KR20030037010A

KR20030037010A - 유전자의 존재 또는 발현정도를 확인하는 방법 및 그를위한 프로브

Info

Publication number: KR20030037010A
Application number: KR1020010067976A
Authority: KR
Inventors: 이희종; 김성준; 조재용; 박영훈
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2001-11-01
Filing date: 2001-11-01
Publication date: 2003-05-12
Also published as: KR100439847B1

Abstract

본 발명은 미지의 염기서열을 갖는 원핵 또는 진핵세포 게놈의 샷건 라이브러리(shotgun library)를 이용하여 DNA 칩(chip)을 제작하고, 분석하고자 하는 총 RNA를 대상 세포로부터 추출한 후, mRNA를 선택적으로 분리하여 그 말단을 형광물질로 직접 표지하고, 한 개의 샷건-라이브러리 DNA 칩에 혼성화시킨 후 판독하여, 유전자의 존재 또는 발현정도를 확인하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 mRNA 프로브(probe)에 관한 것이다.

Description

유전자의 존재 또는 발현정도를 확인하는 방법 및 그를 위한 프로브{Method for identifying the presence of or the expression level of a gene and probe for the same}

본 발명은 미지의(unknown) 염기서열을 갖는 원핵 또는 진핵세포의 게놈으로부터 제작된 샷건 라이브러리(shotgun library) 유래의 DNA 칩(chip)[이하, "샷건-라이브러리 DNA 칩)"이라 함]을 이용하여, 원핵 또는 진핵세포에서 유전자의 존재 또는 발현정도를 확인하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 샷건-라이브러리 DNA 칩을 프로브(probe)로서, 말단이 형광물질로 직접 표지(label)된, 원핵 또는 진핵세포로부터 분리된 mRNA로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

DNA 칩 또는 DNA 마이크로어레이(microarray) 활용기술은 최근의 생명공학 및 관련 사업에서 그 중요성이 부각되고 있는 신기술이다. DNA 칩은 분석하고자 하는 유전자의 특정 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 유전자 단편을 작은 유리 슬라이드상에 고밀도로 부착시켜 제작된다. 이렇게 제작된 DNA 칩에 분석하고자 하는 유전자 또는 그 단편을 형광을 발산하거나 발색가능한 상태로 혼성화(hydridization)시킨 후, 판독기(scanner)로 판독하여, 특정 유전자의 존재 또는 발현정도를 확인하게 된다. 이러한 DNA 칩 활용기술은 고밀도 유전자 검색기술이다.

알려진 염기서열을 갖는 유전자에 대한 DNA 칩의 제작방법과 분석하고자 하는 프로브의 제조방법 및 이를 분석할 수 있는 방법은 이미 공지되어 있다(WO 97/27317, Affymetrix, INC.).

DNA 칩을 제작하는 방법으로는, ⅰ) 이미 염기서열이 알려진 유전자의 단편을 유리 슬라이드상에서 직접 합성하는 방법[올리고뉴클레오타이드 칩(oligonucleotide chip)]과, ⅱ) 유전자를 증폭하여 얻은 고농도의 DNA를 유리 슬라이드상에 집적하는(spotting) 방법[DNA 집적 칩(DNA spotting chip)]이 있다. 그러나, 이러한 방법은 유전자 칩을 제작하기에 앞서, 집적하려는 유전자의 염기서열이 밝혀져 있어야 하므로, 고비용과 장시간을 투자하여 염기서열을 규명하는 작업이 선행되어야만 하는 문제점이 있다.

한편, 분석하고자 하는 유전자를 형광물질이나 발색 그룹으로 표지하는 방법에는 크게 두 가지가 알려져 있다. 첫 번째 방법은 분석하고자 하는 유전자의 염기서열을 알고 있는 경우에는, 특정 프라이머(primer)를 이용하거나, 그렇지 않은 경우에는 무작위 헥사머(random hexamer)를 이용한 역전사 반응으로 cDNA 프로브를 제조하거나, cDNA에 상보적인 RNA(cRNA) 프로브를 제조하는 방법이다. 두 번째 방법은 mRNA 또는 총(total) RNA를 직접 형광물질로 표지하는 방법이다. 그러나, 두 번째 방법은 실험과정이 어렵고, 유전자 칩에 프로브를 혼성화시킨 후, 형광으로 표지하므로, 항상 두 개의 유전자 칩을 이용하여야만 하는 문제점이 있다. 이와 같은 이유로, 이 방법은 주로 칩간의 변이성이 상대적으로 작은 올리고뉴클레오타이드 칩에서만 이용되어 왔다.

염기서열이 밝혀지지 않은 유전자를 RNA에서 cDNA로 증폭할 경우, 통상적으로 무작위 헥사머를 이용하는데, 이 경우 mRNA(전체 RNA의 2∼3%)외에 rRNA(전체 RNA의 90% 이상)까지 함께 증폭되어 정확한 유전자의 발현양상을 분석하는데에는 한계가 있다. 또한, cDNA 합성과정에서 형광 뉴클레오타이드가 삽입되면서 합성된 cDNA가 형광으로 표지되는데, 이 경우 특정한 뉴클레오타이드만이 표지되므로, 특정 염기서열에 의존적으로 표지효율이 변화될 수 있다.

상기와 같은 종래기술의 장단점을 고려하여, 본 발명자들은 샷건-라이브러리 DNA 칩을 분석하기 위한 프로브로서 mRNA만을 분리하여 그 말단을 형광으로 직접 표지하는 방법을 착안하였다. RNA를 직접 형광으로 표지하는 방법은 본 발명 이전에는 올리고뉴클레오타이드 칩에만 적용되었을 뿐만 아니라, 혼성화 후에 형광으로표지하기 위하여 항상 두 개의 칩을 이용하여야 하였으므로, 칩 제작상 발생할 수 있는 오차까지 고려하여야 하는 문제점이 있었다. 이에, 본 발명에서는 두 가지 이상의 형광물질로 직접 표지된 mRNA 프로브를 이용하여 한 개의 샷건-라이브러리 DNA 칩에서 유전자 발현양상을 분석하는 방법을 확립하였다.

본 발명의 목적은 기존의 DNA 칩을 제작하기 위하여 선행되어야 했던 염기서열 분석과정을 생략하고 샷건-라이브러리 DNA 칩을 제작하여, 원핵 또는 진핵세포에서 특정 유전자의 존재 및 발현양상을 단시간내에 확인한 후, 실험 결과로 얻은 표적 스팟(target spot)에 대한 염기서열만을 결정함으로써, 표적 유전자를 보다 간단하고 저렴한 비용으로 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에서 사용하기 위한 프로브 및 그의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.

도 1은 샷건-라이브러리(shotgun-library) DNA 칩 분석과정을 개략적으로 나타낸 블록도이고;

도 2는 형광물질 cy3 및 cy5의 강도에 대한 로그 플랏(log plot)이다.

본 발명은 미지의 염기서열을 갖는 원핵 또는 진핵세포 게놈의 무작위 샷건 라이브러리를 이용하여 DNA 칩을 제작함과 동시에, 분석하고자 하는 총 RNA를 대상 세포로부터 추출한 후, mRNA를 선택적으로 분리하여 그 말단을 형광물질로 직접 표지하고, 한 개의 샷건-라이브러리 DNA 칩에 혼성화시킨 후 판독하여, 유전자의 존재 또는 발현정도를 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 특히, 염기서열이 알려져 있지 않은 원핵 또는 진핵세포, 특히 원핵세포의 게놈 유전자 발현양상을 분석하기 위한 보다 정확하고 간편한 방법으로서, 원핵 또는 진핵세포, 특히 원핵세포로부터 추출된 두 가지 이상의 mRNA를 각각 다른 형광물질로 직접 표지하여 mRNA 프로브들을 제조하고, 이 mRNA 프로브들을 한 개의 샷건-라이브러리 DNA 칩에 동시에 적용하는 방법을 제공한다.

이하, 도 1을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 개략적인 블록도로서, 그 구성은 다음과 같다. 원핵 또는 진핵세포의 게놈 DNA를 추출한 후, 제한효소로 처리하여 목적에 맞는 적당한 길이의 DNA 단편을 분리한다. 이 DNA 단편을 클로닝 벡터에 삽입하고 대장균에 도입하여 샷건 라이브러리를 제작한다[단계 (1-1) 및 (1-2)]. 이 때 여러 종류의 제한효소를 이용하여 특정 부분의 DNA가 유실되지 않도록 한다. 이렇게 제작된 샷건 클론에 대하여 클로닝 벡터에 포함된 상용화된 프라이머(T7, Sp6, M13 프라이머 등)를 이용하여 삽입된 단편만을 PCR로 증폭한 후[단계 (1-3)], 증폭된 DNA 단편을 유리 슬라이드상에 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용하여 집적한다[단계 (1-4)].

샷건-라이브러리 DNA 칩을 분석하기 위한 mRNA 프로브를 제작하는 방법은 다음과 같다[단계 (2-1)∼(2-7)]. 원핵 또는 진핵세포의 총 RNA를 추출한 후[단계 (2-1)], 다음과 같은 과정으로 mRNA를 분리한다. rRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머를 제작하여 rRNA만을 역전사 반응으로 증폭시킨 후, RNaseH를 이용하여 rDNA-rRNA 하이브리드 형태의 rRNA만을 특이적으로 분해하고, 증폭된 rDNA(cDNA)는 DNaseⅠ으로 제거한다. tRNA는 RNeasy 칼럼(QIAGEN)으로 제거한다. 이와 같은 방법으로 분리된 mRNA를 작은 단편으로 단편화(fragmentation)시킨 후, -S-ATP의 -S기를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(polyneucleotide kinase)를 이용하여 5'-말단에 결합시킨다. -S기가 결합된 mRNA는 바이오틴(biotin)으로 5'-말단을 표지하고[단계 (2-3)], 바이오틴에 특이적으로 결합하는 스트렙타비딘(streptavidin)의 성질을 이용하여, 스트렙타비딘과 결합된 형광물질로 mRNA가 형광을 띠도록 표지한다[단계 (2-4)]. 이렇게 준비된 mRNA 프로브를 유전자 칩에 부착하고[단계 (2-5)], 칩에 부착되지 않은 잔여 mRNA 단편을 세척하여 제거한 후[단계 (2-6)], 판독한다[단계 (2-7)].

이하, 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 샷건 라이브러리 및 샷건-라이브러리 DNA 칩의 제작

아미노산 생산 미생물인 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032의 게놈 DNA를 통상의 방법에 따라 추출하였다(QIAGEN). 5∼10 ㎍의 게놈 DNA를 네 가지 제한효소(Sau3AⅠ,HaeⅢ,AluⅠ,NlaⅢ)(∼2.5 유닛/㎍ DNA)로 10 분간 처리하였다. 1.0∼1.5 Kb 크기의 DNA 단편을 추출한 후, pGEM 클로닝 벡터(Promega)에 삽입하였다. 상기 벡터로 대장균을 형질전환시켜 LB 배지(앰피실린 포함)에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 게놈 DNA 단편의 삽입을 확인한 12,000 개(전체 유전체의 4×coverage) 균주에 대하여 글리세롤이 함유된 스톡 플레이트(stock plate)를 제작하여 -70 ℃에 보관하였다.

샷건-라이브러리 DNA 칩을 제작하기 위하여, pGEM 벡터의 T7, SP6 프라이머를 이용하여 삽입된 DNA 단편 1,000 여개를 200 ng/㎕의 농도로 증폭하였다. 증폭된 단편을 ArrayIt™ 슈퍼 마이크로어레이어(TeleChem International, Inc.)를 이용하여 유리 슬라이드위에 집적하였다.

실시예 2: mRNA 프로브의 제작

그람 양성 세균인 코리네박테리움 글루타미컴의 총 RNA를 리소자임(lysozyme)과 65 ℃ 가열하의 산성 페놀 처리과정을 거쳐 추출한 후, 200 ㎍의 RNA로부터 mRNA만을 분리하였다. 즉, 200 ㎍의 RNA를 주형으로 하고,C. glutamicum의 16S rRNA과 23S rRNA에 상보적인 12 종류의 프라이머(서열번호 1 내지 12)와 함께 역전사 반응을 수행하여, rRNA에 대한 cDNA를 선택적으로 증폭하였다(2.3 μM rRNA 프라이머, 1×슈퍼스크립트(superscript) RT 완충용액, 5 mM DTT, 0.5 mM dNTPs, 0.735 U/㎕ RNase 억제제, 3 U/㎕ 슈퍼스크립트 역전사 효소; 42 ℃ 25 분, 45 ℃ 20 분).

상기 용액에 0.12 U/㎕ RNaseH(Epicentre Technologies)를 첨가하고 37 ℃에서 45 분간 반응시켜, rRNA-rDNA의 이중나선(double stranded) 구조로 증폭된 하이브리드 분자중 rRNA 부분만을 선택적으로 제거하였다.

DNaseⅠ 0.12 U/㎕ 및 RNase 억제제 0.225 U/㎕으로 37 ℃에서 20 분간 증폭된 rRNA 유래의 cDNA를 제거한 후, QIAGEN RNeasy 칼럼을 이용하여 잔류 효소 및 5S rRNA를 제거하였다.

상기 과정으로 분리된 mRNA는 1.1×T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 완충용액내에서 95 ℃에서 30 분간 반응시켜 단편화하였다. 여기에 0.1 mM -S-ATP와 1 U/㎕ T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제를 첨가하여 mRNA의 5'-말단에 황(sulfur)을 결합시켰다(37 ℃, 50 분). 결합되지 않은 과량의 -S-ATP는 에탄올 침전으로 제거하였다.

mRNA에 결합된 황에 특이적으로 결합하는 PEO-요오도아세틸-바이오틴을 이용하여 mRNA에 바이오틴을 결합시킨 후(30 mM MOPS, 2 mM PEO-요오도아세틸-바이오틴; 37 ℃, 1 시간), RNeasy 칼럼으로 결합되지 않은 바이오틴을 제거하였다. 상기와 같은 방법에 의해, 200 ㎍의 총 RNA로부터 5∼10 ㎍의 mRNA만을 분리하였다.

실시예 3: mRNA 직접 표지(direct-label) 및 샷건-라이브러리 DNA 칩 분석방법

mRNA 직접 표지방법을 이용한 샷건-라이브러리 DNA 칩의 유전자 발현 분석방법에 대한 적용가능성을 확인하기 위하여, 동일한 mRNA를 두 가지 형광물질로 표지한 후, 샷건-라이브러리 DNA 칩에 적용하였다.

실시예 2에서 제조된 mRNA를 각각 스트렙타비딘이 결합된 cy3 및 cy5(0.125 ㎍/㎕)와 상온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 샷건-라이브러리 칩(4068 개의 샷건 클론을 포함함)에 혼성화시켰다. 혼성화 용액은 1×MES 완충용액, 0.1 ㎎/㎖ 청어 정자 DNA, 0.5 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민 및 두 종류의 표지된 mRNA로 조성되었다.

샷건-라이브러리 DNA 칩은 혼성화 스테이션[hybridization station(GENOMICSOLUTION)]을 이용하여 먼저 예비-혼성화 용액(1× MES 완충용액, 0.1 ㎎/㎖ 청어 정자 DNA, 0.5 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민)내에서 45 ℃에서 10 분간 반응시킨 후, 혼성화 용액내에서 45 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰다.

반응 후 부착되지 않은 mRNA 프로브는 6×SSPE, 0.01% 트윈(Tween) 20 용액으로 30 ℃에서 2 분씩 10 회 세척하고, 다시 100 mM MES, 0.1 M 나트륨, 0.01% 트윈 20 용액으로 30 ℃에서 2 분씩 5 회 세척하여 제거한 후, GSI LUMONICS사의 Scanarray 5000을 이용하여 각각의 형광 강도(intensity)를 측정하였다. 각 값은 배경값(background)을 제하고 표준화(normalization)한 후, 로그 값으로 계산하여 cy3와 cy5에 대한 강도 비율(intensity ratio)을 나타내기 위하여 도시하였다(도 2 참조).

상기한 바와 같이, 동일한 조건하에서 동일한 방법으로 추출된 동일한 종류의 mRNA를 이용하여 두 가지의 형광물질(cy3 및 cy5)로 유전자의 발현양상을 분석한 결과, 대부분의 유전자를 대표하는 스팟들이 cy3와 cy5에서 거의 1:1의 비율로 동일한 값을 나타내는 것으로 확인되었다(도 2 참조). 이와 같은 결과는 mRNA 프로브를 혼성화하기 전에 형광물질로 직접 표지하여 프로브로 이용하는 방법이 유효하며, 두 형광물질의 표지효율도 동일함을 보여주는 것이다.

본 발명에 따르면, 통상적으로 사용되는 mRNA 유래 프로브는 역전사 효소에 의해 상보적 DNA(cDNA)를 제작하는 반면, mRNA 유래 프로브를 역전사 효소를 사용하지 않고 혼성화를 수행하기 전에 형광물질로 직접 표지함으로써, 궁극적으로 한개의 유전자 칩을 이용하여 대조군간의 유전자 발현양상에 대한 결과를 판독할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 게놈의 염기서열이 알려져 있지 않은 생물체의 유전자 발현양상을 분석하기 위한 보다 정확하고 간편한 방법으로서, 동종 생물체로부터 추출된 두 가지 이상의 mRNA를 각각 다른 형광물질로 직접 표지하여, 이들 mRNA 프로브를 한 개의 DNA 칩에 동시에 적용할 수 있는 방법을 확립하였다.

Claims

(ⅰ) 미지의 염기서열을 갖는 원핵 또는 진핵세포의 게놈 DNA의 샷건 라이브러리(shotgun library)를 지지체상에 고정화하여 DNA 칩(chip)을 제조하고;

(ⅱ) 프로브(probe)로서, 말단이 형광물질로 직접 표지(label)된, 원핵 또는 진핵세포부터 분리된 mRNA를 게놈 DNA와 혼성화(hybridization)시키고;

(ⅲ) DNA 칩을 세척하여 혼성화되지 않은 mRNA를 제거하고;

(ⅳ) DNA 칩상의 형광을 판독하는 단계를 포함하는,

유전자의 존재 또는 발현양상을 확인하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (ⅱ)에서 한 개의 DNA 칩상의 게놈 DNA를 각각 다른 형광물질로 표지된 2 종 이상의 mRNA와 동시에 혼성화시키는 방법.
제1항에 있어서, 형광물질로 표지된 mRNA가 바이오티닐화(biotinylated) mRNA를 스트렙타비딘(streptavidin)-결합 형광물질로 표지하여 제조된 것인 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한, 말단이 형광물질로 직접 표지된 mRNA 프로브.
(ⅰ) 원핵 또는 진핵세포로부터 총 RNA를 추출하고;

(ⅱ) 상기 총 RNA로부터 mRNA를 선택적으로 분리하고;

(ⅲ) 상기 mRNA의 말단을 형광물질로 직접 표지하는 단계를 포함하는,

제4항에 따른 mRNA 프로브의 제조방법.
제5항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서 바이오티닐화 mRNA를 스트렙타비딘-결합된 형광물질로 표지하는 방법.
(ⅰ) 지지체상에 미지의 염기 서열을 갖는 원핵 또는 진핵세포의 게놈 DNA의 샷건 라이브러리가 고정화된 DNA 칩;

(ⅱ) 프로브로서, 말단이 형광물질로 직접 표지된, 원핵 또는 진핵세포부터 분리된 mRNA; 및,

(ⅲ) DNA 칩상의 게놈 DNA와 mRNA간의 혼성화를 가능하게 하는 완충용액을 포함하는,

유전자의 존재 또는 발현양상을 확인하기 위한 키트.