 유사하도록 조절할 수 있다. 이렇게 함으로써, 하나의 어레이 상에서 동일한 온도에서 혼성화될 수 있는 프로브 폴리뉴클레오티드를 더 많이 고정화할 수 있다. 그 결과, 하나의 어레이를 사용하여 검출할 수 있는 표적 핵산의 수가 증가하며, 하나의 어레이를 사용할 수 있으므로 빠른 속도로 분석할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 어레이 중의 상기 스팟 군에 고정화되어 있는 프로브 폴리뉴클레오티드에 시료를 첨가하고 혼성화하는 단계를 포함하고, 1이상의 상기 스팟 군에 대하여 변성제, 안정화제 및 그의 조합으로부터 구성되는 화합물을 포함하는 혼성화 용액을 사용하여 각 스팟 군에 고정화되어 있는 프로브 폴리뉴클레오티드와 표적 폴리뉴클레오티드와의 Tm이 유사하도록 하는 것을 특징으로 하는, 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 혼성화 반응의 결과를 형광을 측정함으로써 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 표적 핵산은 다양한 검출가능한 기로 표지되어질 수 있다. 상기 표지에는 예를 들면, 방사능 물질, 형광, 효소 및 리간드가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 표적 핵산은 형광 표지된 것이다.
본 발명에서 사용되는 상기 변성제는, 이중가닥 폴리뉴클레티드를 불안정하게 하게 하는 물질로서, 특별하게 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 변성제는, 핵산 염기들 간의 수소 결합을 불활성화시킬 수 있는 자유전자를 갖는 부분을 포함하는 화합물이다. 상기 변성제는 예를 들면, 포름아미드, 요소, 구아니딘 클로라이드, DMF 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 상기 안정화제는, 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 안정화시켜 주는 화합물로서, 특별하게 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드는 음이온을 띠고 있기 때문에 양전하를 띠는 화합물이 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 안정화시키는 것으로 알려져 있다. 상기 안정화제는 바람직하게는, Na+, K+, Ca2+ 및 Mg2+와 같은 양이온을 포함하는 금속 염이다.
본 발명에 있어서, 첨가되는 변성제 또는 안정화제의 농도는 실험을 통하여 경험적으로 결정하여 첨가하거나, 상기한 Tm 관계식으로부터 각 폴리뉴클레오티드 블록이 유사한 Tm을 갖도록 설정한 다음, 계산에 의하여 계산할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 혼성화의 온도는 소망하는 특이성과 민감도에 따라 달라질 수 있다. 상기 혼성화는 Tm 보다 20 ℃ 내지 25 ℃ 더 낮은 온도에서 수행될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : Tm에 따라 분리된 스팟 군을 갖는 폴리뉴클레오티드 어레이의 제조
본 실시예에서는 청년기발병 당뇨병 3(MODY 3)과 관련된 HNF-1α (hepatocyte nuclear factor-1a) 정상형 유전자의 프로모터와 엑손 1-10 영역을 표적 폴리뉴클레오티드로 사용하였다. 상기 10개의 표적 폴리뉴클레오티드는 10 쌍의 프라이머 쌍(서열번호 1 내지 20)을 프라이머 (각각 10 pmol)(표 1 참조)로 하고, 인간 혈액으로부터 분리한 gDNA를 주형 (0.2 ㎍)으로 한 다중 PCR을 수행하여 얻었다. 다중 PCR은 초기 변성; 95℃에서 5분; 변성 95℃에서 30초, 어닐링 64℃에서 10초, 및 연장 72℃에서 30초를 30회 반복하고, 최종 연장 72℃에서 3분 반응하여 수행하였다．상기 표적 핵산의 PCR 과정에서 Cy3-dUTP (Amersham Biosciences, Uppsala, 스웨덴)를 첨가하므로써, 형광염료가 표지된 표적 핵산을 준비하였다.
표 1. HNF-1α 유전자로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭에 사용된 프라이머
| 프라이머 | 서열 | 프라이머 | 서열 |
| 프로모터_포워드 | 서열번호 1 | 엑손5_포워드 | 서열번호 11 |
| 프로모터_리버스 | 서열번호 2 | 엑손5_리버스 | 서열번호 12 |
| 엑손1_포워드 | 서열번호 3 | 엑손6_포워드 | 서열번호 13 |
| 엑손1_리버스 | 서열번호 4 | 엑손6_리버스 | 서열번호 14 |
| 엑손2_포워드 | 서열번호 5 | 엑손7_포워드 | 서열번호 15 |
| 엑손2_리버스 | 서열번호 6 | 엑손7_리버스 | 서열번호 16 |
| 엑손3_포워드 | 서열번호 7 | 엑손8,9_포워드 | 서열번호 17 |
| 엑손3_리버스 | 서열번호 8 | 엑손8,9_리버스 | 서열번호 18 |
| 엑손4_포워드 | 서열번호 9 | 엑손10_포워드 | 서열번호 19 |
| 엑손4_리버스 | 서열번호 10 | 엑손10_리버스 | 서열번호 20 |
이러한 표적 폴리뉴클레오티드에 대하여 완전 매치(perfect match) 및 불완전 매치(mismatch)되는 프로브 폴리뉴클레오티드를 설계하였다. 이러한 프로브 폴리뉴클레오티드의 특성을 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 이들 프로브 폴리뉴클레오티드는 Tm이 52.8 ℃ 내지 56.9 ℃의 범위에 속하는 프로브 폴리뉴클레오티드 군과 69.4 ℃ 내지 77.8 ℃의 범위에 속하는 군의 2개의 군으로 분류하고 이들을 각각 블록 1과 2에 고정화하였다 (도 1 참조).
표 2. 프로브 폴리뉴클레오티드의 서열 및 특성
| 블록 | 표적부위 | 완전 매치 프로브(WP) | 불완전 매치(MP) | Tm(℃) |
| 1 | 엑손 1 | 서열번호 21 | 서열번호 22 | 55.51 |
| 1 | 엑손 2 | 서열번호 23 | 서열번호 24 | 54.3 |
| 1 | 엑손 7 | 서열번호 25 | 서열번호 26 | 52.8 |
| 1 | 엑손 9 | 서열번호 27 | 서열번호 28 | 56.9 |
| 1 | 엑손 10 | 서열번호 29 | 서열번호 30 | 53.4 |
| 2 | 엑손 1 | 서열번호 31 | 서열번호 32 | 77.8 |
| 2 | 엑손 2 | 서열번호 33 | 서열번호 34 | 71.2 |
| 2 | 엑손 4 | 서열번호 35 | 서열번호 36 | 71.0 |
| 2 | 엑손 4 | 서열번호 37 | 서열번호 38 | 69.4 |
| 2 | 엑손 9 | 서열번호 39 | 서열번호 40 | 75.7 |
표 2에 계산된 프로브 폴리뉴클레오티드의 Tm 값은 싼타루치아 98 파라미터를 이용하여 PERL 언어를 사용하여 만든 프로그램(자체 제작)을 사용하여 계산하였 다. 이러한 파라미터는 당업자라면 용이하게 알 수 있다.
본 발명에서 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체(히드로겔)를 이용한 스폿팅 방법을 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이를 제작하였다. 구체적인 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제작과정은 다음과 같았다.
1. 에폭시기를 갖는 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체의 합성
NaOH 수용액(50 wt%, 2mL)에 에피클로로하이드린(7.5 mL)과 테트라부틸암모늄 브로마이드(tetrabutylammonium bromide,0.32g)을 첨가하여 교반한 다음, 펜타에리쓰리톨 에톡실레이트(pentaerythritol ethoxylate, 1g)을 천천히 가하고 상온에서 18시간 교반하였다. TLC(thin layer chromatography)로 반응의 종결을 확인하였는데, 반응이 종결되지 않은 경우 60℃에서 1시간 동안 더 교반하였다. 그런 다음, 물(30 mL)을 가하여 희석한 후, 메틸렌 클로라이드(40 mL)로 세 번 추출하였다. 유기용액 층을 다시 포화 NaHCO3(40 mL)로 세 번 세척하고 분리하여, 무수 MgSO4를 첨가하고 건조시킨후 저압에서 용매를 제거하였다. 이어, 진공에서 이틀간 건조시키므로써 에피클로로하이드린의 잔여물을 제거하였다. 이렇게 하여 합성된 에폭시기를 갖는 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체는 H NMR과 0.1N HBr/초산(glacial)을 이용하는 에폭시기의 적정으로 확인하였다.
2. 디아민 가교제의 합성
DMF (40 mL) 용액에 펜타(에틸렌글리콜)디-토실레이트(5g, 9.2 mmol)을 용해시키고, NaN3 (4.2g, 64.1 mmol)와 피리딘(0.5 mL)을 순차적으로 첨가한 다음, 140 ℃에서 18시간 동안 교반하였다. 저압에서 용매를 제거하고, 물 (200 mL)을 가하면서 교반한 후, 메틸렌 클로라이드(100 mL)를 가하여 추출하고, 유기용매 층을 브린 (brine,100 mL)으로 3회 세척하였다. 무수 MgSO4를 첨가하여 건조시키고, 저압에서 용매를 제거하여 컬럼 크로마토그래피 (flash column chromatography, EA:nHex = 1:2)하므로써 디아지드 중간체를 얻었다. 이 중간체를 메탄올(30 mL)에 용해시키고, 10% Pd-C (0.1 당량)을 첨가한 후, 수소 가스를 이용하여 18 시간 동안 환원반응을 진행시켰다. 셀라이트 패드(Celite pad)를 이용하여 촉매를 제거하고 패드는 에탄올로 세척하였다. 여액과 에탄올 세척액을 혼합하고 저압에서 용매를 제거하여, 디아민 가교제를 얻었다.
3. 가교제를 이용한 젤 매트릭스 용액의 제조
분자량이 1500인 PEG를 각각 2N NaOH가 있는 수용액에 넣고, 빙조에서 교반하여 PEG 가교제 용액을 준비하였다.
그런 다음, 실시예1에서 합성한 에폭시기를 갖는 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체를 카보네이트 완충용액(0.1 M, pH 9.1)에 용해시킨 후, 상기에서 준비한 PEG 가교제 용액을 천천히 주입하고, 3 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 종결됨을 확인한 후, 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)로 추출하고 저압에서 용매를 제거하여 4℃에서 보관하였다.
4. 칩 위에 젤 매트릭스-DNA 접합체 용액의 스폿팅을 통한 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조
에폭시기를 갖는 방사형 폴리에틸렌글리콜, 가교제, 그리고 프로브 폴리뉴클레오티드의 당량비가 4:1:4로 되도록 폴리뉴클레오티드 프로브를 상기 3에서 제조한 젤 매트릭스 용액에 첨가하고, 교반하여 37℃에서 14 시간 동안 방치함으로써 매트릭스-DNA 접합체를 제조한 다음, 이를 스폿팅 용액으로 하였다.
상기 스폿팅 용액을 아민기를 갖도록 표면처리된 유리 표면 위에 스폿팅한 후, 4 시간 동안 37℃의 습한 챔버(wet chamber)에서 방치하였다. 이어, 배경 노이즈의 제어(background control)에 필요한 공정, 즉 표적 핵산이 유리 표면에 부착하지 않도록 하기 위해 스폿팅되지 않은 위치의 유리 표면 아민기가 음전하를 띄도록 반응을 실행하고 건조기에 보관하였다.
대조군 폴리뉴크레오티드 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드를 Tm에 따른 구분없이 기판 상에 고정화하여 동일한 혼성화 조건에서 반응할 수 있도록 하였다.
실시예 2: 혼성화 반응 및 표적 폴리뉴클레오티드의 검출
표적 폴리뉴클레오티드는 실시예 1에서 PCR 증폭된 HNF-1α(hepatocyte nuclear factor-1) 정상인(wild type) 유전자 중의 10개 영역 서열의 혼합물을 사용하였다.
먼저, 실시예 1에서 제조된 2 블록 폴리뉴클레오티드 어레이 중의 제1 블록에는 포름아미드가 첨가되지 않은 혼성화 용액을 사용하고, 제2 블록에는 7.5%의 포름아미드가 첨가된 혼성화 용액을 사용하여 동안 혼성화 반응을 수행하였다.
실시예 1에서 얻어진 다중 PCR 산물을 1.8% 아가로스 젤 전기영동 상에서 분 자량 마커를 기준으로 하여 확인하였다. 다중 PCR을 통해 10 가지 해당 유전자 부위 (579, 459, 365, 308, 332，241，286，230, 414 및 171 bp)가 모두 증폭된 것을 확인하였다. 상기 PCR 산물을 PCR 산물 정제 키트(Qiagen 사)를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 0.5 U DNase I (Boehringer Mannheim, 독일)로 37 ℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 반응정지액(stop mix)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 절단된 DNA 산물을 150 내지 187.5 nM 농도로 조정하고, 94 ℃에서 5 분 동안 변성시킨 다음, 얼음위에 2 분 동안 방치하였다. 냉각된 DNA 용액을 동량의 혼성화 버퍼 (6 x SSPE-0.1% 트리톤 X-100)와 혼합한 다음 프로브 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 혼성화 챔버에 주입하였다. 상기 마이크로어레이를 32 ℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 마이크로어레이를 세척버퍼 I(6x SSPE-트리톤 X-100 0.05%)로 5 분 동안 상온에서 세척한 다음 세척버퍼 II(3x SSPE-트리톤 X-100 0.005%)로 5 분 동안 상온에서 세척하였다. 15 분 동안 상온에서 건조시킨 다음, 스캐닝하였다 (실험군). 이때, 스캐닝은 엑손 인스트루먼트 사(Axon Instruments, 미국)의 GenePix 4000B 모델 스캐너를 이용하여, 이미지를 생성하고, GenePix Pro 소프트웨어(Axon Instruments, 미국)를 이용하여 이미지를 분석하였다. 형광 측정은 532 nm에서 하였다.
대조군 실험은 동일한 조건에서 혼성화될 수 있도록 프로브 폴리뉴클레오티드가 고정화된 폴리뉴클레오티드 어레이, 즉 Tm에 따라 블록으로 구분되지 않은 폴리뉴클레오티드 어레이를 이용하고, 여기에 포름아미드가 첨가되지 않은 혼성화 용액을 사용하여 32 ℃ (대조군 1)와 40 ℃(대조군 2)에서 혼성화하였다. 그외의 조 건은 동일하였다.
그 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3에서 블록에 대한 사항은 실험군에만 해당된다.
표 3. 혼성화 결과의 측정 결과
| 블록 | 표적 부위 | 실험군 | 대조군 1 | 대조군 2 | ||||||
| Wp | Mp | 비율 | Wp | Mp | 비율 | Wp | Mp | 비율 | ||
| 1 | 엑손1 | 6712 | 10 | 6.51 | 5924 | 10 | 6.38 | 2962 | 4.5 | 6.49 |
| 1 | 엑손2 | 4934 | 11 | 6.11 | 3850 | 10 | 5.95 | 1925 | 5.9 | 5.79 |
| 1 | 엑손7 | 20021 | 3524 | 1.74 | 18005 | 334 8.6 | 1.68 | 9002.5 | 1512 | 1.78 |
| 1 | 엑손9 | 7178.4 | 32 | 5.41 | 6596 | 24.8 | 5.58 | 3298 | 14 | 5.46 |
| 1 | 엑손10 | 14366 | 10 | 7.27 | 14706 | 10 | 7.29 | 7353 | 4.8 | 7.33 |
| 2 | 엑손1 | 2016.4 | 1 | 7.61 | 2833.2 | 56 | 3.92 | 1416.6 | 1 | 7.26 |
| 2 | 엑손2 | 3221.8 | 1 | 8.08 | 5087.2 | 365.8 | 2.63 | 2543.6 | 1 | 7.84 |
| 2 | 엑손4 | 14269. 6 | 309.4 | 3.83 | 17842.4 | 1671.8 | 2.37 | 8921.2 | 281 | 3.46 |
| 2 | 엑손4 | 14637 | 262.8 | 4.02 | 14031.8 | 874.4 | 2.78 | 7015.9 | 210 | 3.51 |
| 2 | 엑손9 | 4009 | 1 | 8.30 | 3321.4 | 179.8 | 2.92 | 1660.7 | 1 | 7.41 |
Wp : 표적 폴리뉴클레오티드와 완전 매치되는 프로브 폴리뉴클레오티드
Mp : 표적 폴리뉴클레오티드와 불완전 매치되는 프로브 폴리뉴클레오티드
비율 : ln(Wp/Mp) 값
실험군 : 블록 1 ; 포름아미드 0%, 32 ℃, 블록 2 ; 포름아미드 7.5%, 32 ℃
대조군 1 : 포름아미드 0%, 32 ℃
대조군 2 : 포름아미드 0%, 40 ℃
표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실험군 마이크로어레이의 블록 1에 고정화된 프로브 폴리뉴클레오티드는 대조군 마이크로어레이 1에 고정된 대응되는 프로브 폴리뉴클레오티드와 동일한 조건이므로, 형광 강도나 ln(Wp/Mp) 값은 거의 변 화하지 않았다. 또한, 실험군 마이크로어레이의 블록 2에 고정화된 프로브 폴리뉴클레오티드의 형광 강도는 대조군 마이크로어레이 1에 비하여 약간 감소하나 ln(Wp/Mp) 값은 현저하게 증가하였고, 대조군 마이크로어레이 2에 비하여는 형광 강도나 ln(Wp/Mp) 값이 모두 증가함을 알 수 있었다. 즉, 기판 상에 Tm에 따라 프로브 폴리뉴클레오티드를 2개 블록에 고정화한 마이크로에러이를 사용하여 동일한 온도에서 혼성화함으로써, 2개의 마이크로어레이를 사용하여 얻을 수 있는 검출 결과를 얻을 수 있었다.
Tm이 넓게 분포된 프로브 폴리뉴클레오티드를 하나의 온도에서 혼성화 반응을 수행하였을 경우, Tm 이 낮은 프로브군과 높은 프로브군 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 최적화된 혼성화 온도에서 혼성화 반응을 수행하여야 한다. 본 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 혼성화 반응액 중에 변성제 또는 안정제를 첨가함으로써 동일한 마이크로어레이에서 동일한 온도에서 혼성화 반응을 수행할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 어레이에는 Tm에 따라 프로브 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 블록의 형태로 존재함으로써, 하나의 어레이를 이용하여 검출할 수 있는 표적 핵산의 수를 증가시킬 수 있으며, 빠르게 검출할 수 있으며, 그에 따라 검출 비용이 절감된다.
따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 어레이에 의하면, 표적 핵산의 검출하는데 있어서 민감도와 속도를 개선할 수 있다.
본 발명의 표적 핵산 검출방법에 의하면, 표적 핵산을 높은 민감도로 빠르게 검출할 수 있다.
<110> Samsung Electronis Co. Ltd.
<120> Polynucleotide microarray comprising 2 or more groups of probe
polynucleotide immobilized on a substrate in accordance with Tm
and method for detecting a target polynucleotide
<130> PN051215
<160> 40
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<220>
<223> primer
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<212> DNA
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taatacgact cactataggg cccggacaca gcttggcttc c 41
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<223> primer
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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gtaaccctca ctaaagggag ggcagggaca gtaagggagg 40
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<223> primer
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<212> DNA
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gggagtcctg c 11
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ggaagtcctg c 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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ccaacgcctc aa 12
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acccagaacc cc 12
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ctgccggcat cc 12
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<223> probe polynucleotide
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cgggccaccc tg 12
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accggcacaa aga 13
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ccggcccacg ggc 13
Claims (5)
- 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 Tm이 30℃ 내지 77.8℃의 범위이고, Tm의 차이가 0 ℃ 내지 10 ℃인 프로브 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 스팟의 군을 2 이상 포함하고, 상기 스팟의 군은 주입구 및 배출구가 구비된 덮개로 폐쇄된 독립된 구획으로 이루어진 것인 폴리뉴클레오티드 어레이.
- 삭제
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- 삭제
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