JP4095985B2 - ポリヌクレオチドアレイ及びそれを利用した標的ポリヌクレオチドの検出方法 - Google Patents
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Description
本実施形態では、青年期発病糖尿病3(MODY 3)と関連したHNF−1α(hepatocyte nuclear factor−1a)、正常型(wildtype)遺伝子のプロモータとエクソン(Exon)1〜10領域を標的ポリヌクレオチドとして使用した。前記10個の標的ポリヌクレオチドは、10対のプライマ対(配列番号1ないし20)をプライマ(それぞれ10pmol)(表1参照)とし、人間の血液から分離したgDNAを鋳型(0.2μm)としたPCRを行って得た。PCRは、初期変性;95℃で5分;変性95℃で30秒、アニーリング64℃で10秒、及び延長72℃で30秒を30回反復し、最終延長72℃で3分反応して行った。前記標的ポリヌクレオチドのPCR過程で、Cy3−dUTP(Amersham Biosciences,Uppsala,スウェーデン)を添加することにより、蛍光染料が標識された標的ポリヌクレオチドを調製した。
NaOH水溶液(50wt%、2mL)にエピクロロヒドリン(7.5mL)とテトラブチルアンモニウムブロミド(0.32g)を添加して撹拌した後、ペンタエリスリトールエトキシレート(1g)をゆっくり加えて常温で18時間撹拌した。TLCで反応の終結を確認したが、反応が終結していない場合、60℃で1時間さらに撹拌した。その後、水(30mL)を加えて希釈した後、メチレンクロライド(40mL)で三回抽出した。有機溶液層をさらに飽和NaHCO3(40mL)で三回洗浄して分離し、無水MgSO4を添加して乾燥させた後で低圧で溶媒を除去した。次に、真空で二日間乾燥させることによりエピクロロヒドリンの残余物を除去した。このようにして合成されたエポキシ基を有する放射形PEG誘導体は、H−NMRと、0.1N HBr/氷酢酸を利用するエポキシ基の滴定とで確認した。
DMF(40mL)溶液にペンタ(エチレングリコール)ジ−トシレート(5g、9.2mmol)を溶解させ、NaN3(4.2g、64.1mmol)とピリジン(0.5mL)とを順次添加した後、140℃で18時間撹拌した。低圧で溶媒を除去し、水(200mL)を加えつつ撹拌した後、メチレンクロライド(100mL)を加えて抽出し、有機溶媒層をブリン(100mL)で3回洗浄した。無水MgSO4を添加して乾燥させ、低圧で溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィ(EA:nHex=1:2)を行ってジアジド中間体を得た。この中間体をメタノール(30mL)に溶解させ、10%のPd−C(0.1当量)を添加した後、水素ガスを利用して18時間還元反応を進めた。セライトパッド(Celite pad)を利用して触媒を除去し、パッドはエタノールで洗浄した。濾液とエタノール洗浄液とを混合して低圧で溶媒を除去し、ジアミン架橋剤を得た。
分子量が1,500であるPEGを2N NaOHの入っている水溶液に入れ、アイスバスで撹拌してPEG架橋剤溶液を準備した。
エポキシ基を有する放射形PEG、ジアミン架橋剤、そしてプローブポリヌクレオチドの当量比が4:1:4になるようにポリヌクレオチドプローブを前記(3)で製造したゲルマトリックス溶液に添加し、撹拌して37℃で14時間放置することによってマトリックス−DNA接合体溶液を製造した後、これをスポッティング溶液とした。
比較用ポリヌクレオディドマイクロアレイとして、単一のスポット群を有し、プローブポリヌクレオチドをTmによる調整を行なうことなしに前記スポット群に固定化した以外は実施例1と同様にしてマイクロアレイを調製した。比較例1における、スポット群内のプローブポリヌクレオチドのスポット群1におけるTmの最高値と最低値との差は、25℃である。
標的ポリヌクレオチドは、実施例1でPCR増幅されたHNF−1αの正常型遺伝子のうち10領域配列の混合物を使用した。
比較例は、比較例1で調製したポリヌクレオチドアレイを使用し、ここにホルムアミドが添加されていないハイブリダイゼーション溶液を使用し、32℃と40℃とでハイブリダイゼーションした。その他の条件は実施例1と同一とした。
Claims (9)
- 標的ポリヌクレオチドとのTmが設定された範囲に属するプローブポリヌクレオチドが固定されたスポット群を2以上含み、各スポット群が他のスポット群とは独立するように、ハイブリダイゼーション溶液注入口及び排出口を有する覆いによって閉鎖されている、ポリヌクレオチドアレイ。
- 前記固定化されたプローブポリヌクレオチドのスポット群内のTmの差は、10℃以下である請求項1に記載のポリヌクレオチドアレイ。
- 前記固定化されたプローブポリヌクレオチドのスポット群内のTmの差は、5℃以下である請求項1に記載のポリヌクレオチドアレイ。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドアレイの、前記スポット群に固定化されているプローブポリヌクレオチドに試料を添加してハイブリダイゼーションする段階を含み、1以上の前記スポット群に変性剤、安定化剤及びその組み合わせから構成される化合物を含むハイブリダイゼーション溶液を添加し、各スポット群に固定化されているプローブポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのTmの差が設定された範囲内となるように調整することを特徴とする標的ポリヌクレオチドを検出する方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドは蛍光標示で標識されており、前記ハイブリダイゼーションの結果を蛍光を測定することによって分析する段階をさらに含むことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記変性剤は、ホルムアミド、尿素、グアニジンクロライド、DMF及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1以上であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記安定化剤は、Na+、K+、Ca2+及びMg2+よりなる群から選択される1以上のイオンであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記Tmの差は、0〜5℃であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記Tmの差は、0〜3℃であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
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