JP2001524808A - 放出可能な不揮発性の質量標識分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本願発明は、不揮発性かつ放射可能な質量標識を用いて、生分子標的に特異的に相互作用する質量標識組成物の合成及び使用を提供する。質量標的化合物の標的分子への結合に続いて、独特の質量標的がマススペクトロメトリーを用いて解析され、標的分子を同定及び特徴付する。本発明の一実施態様では、質量標識されたオリゴヌクレオチドプローブが特異的な遺伝子配列を同定するために使用される。無数の質量標識された化合物は、オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドとの相互作用、酵素と基質または基質類似体／中間体との相互作用、ポリペプチドと核酸との相互作用、タンパク質とリガンドとの相互作用、リセプターとリガンドとの相互作用、ポリペプチドと金属との相互作用、核酸と金属との相互作用、または抗原と抗体との相互作用のような多岐にわたる相互作用における使用のために製造されうる。種々の標的のための迅速なスクリーニングを可能にする化合物の大きなライブラリーを作成するためのコンビナトリアル方法をも意図される。

Description

【発明の詳細な説明】 放出可能な不揮発性の質量標識分子 発明の背景 本発明は、１９９６年１２月１０日に出願の出願番号６０／０３３，０３７の 仮出願及び１９９７年５月１６日出願の出願番号６０／０４６，７１９の一部係 属出願であり、この全開示は権利放棄することなく、引用することにより本明細 書の一部をなすものとする。政府は、米国商務省の高等技術プログラムからの協 約第７０ＮＡＮＢ５Ｈ１０２９号に従って本発明の権利を所有することが可能で ある。 １． 発明の分野 本発明は、一般的に化学分析に関する。より詳細には、本発明は、標的物質の 検出及び分析例えば質量分析における使用のための新クラスの不揮発性で放出可 能なタグ試薬に関する。 ２． 関連技術の説明 タグまたはシグナル試薬としても知られる化学的標識は、化学分析で広く使用 されている。使用される分子の中には、放射性原子、蛍光試薬、発光試薬、金属 含有化合物、電子吸収物質及び光吸収化合物がある。化学的シグナル基は、反応 性の基と結合することができ、従って化学的シグナル試薬は標的に共有結合的に 付着し、これにより物質は検出される。しかし多くの場合、標的に存在する化学 的部分あるいは成分は、シグナル基の検出を邪魔するかまたは最適な検出環境に おけるシグナル基の測定を可能にしない。 従って、標的の間接的検出がしばしば優先される。例えばシグナル基は標的の 分解の生成物または標的の誘導体であることもある(Ｂｕｅｈ等，１９７４年； Ｓｅｎｆｔ，１９８５;米国特許４６５０７５０号;米国特許４７０９０６１号； 米国特許４６２９６８９号)。しばしばガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ −ＭＳ）である種々の形の電子付着質量分析を使用して分析されることが可能で ある揮発性の放出可能タグ化合物が開示された(Ｗａｎｇ等，１９９６；米国特 許５３６０８１９号；米国５５１６９３１号)。広い領域の揮発性標識が報告さ れたにもかかわらず、液相から気相への移行が、標識に大きい合成及びサイズパ ラメーターを付する分析のために要求される。種々の質量分析サンプリングアプ ローチによる、例えば亜鉛または硫黄同位体を使用しての同位体質量標識も開示 された(Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ等，１９９７年；米国特許５１７４９６２号)。 同位体標識は、しばしば、多重化の範囲を制限し、より複雑な要求を課する。 シグナル基の質量スペクトル分析は、放射性シグナル基に関連するこれらの問 題、例えば放射性シグナル基の半減期の短いこと、放射性シグナル基の安全性及 び廃棄の問題等のうちのいずれも有しない。質量分析を介してのシグナル基の検 出の別の1つの重要な利点は、質量分析により多重化すなわち複雑な混合物の中 の２つ以上のシグナル基を検出する大きな能力を得られることにある。Ｂｒｕｍ ｍｅｌ等（１９９４；１９９６）は、小さいペプチドの組合せライブラリーの直 接分析における質量分析の使用を示した。しかし、この技術の使用は、質量分析 によるすべての反応化合物の分析に制限される。 多重蛍光標識の検出は、核酸の塩基配列を分析するのに使用された。核酸ハイ ブリダイゼーションプローブは、光により励起されるとユニークなスペクトルシ グナチャーを放射する蛍光発色団を含むように修飾される。蛍光に基づく配列決 定式において、4つの異なる発色団が1つのサンプルの中で多重化され、ソフトウ ェア解析を用いて検出されることが可能である。蛍光多重化のための実際の上限 は、存在する蛍光発色団により発生される広幅の重畳スペクトルに起因して約１ ０の異なる標的である確率が高い。明らかに、質量分析器の使用可能な領域を介 して検出可能である不揮発性で放出可能部な質量標識の開発は、ユニークにそれ ぞれの所望の標的を識別するのに使用されることが可能である１０、１００およ び１０００でさえもあることもある異なる質量標識の多重化を可能にすることに より1つの重要な利点を提供する。 現在、標的分子を検出できるツールが利用可能であるが、多数の標的を同時に 分析するためにこれらのシステムの更なる開発の必要性が存在する。これにより 、前もって定められた特性および機能を有する標的分子の組織的な分析が可能と なるからである。発明の概要 従って本発明の目的は、標的分子の検出および分析のためのリリースタグ化合 物の使用に関する構成および方法を提供することにある。 本発明は、化学分析における放出可能な質量標識を含む不揮発性かつ放出可能 な化合物の使用に関し、存在を検出する分子と非共有結合的に反応または結合す るプローブと組合せての試薬の使用に関する。放出可能なタグ試薬はこのように して間接的に、生分子標的を含む標的分子を検出することが可能である。質量標 識は、標的との反応または結合の後にプローブから放出され、質量分析により検 出されることが可能である。標識の質量値は、プローブひいては標的分子を同定 および特徴付けする。ポリヌクレオチドを標的するのに使用される質量標識され たオリゴヌクレオチドの場合、核酸プローブまたは核酸標的自身よりむしろ質量 標識の検出により、生化学分析法を大幅に簡単化できる。遅く、労力を要し、費 用がかかりおよび／または複雑な固相および／または溶液相の浄化および脱塩手 順の必要性を最小化しまたは必要にすることができる。 従って本発明により、Ｒｘ，ＲｅおよびＭを含むリリースタグが提供され、Ｒ ｘは反応性の基、Ｒｅは放出基、Ｍは質量分析により検出可能な質量標識である 。本明細書において「１つの」という表現は、この表現が単一の元素を意味する 実 施の形態にも、1つ以上のこのような元素を含む実施の形態にも使用される。例 えば「1つ反応基」という表現は、単一の反応基を意味することもあり、1つ以上 の反応基を含み、実施の形態に使用されることもある。 質量標識は、典型的には合成ポリマーまたはバイオポリマーまたはこれらの何 らかの組合せであることもあり、いくつかの実施の形態では質量標識は一般的に 、質量分析により検出できる任意の化合物であることもある。特別の実施の形態 では質量標識は、モノマー単位を含むバイオポリマーであり、それぞれのモノマ ー単位は、別個かつ独立的に、実質的にアミノ酸、核酸、および糖類から成る基 から選択され、アミノ酸および核酸が有利なモノマー単位である。それぞれのモ ノマー単位は、別個にかつ独立的に選択されるので、バイオポリマー質量標識は ポリ核酸類、ペプチド類、ペプチド核酸類、オリゴヌクレオチド類等である。 本明細書において「核酸」とは標準的核酸または天然核酸および修飾／非天然 核酸を意味し、これらはしばしば核酸模倣物として知られている。このようにし て「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオチド二リン 酸、およびヌクレオチド−リン酸を含む天然ヌクレオチドおよび修飾／非天然ヌ クレオチド類と、ポリ核酸またはオリゴヌクレオチドの中に存在する一リン酸塩 モノマーとの双方を意味する。ヌクレオチドはリボ、２’−デオキシ、２’，３ ’−デオキシであるこことも、当業者には自明な多数の一連の他のヌクレオチド 模倣物であることもある。模倣物は、鎖停止反応性ヌクレオチド、例えば３’− Ｏ−メチル，ハロゲン化塩基または糖置換物；非糖質のアルキルリング構造を含 む代替的糖構造；イノシンを含む代替的塩基；デアザー修飾、χおよびψ、リン カー修飾；質量標識修飾；ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボランホ スホネート、アミド、エステルを含むホスホジエステル修飾または置換；および 切断連鎖、例えば光切断可能なニトロフェニール部分を含む基本的または完全な インターヌクレオチド置換ホスホジエステル修飾または置換を含む。これらの 修飾は当業者に自明であり、引用することにより本明細書の一部を成すものとす るＳａｅｎｇｅｒ（１９８３）に説明される基本的原理を基礎にしている。 同様に「アミノ酸」という表現は、天然アミノ酸も、当業者には自明の方法に より合成されるかまたは得られる修飾アミノ酸も意味する。 別の１つの実施の形態では、質量標識は、合成ポリマー例えばポリエチレング リコール、ポリビニルフェノール、ポリプロピレングリコール、ポリメチルメタ クリレート、およびこれらの誘導体である。合成ポリマーは、典型的には、実質 的にエチレングリコール、ビニルフェノール、プロピレングリコール、メチルメ タクリレート、およびこれらの誘導体から成る群から選択されるモノマー単位を 含む。 質量標識は典型的には質量分析法により検出可能である。任意の既知の質量分 析法が、本発明の質量標識を検出するのに使用されることが可能であるが、マト リクス支援レーザー脱離イオン化質量分析、（マトリクス無しの）直接レーザー 脱離イオン化質量分析、エレクトロスプレーイオン化質量分析、二次中性質量分 析、または二次イオン質量分析が優先される。 ある実施の形態では質量標識は、５００ダルトンより大きい分子量を有する。 いくつかの実施の形態では、（非揮発性を含む）不揮発性質量標識が優先される が、しかしその他の実施の形態では揮発性標的も考慮される。 本明細書では、「反応基」とは、存在を検出する分子と反応できる基を意味す る。例えば、反応基は、特別の分子認識ができる生分子である。特別の分子認識 ができる生分子は典型的には、ユニークな分子または分子クラス、例えばペプチ ド、タンパク質、ポリ核酸等と特異的な結合相互作用ができる任意の分子である 。 このようにして、開示された方法との使用のために本明細書に開示された反応 基は、ポリペプチド類およびポリ核酸類を含む。本明細書ではポリペプチドとは 、（活性および非活性アミノ酸モノマーを含む）２つ以上のアミノ酸を含む分子 の ことである。このようにしてポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸；活性タンパ ク質；酵素；遺伝子産物；抗体；タンパク質複合体；突然変異または多型性のポ リペプチド；翻訳後修飾タンパク質；化学合成生成物を含む遺伝子操作された遺 伝子生成物、インビトロ翻訳、ベクターシャフリング、ランダムあるいは指向性 突然変異誘発、およびペプチド配列ランダミゼーションを含む細胞ベース発現シ ステムを含む。有利な実施の形態では、ポリペプチドは、オリゴペプチド、抗体 、酵素、レセプター、調節タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、または ディスプレイ法のタンパク質産物、例えばファージディスプレイ法または細菌デ ィスプレイ法である。本明細書では「ディスプレイ法の産物」とは、当業者には 自明のディスプレイ法の実行から得られる任意のポリペプチドのことである。当 業者には自明の任意のディスプレイ法は、本発明と組合せて使用するためのポリ ペプチドを生成するのに使用される。 同様に、「ポリ核酸」とは、２つ以上の核酸を含む分子のことである。ポリ核 酸は、２つ以上のヌクレオチドモノマーの長さを含み、核酸類、オリゴヌクレオ チド類、ポリヌクレオチド類、ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ(ｍｔＤＮＡ)、コ ピーＤＮＡ(ｃＤＮＡ)、バクテリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、 伝令ＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、運搬ＲＮＡ(ｔＲＮＡ)、リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、 触媒ＲＮＡ、クローン、プラスミド、Ｍ１３、Ｐ１、コスミド、バクテリア人工 染色体(ＢＡＣ)、酵母人工染色体(ＹＡＣ)、増幅された核酸、アンプリコン、Ｐ ＣＲ産物およびその他のタイプの増幅された核酸を含む。有利な実施の形態では ポリ核酸は、オリゴヌクレオチドである。 更に別の1つの実施の形態ではＲｘは、１つ以上のヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレオチドであるか、またはオリゴヌクレオチドは、Ｒｘのハイブリダイゼ ーションの後に相補核酸配列に付加される。相補という用語は、一般的に、２つ の核酸のハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖核酸配列を安定化する ために充分な２つの核酸の間の水素結合の形成を意味する。 典型的には、核酸はポリメラーゼにより付加でき、オリゴヌクレオチド類はリ ガーゼにより付加できる。しかし、当業者には自明の核酸およびオリゴヌクレオ チドのその他の付加法も考慮される。別の実施の形態では、ハイブリダイゼーシ ョンの後に付加された核酸は鎖停止修飾を有し、例えば、付加的ヌクレオチドは 鎖停止ジデオキシヌクレオチドである。 付加されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが更に、強固な支持体、例 えばビオチンまたはジゴキシゲニンに固定化できる官能基を含む。一般的にこの 官能基または結合基または結合部分は、タグ化合物を強固な支持体に付加または 結合できる。この結合部分または結合基は、介在する結合基により直接に付加ヌ クレオチドまたは付加オリゴヌクレオチドに付加されるかまたは特別のハイブリ ダイゼーションにより、自身が強固な支持体に結合されている仲介オリゴヌクレ オチドに付加される。結合部分あるいは結合基は、強固な支持体への共有結合の ための官能基、高親和性を介しての強固な支持体に付着するリガンド、非共有相 互作用(例えばストレプトアビジン)、自身が強固な支持体に付着されている仲介 オリゴヌクレオチドに対して相補的な一連の塩基、および当業者には自明のその 他の手段例えば引用することにより本明細書の一部を成すものとするＰＣＴ国際 公開ＷＯ９６／３７６３０号公報に開示されている手段を含む。 別の実施の形態では、反応基は、ヌクレアーゼブロッキング部分を含む。これ らの部分は、ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチ ドの消化をブロックするのに用いられる。典型的なヌクレアーゼブロッキング部 分はこのようにしてホスホロチオエート、アルキルシリルジエステル、ボラノホ スフェート、メチルホスホネート、およびペプチド核酸を含む。 質量標識は放出可能な付着物を介して反応基に結合または付着される。このよ うにして典型的には、質量標識は、本明細書に説明されている種々の方法により 考慮されている質量スペクトル分析の前に反応基の全体または一部から放出され る。この放出可能な付着物は、典型的には、質量標識と反応基との間の結合であ るかまたは反応基の一部または全体を含むかまたは反応基の中に含まれている放 出基の使用により発生する。 放出基は、このような放出可能な付着物のための任意の不安定基である。放出 基はこのようにして、化学的に切断可能な結合または不安定な化学的結合である 。このような結合は、典型的には、当業者には自明の方法、例えば酸、塩基、酸 化、還元、熱、光、または金属イオンにより触媒された置換または離脱化学反応 により切断される。１つの特別の実施の形態では、化学的に切断可能な結合は修 飾塩基、修飾糖質、ジスルフィド結合、ホスフェートバックボーンの中に取込ま れた化学的に切断可能な基、または化学的に切断可能なリンカーを有する。これ らの結合のいくつかの例がＰＣＴ国際公開ＷＯ９６／３７６３０号公報に開示さ れている。本明細書において「化学的切断可能なリンカー」とは、例えば酸、塩 基、酸化、還元、熱、光、金属イオンにより触媒された置換または離脱化学反応 である。 ホスフェートバックボーンの中に取込まれた化学的に切断可能な基は当業者に 自明であり、ジアルコキシシラン、３’−（Ｓ）−ホスホロチオエート、５’− （Ｓ）−ホスホロチオエート、３’−（Ｎ）−ホスホロアミデート、または５’ −（Ｎ）−ホスホロアミデートを含むこともある。別の実施の形態では化学的に 切断可能な結合は、修飾糖質、例えばリボースである。代替的に結合はジスルフ ィド結合である。 更に別の１つの実施の形態では、ＲｅはＲｘの中に含まれている。この場合、 Ｒｅの放出は選択的なイベントにより活性化される。特別の実施の形態では、選 択的な放出は、酵素例えば二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡに特異的なエキソヌ クレアーゼにより仲介される。ＲｅがＲｘの中に含まれている場合には、一般的 に、反応基の構造の中に特定の放出基が含まれ、この放出基により質量標識は、 この特別の実施の形態ではタグから離脱することを意味する。 このようにして、本発明の中に含まれる放出基は、酵素により切断可能である 基または結合も含む。酵素的に切断可能な放出基は、ホスホジエステルまたはア ミド結合および制限エキソヌクレアーゼ認識部位を含む。 有利な実施の形態は、ヌクレアーゼにより切断可能な放出基を含む。これらの ヌクレアーゼは典型的にはエキソヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼで ある。典型的なエキソヌクレアーゼは、二本鎖および一本鎖ポリ核酸双方に特異 的なエキソヌクレアーゼを含む。付加的に、ある実施の形態の中に含まれる制限 エンドヌクレアーゼはＩＩＳ型およびタイプＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを含 む。 別の実施の形態では、放出基はプロテアーゼにより切断可能である。典型的な プロテアーゼはエンドプロテイナーゼを含む。 別の実施の形態では、Ｒｘがヌクレオシド三リン酸を含むかまたは、質量標識 ヌクレオシド三リン酸を使用して合成される。別の１つの実施の形態ではＲｘは ヌクレオシドホスホラミディートを含むかまたは、質量標識ヌクレオシドホスホ ラミディートを使用して合成される。 更に別の実施の形態では、質量標識プローブが提供され、少なくとも１つの成 分はヌクレオシド三リン酸である。更に、本発明の標識プローブが、少なくとも ２つのユニークな質量標識を内部に含むことが考慮されている。 Ｒｘ、ＲｅおよびＭを含む放出タグ化合物も提供され、Ｒｘは、制限エンドヌ クレアーゼ認識部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであり、Ｒｅは、制限エン ドヌクレアーゼにより切断できるホスホジエステル結合を含む放出基であり、Ｍ は、質量分析により検出可能な質量標識である。Ｒｘは更に修飾ヌクレオチドを 含み、質量標識はＲｘの一部であることもある。 本明細書における二本鎖オリゴヌクレオチドは、水素結合相互作用を介して互 いにハイブリダイゼーションされた２つの相補的な鎖を含むだけでなく、ヌクレ オチドの一本鎖も含み、鎖の一部は一本鎖であり、鎖の一部は二本鎖である。例 えばＲｘの一部または全体は、自己相補的オリゴヌクレオチドヘアピンであり、 Ｒｘの一部はＲｘの別の一部に対して相補的である。この場合、ある条件により 、これら２つの部分の間の二本鎖デュプレックスの形成が可能となる。本発明の ある実施の形態のためには、Ｒｘの全体が二本鎖である必要はなく、一本鎖領域 を含む放出タグ化合物も、この実施の形態の中にあるものと考慮されている。 放出タグ化合物は、Ｒｘ、ＲｅおよびＭを有するものとしても考慮され、Ｒｘ は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、Ｒｅは化学的に切断可能な放出基であり、 Ｍは、質量分析により検出可能な質量標識である。この実施の形態ではＲｅは典 型的にはＲｘの中に位置する。化学的に切断可能な放出基における切断は一般的 に、放出基における二本鎖オリゴヌクレオチドの存在によりこの形態では阻害さ れている。前述の化学的に切断可能な放出基例えば３’−（Ｓ）−ホスホロチオ エート、５’−（Ｓ）−ホスホロチオエート、３’−（Ｎ）−ホスホロアミデー ト、またはリボースは、これらの実施の形態において使用されている。これらの 実施の形態ではＲｘの一部は、Ｒｘの一部を標的核酸にハイブリダイゼーション することにより二本鎖にされる。 特定の標的核酸を検出するための放出タグ化合物の１セットも提供されている 。この形態では、標的核酸は、典型的には２つ以上の放出タグ化合物を含む。そ れぞれの放出タグ化合物は、Ｒｘ、ＲｅおよびＭの成分を含み、Ｒｘは可変領域 及び不変領域ヲ含むオリゴヌクレオチドであり、Ｒｅは放出基であり、Ｍは質量 分析により検出可能な質量標識である。不変領域および可変領域は、標的核酸と 反応する。「セット」という用語が、２つ以上のタグ化合物を意味することは一 般的に当業者には自明である。一般的にそれぞれのメンバー、すなわちこの群の そ れぞれのタグ化合物は、この群のその他のすべてのメンパーとは異なる。すなわ ちそれぞれのメンバーは、反応基、放出基および質量標識の異なる組合せを含む 。 典型的には、そのセットの少なくとも１つのメンバーの質量標識は、可変領域 の中の特異的な配列を同定できる。いくつかの実施の形態では、セットのそれぞ れのメンバーの質量標識は、可変領域の中のそれぞれの異なる配列をユニークに 同定する。その他の実施の形態では２つ以上の放出タグの質量標識の組合せは、 可変領域の中のそれぞれの異なる配列を同定する。 前述のようにＲｘは、更に、標的核酸にハイブリダイゼーションへのハイブリ ダイゼーションの後に付加されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む 。この形態では、付加されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは更にＲｅ ’およびＭ’を含み、Ｒｅ’は放出基であり、Ｍ’は、質量分析により検出可能 な質量標識である。付加されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、強固 な支持体例えばビオチンまたはジゴキシケニンに固定化できる鎖停止部分または 官能基も含むこともある。 高分子化を可能にする条件下でヌクレオシドまたはアミノ酸を少なくとも１つ の質量標識モノマーに組合せることを含む質量標識プローブを生成する方法が提 供される。 高分子化が酵素により仲介される更に別の実施の形態が提供される。本発明の 化合物を生成する有利な合成方法は実質的に、標準ペプチドおよびＤＮＡ合成の ための方法である。 特別の実施の形態では固相である合成が、組合せ方法を使用して種々の化合物 を生成することを可能にするので優先される。 付加的な実施の形態では、（ａ）高分子化を可能にする条件下で、ヌクレオシ ドモノマーを少なくとも１つの活性化されたヌクレオシドモノマーと組合せるス テップと、（ｂ）放出可能で不揮発性質量単位を前記活性化されたヌクレオシド モノマーに付加するステップとを有する、質量標識プローブを生成する方法が提 供される。 本発明の別の１つの実施の形態では、標的分子を検出する方法が提供される。 一般的にこの方法は、複数のプローブを得ることを含み、前述のようにそれぞれ のプローブは反応基、放出基および質量標識を含む。複数のプローブのうちのそ れぞれのプローブは、ユニークな質量標識を含むことが優先される。「ユニーク な質量標識」とは、複数のプローブのうちのそれぞれのプローブが、複数のプロ ーブのうちのすべてのその他のプローブとは異なる質量標識を有することを意味 する。複数のプローブとは、一般的に、２つ以上のプローブを含むことを意味す る。次に、標的分子が、プローブの形成を可能にするのに適する条件下で複数の プローブに接触される。質量標識がプローブから放出され、質量標識の質量が求 められる。典型的には質量は特異的な標的分子を示す。このようにして標的分子 が、質量標識のユニークな組合せにより同定される。 別の1つの形態では、本発明は、標的分子が増幅標的分子を生成するために増 幅される標的分子検出の方法を提供する。増幅標的分子は次いで、プローブによ り増幅された標的分子複合体を生成するために、例えば前述のプローブ等のプロ ーブとハイブリダイゼーションされる。プローブにより増幅された標的分子複合 体に付加されている質量標識は、次いで放出され、質量標識の質量が質量分析に より求められる。 標的核酸は、当業者には自明の任意の方法例えばポリメラーゼ連鎖反応（「Ｐ ＣＲ」）により増幅でき、ＰＣＲは有利な増幅方法である。増幅は、強固な支持 体、例えばビオチンまたはジゴキシゲニンに固定化できる官能基を含む。この官 能基は、増幅ステップの間に増幅分子の中に取込まれたオリゴヌクレオチドプラ イマーに付着されることも可能である。 増幅標的分子が強固な支持体に固定化され、プローブにより増幅された標的分 子複合体の一部でない任意のプローブが洗浄により除去される方法も提供される 。反応基による標的分子の認識の特性が、標的分子および反応基の同一性に依存 することは当業者には自明である。限定のためでなく例示として、例を挙げると 、この認識は、反応基および標的分子かオリゴヌクレオチドであるハイブリダイ ゼーションの二本鎖デュプレックスの形成を含む。質量標識は酵素的または化学 的に放出させることができる。 この実施の形態のための有益な酵素は、ヌクレアーゼ例えばＴＴ型およびＩＩ Ｓ型制限エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを含む。考慮されるエキ ソヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４エンド ヌクレアーゼＶＩＩ、λエキソヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼに特異 的であることもある。これらの実施の形態では、質量標識の放出は，増幅生成物 へのプローブのハイブリダイゼーションにより引き起こされる。この実施の形態 ではプローブは一本鎖であり、存在を検出する標的へのハイブリダイゼーション ができる。エキソヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡに特異的である。 化学的に切断可能な結合部分は、修飾塩基、修飾糖質、ジスルフィド結合、ホ スフェートバックボーンの中に取込まれた化学的に切断町能な基、または化学的 に切断可能なリンカーを含み、典型的には酸、塩基、酸化、還元、熱、光、ある いは金属イオンにより触媒された置換または離脱化学反応によって切断される。 反応基が更に、増幅する生成物、増幅された標的分子あるいは増幅された核酸 分子へのハイブリダイゼーションの後に付加されたヌクレオチドまたはオリゴヌ クレオチドを含む実施の形態が提供される。これらの付加されたヌクレオチドま たはオリゴヌクレオチドは選択的に、強固な支持体に固定化できる官能基を含む 。 強固な支持体への不動化を使用する実施の形態では典型的には、ヌクレオチド またはオリゴヌクレオチドの付加の後に反応基が強固な支持体に固定化され、次 いで、結合されていない反応基を有するいかなるプローブも、プローブにより増 幅された標的分子複合体またはプローブ・標的分子複合体に属するいかなるプロ ーブの質量標識をも放出する前に除去される。 これらの実施の形態では、反応基と放出基とは同一であるかまたは放出基は反 応基の中に含まれている。プローブは少なくとも２つのユニークな質量標識を含 むこともある。 標的分子が複数のプローブと接触される多重化法も提供される。これらの場合 には、それぞれのプローブのそれぞれの反応基は、１つのユニークな質量標識に 対応するかまたは質量標識の１つのユニークな集合に対応する。このようにして 、標的分子は、１つの特定の質量標識または質量標識の１つの特定の集合の質量 スペクトル検出により検出される。質量標識の１つの集合が使用される場合には 、質量標識の集合は、同一のプローブに付着されることもある。代替的に集合の それそれのメンバーは、１つの異なるプローブに付着されることもある。 増幅された核酸生成物が、ミスマッチを含む二本鎖分子と、鎖の３’末端のエ キソヌクレアーゼ阻止官能性とを含むミスマッチ検出法も提供される。典型的に はこの方法は更に、ミスマッチの部位における二本鎖分子の少なくとも１つの鎖 の切断と、質量標識の選択的放出とを含む。質量標識の選択的放出は典型的には 、３’→５’エキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩによる切断 された鎖の消化により達成できる。 本明細書において「選択的放出」は、プローブ・標的分子複合体に属するプロ ーブからの質量標識の放出であって、このような複合体に属しないプローブから の質量標識の放出は、物理的にこれら２つのタイプのプローブを分離することな しには発生しない放出を意味する。しかし実施の形態は、選択的放出と物理的分 離との双方を含む。前述の固定化および洗浄技術は、物理的分離法の例である。 ミスマッチは、酵素、例えばｍｕｔＨＬＳ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、 ｍｕｔＹ ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ、あ るいはエンドヌクレアーゼＶにより切断できる。ミスマッチは薬晶例えばＯｓＯ₄ 、ＨＯＮＨ₂、あるいはＫＭｎＯ₄によっても切断できる。 本発明は更に、（ａ）反応基、放出基および不揮発性質量標識を含むプローブ を得るステップと、（ｂ）プローブ・標的分子複合体を生成するためにプローブ に標的分子を接触するステップと、（ｃ）放出された質量標識を生成するために プローブ標的分子複合体から質量標識を選択的に放出するステップと、（ｄ）質 量分析により、放出された質量標識の質量を求めるステップとを含む標的分子検 出法を提供する。 典型的には、同様の化学的および酵素的放出法がこれらの実施の形態で使用さ れる。質量標識の選択的放出は、前記放出基における二本鎖オリゴヌクレオチド の存在により阻害される切断手段を使用することにより達成することもできる。 前述の説明において「前記放出基における」とは、塩基対が、少なくとも１つの ヌクレオチドにより放出基の両側で維持されることを意味する。 この実施の形態では、プローブの標的分子との接触により典型的には放出基が 一本鎖領域の中に存在することになる。何故ならばプローブの１つの鎖ga標的分 子と、例えばこの標的分子にハイブリダイゼーションすることにより相互作用す るからである。 本発明の別の１つの形態では、標的分子検出の多重化法は、（ａ）それぞれの プローブが反応基、放出基および質量標識を含む、複数のプローブを得るステッ プと、（ｂ）プローブ・標的分子複合体を生成するために複数のプローブに標的 分子を接触するステップと、（ｃ）放出質量標識を生成するためにプローブ・標 的分子複合体に所属する任意のプローブから質量標識を放出するステップと、（ ｄ）質量分析により任意の放出された質量標識の質量を求めるステップとを含む 。この形態では、特異的な標的分子を認識するそれぞれの反応基は、質量標識の １つのユニーク集合に対応する。複数の標的分子が複数のプローブに対応する としばしば有利である。 質量標識の集合のメンバーは、同一のプローブまたは異なるプローブに付着さ れる。付加的に、同一の質量標識は、２つ以上の反応基を示す集合のメンバーで あることもある。このようにしてこの実施の形態では、個別の質量標識ではなく 質量標識の集合が１つの特定の反応基に対してユニークである。この実施の形態 では、１つの特定の標定を識別する１つの反応基を有するプローブは、放出基お よび質量標識およびその他の面においても互いに異なる。 固定化および洗浄技術がこの実施の形態において使用され、いくつかの有利な 実施の形態では、強固な支持体に複数の標的分子を固定化し、次いで、これらの 標的分子を質量標識プローブに接触させる。典型的な標的分子はポリヌクレオチ ド、抗原、リガンド、ポリペプチド、炭水化物、および胞質を含む。 別の有利な実施の形態では、質量標識の複数のセットが使用され、そのセット の質量標識メンバーは、１つの特定の部分または官能性または標的分子の部分セ ットを表す。例えば、質量標識Aは、Ａ’Ｘ２...ＸＮ官能基から成る１つの反応 基に対応し、Ａは反応基の中の任意の場所にあり、Ａ’を表すにすぎず、何らか の面でＡ’に構造的に関連することもしないこともある。このようにして、質量 標識を検出することにより、Ａ’を認識する標的分子を認識するが、しかし標的 分子の構造または組成についてのその他のいかなることも認識するとは限らない 。 このようにして、質量標識のユニークなセットが、反応基の中の特定の成分の 存在を示す質量標識を含む方法が提供される。更なる実施の形態は、質量標識が 反応基の中の特定の位置における特定の成分の存在を示す方法を含む。ｎ個の特 定の成分を含む反応基は、ｎ個のメンバを有する質量標識の１つのユニークなセ ットに対応することもある、ただしｎは典型的には１〜１０００である。 ｎ個の特定の成分を含む１つの反応基は、ｙ個のメンバーを有する質量標識の １つのユニークな集合に対応することもある、ただしｎはｙ！／［ｘ！（ｙ−ｘ ）！］であり、Ｘは１つの反応基当りの質量標識の数を成す。 いくつかの実施の形態では、複数のプローブのそれぞれが、質量標識の既知の セットを有する１つの既知の反応基を有し、複数のプローブは組合せ合成により 生成できる。複数の標的分子は、既知の化学的構造を有することもある。 （ａ）複数のプローブを得、それぞれのプローブは１つの反応基、１つの放出 基および１つの質量標識を含むステップと、（ｂ）プローブ・標的核酸複合体を 生成するために複数のプローブに複数の標的核酸を接触するステップと、（ｃ） 放出質量標識を生成するためにプローブ・標的核酸複合体に所属する任意のプロ ーブから質量標識を選択的に放出するステップと、（ｄ）質量分析により任意の 放出された質量標識の質量を求めるステップとを含む遺伝子発現監視法も提供さ れる。 典型的には、標的核酸は、特定の細胞培養物の中で発現されている遺伝子を表 す配列を有し、標的核酸のｍＲＮＡ存在量レベルに対応する濃度で存在する標的 核酸は典型的にはｍＲＮＡまたは第１鎖ｃＤＮＡおよび増幅された核酸生成物を 含む。 このような増幅された核酸生成物は、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ＬＣＲ、Ｑβレプ リカーゼ、ＳＤＡ、ＴＡＳ、ＮＡＳＢＡ、あるいは複数ラウンドのＲＮＡ転写あ るいはこれらのいくつかの組合せを使用して生成できる。増幅は、これらの遺伝 子生成物のための検出シグナルを増加し、増幅されたサブセットの外部の遺伝子 生成物からのバックグラウンドを低減するｍＢＮプールのサブセットを選択的に 増幅するのに使用される。 別の１つの実施の形態は、複数の増幅された核酸生成物を生成するためにｍＲ ＮＡの部分集合を増幅するステップと、複数の生成物に複数の増幅された核酸生 成物を接触するステップとを含み、放出線量を生成して任意の放出された質量標 識の質量を質量分析により求めるために、プローブ・増幅核酸生成物複合体に所 属する任意のプローブから質量標識を選択的に放出するプローブ・増幅核酸生成 物複合体を生成するためにそれぞれのプローブは反応基、放出基および質量標識 を含む、遺伝子発現の監視法を含む。 この実施の形態では１つ以上のプローブまたは増幅された核酸生成物を強固な 支持体に固定化できる。 本発明の別の１つの形態は、プローブ・標的分子複合体を生成するために反応 基、放出基および不揮発性質量標識を含むプローブに標的分子を接触することと 、放出質量標識を生成するために複合体に所属する任意のプローブから質量標識 を放出することと、プローブ・標的分子複合体に属しないプローブが脱離しない ように質量スペクトルマトリクスからの放出質量標識を選択的に脱離することと 、質量分析により放出質量標識の質量を求めることとを含む、標的分子検出法で ある。 これらの実施の形態では質量標識は、プローブまたは質量標識されたプローブ より効率的に質量スペクトルマトリクスから脱離する。有利な質量スペクトルマ トリクスは、２，５−ジヒドロキシ安息香酸，シナピニン酸、あるいはα−シア ノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む。 標的分子の検出法も提供される。この方法は、増幅された核酸生成物を生成 するために１つ以上の標的核酸を増幅するステップと、増幅プロセスの間に、増 幅された核酸生成物の中に、反応基、放出基および不揮発性質量標識を含む１つ 以上の分子を取込むステップと、放出された質量標識を生成するために、増幅さ れた核酸生成物の中に取込まれた質量標識を放出するステップと、質量分析によ り、放出された質量標識の質量を求めるステップとを含む。 取込まれた分子は、オリゴヌクレオチドおよびヌクレオシド三リン酸であるこ ともあり、増幅された核酸生成物は、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ＬＣＲ、Ｑβレプ リカーゼ、ＳＤＡ、ＣＰＲ、ＴＡＳ、ＮＡＳＢＡ、あるいは複数ラウンドのＲＮ Ａ転写あるいはそれらの何らかの組合せである。１つ以上の第２の分子も、増幅 された核酸生成物の中に取込まれることもあり、それぞれの第２の分子は、強固 な支持体に固定化できる官能基を含む。官能基は、増幅された核酸生成物を強固 な支持体に結合するのに使用でき、取込まれた質量標識分子を、取込まれていな い質量標識分子から分離できる。増幅された核酸生成物を、取込まれていない質 量標識分子から、例えば増幅された核酸生成物を強固な支持体に結合することに より、または、増幅された核酸生成物を、強固な支持体に結合されているポリヌ クレオチドにハイブリダイゼーションすることにより分離すると有利である。後 者の場合、結合されたポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド、ポリリボヌクレ オチド、プラスミド、Ｍ１３、コスミド、Ｐ１クローン、BACあるいはＹＡＣで あることもある。複数のこれらのポリヌクレオチドも、間隔を置いた位置で強固 な支持体に不動化できる。 標的核酸分子の存在の検出法も提供され、前記方法は、反応基、放出基および 質量標識を含むプローブを得るステップと、プローブ・核酸分子複合体を生成す るために標的核酸分子にプローブを接触するステップと、質量修飾された標識を 生成するためにヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブに付着するこ とによりプローブ・核酸分子複合体を質量修飾するステップと、質量修飾された 質量標識を放出するステップと、質量分析により、質量修飾された質量標識の質 量を求めるステップとを含む。 別の１つの実施の形態は、酵素結合された親和性アッセイにおける特異的な生 分子の検出法を含み、この検出法は、基質を得るステップと、親和性・酵素複合 体・標的分子複合体を生成するために標的分子を親和性リガンド・酵素複合体に 接触させるステップと、質量修飾された生成物を生成するために親和性リガンド ・酵素複合体・標的分子複合体を基質に接触させるステップと、質量分析によ り質量修飾された生成物の質量を求めるステップとを含む。 本明細書において「親和性リガンド」とは、前述の質量標識プローブで使用さ れる反応基と同様に、特定の標的分子との親和性を有するかまたはこれと反応す る基、分子、あるいは部分である。親和性リガンドは、特異的な分子認識をでき る生分子例えばポリペプチドあるいはポリ核酸であることもある。有利なポリペ プチドは抗体、酵素、レセプター、調節タンパク質、核酸結合タンパク質、ホル モン、およびディスプレイ法のタンパク質生成物、例えばファージディスプレイ 法あるいはバクテリアディスプレイ法を含む。 これらの親和性リガンドに複合されている酵素は、異なる質量を有する生成物 、例えば制限エンドヌクレアーゼおよびプロテアーゼへの基質の転換を触媒する 任意の酵素であることもある。このようにして基質の質量は、酵素により生成物 の生成において修飾される。親和性リガンド・酵素複合体は、親和性リガンドと 酵素とが、水素結合を含む共有相互作用または非共有相互作用の形成により付着 される分子である。 いくつかの実施の形態では複数の制限エンドヌクレアーゼを使用されると有利 である。これらの場合、種々のエンドヌクレアーゼは親和性リガンドに複合され 、これによりいくつかの親和性リガンド・酵素複合体が形成され、この複合体は 次いで標的分子に接触される。同様に、異なる親和性リガンド、酵素、あるいは 双方を有する複数の親和性リガンド・酵素複合体を使用すると有利である。 基質は、質量修飾された生成物が使用酵素例えばポリペプチドにより生成され る任意の分子であることもある。制限エンドヌクレアーゼを使用する実施の形態 では、従って基質は、制限部位を含む。 図面の簡単な説明 以下の図面は、本明細書の一部をなし、本発明の若干の態様をさらに示すため に含まれている。本発明は、本明細書に記載した具体的な実施態様の詳細な説明 と合せてこれらの図面の１つ以上を参照することで、さらに理解か深まるであろ う。 図１Ａおよび図１Ｂは、質量標識ポリヌクレオチドを調製するための２種の質 量標識したビルディングブロック、すなわち質量標識ヌクレオシド三リン酸(図 １Ａ)および質量標識ヌクレオシドホスホルアミダイト（図１Ｂ）の、一般化さ れた例を示す図である。これらの図で、Ｂは塩基を指し、Ｒは任意の放出結合を 指し、Ｍは質量標識を指す。リンカー試薬を介するポリヌクレオチド合成後に、 質量標識を付加することも可能である。 図２Ａおよび図２Ｂは、反応基内に放出基が含まれ、且つ放出された質量標識 が１種以上の反応基のモノマーを含む、質量標識プローブの例を示す図である。 図２Ａに、デオキシリボヌクレオチドおよびジデオキシリボヌクレオチドおよ びその組み合わせを含む、ヌクレオシド三リン酸を使用して、ポリメラーゼによ って伸長する（工程Ａ）か、オリゴヌクレオチドを使用してリガーゼによって伸 長することができる、オリゴヌクレオチドプライマーとしてのプローブの使用を 示す。リガーゼを使用して、オリゴヌクレオチドを５'末端ならびに３'末端に結 び付けることが可能である。付加されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド ならびにプローブ内のヌクレオチドモノマーは、場合に応じて修飾されたヌクレ オチドまたは非天然の模擬ヌクレオチドで構成されていてもよい。質量標識生成 物の放出（工程Ｂ）前に、伸長された質量標識プライマーの捕捉に使用すること ができるビオチン（標識されたＢ）のような固相結合基も示す。放出後、質量標 識生成物を質量分析法で分析する(工程Ｃ)。質量標識の非反応基成分はＭｘで表 示され、ｘは、この成分が１個の分子量を有してもよく、規定の質量の２個以上 の分子の結合体を表す可能性もあることを意味する。この成分が単一の分子量を 有してもよく、規定の質量の２個以上の分子の組み合わせを表してもよいことを 意味する。Ｍｘ成分は、場合に応じて、反応基に完全に含まれていてもよく、 ヌクレオチドまたは非天然の模擬ヌクレオチドを含んでもよい。質量標識生成物 の質量測定は、ヌクレオチド組成物およびプローブに隣接する塩基配列を同定す る手段を実現する。 図２Ｂに、質量標識プローブが、１つのヌクレオチド多型性を検出するための プライマーとして機能する具体的な例を示す。工程Ａで、鋳型核酸にハイブリッ ド形成した後、可能な４つの塩基から選択して、ヌクレオチド鎖ターミネーター またはその質量修飾バージョンを付加するのに、ポリメラーゼが使用される。プ ローブ伸長後、質量標識生成物が放出され（工程Ｂ）および質量分析法で分析す る。図２Ａと同様、プローブは、場合に応じて、放出工程の前に、プローブを結 合して洗浄するのに使用することが可能な固相結合基を含んでもよい。この例で は、Ｔ鎖ターミネーターを加えると質量標識生成物の質量が２９８Ｄａ増加し、 鋳型内の標的の位置にＡが存在することを示す。 図２Ｃは、１つのヌクレオチド多型性の決定に質量標識プローブを使用するた めの異なる実施態様を示す図である。質量標識プローブを鋳型にハイブリッド形 成し、１つの鎖終結ヌクレオチドを組み込むポリメラーゼで伸長する。質量標識 生成物の放出（工程Ｄ）前に、伸長した質量標識プライマーの捕捉に使用される ビオチン（標識されたＢ）のような、固相結合基を含むように鎖終結ヌクレオチ ドを修飾する。この例では、プローブがハイブリッド形成する位置に隣接した位 置に、Ａヌクレオチドが存在するか否かを確認するためにプローブが使用されて いる。反応は４つの鎖終結ヌクレオチド全部を含む可能性があるが、固相結合基 を担持するようにＴ鎖ターミネーターのみを修飾する。したがって、Ｔが結合し 、且つ鋳型にＡが存在しさえすれば、質量標識プローブは修飾されて固相に捕捉 される(工程Ｂ)。放出（工程Ｄ）前に洗浄工程（工程Ｃ）を使用すると、Ｔが結 合しなかったプローブは全て除去され、それらの質量標識が系から除去される。 固相に結合したプローブ（工程Ｂ）のみが質量分析系で検出される(工程Ｅ)。 質量標識はＭｘで表示され、ｘは、この成分が１個の分子量を有してもよく、規 定の質量の２個以上の分子の結合体を表す可能性もあることを意味する。多くの 異なるプローブの多重送信が可能である。放出基Ｒｅは、質量標識をプローブに 接続するリンカー内に入れてもよく、またプローブのバックボーンの任意の位置 に配置してもよい。この方法論は、ヌクレオチドと鎖終結ヌクレオチドの組み合 せを使用する事例、ならびに、固相結合基を含むように個々の成分を選択される 場合、オリゴヌクレオチドに拡大することが可能である。 図３Ａおよび図３Ｂは、各々が独特の質量標識１つまたは質量標識の組み合わ せを有する核酸プローブの混合物を生成するための一般化された図式(図３Ａ)、 および、特に、ＤＮＡポリメラーゼ（工程Ａ）またはリガーゼ（工程Ｂ）を使用 して、質量標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチド配列 に組み込むための一般化された図式を示す図である(図３Ｂ)。 図３Ｂは、不変領域および可変領域を含む核酸プローブを示す図である。不変 領域は、任意であり、ファミリー内の全プローブが、同一またはほぼ同一の配列 を担持する。可変領域は、可能な配列全部またはそのサブセットを幾つか含む。 一例として、可変領域がヌクレオチド４個の長さの場合、２５６の異なるプロー ブを作ることができ、可変領域がヌクレオチド６個の長さの場合、４０９６の異 なるプローブを作ることができる。各プローブと関連して、配列は質量標識１つ または質量標識の組み合せである。いずれの場合にも、選択した質量標識は各配 列独特である。組み合わせを使用する場合、質量標識（標識されたＭ）は、同一 配列を担持する異なるプローブに付着した単一の標識であってもよく、１つのプ ローブに付着した多様な標識であってもよく、それらの組み合わせであってもよ い。 図３Ｂは、質量標識されたプローブのファミリーを使用して核酸鋳型をスクリ ーニングすることが可能な、２つの実施態様を示す図である。鋳型へのプロー ブの簡単なハイブリッド形成に加えて、ポリメラーゼ（工程Ａ）またはリガーゼ （工程Ｂ）のいずれかを使用して、プローブを伸長することが可能である。いず れの場合にも、付加される核酸生成物の配列を同定する、さらなる質量標識（標 識されたＭ^*）を担持するヌクレオチドまたはオリコヌクレオチドを使用するこ とが可能であり、したがって、プローブハイブリッド形成事象当たりの決定され る鋳型配列総計が増大する。好ましい実施態様では、鋳型は固相に結合している 。あるいは、プローブに付加されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、 固相結合基を含んでいてもよく、プローブの単離、および固相捕捉を介した付着 が可能になる。図解の通り、Ｘ−Ｙは、プローブの可変領域内のＷａｔｓｏｎ− Ｃｒｉｃｋ塩基対を表し、Ｎ−Ｍは、付加されたヌクレオチド配列またはオリゴ ヌクレオチド配列中のワトソン・クリック塩基対を表す。 図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃは、質量標識プローブを作成するための異なる組 み合わせアプローチ(図４Ａ)、ベクター挿入物のスクリーニングにおける質量標 識プローブの使用(図４Ｂ)、および大型質量標識ポリヌクレオチドプローブを作 成するための転写およびＰＣＲを含む酵素的方法を示す図である。 図４Ａでは、組み合わせ標識を使用して、オリゴヌクレオチドの複合セットを 標識する方法について説明する。この例では、２５６の可能な配列の組み合わせ を含む、長さが４ヌクレオチドの可変領域を有する一組のプローブについて説明 する。これより短い可変領域または長い可変領域も可能である。１６の異なる質 量標識の一組を使用して、２５６の組み合わせ全部に独特である質量標識サイン を作る方法が、表および例のリスト（Ｃ）に示されている。２つの異なるアプロ ーチを使用して標識プローブを作ることが可能であり、第１（Ａ）では、各々、 塩基および合成の位置に応じて使用される異なる質量標識を含む、１６の異なる ホスホルアミダイトが使用される。このアプローチは、４つの標識を上に有する 一組の分子をもたらし、１つの反応として実施される。合成を複数のポットに分 割し、分子当たりの標識数を減らすために標準ホスホルアミダイトを幾つかの適 所で使用する場合、変形が可能である。第２の組み合わせアプローチ（Ｂ）は、 質量標識を付加する前に１６の異なる反応で２５６の組み合わせを予備合成する 方法である。その各々を使用して、４つの位置のうちの１つにおける４塩基のう ちの１つを明確にする方法である。オリゴヌクレオチド合成後、１６の異なる反 応の各々を、１６の異なる質量標識の１つと組み合せる。最終生成物は、プール 内の各プローブが特異的標識を１個だけ含むものである。第２のアプローチは、 質量標識がオリゴヌクレオチド合成に直接連結していないため、質量標識の配置 およびタイプに、より大きい柔軟性を与える。オリゴヌクレオチド合成後方法を 使用するとき、特に、２５６の組み合わせを全て別々に合成するのであれば、究 極的な柔軟性のある、より多数の反応でオリゴヌクレオチドセットを合成すると き、オリゴヌクレオチド合成方法の他の標識方法を考えることができる。いずれ のアプローチを用いても、図４Ａに示す通り、合成は不変合成領域を任意に含む ことが可能である。可変領域は、不変領域内の１つ以上の不連続な塩基も含むこ とが可能である。これらのプローブは、可変領域がヌクレオチド１個だけの長さ である単一のヌクレオチド多形性を含む診断用途およびゲノム用途において、多 形性のスクリーニングに応用することが可能である。 図４Ｂでは、組み合わせ標識プローブを使用して、ｃＤＮＡおよびゲノムクロ ーンを含む、クローニングベクター内の挿入配列に隣接している多形配列をスク リーニングする方法について記載する(Ａ)。プローブ内に不変配列を使用すると 、既知のベクター配列と、既知の配列にハイブリッド形成するプローブの不変領 域およびその未知領域内の補体を選択する可変領域を含む未知の挿入配列との間 の接合点に、プローブを固定することができる(Ｂ)。これらのプローブを使用す る方法は、クローン挿入端の一方または両方への単純なハイブリッド形成、図３ Ｂに記載のヌクレオチド伸長物またはオリゴヌクレオチド伸長物、および 挿入物のコピー１つを作るためのプライマー伸長用または増幅用のプローブの使 用を含む。所与の挿入配列の場合、ＰＣＲ増幅において前方プローブおよび逆プ ローブを使用すると、セットの中から前方プローブただ１つと逆プローブ１つと を選択し、増幅生成物が生成する。この技術を使用すると、多数の異なる選択的 質量標識放出方法論と組み合せて配列を同定することができる。 図４Ｃは、転写（Ａ）またはＰＣＲ増幅（Ｂ）のいずれかを使用して、質量標 識ポリヌクレオチドプローブを作る、２つの異なる方法を示す図である。質量標 識プローブの合成におけるＲＮＡ転写の使用は、プロモーター配列（標識された Ｐ）から下流である配列領域に限定される。一般的な合成手順では、１種以上の 質量標識を担持していてもよい質量標識バージョンを含む、ＲＮＡポリメラーゼ およびリボヌクレオシド三リン酸を使用する。転写プロモーターを担持する転写 ベクター、および下流に転写されるべきクローン挿入配列を（Ａ）に示す。この ベクターは、転写物の長さをコントロールするために、任意に切断することが可 能な、１つ以上の制限部位（標識されたＲ）も担持する。（Ｂ）に示す通り、Ｐ ＣＲを含め、実質的に任意の増幅技術を使用して質量標識プローブを作ることが 可能である。ＰＣＲ増幅は、プライマーの間に位置する配列の指数的増幅を可能 にするために、２つの対立するプライマーを使用することが必要である。プライ マーの一方または両方に１個以上の質量標識を配置してもよく、質量標識ヌクレ オシド三リン酸を使用して、任意に組み込んでもよい。 図５Ａおよび図５Ｃは、酵素的に合成された質量標識プローブを用いたミスマ ッチ特異的技術を使用して突然変異を検出する方法を示す図である。一般に、こ の方法論は、ミスマッチを含む二本鎖生成物を形成するための、正常な核酸と、 突然変異核酸または多形核酸との交差ハイブリッド形成、ミスマッチ部位におけ る酵素的切断または化学的切断、および１つ以上の質量標識を放出するためのプ ローブの切断誘導性消化を必要とする。図５Aから図５Bに続けて示した例では、 ＰＣＲを使用して二本鎖質量標識核酸プローブを合成し(Ａ)、その生成物の３' 末端をエキソヌクレアーゼ消化から遮断し(Ｂ)、塩基対ミスマッチの形成をもた らすＤＮＡ担持突然変異体にＰＣＲプローブをハイブリッド形成し(Ｃ)、このミ スマッチを切断し(Ｄ)、切断生成物を３'〜５'ヌクレアーゼで消化し(Ｅ)、質量 標識を放出させ(Ｆ)、質量分析法で分析する(Ｇ)。３'エンドヌクレアーゼ封鎖 基の例としては、３’末端付近に組み込まれたヌクレオチド模擬物、たとえば、 ボラノホスフェートまたはホスホロチオエートを含むヌクレオチド、または縮小 セットＰＣＲ中に生成されるか、あるいは３'突出を認識したり消化したりしな い二本鎖特異的３'〜５'ヌクレアーゼ、たとえば、エキソヌクレアーゼIIIと組 み合せたターミナルトランスフェラーゼによる鋳型非依存性伸長によって生成さ れた３'突出の使用が含まれる。(D)で使用するためのミスマッチ特異的切断剤の 例としては、化学物質OsO₄、ＫＭｎＯ₄およびＨＯＮＨ₂、および酵素、たとえば 、ｍｕｔＨＬＳ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、ｍｕｔＹ ＤＮＡグリコシラー ゼ、チミンミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼなどがある。 ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを使用する方法も可能である。。 図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、ペプチド結合したヌクレオシド三リン酸の合 成方式(図６Ａ)、放出基、ジスルフィド、および何か他の質量標識成分のペプチ ドを末端ににカップリングするための末端アミノ−修飾を含むリンカー分子を有 するオリゴヌクレオチド(図６Ｂ)、およびペプチド結合したヌクレオシドホスホ ルアミダイトの合成方式（図６Ｃ）を示す図である。 図７Ａおよび図７Ｂは、例１Ｄの非複合オリゴヌクレオチド（図７Ａ）および オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体（図７Ｂ）の質量スペクトルを示す図であ る。図７Ａのスペクトルは、ｍ／ｚ ７０５２における所望のオリゴヌクレオチ ドのシグナルのほかにも、塩基が１個少ないものおよび塩基が３個少ないものに 相当する、２つの重大な合成失敗の存在を表すシグナル、およびこれらの 各々に関する二重荷電イオンのシグナルも含む。図７Ｂのスペクトルは、精製さ れた複合体が、出発オリゴヌクレオチドと同様の純度のものであることを示す。 図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄは、エキソヌクレアーゼIII消化後の、 緩衝液中の、ハイブリッド形成した質量標識プローブおよび標的の質量スペクト ル(図８Ａ)、エキソヌクレアーゼIIIを用いずにインキュベートした質量標識プ ローブおよび標的の質量スペクトル(図８Ｂ)、エキソヌクレアーゼIIIと共にイ ンキュベートした緩衝液中の質量標識プローブの質量スペクトル(図８Ｃ)、非相 補的３６ｍｅｒの標的の存在下で、エキソヌクレアーゼIII緩衝液と共にインキ ュベートした質量標識プローブの質量スペクトル（図８Ｄ）を示す図である。こ れらの図からわかるように、質量標識は、エキソヌクレアーゼおよび相補的標的 鎖の存在下でのみ放出される。 図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、放射性標識プローブ(図９Ａ)、蛍光標識プロ ーブ（図９Ｂ）および質量標識プローブ（図９Ｃ）を使用した固体支持体グリッ ドアッセイを比較する図である。 図９Ａは、間隔をあけたグリッド上に配列した核酸試料を精査する古典的アプ ローチについて説明する図である。一般に、ｍＲＮＡ単離物、ｃＤＮＡクローン 、ゲノムクローンを代表する核酸試料を、ナイロン膜またはフィルターグリッド （Ａ）上に配列する。試料を共有結合的に膜に付着させるための光架橋工程後、 溶液中の、放射性プローブ（Ｂ）(標識されたＡ)を加え、グリッド（Ｃ）と共に インキキュベートする。プローブは、核酸試料がプローブと相補的な配列の長さ を含むグリッドの適所にハイブリッド形成する。洗浄工程後、グリッドをＸ線フ ィルムに暴露し、ハイブリッド形成の位置を同定する（グリッドのＡ位置で表示 される）(Ｄ)。 図９Ｂは、図９Ａの方法の、蛍光標識プローブ（Ｂ）の使用への拡大を示す図 である。異なる蛍光標識は放射スペクトルが異なるため、少数、たとえば、４ 種（標識されたＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の、異なる標識をした蛍光プローブを多重送信 して、グリッド（Ｃ）に交差ハイブリッド形成することが可能である。蛍光を使 用する場合、蛍光走査技術を可能にするために、フィルターや膜よりむしろガラ スプレート上にグリッドを構成してもよい。 図９Ｃは、核酸サンプルのグリッド配列に対してハイブリッド形成するための 質量標識プローブ（Ｂ）(標識されたＡ〜Ｓ)の使用を示す図である。単一標識技 術または組合せ標識技術のいずれを使用しても、数１００万種の異なるプローブ を作り、全てを同時に配列に対してハイブリッド形成することが可能である。グ リッド（Ｄ）は、ナイロン膜であっても何か他の伝導性材料であってもよく、ハ イブリッド形成、洗浄、質量標識放出、およびマトリックス付加工程の後、質量 分析計で直接走査することが可能である。グリッドの各位置を質量分析計で走査 すると、各々独特のプローブと関連のある、多くの可能な質量標識シグナルの１ つが明らかになる。このテクノロジーを使用するアッセイの代表例は、グリッド 状に配列されたｃＤＮＡクローン、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは増幅したｃＤＮＡ プールに対する既知の遺伝子特異的プローブの使用を含む。ゲノムプローブは、 既知のものも未知のものも、グリッド状に配列されたゲノムクローンに対する。 ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ｃＤＮＡは既知のグリッド状に配列された遺伝子に対 する。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、蛍光を用いる系（図１０Ａ）および質量標識系（ 図１０Ｂ）を使用したライブラリー発現分析を比較する図である。ｍＲＮＡ由来 のｃＤＮＡプール対の蛍光標識を使用して、遺伝子発現パターンを、２つの異な る生物学的試料間で交差比較する 図１０Ａでは、１つのｃＤＮＡプールを蛍光タグＡで標識し、もう１つのプー ルを蛍光タグＢで標識する(Ａ)。これらのプールは、標準化された濃度を有し、 混合されている(Ｂ)。次いで、一般にｃＤＮＡクローンとして配列された、 グリッド状に配置された既知の遺伝子の参照配列に対して、プールの混合物をハ イブリッド形成する。ハイブリッド形成後、配列を蛍光測定法で走査し、各位置 について、２つのタグの比率を測定する。所与の位置で、タグＡがタグＢの強度 の２倍であれば、その位置にグリッド状に配列された遺伝子は、試料Ａは試料Ｂ と比べて２倍の濃度で、ｍＲＮＡとして発現される。 図１０Ｂは、競合的ハイブリッド形成ｃＤＮＡプールの概念を２つのプールレ ベル以上に拡張する。放出可能な質量標識を使用すると、多くのより多くのプー ル（Ａ）(標識されたＡ〜Ｈ)を調製する手段、交差競合的ハイブリッド形成(Ｂ) 、および全て同時に発現されたメッセージの、多くのより多いプールの検出（Ｃ ）が実現する。 図１１は、質量分析法による分析のために、核酸プローブから質量標識を放出 する基本原理を表す図である。質量標識Ｍ１は、化学的または酵素的のいずれか で放出され(Ａ)、質量分析法で検出される(Ｂ)。 図１２は、核酸プローブを標的ＤＮＡ配列にハイブリッド形成した後の、質量 標識の選択的放出を表す図である。質量標識核酸プローブ（Ａ）は、１つより多 い標識を含んでもよく(表示の通り)、異なる質量標識の質量を有し(表示せず)、 相補的核酸標的にハイブリッド形成して(Ｂ)、二本鎖複合体（Ｃ）を形成する。 この複合体は、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼにより認識されるため、このプ ローブは消化され(Ｄ)、プローブから質量標識を放出する(Ｅ)。漸進的なエキソ ヌクレアーゼの場合、この工程は、プローブ全部が消化されるまで継続する(Ｆ) 。次いで、質量分析法で消化を分析し、放出された質量標識を検出する(Ｈ)。質 量標識は、エキソヌクレアーゼで消化されるとき、少なくとも1つのヌクレオチ ドを含む。 図１３は、ＡがアンギオテンシンＩであり、ＢがサブスタンスＰであり、Ｃが ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（配列番号２）であり、ＤがＴＣＶＥＷＬＲＲＹ ＫＮ（配列番号７）であり、ＥがＣＳＲＡＲＫＱＡＡＳＴＫＶＳＡＤＲ（配列番 号８）であり、Ｆが酸化されたＡ鎖インスリンであり、Ｇがメルチンである場合 の、ＭＡＬＤＩ質量分析法によるペプチドＡ−Ｇの分離を表す図である。 図１４は、一連の遺伝子特異的質量標識核酸プローブを使用して、所与の試料 内の、異なる標的ｍＲＮＡを検出し、その量を測定する方法を示す略図である。 核酸（Ａ）の出発プール、すなわち、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー、ま たはｍＲＮＡ由来の核酸の増幅多重送信を一組のメッセージ特異的質量標識核酸 プローブ（Ｂ）(異なる質量標識、すなわち標識されたＡ〜Ｓを有するプローブ) と混合する。この混合物をハイブリッド形成させると、プール中で相補的メッセ ージを見つけるプローブは二本鎖複合体を形成し、遺伝子特異的二本鎖複合体の 濃度は出発物質中に存在するｍＲＮＡのレベルに比例している(Ｃ)。二本鎖複合 体の形成後、この混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ、たとえば、エキソヌクレ アーゼIIIで処理すると、ハイブリッド形成していたプローブから質量標識を選 択的に放出する(Ｄ)。放出された質量標識（標識されたＡ〜Ｓ）を質量分析法で 分析する（Ｅ）と、検出された各質量標識の量は、出発物質中に存在するｍＲＮ Ａレベルに比例している。選択的放出工程は、二本鎖化学的放出プローブならび に固相捕捉方法を任意に使用して、二本鎖プローブと未ハイブリッド形成一本鎖 プローブとを識別することが可能である。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、２つの質量スペクトルを表す図である。図１５Ａ では、リボソームタンパクＬ７のｍＲＮＡを標的とする一対の質量標識プラーマ ーを使用して、ｒｔＰＣＲ^TM反応を実施した。ＰＣＲ^TM後、反応混合物を二本鎖 特異的Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理した。二本鎖ＰＣＲ^TM生成物が形 成されたときだけ、エキソヌクレアーゼが生成物を消化し、スペクトルの２つの ピークで示される通り、２つの質量標識を放出する。図１５Ｂでは、一本鎖、質 量標識プライマーをＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼと共にインキュベートす る、コントロールを実施した。消化は起こらなかった。 図１６は、７種の異なるｃＤＮＡプラスミドにハイブリッド形成し、次いでエ キソヌクレアーゼIIIで処理した、一連の７種の異なる質量標識プローブの放出 を表す図である。二本鎖特異的消化物の一部をとり、質量分析法で分析した。各 質量標識シグナルで標識されたＡ〜Ｇに相応するピークを有する質量スペクトル を示す。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、質量標識プライマーおよびビオチン化ジデオキシ ヌクレオシド三リン酸を使用したＳＮＰ分析による２つの質量スペクトルを示す 図である。図１７Ａでは、鋳型上の多型性塩基とビオチン化ジデオキシヌクレオ シド三リン酸との間で相補的ミスマッチが生じる。質量標識プライマーが伸長さ れ、したがってビオチン化されると、これはストレプトアビジン被覆表面上に捕 捉され、洗浄され、次いで表面から切断される。図１７Ｂは、多型部位の塩基が 、反応中に存在する相補的に適合しない反応の、質量スペクトルを示す図である 。プライマー質量標識に関する質量スペクトル測定法的シグナルが欠如している ことによって立証される通り、プライマーの伸長は起こらなかった。非伸長プラ イマーは、ストレプトアビジン被覆表面上に捕捉されず、その後の洗浄液中に除 去される。 図１８は、多重送信ＳＮＰ分析による質量スペクトルを示す図である。３種の 異なる多形部位用の３種の異なる質量標識プライマーは、全て同時に、ビオチン 化ジデオキシヌクレオシド三リン酸で伸長した。３種の伸長プライマー全てをス トレプトアビジン被覆表面上に捕捉することができ、洗浄して非伸長プライマー を除去し、次いで表面から切断した。 図１９Ａおよび図１９Ｂは、多形部位の数塩基先に伸長が実行され、ビオチン 化ジデオキシヌクレオシド三リン酸を介してビオチンが組み込まれるＳＮＰ分析 による２つの質量スペクトルを表す図である。反応中の三リン酸エステルの混 合物は、デオキシ−ＡＴＰ、ビオチン化−デオキシ−ＣＴＰ、およびジデオキシ −ＴＴＰから成る。 図１９Ａでは、プライマーの３'末端の１塩基先に位置する、鋳型上の多形部 位はＴである。多形部位は、反応中のビオチン化ジデオキシヌクレオシド三リン 酸のうちの１つに相補的に適合するため、プライマーは、多形部位の先に伸長し 、続いて、ジオキシヌクレオシド三リン酸による連鎖伸長を終結する前に、ビオ チン化−ｄＣＴＰを組み込む。 図１９Ｂにスペクトルを示す反応は、鋳型上の多型部位がＡである反応である 。したがって、プライマーの先の最初の塩基にジデオキシＴＴＰが組み込まれ、 ビオチン化ｄＣＴＰの組込み前に連鎖伸長が終結し、その結果、質量スペクトル にシグナルが欠如する。 図２０Ａおよび図２０Ｂは、３'末端塩基のみが異なり、且つ各々が独特の質 量標識を含む、３種のプライマーの混合物をビオチン化ジデオキシヌクレオシド 三リン酸で伸長するプライマー伸長分析による２つの質量スペクトルを表す図で ある。図２０Ａでは、質量スペクトルは、主に、３'末端塩基（プライマーＡ） が、反応に使用した鋳型に完全適合しているプライマーに関するシグナルを示す 。図２Ｂのスペクトルは、３'末端塩基が異なるプライマーに適合するような方 式で、鋳型が図２０Ａの反応から変化しており、主にプライマーＥの伸長からの シグナルを与える。 図２１Ａおよび図２１Ｂは、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡに関する、化学的切 断速度を比較する２つの質量スペクトルを表す図である。５'−Ｓ−Ｐ結合を含 む切断可能なオリゴヌクレオチドは、ＡｇＮＯ₃で切断できる。２つの切断反応 を実行する。第１の反応では、切断剤を加える前に、切断可能なオリゴヌクレオ チドを相補的オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成し、二本鎖にする。第２の 反応は、一本鎖オリゴヌクレオチドに対して実施する。図２１Ａの質量スペ クトルは、二本鎖ＤＮＡの切断による生成物を表す。切断生成物は、質量６５６ ０Ｄａおよび１４７０Ｄａに予期され、未切断オリゴヌクレオチドは８０１２Ｄ ａに見られる。図２１Ａのスペクトルから、約５％の切断が起こったに過ぎない ことがわかる。図２１Ｂのスペクトルは、一本鎖オリゴヌクレオチドの切断によ るものであり、同一条件で、切断が約９０％完全であることを示す。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、遺伝子特異的ＲＮＡ転写物のプローブアッセイに よる２つの質量スペクトルを表す図である。２種のエキソヌクレアーゼII消化反 応を実行する。両反応で、２つのプローブの混合物が存在し、鋳型はＲＮＡ転写 またはＲＮＡが転写されるＤＮＡ ＰＣＲ生成物鋳型から成る。プローブの１つ だけがＲＮＡ転写物に相補的であり、他方は向かい合った鎖に相補的である。し たがって、ＤＮＡ ＰＣＲ生成物から質量標識シグナルが得られる場合、両プロ ーブに関するシグナルがみられるが、ＲＮＡ転写物からシグナルが得られる場合 、ただ１つのシグナルが見られる。 図２２Ａでは、質量スペクトルは、結果として生じる、ＲＮＡ転写物が存在す る反応に関する放出質量標識を表す。第２の反応は、第１の反応に存在するより も１００倍多い量のＤＮＡ ＰＣＲ生成物を含み、ＲＮＡ転写物は全く含まない 。 図２２Ｂは、第２の反応から生じる質量スペクトルを示す。両プローブからの シグナルが存在することによって、図２２ＡのシグナルがＲＮＡ−ハイブリッド 化プローブから生じることが確認される。 図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃおよび図２３Ｄは、ＭＡＬＤＩ用の２つの異な るマトリックスの検体選択性を比較する、４つ一組の質量スペクトルを表す図で ある。比較に使用した試料は、オリゴヌクレオチドとペプチドとの複合体の選択 的化学的切断によって得られたヌクレオチジル化ペプチドとオリゴヌクレオチド との等モル混合物である。図２３Ａおよび図２３Ｂは、２，５−ジヒドロキ シ安息香酸マトリックス（図２３Ａ）および３−ＨＰＡマトリックス（図２３Ｂ ）を用いて得られた同一試料のスペクトルを比較する。ペプチドおよびオリゴペ プチドに関する脱着選択性またはマトリックスの効率が異なるため、図２３Ａで はペプチドシグナルが優勢であるが、図２３Ｂのスペクトルではオリゴヌクレオ チドが優勢である。図２３Ｃおよび図２３Ｄのスペクトルは、イオン化選択性が 普通であることを示す異なる試料を用いて同じ比較をする。 図２４は、核酸標的配列を検出および計量するための二本鎖質量標識核酸プロ ーブの使用を表す図である。二本鎖プローブ内に含まれるものは、適当な条件で 、核酸プローブが一本鎖であるときに切断するにすぎない、化学切断基である。 一本鎖のときに切断速度の増強を示す化学切断機の例としては、化学的に不安定 な核酸バックボーン修飾、たとえば、５'−（Ｓ）−ホスホロチオエート、５'− （Ｎ）−ホスホルアミデート、３'−（Ｎ）−ホスホルアミデート、およびリボ ースなどがある。核酸標的配列の精査は、二本鎖プローブ（Ａ）と一本鎖標的（ Ｂ）との結合、および平衡条件下での変性およびアニーリング（ｃ）を含む。質 量標識および一本鎖特異的放出基（標識されたＲｅ）を含むプローブ鎖は、標的 核酸と相同であり、相補鎖は標的にも相補的である。この平衡事象のその他の生 成物は、質量標識された、切断可能な一本鎖の形の鎖(Ｄ)、および標的にアニー リングされた相補鎖（Ｅ）である。質量標識鎖から放出され、標的にアニーリン グされ相補鎖の量は、標的核酸の濃度に比例している。アニーリングステップの 後、プローブを一本鎖特異的化学切断剤（Ｆ）で処理すると、切断された一本鎖 プローブ（Ｇ）が生成し、質量分析法で検出し、定量する(Ｈ)。本明細書に記載 の他の質量標識プローブを用いた場合と同様、質量標識は、核酸プローブまたは 反応基の中に完全に含まれていてもよく、部分的に含まれるだけであってもよく 、また核酸模擬物の使用を含んでもよい。 図２５は、酵素結合アフィニティーアッセイにおける質量標識基質の使用を 表す図である。標的分子（標識されたＴ）がタンパクである場合（Ａ）および核 酸である場合（Ｂ）を具体的に示してある。図解（Ａ）では、抗体（標識された Ａｂ）を使用して固相結合標的を認識する。シグナルの生成に使用される酵素（ 標識されたＥ）に抗体を結合させる。この特定のアフィニティーアッセイで、酵 素は質量標識基質（標識されたＭＸ）を認識し、これを、この例では、２つの生 成物（標識されたＭおよびＸ）を形成するための切断事象である生成物に変換し 、これを質量分析法で分析する。質量標識基質に関する第一の必要条件は、基質 に化学部分を付加するか、基質から化学部分を除去するかのいずれかによって、 基質か生成物に変換されるとき、酵素が基質の質量を少し変えることである。図 解（ｂ）では、抗体が核酸プローブに置き換えられ、次い、これがシグナル生成 酵素に結合される。このアッセイは極めて汎用性があり、当業者はプローブと標 的、ならびに使用可能な酵素と質量標識基質との様々な組み合わせを同定するこ とができるであろう。 図２６は、酵素結合アフィニティアッセイ用の質量標識基質の２つ例を示す図 である。２例、すなわち（Ａ）制限エンドヌクレアーゼ部位（標識されたＲ）を 含む二本鎖オリゴヌクレオチド、および（Ｂ）特異的タンパク分解結合を含むポ リペプチドを具体的に示す。両例ともに、配列特異的切断活性またはモノマー特 異的切断活性のいずれかを示す様々な制限ヌクレアーゼおよびプロテアーゼが存 在するため、酵素と質量標識基質の能力範囲を発展させることが可能である。こ れらのクラスの酵素を使用すると、複数のアフィニティアッセイを同一反応バイ アル内で同時に行うことが可能である。全て、質量弁別可能な質量標識生成物を 生成する。本明細書に記載の他の質量標識プローブを用いた場合と同様、質量標 識は、核酸基質またはポリペプチド基質の中に完全に含まれていてもよく、部分 的に含まれるだけであってもよく、また核酸模擬物または非天然アミノ酸の使用 を含んでもよい。実施態様の説明 本発明は、化学分析に使用する放出可能かつ不揮発性質量標識の組成と利用に 関する。この質量標識は、質量分析器によって検出される。本発明はまた、あら ゆる形状の質量標識の利用における新規の方法をも開示する。本発明で使用され る「不揮発性」という用語は、純粋かつきれいな状態の分子が加熱された状態で存 在する場合、有意な程度にそのまま昇華しない分子を指して使用される。また、 不揮発性化合物という定義には、汎用ガスクロマトグラフィーをサンプリングス テップに使用する場合、質量分析法によって事実上検出不可能な純粋できれいな 状態の化合物が含まれる。揮発性質量標識に対して不揮発性質量標識を使用する 利点は、試料混合物が放出後において物理的に安定であることにある。ここで開 示した質量標識は、目的のターゲットと特異的に反応できるプローブ分子に付着 する。若干の場合、特別の放出基が、プローブの質量標識の科学的結合に含まれ る。 室温では無視できるほど微少な蒸気圧を有する質量標識であっても、上記の定 義によれば揮発性であると考えられる質量標識を使用することも可能である。本 発明において、室温ではほとんど蒸発しないプローブ分子が放出した新規質量標 識は、効率よいエレクトロフォアではない。このカテゴリーに属する分子は、非 揮発性質量標識と命名される。 本発明の化合物は、多様な２分子間相互作用を検出する上で有用である。代表 的実施態様には、遺伝子塩基配列の同定、非コード型ヌクレオチド塩基配列の同 定、１個の遺伝子またはタンパク塩基配列内部における突然変異の同定、金属の 検出、毒素の検出、１個の有機体または細胞上の受容体の検出、抗体−抗原相互 作用の定性、酸素−基質の相互作用およびリガンド相互作用の定性がある。 A.質量標識 質量標識とは、タグまたはシグナルと同義に利用できる用語である。本発明に おける質量標識のタイプの実例には、種々の化合物が含まれ、好ましくは質量分 析法における類似した脱着特性を示し、多様な質量標識変種の合成をストリーム ライン化するために類似または同一の結合化学特性を有する。本発明における質 量標識は、質量分析法で検出される。質量分析法の技術における代表的タイプに は、マトリクス支援レーザー脱着イオン化、直接式レーザー脱着、電子スプレー イオン化、二次中性および二次イオン質量分析器を含み、レーザー脱着イオン化 が好ましい。質量スペクトルの測定におけるダイナミックレンジは、一般に、シ グナルのプロセシングおよび分析における指数増幅器および／または可変式アテ ニュエーションを利用することによって拡大できる。ペプチド混合物を質量分析 法で分離した例を図13に示す。 質量標識には、バイオポリマーおよび合成ポリマーを含む多様なタイプの混合 物の広範なアレーが含まれる。単量体または重合体として質量標識に使われる代 表的な生物学的単量体ユニットには、アミノ酸類、非天然型アミノ酸類、核酸、 糖類、炭水化物、ペプチド模擬物、拡散模擬物がある。好適なアミノ酸類には、 単一の胞肪族炭化水素側鎖を含むもの(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン およびイソロイシン)、芳香族側鎖を含むアミノ酸(フェニルアラニン、トリプト ファン、チロシンおよびヒスチジン)、酸素およびイオウを含む側鎖を含むアミ ノ酸(セリン、スレオニン、メチオニンおよびシステイン)、カルボキシル基また はアミノ基を含む強塩基を伴うアミノ酸類(リジンおよびアルギニン)、およびプ ロリンがある。上述のアミノ酸類の誘導体はまた、単量体ユニットとして企図さ れている。本発明におけるアミノ酸誘導体は、その構造体内部において、αアミ ノ酸が置換されたカルボキシル酸からなるアミノ酸の基本核を含む化合物であり 、アザゼリン、フルオロアラニン、ＧＡＢＡ、オルニチン、ノルロイシン、シク ロセリンを含む代表例がここに含まれるが、これに限定されない。上述のアミノ 酸から派生したペプチドも単量体ユニットとして使用できる。代表的実 施態様には、分子量約500ダルトンの天然型ペプチドおよび合成ペプチドが含ま れ、好ましくは分子量約500〜5000ダルトンのペプチドが含まれる。糖類の代表 的実施態様にはリボース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトー ス、およびその他の炭素数2-7個の鎖からなる糖誘導体が含まれる。代表的多糖 類には、上述の糖ユニットが配糖体結合によって結合した糖ユニットの組成物が 含まれる。あらゆる単一の質量標識内部における重合ユニットの配列は限定的な ものではなく、全体質量がその標識にとっての鍵となる特徴を示す。 本発明におけるモノマーユニットはまた、ヌクレオベース化合物から成ること もある。本発明で使用されるように、ヌクレオベースという用語は、その構造体 内部にプリン、ピリミジン、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または前述の ものからの誘導体すなわち保護ヌクレオベース、プリン誘導体、ピリミジン誘導 体、葉酸誘導体、メチルホスホネート誘導体、ホスホトリエステル誘導体、ボラ ノホスフェート誘導体、またはホスホロチエート誘導体等を含むあらゆる部分を いう。 本発明による質量標識はまた、特定の質量値を有し、バイオアッセイ中におい て水溶性の状態のまま存在し、質量分析法で検出される有機または無機ポリマー をも含有する。重合体において質量単位に使われる代表的な合成モノマー単位に は、ポリエチレングリコール、ポリビニルフェノール、ポリメチルメタクリレー ト、ポリプロピレングリコール、ポリピロール、およびこれらの誘導体が含まれ る。広範なポリマーがすでにAllcock et al（1981）等の参考文献類に基づいて 、本発明における周知技術の一つとして利用でき、この文献は、本発明中で使用 することを企図した多くの付加ポリマー類の特徴を開示している。ポリマーはモ ノマー単位１個から成るか、またはモノマー単位を複数組み合わせた形となって おり、これらが混合ポリマーを作り出す。あらゆる１個の質量標識中におけるポ リマー単位の配列は厳密なものではなく、全体質量がこの標識の鍵となる特徴を 示 している。 約500Da以下の質量を有する不揮発性質量標識では、通常、有意なイオン的特 徴が必要であり、代表的実施態様は4級アンモニウム塩のポリエチレングリコー ルオリゴマー（R-CO-CH₂-CH₂）n-N(CH₃)₃+・Cl-）であり、カルボキシル酸のポ リエチレングリコールオリゴマーおよびその塩（R-CO-CH₂-CH₂）n-Co₂-・Na+)で ある。 非揮発性質量標識の例は、代表的には分子量約500Da未満のポリエチレングリ コールの小型オリゴマーと小型ペプチド（天然型または改変型の）を含む。これ らの例においては、本発明において考慮されるすべての例において、質量分析は 電子付加によるものではない。 本発明における質量標識はまた、非重合性の多様な不揮発性および非揮発性有 機化合物をも含んでいる。不揮発性有機化合物の代表的実施態様にはヘム基、発 色団、有機金属化合物、ステロイド類、フレルゲン、レチノイド、カロチノイド および多重環芳香族炭化水素が含まれる。 前述のポリマーまたは混合ポリマーの質量標識に加え、本発明における質量標 識にはまた、質量変動型ポリマー成分および非ポリマー性質量安定型成分を含有 する混合質量標識が含まれる。代表的実施態様には、ポリマー成分を伴う１セッ トの質量標識が含まれ、このセット内における反復ユニットの数は約10から100 の範囲にあり、各ポリマーは固定された巨大質量の化合物である。好適な実施態 様においては、１個のセット内の質量標識がすべて同一の質量安定型成分を含有 する。この好適な化合物セットにおいて、ポリマーの長さは漸増式の１セットの 質量標識を伴う１セットの質量標識を提供するよう変更され、質量標識間では比 較的均一なシグナルを有する。 以上の化合物は、希望するスペクトル特性を示す質量標識を使う手段を提供す るが、多様な質量からなる巨大なレパートリーには利用できない。プローブ上で 多重式質量標識を使う場合は、シグナルの重なりを避けることが好ましい。１価 の荷電を伴う質量標識に対する多重の１次シグナルを提示することに加え、１個 の質量標識の二量化を行うのと同時に、１個の質量標識を多価に荷電するバージ ョンの可能性もある。１個の質量標識用多重シグナルは、重なりを生じ、２番目 の質量標識に対する第１ピークに対するシグナルが不明瞭になる恐れがある。こ のため、該当する分析に使う質量標識の代表的範囲は、多価でなく、二量体が全 質量標識の検出を妨げることがあり、たとえば、質量標識の質量範囲において、 最小質量標識が最大質量標識の半分以上の値を示すことがある。 Ｂ．反応基 質量標識は典型的に反応基に付着している、特に、本発明の反応基は、分子を 特異的に認識する能力のある、いかなる生物分子であってよい。特に、この反応 基は、標的分子との特異的な相互作用を行うものであって良い。この相互作用は 、非共有結合性の作用であり、例えば、オリゴヌクレオチドのDNAターゲットへ のハイブリダイゼーションであったり、または架橋形成等の共有結合性のもので ある。本発明の代表的反応基には、ポリペプチド-抗体、酵素、ポリ核酸、脂質 、ステロイド、炭水化物、抗生物質、およびある種のDNA配列に好適なネオカル チノスタチン等の化合物が含まれ、ポリ核酸が好ましく、さらに好ましくはオリ ゴヌクレオチドが含まれる。代表的ステロイドホルモンには、エストロゲン、プ ロゲスチンおよびアンドロゲンが含まれる。 代表的な反応基-標的分子相互作用には、オリゴヌクレオチド−オリゴヌタレ オチドハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチド-ポリヌクレオチド相互作用 、酵素-基質反応、または基質誘導体／中間体相互作用、ポリペプチド-核酸相互 作用、タンパク-リガンド相互作用、受容体-リガンド相互作用、脂質-脂質相互 作用、炭水化物-炭水化物相互作用、ポリペプチド-金属相互作用、核酸-金属相 互作用、または抗原-抗体相互作用が含まれる。 ある実施態様においては、このプローブが合成オリゴヌクレオチドまたはDNA 分子、RNA分子、またはそれら分子の変化体となる酵素合成型オリゴヌクレオチ ド、ペプチド核酸等となる。このオリゴヌクレオチドは代表的に、実質的に相補 性の配列と選択的に結合する。本発明で使用されるように、実質的に相補的な塩 基配列は、その配列中で相補的なヌクレオチドと塩基対をつくるのが一般的であ り、塩基対のミスマッチがきわめて少数であるが存在する。このポリヌクレオチ ドは、10-mer程度で比較的小さいか、またはプラスミド中の1kbの挿入部分程度 の大きさがあるか、1kbの増幅核酸(アンプリコン)、または長いRNA転写体である 。ポリヌクレオチドは、ターゲットより大きいか、小さいか、あるいは全く同じ 多きさである。プローブには質量標識が含まれているので、そのことによってタ ーゲットと識別される。 反応基とターゲットとの共有結合性相互作用として代表的な例は、架橋形成剤 と反応して活性化され、ターゲット分子とコンジュゲートを形成する反応基がこ れに含まれ、たとえば抗体-抗原相互作用、酵素-基質相互作用、受容体-リガン ド相互作用、受容体-膜相互作用またはタンパク-核酸相互作用がある。代表的な 架橋形成剤には、EDCまたはMBS等の化学的活性化架橋形成剤、およびSADPまたは PNP-DTP等の光活性化架橋形成剤がある。 Ｃ．質量標識放出法 いくつかの実施態様においては、図11に示す質量標識核酸プローブのように、 質量分析に先立って反応基の全部または一部から質量標識を放出させることが重 要である。この理由により、放出基が望まれる。多くの手段によって放出を行い 、質量標識と反応基との間の固定化化学結合もこれに含まれる。本発明で使用さ れる固定化化学結合は、二次化学試薬、光、酵素または熱にうよる処理において 、一部を開裂させ、質量標識を放出させる。これらの結合には化学的に開裂可能 な、燐酸をバックボーンとする結合内部に含まれる基(フォスフェートとフェス フォ ルアミデートと置換する等)、またはオリゴヌクレオチドプライマー上の塩基ま たは糖の１つと置換して、置換体として存在する(さらに不安定なな配糖体結合 等の改変塩基または改変糖等)。このような化学的に開裂する基は本発明の開示 に照らして周知である技術の一つとして明らかであり、たとえば3'-(S)-ホスホ ロチオエート、5'-(S)-ホスホロチオエート、3'-(N)-ホスホロアミデート、5'-( N)-ホスホアミデート、およびリボースが含まれる。また、実験的にみると、相 補性の鎖にハイブリダイゼーションするよりは１本鎖の形で存在する場合のほう が極めて迅速にこのような基を開裂させる。このような動力学的選択性の実例を 、例9に示す。化学的な開裂部位は一般に増幅時、ハイブリダイゼーションおよ び洗浄条件を実施する時点では安定でなくてはならない。固定化e化学的な例は このほかに、ジアルキル・タートレート等の酸化によって開裂を受ける基から成 るリンカー、ビス［2(アルコキシカルボニルオキシ)エチル］スルホン等の塩基 を開裂できる基、フルオライドイオンまたは酸を使った処理において開裂するシ リルエーテルおよびケタル類、光により放射活性化されて開裂するオルソ・ニト ロベンジル・エーテル、ジアルキルジスルフィド等により還元されて開裂する基 がある。 好適なlabile化学リンケージには、2-メルカプトエタノール等のスルフヒドリ ル試薬で処理して生成するジスルフィド結合が含まれ、ジスルフィド結合を２つ の-SH基に還元する。プローブから化学的に開裂した質量標識にとって、質量分 析法にかけた場合に可視化されそうな反応基モノマーを除去するか、または洗い 流すことが好ましい。 しかし、本発明におけるその他の実施態様においては、放出基が反応基内部に 含まれるので、付加的結合基はこれ以外には不要である。こうして、放出された 質量標識は、特定の質量標識に結合したままの反応基全体を含まないか、または 一部を含むか、あるいは全部を含むことになる。反応基内部に含まれる代表的な 放出基には、ポリペプチド中に含まれるアミノ酸類の問の内因性ペプチド結合と 、ポリヌクレオチド内部の塩基間に含まれる内因性ホスホジエステル結合がある 。反応基がポリヌクレオチドの場合、質量標識は、プローブヌクレオチドバック ボーンを酵素（ヌクレアーゼ）で消去する間か、またはプローブヌクレオチドバ ックボーンを酸誘導型消去を行っている間に放出する。これらの内因性結合は、 反応基内部の特異的配列を標的とするため改変されることがある。例には、ホス ホロチオエート、ホスホルアミデート、およびジアルキル・ケタル等の改変型ホ スホジエステル結合が含まれる。ヌクレオチド配列はまた、II型またはIIS型制 限酵素等のエンドヌクレアーゼ（制限酵素）により認識されるよう誘導される。 ある種の実施態様では、ホスホジエステル結合がエンドヌクレアーゼ酵素で認識 されるために、放出基となる。温度で変化しやすい放出もまた企図される。代表 的例には、DNA標的からのハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドの熱 による溶融、またはタンパクの温度依存性熱変性による結合分子放出がある。 特異的ペプチド結合は、ポリペプチド反応基内部において誘導されることがあ る。例には、CNBrで認識されるメチオニン等の化学薬品によって特異的に開裂す るペプチド結合、またはエーテル・イソ安息香酸またはBNPS-スカトールによっ て開裂できるトリプトファン等がある。ペプチド結合はまた、トリプシン等の応 訴によって認識されるべく誘導されることもある。 放出基としての内因性結合の詳しい例には、配糖体結合における化学品または 酵素による開裂がある。本発明において周知の技術では、広範な放出アプローチ が、本発明の目的においてなされていることが認識されている。 D.質量標識の選択的放出 本発明において、一つまたはそれ以上の異なる核酸プローブの利用に関与して 開示されている実施態様のいくつかにおいては、質量標識化した核酸プローブが 、特別事象の発生に相関しているある種の質量標識における選択的放出に依存し て いる。たとえば、質量標識の放出は、特殊な質量標識核酸プローブｔｐ核酸標的 配列との間にハイブリダイゼーション事象が起こったことを示している。選択的 放出のアプローチは、図12に示すように、二本鎖内に存在するハイブリダイゼー ションしたプローブのみを標的としたヌクレアーゼ消去と関わっている。たとえ ば制限エンドヌクレアーゼとDNase１のような多数のヌクレアーゼは、２本鎖の 核酸のみを消去する。この結果として、このような酵素による処理は、標的配列 に首尾よく結合している核酸プローブから質量標識のみを放出する。放出しない 場合、S1ヌクレアーゼのように、１本鎖配列上に存在する核酸のみを認識するヌ クレアーゼは、ハイブリダイゼーションに関わらないプローブのシグナルを得て 、データを同定する目的で使用することが可能である。 長さが少なくとも10-14ヌクレオチドであるハイブリダイゼーション用プロー ブを使用すると、安定な上に選択性のある二本鎖分子を形成することができる。 長さが10塩基対以上に伸びた腕上にある隣接する相補的配列を有する分子は、ハ イブリッドの安定度と選択性を増大させる目的で利用する。一般的には、長さ約 15〜20の隣接ヌクレオチドを有する相補的ストレッチを有する核酸を設計したい と望むであろうし、希望があれば、さらに長いヌクレオチドが好ましい。たとえ ば、約25、約30、約35、約40、約45、または約50の隣接ヌクレオチド等を設計し たいと望むであろう。このコンテクストにおいて、「約」という用語は、核酸が 1個から4個のヌタレオチドからなる長さまで幅をもっていることを示す。たとえ ば、「約25」という語は21,22,23,24を含むと理解できるし、「約30」という語は、2 6,27,28,29を含むと理解できる。「約35」は31,32,33および34を含むと理解でき る等である。 ハイブリダイゼーション用プローブは標的配列のあらゆる部分から選択される 。プローブおよびプライマー配列の選択は、実施態様の方法等によって様々な因 子により行われるが、これらに制約を受けることはなく、全体の配列において末 端 部近くの領域か、あるいは機能性ドメインコード配列の末端部からプライマーを 選ぶか、またはDNA全体に相当するプローブを使用することがある。プローブは 、ヒトを含む多数の種間で相同性を示す遺伝子を同定するよう設計されるか、ま たは、野生株、ヒトまたはその他のヒト以外の被験体を同定するべく設計された 配列を伴う突然変異プローブまたはプライマーを操って、突然変異を保持し、疾 患その他薬理学的試薬に感受性を示したりすることもある。 ハイブリダイゼーションに関わる様々なパラメータには、温度、時間、塩濃度 およびホルムアミド濃度がある。ハイブリダイゼーションは、安定性のある非並 列的複合分子を、核酸分子の相補的ヌクレオチド塩基が特異的に水素結合するよ う仕向ける手段であると理解されている。 核酸中の２つの相補的鎖が、それらの相補的塩基相互の水素結合が形成される ことによって溶液中でアニールするか、またはハイブリダイゼーションする傾向 は、溶液中における１価または２価の陽イオンの濃度に厳密に依存する。ナトリ ウム(Na+)は、２倍体の核酸の安定度に影響を及ぼす塩濃度を決定するために使 用されてきた。Na+濃度が閾値を超えると、核酸中で互いに相補的な２本の鎖が （DNAまたはRNA）各鎖における１本鎖上での塩基の相互作用によって水素結合し 、DNAまたはRNAの二本鎖、またはDNA-RNAのヘテロ型二本鎖を形成する。互いに 相補的な塩基はアデノシン(A)とチミジン(T)(DNA中)、またはアデノシンとウリ ジン(U)(RNAの場合)、およびDNAならびにRNAにおけるシトシン(C)とグアニン(G) である。２本の水素結合は対になったAとT、またはAとU残基との間で形成される 一方、C-Gの塩基対は3本の水素結合が形成された結果つくられる。G-C塩基対はA -UまたはA-T塩基対よりも強固な相互作用となる。一般的には、水素結合(２倍体 形成を導く)は、互いに相補的でない塩基間では起こらない。２本の１本鎖から 安定な2本鎖２倍体をつくる能力は、互いに並列方向にない、直線化した複数の 鎖が存在する場合等において、互いに相補的な各鎖における塩基の配列に依 存して変化する。あらゆる相補的塩基間の水素結合は弱い結合エネルギーを提供 するにすぎないが、多くの配列化した塩基対間の集約的結合エネルギーは、適正 な引力を提供して、安定な２本鎖の状態に鎖を保持する。陽イオンは相補鎖の形 成傾向を増強し、ホスホジエステル結合におけるホスフェート基の陰電荷間を質 量クして水素結合を生じさせ、核酸鎖の「バックボーン」を形成する。低濃度の正 電荷イオンでは、陰に帯電した鎖間にはたらく反発力が１本鎖または改変鎖を好 み、陽イオンの濃度が上昇すると、陰電荷が質量クされて水素結合を介した相補 型塩基対ができて、２倍体の核酸分子が形成される。ミスマッチ（非相補的）塩 基対を含む２倍体においては、相補的でない２本の鎖における、１本の、対を作 らない部位が、RNase保護アッセイにおける１本鎖特異的RNaseの標的を提供する 。 陽イオン濃度以外のパラメータは、代替性２本鎖または１本鎖コンホーメーシ ョンにおいて相補鎖を形成する傾向がある。温度は重要な因子となる。２倍体核 酸分子の入った溶液の温度が上昇すると、A-Uを多く含む領域間の水素結合が最 初に切れて、G-Cを多く含む領域は最後に切れ、限定された温度に上昇するまで は、互いに相補的な鎖は離れた場所にある。２本の鎖の組成、すなわちGC含量% は、与えられたイオン強度における２倍体熱変性の厳密な温度を決定する。当然 の結果として、GC%もまた、所定温度における２倍体の安定度を維持するために 必要なNa+濃度の閾値を決定する。溶液中における２倍体核酸分子の安定度はま た、溶媒の特徴によっても影響を受ける。たとえば、ホルムアミド中(水素結合 を安定でなくする)では、２倍体は、水溶液中と比べた場合、はるかに不安定で 、この事実を利用して、分子生物学者は、より低い温度における核酸ハイブリダ イゼーションを達成している。 温度、塩濃度、核酸の鎖長および組成、ならびにホルムアミド濃度等の主要な 因子に対する２倍体形成を関連付けた式が、次のように誘導されている。 1.Tm＝81.5-16.6(log[Na⁺])＋0.41（%GC）-600/N （Tm＝２倍体の半分が熱変性する温度；N=鎖長） 2.Tm＝81.5-16.6(log[Na⁺])＋0.41（%GC）-0.63(%ホルムアミド)-600/N 一連の条件下において、2本鎖または１本鎖内部に相補鎖が存在するか否かを 予測することができる。相補鎖が安定な2倍体を形成するよう条件を選択すれば 、理諭上は２倍体が酵素による核酸溶解反応(DNaseおよびRNase)に耐性を示し、 １本鎖分子におけるホスホジエステル結合の開裂に特異的となる。さまざまなタ イプのヌクレアーゼが存在し、基質に対する特異性も異なっている。RNase保護 アッセイ中に共通して使用されるRNaseは、１本鎖RNA分子中の特別な塩基が開裂 した場合に特異的である。２倍体の安定度を保つのに必要なNa+濃度閾値以下で は、相補的RNA鎖が１本鎖に変性され、これがRNaseによる崩壊における基質とな る。RNase Aによる消化に対する感受性は、相補鎖が１本鎖か２本鎖分子のいず れの状態で存在するかをたしかめる機能的アッセイとなっている。ハイブリダイゼーション 標準的アニーリングおよびハイブリダイゼーション手順は、Sambrook et al.( 1989)に開示されている。このような手順により、一般的には、２個以上の核酸 、たとえば試料プローブと被験試料核酸を混合し、熱変性後に相補性アニールを 起こす条件におくか、または水素結合によって塩基対が２本鎖を形成する条件に おく。熱変性した鎖はハイブリダイゼーションしたと言われる。たとえば、混合 液を約90℃から約95℃に約3分間加熱し、それからゆっくりとたとえば42℃にま で下げて、一定時間おき、相補鎖の水素結合を起こさせる。相補鎖のアニーリン グを起こす所要時間は、各鎖の濃度によって変化し、数分(被験用の複数の核酸 濃度とプローブ濃度が共に高いような反応の場合)から、核酸濃度またはプロー ブ濃度のいずれか一方が低い場合に数時間から１晩反応させる場合がある。この ために、高濃度のプローブと被験試料核酸を使う利点は、PCR増幅および／また はPCR増幅を行った配列の転写等のような場合に認められる。 具体化した適用法によっては、さまざまな条件のハイブリダイゼーションを行 って、標的配列に近づくプローブの選択性の度合いを変化させることになる。高 い選択性を有する適用法の場合は、代表的に比較的厳重な条件でハイブリッドを 形成させ、つまりは比較的低い塩濃度および／または高温条件すなわち0.02M-0. 15MのNaClで50-70℃で実施する。このような選択的条件では、ほとんどの場合、 プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチが許されることはない 。 もちろん、若干の適用法では、たとえば使用中のテンプレートにハイブリダイ ゼーションする突然変異型プライマー鎖を操る突然変異体を同定したい場合、ま たは近縁の種、機能的に等価な種等からタンパクコード配列を単離する場合、ほ とんど厳密でないハイブリダイゼーション条件によって、代表的にヘテロ二倍体 の形成が行われている。このような環境下では、0.15M-0.9M塩のようなより緩や かなハイブリダイゼーション条件で実施するであろうし、温度を20-55℃の範囲 におくであろう。交差ハイブリダイゼーションする種は、このようにして、対照 用ハイブリダイゼーションに対して、積極的にハイブリダイゼーションするシグ ナルとして同定される。さらには、ホルムアミドの添加量を増やすことによって さらに厳密になることになり、温度上昇と同じ方法でハイブリッド形成した２倍 体の安定度を不安定にする。このため、ハイブリダイゼーションの条件は、希望 する結果を得るために前もって探索しておく。放出方法 標的核酸にハイブリダイゼーションした質量標識化核酸プローブを選択的に消 去するヌクレアーゼを利用すると、シグナルを１次関数的に増幅することができ る。たとえば、核酸プローブのみを消去し、標的を消去しない能力をもつヌクレ アーゼを使い、２本鎖特異的なエキソヌクレアーゼを使って、短い直線のプロー ブを、末端部のない円状の標的の存在下において消去し、エキソヌクレアーゼの 消去を開始させる。長い直線状の標的はまた、エキソヌクレアーゼが隠れている か、または平坦な２本鎖末端部である必要のある場合に使われる。プローブが標 的にハイブリダイゼーションすると、標的が消去されて、標的から消去画分が放 出し、プローブの２次コピーがハイブリダイゼーションする余地ができる。２次 プローブは消去され、再び標的が次のハイブリダイゼーションから解放される。 ハイブリダイゼーションと消去の反復サイクルによって、溶液中で放出した質量 標識の量を一次関数的に増幅させ、この結果として質量分析器におけるシグナル の数が増える。このような系を使うと、シグナルを数百倍に増幅できる。Okano and Kambara,1995(エキソヌクレアーゼIII)；Copley and Boot,1992(λエキソヌ クレアーゼ)を参照のこと。 ヌクレオチドの放出現象はまた、本発明で説明した方法によっても実施される 。たとえば、フォスフィンまたはメルカプタン等の化学薬品を使用することによ り、ジスルフィド放出基の非選択的開裂を使用する。 ある種の実施態様において、希望する標識の検出は、反応基または標的集団の 特異的分割によって変化する。たとえば、特定の標識を認識し結合する反応基は 、特異的な位置に固定化されている。たとえば、標的配列または核酸配列がフィ ルタ、グラス、金またはビーズを束にしたベッド等の固体保持装置上のグリッド の位置に付着させることもある。標的配列にハイブリダイゼーションしない質量 標識化オリゴヌクレオチド（プローブ）を、ハイブリダイゼーションしたプロー ブと分離して、フィルマーまたはビーズで洗浄することのみにより、標的を固定 化することがある。こういったアプローチは、配列に非特異的な放出機序が働く 場合に、ハイブリダイゼーションしていないプローブを除去する上で特に好まし い。この逆の場合も行われることがあり、その場合は標識プローブが固定化され て標的がそのプローブにハイブリダイゼーションする。 本発明で述べた方法は、質量標識化核酸プローブへのポリメラーゼ鎖反応 （PCR^TM）等の核酸増幅事象と関わっており、特にプライマーとして利用してお り、第２のプライマーは固体サポートへの結合力があるか、または現実に結合し ている。２次プライマーの例としては、ビオチン部分を含むプライマーがある。 前述の実施態様と同様に、固相への増幅産生物が結合すると、未使用プライマー を洗浄するメカニズムが働き、残留する質量標識を選択的に放出する。 １つまたは２つ以上の異なる核酸プローブを使用する核酸増幅事象は、質量標 識化核酸プローブを転換するべく利用され、１本鎖形状から２本鎖形状へ転換す る場合のプライマーとして使用する。この転換により、２本鎖特異的なヌクレア ーゼを利用して、増幅に関わっているプライマーへ付着した質量標識のみを選択 的に放出させることができる。未使用のプライマーは、１本鎖のままであり、付 着した質量標識を放出することはない。 本発明の一部としてここに述べたような、１つまたは２つ以上の異なる核酸プ ローブを利用する方法では、標的へのハイブリダイゼーションに続いて選択され たプローブを改変し、こうすることによってプローブ集団を分割できる。このよ うな方法には、２本鎖依存的にビオチン化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ドを、ポリメラーゼまたはリガーゼを使って質量標識プローブの末端部へ添加し 、続いてビオチン化プローブをストレプトアビジン改変表面にて直接捕獲する方 法が含まれる。 別のオプションとしては、質量標識核酸プローブを、放出した未処理質量標識 を選択的に吸着し、それぞれの核酸プローブにまだ付着している質量標識を吸着 しないようなマトリックスを使い、MALDI質量分析機にかけて分析することもあ る。しばしば核酸分子は、放出した質量標識の吸着に効果的なマトリックス上に 吸着しないことがあり、塩等の不純物があるとこの違いが集約する。質量標識核 酸プローブは、厳密な精製を行わなくても、レーザー蒸着質量分析機によって直 接分析されることが代表的であり、たとえば、放出質量標識を未放出標識よりも はるかに効率よく検出できる。別の形態の質量分析機でも同じことがいえる。こ のため、レーザー蒸着質量分析器を使った好適な実施態様では、放出質量標識と 未放出質量標識とを物理的に分離する必要はない。本開示に照らして習熟された 技術では、選択的プローブ分割、ブローブー標識合成、標識放出、標識質量スペ クトルの検出、およびこれらの組み合わせに関わる多様な技術の利用について具 体化する。 E.合成技術 合成中に質量標識を反応基へ添加するか、合成後に反応基を改変する。たとえ ば、障壁を作り出す核酸またはアミノ酸を改変することにより、合成中に反応基 を質量標識するための一般的方法を開発することができる。たとえば、ポリペプ チドまたはポリ核酸を合成中であれば、混合液中へ異なる質量標識化ヌクレオチ ドまたはアミノ酸を添加し、成長中のポリマーへ取り込ませる。質量標識化した ヌクレオチド３燐酸の一般例を図1Aに図解する。本発明の開示に照らして習熟さ れた１つの技術は、多様な付着技術と付着位置を具体化している。一般に、質量 標識の付着が実質的に反応基と標的分子との相互作用、たとえば質量標識の塩基 および相補的標的塩基との水素結合等を妨げてはならず、ポリペプチドを適正に 保持することによって活性化タンパクを形成するのを崩壊させてはならない。さ らには、質量標識化ヌクレオチド３燐酸の場合、この標識がポリメラーゼ酵素に よる多重合を妨げることがあってはならないのが代表的である。 本発明における合成アプローチの一つは、ポリメラーゼに取り込まれて質量標 識化ポリヌクレオチドを産生する改変型ヌクレオチド３燐酸の利用に関わってい る。この方法を使うと、１個の質量標識を多数回複製することによって核酸プロ ーブをロードしやすくなる。ポリメラーゼを元にする方法により、長さ数百から 数千の塩基対をもつきわめて長いプローブを、RNA転写物またはPCRＴＭアンプリ コンへ取り込ませることによって、安価で合成できる。 反応基がタンパクの場合、この質量標識は、タンパクのカルボキシル末端また はアミノ末端へ付着するペプチドを形成するアミノ酸の長さとなる。質量標識の 組成を、反応基を示すタンパクコード領域に近接するDNA配列中へ、直接コード 化する。このDNA配列を二次的に転写し翻訳することによって、ペプチド質量標 識がタンパクに融合した産物を得ることになる。 F.酵素増幅技術 核酸増幅技術はを、質量標識プローブの調製、または標的配列の存在を検出す る目的で使用する。最良の周知増幅法の一つに、PCR^TMがあり、これは、米国特 許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号に詳述され、これらの文 献は引用することにより本明細書の一部をなすものとするものであり、Innis et al(1990年、引用することにより本明細書の一部をなす。)にも記されている。 PCR^TMでは、標的配列の反対側に位置する相補鎖の領域に対して相補的な、２ つのプライマー配列を調製するのが代表的である。このプライマーをハイブリダ イゼーションさせて、試料中に標的配列が存在する場合は、核酸／プライマー複 合体を形成する。デオキシヌクレオチド３燐酸を過剰にDNAポリメラーゼ（Taqポ リメラーゼ）に対して反応混合液中へ添加しても、テンプレート依存性の核酸合 成が可能になる。 マーカー配列／プライマーの複合体が形成されていれば、ポリメラーゼがヌク レオチドの添加によってマーカー配列に沿ってプライマーを伸展させる。反応液 の温度を上下させることにより、伸展したプライマーがマーカーからはずれて、 反応生成物を形成し、過剰のプライマーがマーカーと反応生成物に結合して、プ ロセスが繰り返される。「サイクル」と呼ばれる多数回の増幅は、適正量の増幅産 生物が産生するまで起こる。 逆転写酵素PCRTM（rtPCRTM）による増幅工程は、増幅されたmRNAの量を定量す る目的で実施する。cDNAへのRNA逆転写法は周知であって、Sambrook et al(1989 ) に開示されている。 別の増幅法はリガーゼ鎖反応（LCR）であり、欧州特許第320,308号に開示され 、この文献は引用することにより本明細書の一部をなすものである。LCRでは、 ２つの相補的プローブ対を調製し、標的配列の存在下で、各対がabutするように 標的の反対側に対して相補鎖と結合する。リガーゼ存在下では、2つのプローブ 対が結合して１つのユニットを形成する。温度サイクルによって、PCR^TMに示す ように、結合したligatedユニットが標的から外れて、過剰プローブ対の結合に 対する「標的配列」の役を果たす。米国特許第4,883,750号は、引用することによ り本明細書の一部をなすものであり、標的配列に対するプローブ対の結合に対す るLCRに類似した方法を開示している。 PCT特許出願PCT/US87/00880に開示したObeta Replicaseは、本発明において他 の増幅法として依然として使われている。この方法では、標的領域に相補的な領 域を有するRNA複製配列を、RNAポリメラーゼ存在下で試料に添加する。このポリ メラーゼが複製配列を複写する。 等温法は、その中で制限エンドヌクレアーゼとリガーゼを使って、制限部位の １本鎖内で5'-［α-チオ］-3-燐酸なるヌクレオチドを含む標的分子の増幅を達 成させるために使用され、本発明においては核酸増幅に有用である。かかる増幅 法は、Walker et al.(1992年、引用することにより本明細書の一部をなす)によ り開示されている。 ストランド置換増幅法（SDA）は、ストランド置換および合成に関わる多数回 の回転に関与する核酸の等温増幅法を実施する別の方法である。修復鎖反応法(R CR:Repair Chain Reaction)とよばれる同様の方法は、増幅の標的とした領域を 介していくつかのプローブを熱変性させ、４つの塩基のうち２つのみが関与する 修復反応が続く。ほかの２つの塩基は、検出しやすいように、ビオチン化誘導体 として添加することができる。SDAでは類似のアプローチが使われている。 標的特異的な配列を、循環プローブ反応（CPR）を使って作ることもある。CPR では、非特異的DNAの3'-および5'-配列を有するプローブと、特異的RNAの中間部 の配列とを、試料中に存在するDNAへハイブリダイゼーションする。ハイブリダ イゼーションにあたって、RNase Ｈで反応を処理し、プローブ産生物は、消去後 に放出する明確なプローブとして同定される。オリジナルのテンプレートを別の 循環プローブにアニールし、反応が繰り返される。 その他の核酸増幅産生物には、転写を基本とする増幅系（TAS）があり、核酸 配列を基本とする増幅（NASBA）および3SR（Know et al.,1989年、PCT特許出願W O88/10315。それぞれ、引用することにより本明細書の一部をなす）を含む。 NASBAでは、標準的フェノール／クロロホルム抽出法により増幅用の核酸を調 製し、臨床検体を熱変性させて、溶解バッファで処理し、DNAおよびRNAの単離用 ミニスピンカラムを通し、RNAをグアニジン・クロライド抽出を行う。これらの 増幅技術では、標的特異的な配列を有するプライマーのアニールが関与する。重 合反応に続いて、DNA/RNAハイブリッドをRNaseHで消去して、その一方で２本鎖D NA分子を再度熱変性させる。いずれかの場合、２番目の標的特異的なプライマー を添加することによって１本鎖DNAを完全に２本鎖とし、続いて重合反応を行う 。２本鎖DNA分子をT7またはSP6等のポリメラーゼによって多数回トランスクライ ブする。等温循環反応では、RNAは逆転写されて２本鎖DNAとなり、T7またはSP6 で再度重合される。この結果生じる産生物は、欠けているか完全かによらず、標 的特異的な配列であることを示す。 欧州特許出願第329,822号(引用することにより本明細書の一部をなす)では、 循環的な１本鎖RNA(ssRNA)および２本鎖DNA（ds DNA）の合成法が関与しており 、本発明に使用されている。 出願に続いて、テンプレートから増幅産生物を単離し、特異的増幅が起こって いるかどうかを調べる目的のために、過剰のプライマーを単離することが望まれ る。１つの実施態様では、増幅産生物をアガロース、アガロース-アクリルアミ ドゲル電気泳動により、標準法を使用して単離した(Sanbrook et al.,1989)。 上記の方法の代りに、単離の効率を上げるためにクロマトグラフィー技術を使 用することがある。本発明で使用したクロマトグラフィーには多数の種類がある 。吸着、分離、イオン交換およびモレキュラー・シーブ、およびその他特別技術 を、カラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィーを含む方法がある(F reilelder,1982)。 ビオチン-ストレプトアビジンまたは抗体-抗原相互作用等の、生物学的基本に よる相互作用を使用することによっても、単離を達成することがある。 質量標識を産生物への取り込みに使用する実施態様では、質量標識の検出が増 幅の確認に使われることがある。質量標識をあとで添加する場合、増幅産生物は 配列の増幅を確認する目的で視覚化しなくてはならないのが代表的である。代表 的な視覚化方法の一つには、エチジウム・ブロマイドを使い、紫外線下で視覚化 するゲル染色法がある。この方法の代りに、増幅産生物を放射標識または傾蛍光 標識ヌクレオチドで標識する場合は、増幅産生物をx線フィルムに曝露するか、 または適正な刺激スペクトル下で視覚化して、次の分離へ進む。 Ｇ．化学合成技術 プローブを化学合成する場合は、質量標識を反応基内部で１箇所か２箇所行う 。たとえば、本発明におけるポリペプチド化合物を、ペプチド合成に関する既知 の方法で合成する(Atherton&Shepard,1989)。合成に好適な方法は、標準的固相 法であり、9-フルオレニルメチルオキシカルボキシル(PMOC)保護基(Darlos et a l.,1989)を基本とした方法等であり、グリシン-機能性0-クロロトリチル・ポリ スチレンレジンと一緒に実施する。固相ペプチド合成を使うと、化合物内部にお いて質量標識を戦略的に置換することが可能になる。同様に、たとえばオリゴヌ クレオチドプローブは、配列内部で特定の位置に質量標識したホスホルアミダイ ト改変型を誘導することによって、特異的に標識される。化学合成法を使用する と、プローブの末端部または質量標識がヌクレオチドの塩基へ直接付着していな い場所で、内部リンカー内で置換することかできる。質量標識化ホスホルアミダ イトの一般例を図1Bに図解する。DNAの化学合成法は本発明において周知である( Agrawal,1993)。 異なる質量標識の組み合わせを利用すると、核酸プローブのライブラリーを作 る場合に入手できる独自の質量シグネチャの数を多くできる一方で、わずかにモ デストの異なる質量標識成分のセットを使用するだけで済む。例としては、ポリ メラーゼを基本とする方法と、40個の異なる質量標識化チミジン3燐酸ヌクレオ チドのレパートリーとを、それぞれに独自の質量標識を行うことによって、膨大 な数の異なる標識プローブのアレーを合成することができる。40個のなかから異 なる２個の質量標識を組み合わせる場合、独自の2-質量標識[-401/２!38!-780] を使って780個のプローブを作成することができる。1個のプローブあたり3個の 異なる標識を使うと、9,880個の異なる組み合わせが可能になる[＝40!／(3!37!) ＝9,880]。この傾向は、40個の標識分子プールから質量標識のセットを選んで組 み合わせるこの例を使うと、以下のようになる。4個の標識の組み合わせのセッ トにより、91,390個の可能な組み合わせができ、5個の標識からは658,008個の可 能な組み合わせができる。6個の標識からは3,838,380個の可能な組み合わせがで き、というように続く。ヒトの体内で遺伝子１つずつに独自の質量標識をつける ことによって、想像できるかぎりのプローブがつくられ、この課題に関してはヒ ト以外のあらゆる生命体についてプローブがつくられる。酵素プローブ合成の例 を図4Cと図4Dに図解する。 質量標識ヌクレオチドの混合物を利用する上での代替法は、質量標識化プライ マーの混合物を使う方法である。PCR^TM法等により、増幅法によってつくられた 核酸プローブでは、プライマーの混合物を使い、これにより各プライマーが異な る質量標識と同一のDNA配列を含むことになる。質量標識化ヌクレオチド３燐酸 と同様に、多くの異なる質量シグネチャを調製するために、質量標識・プライマ ーのレパートリーを使う。 単一タイプの質量標識を伴うプライマー混合物に加えて、単一分子内でいくつ かの異なる質量標識を含むようプライマーを調製する。 固相合成法を使う特別な利点とは、複合合成技術によりこれら化合物を改変す る点にある。複合型合成技術とは、多数の化合物ライブラリーを、異なる構築ブ ロックを並べて連結させることによって、同時に大量に生成させる技術であると 定義され、ライブラリーは、溶液中に浮遊する化合物を使って構築するが、好ま しくはビーズ、固形粒子または微生物の表面に現れるもの等の固形支持体に結合 している。複合合成法にはいくつか方法があり(Holmes et al.,1995;Burbaum et al.,1995;Martin et al.,1995;Ohlmever et al.,1993)、スプリット合成または 並列合成もこれに含まれる。スプリット合成は、比較的多数の化合物を少量つく る場合に使う一方で、並列合成は少数の化合物を大量につくる場合に使う。各段 階において、組み合わせを変更して新しい群を形成する。 化合物が完成するまでは、この工程を繰り返す。各粒子は同一化合物の数回分 のコピーを保持するので、分離および精製が容易になる。スプリット合成は固形 の支持体のみを使って実施できる。 並列合成として周知の代替技術は、固形相または溶液中で行う。並列合成を使 うと、別個の容器において異なる化合物が合成され、しばしば自動化される。並 列合成はマイクロタイタープレート中で実施され、予め決めておいた方法で各ウ エルに多様な試薬を添加して、複合ライブラリーを生み出す。並列合成は酵素技 術を使う場合好適なアプローチである。この技術には多くの改変型が素材するこ とが知られており、本発明において使用されている。複合法を使うと、独自かつ 多数の質量標識ブローブを使って、合成される。 １つの実施態様では、各独自配列がプール内で独自の質量シグネチャを持つよ うな方法で同時に可能な配列の組み合わせすべてを合成するアプローチを示す。 合成アプローチでは、１個のオリゴヌクレオチド内で4つの質量標識ヌクレオチ ドからなる独自のセットの利用が関与しており、４つの質量標識からなる１個の セットがポジション１に例外的に使われ、別の４個の質量標識からなる１個のセ ットがポジション２におかれる等になっていく。前記プローブの主要な合成法は 、ホスホルアミダイトケミストリを使った化学的手法であるが、ポリメラーゼの 関与によって１個の塩基添加を含む化学的かつ酵素的方法である。例としては、 すべてのオリゴヌクレオチドからなる複合セットの合成には、10個の塩基の長さ には40個の異なるホスホルアミダイトが必要となる。独自の質量標識を伴う10個 の異なるＡ、独自の質量標識を伴う10個の異なるC、独自の標識を伴う10個の異 なるG、および独自の標識を伴う10個の異なるＴがある。このスキームを図4Aに 示す。 完全プローブのセットを使うことは困難である。これらのアプリケーションに は、固形相への結合アレーまたは別の他のフォーマットにおけるその他の配列中 におけるcDNAの同定用ハイブリダイゼーションアッセイ、マッピングアプリケー ション、およびその他の診断用アプリケーションが含まれる。無作為にPCRTM増 幅アッセイのセットを使うことも可能であり、その場合は、プローブを電気泳動 法によって単離し、対をつくって別のPCRTM産生物を形成するプライマーが同定 される。こういったアプリケーションもまた、短い配列のリードを同定するため に使われる方法である。 プローブの複合合成は、単一の容器中における単一の反応として実施されるか 、または前述のスプリット合成技術を使って実施される。複合合成でスプリット 合成を使用しない場合は、多機能型プローブがハイブリダイゼーションした場合 に配列同定が難しくなる。１式のプローブを使う場合は、1個以上のプローブが 有 意な分量存在する場合、独自の配列を同定するのが難しくなる。特定の標的にハ イブリダイゼーションするプローブの数を制限する上で可能なアプローチは、独 自のアンカー配列を、位置を制限するプローブセットへ付着させて、プローブを ハイブリダイゼーションしやすくする。このアンカー法は、短い配列リードを同 定する場合に使う方法と似ている。可能であれば、前述のように、プローブの末 端に別の塩基を付けて配列を長くし、配列決定と鑑別を改良する。 アンカー式の複合合成プローブを使った特別な例を図4Bに図解する。ゲノムま たはcDNAクローン挿入部をスクリーニングする場合は、アンカー化された不変領 域を使って、挿入部に隣接する既知のベクターへハイブリダイゼーションさせる か、または特定のcDNA挿入部の場合は挿入部のpolyA/T領域へハイブリダイゼー ションさせる。 すでに合成されたプローブに標識を添加する場合は、本発明においては改変後 、プローブ上の様々な化学的活性領域を利用する。たとえば、標識の適正な機能 性により、5-プロパグリルアミノデオキシウリジン上、末端アミノまたはカルボ キシルリンカー、またはシトシン、グアニンまたはアデニンにおける環外アミン のような内側部分の１級アミンと反応する。リンカー形成の可能な基には、非相 同型２機能性架橋形成剤である・al-sac-HNSA(Bachem Inc.,Torrence,CA)、また はPierce Chemical Company(Rockford,IL)から入手できる多様な架橋形成剤が含 まれる。本開示に照らして周知となっている技術の１つは、他の実施態様を提供 している。改変後に多重性質量標識を添加することもできる。 I．非揮発性放出可能型質量標識プローブを使ったアッセイ 前述の質量標識核酸プローブには多数の利用者がいる。標識ポリペプチドは反 応基と特定の標的の間で相互作用が起こるかどうかを検出する目的で使う。代表 的例には、溶液中または固形支持体上で抗原を検出する質量標識抗体、、または 基質を検出するための質量標識酵素が含まれる。本発明において周知の技術の一 つは、標的分子との相互作用を検出するために標識ポリペプチドを使って検出で きるこのような相互作用が多数あることを明らかにする。 本発明に関する１つの好適な実施態様は、特定の標的核酸を簡単に検出するこ とと関係している。 特定の核酸配列を検出するには、多様な理由がある。この理由には、限定はさ れないものの、臨床検体中の感染物の検出、ゲノムDNAまたはRAM、あるいはメッ セージとしてのRNAから派生した増幅産生物の検出、クローン中に挿入された遺 伝子(cDNA)の検出がある。簡単な検出は、核酸プローブと質量標識の調製、放出 および検出に関して本発明で開示した方法をすべて組み合わせることによって達 成される。また、検出量を定量することもある。これら方法のほとんどは、質量 標識の放出の引き金となるハイブリダイゼーション・特異的な事象の利用と関与 しており、標的物質がごく少量しかない場合、増幅技術を使う。 質量分析装置で検出可能な質量標識化合物を使うことの利点は、同時に多くの 標的化合物を平行して検出できる能力にある。現存する蛍光色素が生み出すスペ クトルに重なりがあるために、蛍光強度の増幅の上限は、約10個の異なる標識に 対して発生しやすい。膜保護式レーザー蒸着／イオン化に要する飛翔時間(MALDI -TOF)を使うと、質量分析装置または直接型レーザー蒸着質量分析装置、あるい は電子スプレー式質量分析装置によって、異なる質量標識を1000倍に増幅し、場 合によっては数千倍に増幅できるようになる。標識の不揮発性プールにより、広 範囲の分量と構造を提供できる。この増幅能により、多くの標識プローブを同時 に処理できるばかりでなく、あらゆる個別のプローブを多数の異なる標識により 標識することができる。 Ｊ．１個のヌクレオチドにおける多形性の検出 詳細な実施態様では、１個の塩基の違いを検出している。このアプリケーショ ンでは、感度の高さが要求される。これらのアプリケーションには、「ホットス ポットの」部位突然変異の検出と、１個の塩基における多形性部位の同定(SNP) が含まれる。質量標識化プローブは、多形性を示す部位に隣接する部位にハイブ リダイゼーションするよう調製され、ポリメラーゼを使って、多形性を示す部位 に１個の塩基を添加する。多くの方法によってこの１個の特定の塩基がプローブ に添加される。たとえば、好適な実施態様においては、１個のプローブを使う場 所では、４個の鎖末端部の３燐酸を付加し、各々に質量標識を付加する。相同性 を示すSNPのケースでは、４個の鎖の末端部にあるヌクレオチドのうち１個だけ が、プローブに対する質量標識に関係するよう結合したプローブの末端部に付加 される。プローブと質量標識とを関連づけるようにいくつかのアプローチが試み られる。これらのアプローチには、制限は受けないけれども、化学的に固定化し た機能を有する基を、拡張プライマーのバックボーン内部か、または鎖末端ヌク レオチドにつけるか、あるいは酵素を使ってプライマー拡張産生物内部の１個ま たは２個以上のホスホジエステルまたは配糖体リンケージを開裂する。質量標識 放出点が拡張産生物のバックボーンの内部にある場合、放出された質量標識は末 端ヌクレオチドまたはそれらの質量改変型バージョンを含む。別のバージョンで は、放出点がプライマー伸長産物の内部にある場合、もとの鎖末端ヌクレオチド 自体は、各塩基が独自の質量を有するために、質量標識の全部または一部の役割 を果たす。質量標識がプローブから化学的に外れていない場合は、取り込まれて いないすべてのプローブを除去するか、または洗浄して、質量分析装置で視覚化 されないようにする。 ハイブリダイゼーションしていない標識三リン酸よりも、ハイブリダイゼーシ ョンされた標識融合プローブのほうが高い分子量をもつことになるので、ハイブ リダイゼーションされた質量標識化鎖末端三リン酸の分割は、質量差をもとに行 う。プローブまたは標的もまた、ビオチン／ストレプトアビジンまたは化学的架 橋形成、もしくは紫外線による架橋形成等の多数の手段によって固相に付着する 。 ヌクレアーゼを使い、質量標識化した鎖の末端部のヌクレオチドを、一リン酸と して放出する。取り込まれなかった質量標識鎖末端のヌクレオチドは三リン酸の まま残り、この結果生じた質量が一リン酸にシフトして、どのヌクレオチドが取 り込まれたかがわかる。このヌクレアーゼ法によって、分析前に取り込まれなか ったヌクレオチドを除去することの必要性がなくなる。 その他の実施態様では、多くのSNPsを同時に検出するように、多数のプローブ の多重化を達成している。好ましくは、質量標識が存在し、プールを構成するプ ローブの各々に、独自に付着している。部分的に多形化を起こしている部位で、 ビオチン化した鎖の終末化ヌクレオチドを添加し、プローブ集団を、特定のビオ チニル鎖終末化ヌクレオチドを取り込んだプローブと、取り込まなかったプロー ブとに分離する。例としては、標的を伴う質量標識プローブのプールが４つの反 応に分けられる。第一の反応には、ビオチン化したジデオキシ・アデノシン・三 リン酸のみが含まれ、第二の反応には、ビオチン化したシチジン三リン酸のみが 、第三の反応には、ビオチン化したジデオキシ・グアニジン山林Ｓなんのみ、そ して第四の反応には、ビオチン化したジデオキシ・チミジン・三リン酸が含まれ る。適正なヌクレオチドの存在下で、１個の塩基の伸展に関わるポリメラーゼ依 存性反応が起こり、これに続いて伸展生成物が捕獲され、洗浄されて質量分析器 による解析用に放出される。第一の反応では、Aを１個取り込んだ質量標識プロ ーブだけが視覚化される。第二の反応では、Cを１個取り込んだ質量標識プロー ブだけが視覚化される。第三、第四の反応では、ＧまたはＴを１個取り込んだプ ローブだけが視覚化される。このようにして、数百個のプローブが多重化される と予測されている。 当業者であれば、SNPを読み出すために、多様な単一または多数のプローブを 、質量標識の有無、または質量標識内に発生する質量電荷の有無に基づいて同定 できる。質量標識内の質量電荷に関する別の例には、質量標識が、プローブの3' 末 端に存在する場合がある。ポリメラーゼ依存性の塩基伸展に続いて、質量標識が 放出され、ペナルミテート塩基と同様に、鎖終末化塩基も含まれる。このタイプ のプローブについて、予想される構造を図２に図解する。質量標識と放出部位の 位置決めは、3'末端近くにある別の塩基の位置にするとよい。すべての場合、質 量標識は放出基と、3'末端の間に位置することが望ましい。別の実施態様では、 効率の良い短鎖終末化反応が何であるか、そしてジデオキシヌクレオチドに加え て、いくらかの正常ジデオキシヌクレオチドが存在する。プライマーが伸展した 結果、正味のプローブー式が生じ、鋳型鎖にある相補型塩基に対応するジデオキ シヌクレオチドによって各々の鎖が終末化される。好適な形状の場合、質量標識 は、化学的放出基を含む3'末端近くのプライマー内部に位置している。そのよう な方法では、１個または２個以上のSNPsの検出同様に、短鎖配列読取りに対する 別個の実施態様が現れる。前述のすべてのSNPs検出法が、異なる生成物間の質量 差を大きくするために、異なるヌクレオチドの質量改変型の利用に関わっている 。 SNPsを検出するために、１個の塩基を添加する上での代替法として、好適な実 施態様とは、オリゴヌクレオチドプローブがマッチした場合、マッチしない場合 におけるエキソヌクレアーゼの識別性能をいう。このアプローチに関する実施態 様の一つは、ニック突然変異式PCRTMを伴う放出質量標識を組み合わせた利用法 である。ポリメラーゼ活性に加えて、Taq DNAポリメラーゼは5'〜3'エキソヌク レアーゼとエンドヌクレアーゼを共にもっている。重合化の過程で完全な相補型 オリゴヌクレオチドプローブが設定されると、たとえばPCRTM増幅中において、 このポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を伴う5'末端にアタックし、ハイブ リダイゼーションするには小さくなりすぎる程度まで消去する。しかし、このオ リゴヌクレオチドが5'末端部近くで完全に相補的な形をとらない場合は、すなわ ちミスマッチを起こした場合は、近傍に存在し、プローブ末端部は摩耗したまま で、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性よりはエンドヌクレアーゼ活性によ るアタックを受ける。核酸溶解により開裂した生成物は、質量標識を含むことが 望ましいが、最終的な質量はミスマッチの存在の有無によって変化し、このよう なミスマッチによってヌクレアーゼによる切断がどのように起こるかによって変 わる。エンドヌクレアーゼ活性はハイブリダイゼーションしたプローブ内部での ミスマッチの有無によって影響されると言われる(Holland et al.,1991;Lee et al.,1993)。オリゴヌクレオチド内部における、質量標識の選択的設定は、予想 されるミスマッチとの関連を生じ易く、実際にミスマッチが起こるか否かによっ て異なるシグナルを得ることになる。 質量標識プローブの能力を多数回増幅させることの利点は、多数のSNPsにおい て同時にこれを検出できるようアッセイを拡張できる点にある。特定のSNPを標 的とするプローブが共に、多形性を示す部位に相補的な4つの塩基のうち一つを 含む。質量標識の位置づけは、このプローブがテンプレートに完全に一致し、Ta qポリメラーゼが、原則的に１個のヌクレオチドを含むよう、エキソヌクレアー ゼの活性によって放出される。この他のプローブはミスマッチを生み出し、ポリ メラーゼのエンドヌクレアーゼ活性が、質量標識が１個以上のヌクレオチドを含 むようプローブの切断を開始する。質量標識開裂生成物における質量のシフトに よって、ミスマッチの発生の有無を知る診断ができる。 質量分析器による検出を、MALDIによって行う場合、マッチングプローブから 生じた小さい生成物と、ミスマッチプローブによって生じた大きい生成物とを区 別できるようなマトリクスを使い、小さいほうの生成物を効率よく、または選択 的に吸着できるとよい。2,5-ジヒドロキシ安息香酸、シナピニック酸、α-シア ノ4-ヒドロキシシナミック酸等のマトリクスを使うと、シグナルの強さが低下し て、より多くのヌクレオチドがプローブへ付くようになる(Jensen et al.,1996) 。 １式の50個からなる標識プローブを使うと、1個の試験管内部で25個のビアリ ールSNPsが検出される。すべてのPCR^TMをもとにした検出法にあるように、SNPs の検出限界は、PCR^TMの多重化の限界から生じている。高いスループットの質量 分析器による分析につなぐと、数万個の試料を解析しなくてはならないときに、 多形性の小さいセットを、エキソンのクラスター内部において効率よく分析でき る。 質量標識プローブと、ニック突然変異翻訳式PCR^TMを組み合わせると、PCR^TM増 幅反応の検出と監視を一般法として使用できる。この場合、マッチングしたプロ ーブのみが存在し、特定のプローブを増幅することによって、ターゲットにされ た特定部位のPCR^TMを行った場合にのみ、質量標識が放出する。 これらアッセイの好適な実施態様を不揮発性放出質量標識または非揮発性放出 質量標識に利用する一方で、同位体質量標識、揮発性質量標識(エレクトロフォ アを含む)、蛍光標識、化学発光標識等、その他の標識タイプを利用できる。 K．短配列読み取り 本発明の、別の好ましい実施態様では、短い配列を識別するために、質量標識 プローブを使用することも可能である。特にハイブリダイゼーションと酵素によ る（ポリメラーゼまたはリガーゼ）拡張の組み合わせは、「プライミング」また は固定領域に隣接する短い配列行程を識別する標識プローブと一緒に使用するこ とが可能である。これを行うには３種類の最良の方法がある。第１は、図3Aに例 証した方法である。各種プローブを、２つの分野、すなわち固定配列認識分野（ 特に単独配列または数個の配列からなる）と、無作為化分野（あらゆる可能な配 列をフルセットでまたはいくつかの下位セットで含む）を包含して合成する。プ ローブの固定配列は、特殊な攻撃標的となる核酸内の、単一部位へのプローブの ハイブリダイゼーションを標的とするために用いられる。この標的部位は一般に 不変である。不変配列に隣接する配列は可変性であり、特殊標的によっては、全 配列組合せのいずれかを有してもよい。すべての可能性を探査するために、すべ ての可能性のある第２分野配列組合せを含む各プローブを合成する必要かある。 第 ２探査領域が４基の長さである場合、そのときは256種のプローブを合成する必 要がある。第２探査領域が長さ５基である場合は、したがって1024種のプローブ を合成する必要がある。さらに6基は4096、と言うように続く。各プローブは、 それぞれが切り離し可能な質量サインのような単独の質量標識組合せを所有する ことで、個々に合成することができる。またその代わりに、プローブは、先に記 載したタイプの結合合成方法を用いて、単独の質量記号と共に合成することが可 能である。特に診断プローブに関する実施態様では、少数のプローブ、たとえば 20個未満、だけを生成することが望ましい。 ２分野のプローブは、クローン挿入物の範囲で、末端配列を突き止めるのに役 立つ。一例としては、固定配列分野が、挿入配列のすぐ隣のクローンとして発生 させたベクター配列に再会合する可能性がある。また、可変配列がクローン化し た挿入物に再会合するのに役立つ。クリーニングベクター配列に隣接するクロー ン化挿入物配列に相補性のプローブだけが完全なハイブリッドを形成する。２つ の範囲のプローブは残存しない。記載した方法の一つを使ってハイブリッド形成 したプローブについて質量標識記号を検出することで、プローブ配列およびクロ ーン挿入物配列を明らかにする。その他の応用方法では、標的部位における超変 異性配列領域または突然変異／多形性分析を標的とすることも含まれる。すべて の場合において、プローブの固定配列は、標的範囲の単独領域にプローブを向か わせ、特に変異領域が探査する場所に固定される。 識別レベルを高めるためにまた短配列読みとりに対して読みとり長さを伸長す るために、ポリメラーゼまたはリガーゼのような酵素を使って、固定されたプロ ーブの変異性領域の末端に単一のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを添加 することが可能で、任意に、これら添加について配列を明らかにすることのでき る添加したヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド上に質量標識を含める。どち らかの酵素による塩基の添加で、酵素の作用を可能にするための完全なハイブリ ッドである変異性領域に対して、より厳しい要求を出すことになる。どのように してこれらのプローブ添加が作用するかの例は、図3Bに示している。ポリメラー ゼについては、添加は、プローブの3’末端に行われるべきだが、リガーゼでは 、3’末端でも5’末端のいずれかで起こることが可能である。また、添加の大き さを増大させるプローブ内の変異性領域は、可能性のあるすべての配列を表すた めにかなりより大きなプールを必要とする。オリゴヌクレオチド添加は、必ずし も全部が変異性である必要はない。変異性領域が、変化しない領域を包含してい る場合もいくつかある。そのような拡張が、オリゴヌクレオチド添加の熱力学的 安定性を増大させ、連結を高温でも起こるのを可能にする。変化しないヌクレオ チド配列が、記載した変異性配列と混ざり合う場合も考えられる。 結合ライブラリーも短い配列を検出するのに使われる。しかしプローブが一揃 い全部使われる場合では、有効性レベルで二つ以上のプローブがハイブリダイゼ ーション後に存在する場合、プローブの配列だけを明らかにすることはできない かもしれない。特殊な標的に再会合（ハイブリッド形成）するいくつかのプロー ブを制限する一つの試みは、プローブが再会合できる場所を制限するプローブセ ットに一本の固定した配列を付着させることである。この固定は、短配列読み取 り分析について先に開示したものと類似している。先に開示したように、配列決 定を伸ばすために、また必要であれば識別を向上させるために、プローブの末端 に追加の塩基を加えてもよい。 固定さた、結合によって合成されたプローブを使った特有例は図4Bに示す。ゲ ノムまたはcDNAクローン挿入物をスクリーニングする場合には、固定された変化 しない配列が、挿入物に近接する既知のベクター配列に、またはcDNA挿入物の特 有な例では、挿入物のポリA/T領域に再会合するために用いられる。 これら分析評価のための好ましい実施態様は、不揮発性切り離し可能質量標識 または不揮発切り離し可能質量標識を使用するものであるが、さらに同位体質量 標識、揮発性質量標識(電気泳動を含む)、蛍光性標識および化学ルミネセンス標 識のような他の種類の標識を用いることも可能である。 L．標的とする分割不適当組合せ検出 特別な突然変異が起こりうる確かな場所を事前に知らない場合に、与えられた 配列の範囲で、突然変異の存在を検出することは重要なことである。ヌクレオチ ドプローブを、問題の領域内で単一の突然変異を含み、不適合組合せ形成に至っ ている標的DNAへのハイブリダイゼーションに用いてもよい。本発明の実施態様 の一つでは、3’末端で二重位置特定酵素分解により塞がれた、酵素により合成 されたマス標識プローブが使われた。プローブの3’末端は化学変化または酵素 により塞ぐことが可能である。たとえば、閉塞は、酵素分解に近づけない3’先 端を作ることで実現できる。プローブの標的配列へのハイブリダイゼーション後 、不適当組合せ特定化学的または酵素による切り離し物質で処理することで、不 適当組合せ部位で再会合した組を裂くことになる。代表的な切り離し反応物質に は、KMnO₄およびT4エンドヌクレアーゼVIIがある。その後、エキソヌクレアーゼ IIIのような、二重位置一特定３’−5’エキソヌクレアーゼで、切り離し組を処 理することで、切り離し部位から5’標識末端までのプローブの分解か起こり、 その結果質標識を切り離しする。この方法は、図5Aおよび図5Bに例証している。 または、システムの極性を、プローブの3’末端に質量標識を置き、かつT7遺伝 子6エキソヌクレアーゼのような二本鎖特定5’〜3’エキソヌクレアーゼを用い ることで逆転させることができる。 その他の不適当組合せの例としては、２種の異なる質量標識プローブを用いた 、標的DNAヘテロ接合体の拡大などがある。相違点は、たとえばA:TからG:Cへの 、単一塩基突然変異であってもよい。４つの生成物がpcR^TM反応で生成される。 ２つは元の配列をした完全に同構造の生成物であるが、他の二つは突然変異部位 に不適当組合せを有している。末端転移酵素で処理することで、すべての生成物 に 長い3’張り出しを追加する。化学的または酵素による不適合組合せ特定切り離 しは、二つの同構造組だけ影響を及ぼして使用する。エキソヌクレアーゼIIIも また、切り離された同構造組だけに影響を及ぼして、3’突出により塞がれた配 列を分解することなく質量標識を切り離す。この方法は、図5Cおよび図5Dで明ら かにしているこれらの不適合組合せは、蛍光性標識または放射性同位元素識別の ような、その他の標識付け方法と組み合わせることも可能である。 これら分析評価のための好ましい具体化は、不揮発性切り離し可能質量標識を 使用するためのものであるが、さらに同位体質量標識、揮発性質量標識(電気泳 動を含む)、蛍光性標識および化学ルミネセンス標識のような他の種類の標識を 用いることができる。 M．高度多様化プローブスクリーニング評価 多数の新しい応用方法が、多様化し、質量標識かされたプローブによって、好 ましい方法が数多くの標的を同時にふるいにかけることができるべき範囲で、可 能になった。 さまざまな応用方法には、多数の病原体診断学、複数遺伝子多形性スクリーニ ング、SNP遺伝子類型分類、クローン・遺伝子位置づけ、および遺伝子発現分析 などがある。 ハイブリダイゼーションによる高度多様化分析は、３種類のアプローチの一つ に分類することができる。(A)未知の配列を標的にしたライブラリーに対して既 知の配列で行うプローブライブラリーのハイブリダイゼーション、(B)既知の配 列を標的にしたライブラリーに対して、未知の配列で行うプローブライブラリー のハイブリダイゼーション、（C）未知の配列を標的とするライブラリーに対し て未知の配列で行うプローブライブラリーのハイブリダイゼーション。 アプローチ(A)は、どの配列がふるいにかけられるべきがが先に決定されてい る、診断学、遺伝子類型分類、発現分析、プローブ位置づけのような応用方法に とって有益である。上記の方法の多くがアプローチ(A)で使用することが可能で ある。結合により合成されたプローブは、プローブの配列（およびプローブが再 会合される標的）が後で決定される、すなわち、どのプローブの配列が再会合し たか探査し、決定する、(A)で使用が可能である。結合プローブについて先に記 述したような限界が当てはまる。結合プローブとは対照的に、質量標識プローブ のレパートリーセットを用いることで、ハイブリダイゼーションにより配列する 、または特別な標的配列のためにプローブサインを産出する目的で、短配列の存 在を検出するために、多様化混合物中で使用することができる。 アプローチ(B)は、オリゴヌクレオチド、pcRTM生成物、RNA転写またはDNAクロ ーンのような、さまざまな既知のDNA配列ライブラリーが整えられたり、未知の プローブセットを分割するために役立つ多くの応用方法にとって一つの道筋とな っている。これらの方法は、往々にして、しかし常にと言うわけではなく、探査 に先立って既知の配列を物理的に分割するために、連続した位相配列を用いるこ とかある。応用方法には、差異発現分析のための競合的ハイブリダイゼーション 、高速遺伝子位置づけ、主要ゲノムクローンライブラリーに対抗するセミクロー ンまたは短配列標識(SSTs)、複合感染性因子検出または、多様な方法で探査され るべきその他のサンプル群が含まれる。 アプローチ(C)は、配列を知る必要は無いが、傾向だけを決定する必要がある 場合に有効である。例として、相同関係の度合いまたは２種類またはそれ以上の 種または２種類以上の発現遺伝子セット間の相補性を決定したいときがあるかも 知れない。ランダムまたは半ランダム標的に対するランダムまたは半ランダムプ ローブが、相同関係のパーセンテージ値を明らかにすることができる。これらの 場合においては、異なる特性を提示する、たとえば非同形分類に入るプローブと 標的は、それらお配列を決定するためのさらなる分析のために使われる可能性が ある。このような方法は、遺伝子発見に使用されるかもしれない。 これら３つのアプローチを使った例は、遺伝子発現グラフを評価するものである 。遺伝子発現グラフを評価する最も基本的な方法は、特殊な細胞試料中の各特殊 遺伝子に対して作られる多数のRNAs(mRNAs)メッセージを統計学的に数える方法 である。一つの特殊遺伝子のmRNAコピーが多ければ多いほど、その発現レベルは 高度になる。共通に取られるアプローチは、mRNAを相補的なDNA(cDNA)にコピー し、各cDNAの個々のクローンコロニーを培養皿で成長させるプロセスを通して、 代表的な数のmRNAsを分離する方法である。典型的には、cDNAsは、プラスミドま たはファージミドクローン発現ベクターのいずれかに挿入することでクローン化 され、それぞれバクテリアに形質転換されるかまたはファージ中にパッケージン グされる。それぞれのクローンは、全個体群からもたらされた個々のmRNAを表し ている。クローンセットには遺伝子発現ライブラリーが含まれている。 一般に、クローンをふるいにかけ、どのmRNA/遺伝子がどのクローンに相関す るかを確認するためのゲノム探査で用いられている共通のアプローチは、DNAを 配列する方法である。各cDNAクローン配列の部分は、メッセージ／遺伝子配列だ けを確認する発現配列標識(EST)を創ることで読みとられている。ESTを、先に確 認された遺伝子配列を含むゲノムデータ塩基と比較することで、同一性が確認さ れている。数年後には、ヒトのすべてのEST配列が、既存の公のおよび私的なデ ータベースに入れられることだろう。 特別なクローンライブラリーをスクリーニングするとき、もしかすると１万の クローンを入れたライブラリーかも知れないが、どんな特殊なESTでも何回も現 れてくる可能性がある。特殊なESTが何回も現れるほど、ESTに相関している遺伝 子に対する発現レベルは高くなる。読みとれるクローンが多いほど、それだけES Tデータは現在の発現に対して統計的に代表的なものになる。より多くのクロー ンをスクリーニングすることで、低レベルでの遺伝子発現がますます多く確認さ れるとだろう。 こう考えると、ライブラリーごとに１０万またはそれ以上のクローンをスクリ ーニングできれば理想的であろう。しかし、このレベルは、既存の配列技術を使 うとコストがかかり、非実用的である。典型的に配列する調査では、5,000〜100 ,000ドルの費用で、500〜10,000の試料を分析する。新しいDNA配列技術では、こ の価格は幾分下げることになるだろう。 本発明の質量標識付けハイブリダイゼーションプローブは、遺伝子発現分析の 費用を安くすることができる。プローブアプローチは第１に分析すべき遺伝子に ついての知識を駆使する。遺伝子配列の大部分が数年の内に知られることになる だろうから、新たな技術を用いる必要はない。また、これらハイブリダイゼーシ ョン処置で未知の遺伝子をあらかじめ検出することも可能である。新しい遺伝子 を徹底的に確認するには、新たに発見されたこれら遺伝子のいずれかの配列を決 定するために、ハイブリダイゼーション評価に続く、分離DNA配列分析が必要で ある。 遺伝子発現分析の配列ベースアプローチに対する場合であるように、本発明の ハイブリダイゼーションアプローチは、通常、mRNA個体群をcDNAに転換し、cDNA をバクテリアに変態させ、バクテリアコロニーを培養プレートで増殖させ、バク テリアから派生したプラスミドをスクリーニングする。アプローチ(A)、未知(cD NAクローン)の標的ライブラリーに対抗する既知のプローブライブラリーのハイ ブリダイゼーション、プロセスに従って、スクリーニングすべきクローンを、ナ イロンフィルター、ガラス、シリコンまたは金のような表面上の等間隔配列に、 またはグリッドに配置する。バクテリアコロニーを伴う典型的なプロセスでは、 バクテリア細胞をグリッドに置き、表面にDNAを固定する。cDNAのグリッドは、 探査すべき何万何十万ものメッセージ発現のライブラリーを象徴するものである 。 従来の方法では、一つのグリッドは、一回に、たった一つのプローブ配列で探 査が行われた。典型的には、図9Aに示したように、放射能で標識付けされて行わ れた。末知cDNAのグリッドを据える方式に従って、cDNA配列ライブラリーを、標 識付けされた核酸プローブを含む溶液で湿らす。グリッド−プローブ溶液を、プ ローブに、グリッド内の一つまたはそれ以上の場所で、その補体を再会合させる ために培養する。ハイブリダイゼーションに従って、グリッドは、プローブ−ハ イブリダイゼーション位置を突き止められるように作られている。多数の遺伝子 を表す多数のプローブを使うために、グリッドは複製される必要があり、また各 プローブに対して一枚のグリッドを使用する。蛍光標識を使うことで、一つの試 料範囲内で４種の異なる発色団に増やすことができ、それぞれを、図9Bに示した ような蛍光放出スペクトルのデコンヴオルーションソフトウエアを使って検出す る。しかし、蛍光多重化の実用上の上限は、存在する蛍光発色団により作られる 、広く、部分的に重なるスペクトルのために、およそ１０種の標識になるだろう 。 もっぱら、個々のプローブを標識付けするために、切り離し可能な、不揮発性 質量標識を使用することで、未知の単一グリッドを同時に調べるためにするため に、高度に多様化したプローブセットを使うという手段がもたらされる。核酸プ ローブは、（核酸）の鋳型として既知の配列を有する個々のcDNAsを使って合成 することができる。いずれの場合でも、プローブは、質量標識または単一質量標 識の組合せを使っても良い。合成および質量標識付けに従って、さまざまなプロ ーブを、多様化方式において単一グリッドを探査するために、組み合わせて使用 してもよい。プローブによる調査方法は、模写段階に達するまで、単一の放射性 標識付けプローブのために使われる方法と全く同じである。蛍光体画像またはX 線フィルムを使う代わりに、存在している可能性のある質量標識シグナルを検出 するために各地点で一時的に小体止して、標識を切り離した後、質量分析計内で 走査する。 使用するプローブの数は、作るのに都合が良く、関心のもてる数に止める。一 例として、人によっては、特殊な疾患において重要な働きをする可能性のある10 00ほどの遺伝子に関心があり、また別の人は、5万種の異なる遺伝子を調べたい と思うこともあるだろう。いずれにしても、プローブは、液体取扱いロボット工 学を用いて、マイクロ滴定濃度皿内で結合によって、個々に合成、または生成し てもよい。恐らく各アプローチには、質量標識RNAプローブを生成するための質 量標識ヌクレオチド三リン酸塩を使って既知のcDNA挿入物を含むプラミドのT7RN Aポリメラーゼ転写、質量標識DNAプローブまたは化学的に合成される質量標識オ リゴヌクレオチドプローブを生成するために、質量標識ヌクレオシド三燐酸塩か 質量標識DNAプライマーのいずれかを使った、既知のcDNAを拡大するPCR^TM反応が 含まれる。酵素によるプローブ合成の例は図4Cおよび図4Dに示している。各合成 反応の範囲内で、異なる一つのまたは単独結合の質量標識ヌクレオシド三リン酸 塩が添加され、それによって、新たに合成されたプローブ内で、単独の質量サイ ンを含む。質量標識オリゴヌクレオチドプローブの場合、化学的に合成された結 合プローブを使用することができる。合成に続いて、プローブセットは、主要プ ローブ混合物を作るために、共に混合する。若干の主要プローブ混合物は、望ま しいのであれば、多様化するために調製しても良く、ここでは、各主要プローブ 混合物の各cDNAは単独の結合質量標識サインを有している。そのときは一組のプ ローブセットまたは複数のセットを、図9Cに示したような、多数の異なる未知の 相補性DNAのグリッドライブラリーを探査するために使用してもよい。さまざま なライブラリーを変化に富んだ試料から調製することができる。たとえば、さま ざまなストレスを引き起こす条件またはさまざまな試験薬にさらされた試料、あ るいは時間と共に付加的に変異したような試料である。 遺伝子発現分析のための別の方法はアプローチ(B)のプロセス、すなわち既知 の標的配列のライブラリーに対する未知のプローブライブラリーのハイブリダイ ゼーション、に従う。もっぱら、未知のcDNAに対して再会合させるために既知の 遺伝子プローブを標識付けするよりは、グリッド上に配列した既知の、標識付け していない遺伝子に対して未知のcDNAsのライブラリーを標識付けして、再会合 させることができる。この方法は、図10Aに示したように、蛍光的に標識付けし た未知のcDNA混合物（Schenaら、１９９５、参照により本文に合体）を使った二 つののライブラリーについて記述が行われている。蛍光の場合、最初の位置のcD NAsを、二つに分離した細胞試料から調製する。第１cDNAs混合物の合成を、一つ の特殊蛍光ヌクレオチドの存在下に行い、第２混合物の合成は別の蛍光ヌクレオ チドの存在下に行う。それぞれのcDNAの混合物は、各試料からの比較的多量のさ まざまなmRNAsを反映しており、固体位相面に存在する既知遺伝子のグリッド配 列に拮抗的に再会合させることができる。cDNAがグリッドに再会合し、結合して いない標識付けcDNA洗い落とした後、２種の色素に対して相対的な蛍光明暗度を 、グリッド配列の各位置で測定する。各色素に対する蛍光明暗度が同等であれば 、各試料からの対応するmRNAsが類似のレベルで明示された。もし蛍光明暗度が 、グリッド配列の特殊位置／遺伝子地点で一方の色素が他の一方よりも強い場合 、蛍光性がより強かった試料においてより高いレベルで明示された。 cDNAsを調製するために、蛍光よりも質量標識付け方法を用いることで、多く のさまざまな細胞源から既知のグリッド配列へcDNAを調製し、同時に再会合させ ることが可能になる。同時に比較を行った２つまたは３つだけのcDNAプールの代 わりに、質量標識を使うことで、図10Bに示したように、100でないにしても10の cDNAプールを同時に比較することができる。質量標識は、記載されている、適切 な切り離しメカニズムのいずれかにより切り離すことができ、またグリッドを質 量標識シグナルについて走査することができる。特定のグリッド位置における質 量シグナルの強度は、グリッド上の検出されたcDNAに対応する元の試料の、mRNA のレベルに比例する。匹敵する質量標識の相対比は、グリッド配列上に存在する すべての遺伝子について、あらゆるさまざまな試料間の、遺伝子発現での差異に 関する情報を提供することで決定される。 この同じ多様化質量標識付けプローブの系統的分類法は、大きなゲノムライブ ラリーへ素早く遺伝子を位置づけることを可能にする。P1、PAC/BACおよびYACク ローンのグリッドライブラリーは、cDNAフィルターと同じ方法で調製する。標識 調査を多数回行うことで、敏速に遺伝子を位置づけ、および遺伝子クラスターを 確認する手段が得られる。特別クローン挿入物または遺伝子配列から発生したプ ローブは、ゲノムのまたはcDNAクローンのライブラリーを審査するのに用いられ る。ハイブリダイゼーションイベントは、ゲノムの場合は挿入配列の重なり、cD NAの場合には遺伝子の存在を知らせる。これらのライブラリーは、たとえばヒト 遺伝子プローブで線虫(C.elegans)ライブラリーを探査する、またその逆を行う と言うように、ゲノム間の探査に用いることもできる。 グリッド配列内で、質量標識も用いて探査するまたは質量標識を検出する技術 は、DNAプローブが使われているその他の固体相システム、特にノザン解析、サ ザン解析に適用することも可能である。これら二つの方法では、最初の段階で、 ポリアクリルアミドジェルを流し込み、DNAを、ブロッティング方法を用いて、 ナイロン薄膜に移し替える(Sambrookら、1989)。上記した他の方法のように、質 量標識付け核酸プローブは調製が行われて、フィルターに再会合される。他の実 施態様では、質量標識の単一または結合混合物は検出を多様化するために用いる ことができる。ハイブリダイゼーション後にフィルターを走査し、質量分析計内 で洗浄することで、特別位置に存在する質量標識を検出し、必要な場合は、その 量を図る手段が得られる。 本技術のもう一つの実施態様は、質量標識付け蛋白質プローブを、抗体の形態 で、1および2次元蛋白質ジェルに対するハイブリダイゼーションに用いることで ある。また当業者は、固体相マトリックスに結合した標的物に対して再会合した 質量標識付けプローブ分子について、他の組合せを構想することもできる。いず れの場合も、質量標識は切り離され、走査質量分析計を使って分析された固体相 表面、または別の表面への転移、そのいずれかが、質量分析前に行われる。 遺伝子標的または他の標的を、フィルター、または他の形態のグリッドへ付着 させることは、本発明を最も幅広く取り扱っている実施態様の役目として必要で はない。たとえば、質量標識付けプローブセットは、溶液中でDNAまたはRNA標的 に直接再会合しても良い。再会合したプローブおよび再会合していないプローブ を区別するために、２つの可能なイベントのうち一つが起こらなければならない 。再会合したプローブ上のいずれかの質量標識を、エキソヌクレアーゼIII、ラ ムダエキソヌクレアーゼ、T7遺伝子6エキソヌクレアーゼまたは制限エキソヌク レアーゼのような二重位置特定ヌクレアーゼを使って酵素により切り離す必要が ある。またはなんらかの分割イベントが起こって、再会合していないプローブを 再会合したプローブから分離する必要がある。当業者は、ビオチニル酸塩で処理 したヌクレオチドを使ったポリメラーゼによる再会合プローブ拡張のような、上 記方法で記載された固体相配列へ標的物を予備結合するのとは別の、分割、また は、pcR^TMやLCRのような拡大イベントの一部としてビオチニル酸塩で処理したプ ローブへの質量標識付けプローブの連結などいくつかの方法を構想することがで きるだろう。 ヌクレアーゼの場合も分割の場合もどちらも、有効な質量標識量を生成するた めに拡大イベントを利用することができる。pcR^TMプライマーの一つから転写末 端で再会合するプローブへ付着した質量標識は、耐熱性ポリメラーゼのニック翻 訳5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を使ったPCR^TM拡張中に切り離すことが可能で ある。プライマー内の質量標識は、拡張後のT7遺伝子6エキソヌクレアーゼのよ うな5’-3’ヌクレアーゼを使って切り離せる。質量標識付けプライマーが拡大 中にビオチン基を有するプライマーに連結する、またはビオチン基を有するヌク レオチドを用いることで、ビオチンが混和される実施態様で、質量標識の切り離 しのために、化学分裂方法のような、非特異性分裂を用いることが可能である。 別の実施態様では、ハイブリダイゼーション−特定ヌクレアーゼ分解を、固体 −相−結合steptavidinを、不分割質量標識を取り去るために使用する分析評価 において、ビオチンおよび質量標識の両方を含むプローブの分割のために用いる ことができる。このような分割の例としては、上記したような二重位置−特定ヌ クレアーゼの使用などがある。制限エンドヌクレアーゼは、中心に制限部位、さ らに対峙し合う末端に質量標識とビオチンを含むプローブの分割に使われても良 い。RNAがプローブとして使用される別の例では、RHaseHを使ったダブル−スタ ンド−特定分割がある。 T7RNAポリメラーゼ転写により生成されるような拡大された単一位置（シング ル−スタンド）標的の検出のための、手本となるような別の方法において、二重 位置プローブは、配列中で、標的スタンド（位置）と相同の位置に付着している 質量標識と共に調製される。質量−標識付け位置は、標的物との拮抗ハイブリダ イゼーションにより置換され、質量標識は、エキソヌクレアーゼ・、緑豆ヌクレ アーゼまたはヌクレアーゼSIのような単一位置特定エキソヌクレアーゼにより切 り離される。別の方法では、化学的に変態させたプローブから質量標識を切り離 すために、単一特定分割反応物（試薬）を用いてもよい。質量標識の単一位置特 定切り離しを提供しうる化学的変態の例には、エステル交換によるリボヌクレオ チドの分割、酸により分割可能な燐酸アミド化、例９で記載したような硝酸銀に より分割可能な5’-P-S燐酸オチオ化がある。 pcR^TMは、質量標識付けプライマーおよび、拡張がおきた場合だけ質量標識の 切り離しを可能にする制限酵素を用いることで、化合させることができる。この 具体化では、質量標識付けPCR^TMは、拡大プロセスの一部としてだけダブル−ス タンドになる制限部位に対して配列を有している。いったん部位がダブルスタン ドになると、制限酵素により確認され、分割される。分割イベントは、プライマ ーのボディーから、質量標識を切り離し、PCR^TM生成物は単に検出されるように だけにする。 質量標識付けプローブが溶液中でmRNAを測定するのに用いられる本発明の実施 態様は、図14に、図解で示されている。一連の遺伝子特定、質量標識付けプロー ブ（調査検討毎に１から100）は、mRNAプール（またはより適当なのは、mRNAプ ールから誘導された第１スタンドcDNAs）に添加され、再会合が可能になる。各 遺伝子特定プローブは、刺激反応性を高めるために、質量標識だけを、あるいは この標識の複数のコピーを運ぶ。 再会合混合物は、標的遺伝子に再会合されたプローブ個体群の一部に対して質 量標識を切り離す、ダブル−スタンド−特定エキソヌクレアーゼで処理を行う。 問題の遺伝子からのmRNAが存在する場合だけ、対応する質量標識が切り離され、 検出される。さらに、特殊質量標識に対するシグナル強度は、プール内の比較的 大量の特殊mRNAに釣り合う。さまざまな質量標識に対して相対的な強度の比較は 、相対的なmRNA発現レベルを反映する。38,400もの遺伝子数に対する相対的な遺 伝子発現パターンは、皿毎に100種のプローブが使われる場合、一つの384マイク ロ滴定濃度皿で探査がされる可能性がある。逆に言えば、一セット100遺伝子は 、一回のマイクロ滴定濃度実験で、384種の試料に対して調べられることになる 。 質量分析感度レベルが、プール細胞が成長した結果細胞数が少ないために、ま たは非常に小さい生検組織から誘導された動物モデル試料において、mRNAを直接 モニターするには不十分であることが分かった例がある。このような例について は、統計分類法にメッセージ増幅機構を組み込む必要があるだろう。 先で記述したように、質量標識付け核酸プローブを、これらが核酸標的に再会 合されている場合、分解するヌクレアーゼを使うことで、シグナルの線状増幅の 可能性がある。標的DNAがシングルスタンドで、使用されているプローブよりも 有意に長い場合は、選択的に、プローブだけを分解することができる。オリゴヌ クレオチドプローブを分解することで、標的スタンドがハイブリダイゼーション と分解を多数回繰り替える行えるようにする。このタイプの増幅は2、3等級大き い増幅をたやすく達成できる。 与えられたいずれの調査も比較的少数（たとえば20〜100）の遺伝子をモニタ ーだけなので、プローブセットとに結合している標的物だけを増大するために、 多数化PCR^TM反応を一つまたは数種使うことが可能であろう。PCR^TMまたは他の増 大方法を使用することで、追加の制御を発展させて、人為的構造増大の影響を減 少させることが必要であるかも知れない。質量標識付けプローブの多機能性によ り、一つまたはそれ以上の制御を含めることが容易になる。差異表示技術で用い られているような、冗長性または半冗長性プライマーを使用することで、有効な 増大手段が得られる可能性もある。Tag DNAポリメラーゼのようなポリメラーゼ が増大に使われている場合にはすべて、5’〜3’エキソヌクレアーゼ活性を、増 大が継続している間、プローブを分解するために使用することが可能である（Ho llandら、1991）． 分割を利用する方法を含む、上記した溶液相方法すべては、質量標識の切り離 しと特殊mRNA配列の存在とを連結する手段を利用しても良い。メッセージ個体群 の増幅に使用できるその他の方法には、リガーゼ鎖反応、cDNA個体群の試験管内 転写、また単一槽多クローン性cDNAプラスミド成長のような、cDNAライブラリー 生成のための方法の別形等がある。 有機体の最大限の遺伝子セットが利用可能になるため、遺伝子発現分析のため の完全な質量標識付けプローブをあらかじめ調製することが考えられている。酵 素で合成されるプローブでは、これらプローブの多量のストックを比較的安価に 一週間以内で作ることができる。また化学的な手段を用いて、迅速にかなりの量 の質量標識付けプローブを作ることも可能である。 ここに記載した、分析評価のための好ましい実施態様は、不揮発性(nonvolati le)切り離し可能質量標識または不揮発性(involatile)切り離し可能質量標識を 使用するものであるが、他のタイプの標識を同じく使用することができる。たと えば、同位体質量標識、揮発性質量標識(電気泳動を含む)、蛍光標識、化学ルミ ネセント標識。 N．類似性評価分析における多様化質量標識基質（培養基） ここで開示している方法もまた、一つまたは複数の標的生体分子の存在を確認 するための間接的な計画で使われてもよい。酵素−連結免疫吸着剤分析(ELISAs) のような間接的計画は、基質を酵素によって再編成することを通して、基質転換 を分子生成物に使用する方法を提供するものである。基質の酵素触媒によって、 生成物シグナルの線状増幅が得られる。 ELISAにおいて、一般に固体相に結合している標的分子は、電子対共有しない 標的物に結合している抗体によって確認される。確認抗体は、生成物に基質転換 を触媒作用によって起こさせるために使用する酵素に共役している。従来のELIS A技術では、アルカリン、ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダー ゼ、またはウレアーゼのような酵素によって生成物に転換されているとき、光学 上の質を変化させた分子をもたらす（たとえば溶液に色が付いたり、生成物が強 い蛍光性を有する）小有機分子基質を使用している。加えて、基質の生成物への 転換では時折質量変化を起こさせる。このように生成物は、質量分析から検出さ れる質量標識のような働きをする。生成物の量は、絶対的に、または酵素の回転 率および反応条件の知識を持って、かつ分析物中に存在する標的分子の量を計算 するために使用される基質に相対的ないずれかの方法で量られる。 従来のELISA分析評価のための方法は、効果的に確立されている(本文に参照と して導入されているMolecular Biology Vol．2，Chapter 11，を参照)。多くの プロトコルが存在し、それには、間接的、直接的拮抗、抗体サンドウィッチ、ダ ブル抗体サンドウィッチ、直接分子、間接分子分析物がある。本応用で構想され る質量標識変態は、従来のELISA方法を適用して、標的生体分子の未知の量を 量ることが意図されている。この変態においては、標的生体分子が電子対を共有 して、または電子対を共有しないで、溶球上またはプラスチック皿上のような表 面に、直接的にまたは小型“捕獲”分子（配位子）または蛋白質（抗体のような ）を通してのいずれかの方法で、結合している。また標的生体分子は、容器の表 面に結合しうる細胞の化合物であってもよい。固体相標的生体分子は、標的生体 分子に対して特殊類似性を有する標的確認分子（抗体、配位子、オリゴヌクレオ チド、等）と共に培養される。この標的確認分子は酵素に共役している。多様化 分析評価のために、各標的確認分子は、さまざまな標的物の分化（“直接”評価 プロトコルの代表的なもの）のための単独触媒活性と共に酵素に、電子対を共有 して結合していなければならない。これら共役した標的確認分子は基質への結合 が可能となり、結合しない分子は洗い流され、次に酵素基質は、結合酵素がその 基質と反応して、質量分析による検出可能な質量だけと共に生成物を切り離すと 言う条件で、添加される。 抗原に対する高度な特殊結合類似性を有する“捕獲抗体”は、可溶性抗原にと って必要となる可能性がある。抗原の捕獲または計量のいずれかのための特殊抗 体調製の方法は、文献では良く確立されている。抗体に対する共役酵素の方法も 、また良く設定されており、グルタルアルデヒドまたはペリオキシダート酸化を 通した共役のような架橋結合因子を含んでいても良い。浄化されたDNA制限酵素 は市販されている。単一触媒活性を有する新しい酵素もまた、設定された分子方 法を用いて計画されても良い 多様な質量標識の検出が容易であるため、一つの溶液内で、多様な免疫評価を 同時に行なうことができる。抗体または他の標的確認分千に共役して、一連の酵 素特定基質と共同して使用される、さまざまな酵素は、唯一質量を持ち、その結 果単独で検出ができ、かつ質量分析による計量できる酵素生成物を産出するため に用いられてもよい。 酵素および基質の関連のない組を多様化する他に、基質の組を変態させる酵素 の組もまた多様化してもよい。たとえば、同じ基質を確認するが、変態は違った 方法起こさせる酵素の組すべては、特殊な化学的に関連する基質を確認し、変態 させる酵素のように（このとき、構造におけるいろいろな変化が特殊な酵素の特 異性を、特殊な基質に対して部分的に変化させる）使うことも可能である。 同じまたは数種の基質を確認する一組の酵素すべては、プロテアーゼである。 プロテアーゼは異なるアミノ酸またはアミノ酸配列モティーフを確認し、アミド 連鎖を分割して、２つ以上の断片を生じさせる。プロテアーゼおよびそれらの特 異性の例としては、次のものかある。トリプシン：アルギニンおよびリジン残基 のどちらでもC-末端部位で分割を起こす。トロンビン：アルギニンで分割を起こ す。Glu-C：グルタミン酸残基のC-末端部位で分割を起こす。Lys-C：リジンのC- 末端部位で分割を起こす。Asp-N：アスパラギン酸残基のN-末端部位で分割を起 こす。特定のアミノ酸またはアミノ酸配列モティーフを含む少量のポリペプチド は、蛋白質分解のための基質として使用してもよい。拮抗基質を使用して、およ び同一の基質から誘導された、さまざまな生成物の比率計測を行うことで、さま ざまな標的生体分子の相対的な量をより正確に測定できることになるであろう。 プロテアーゼを使用することで起こりうる問題は、生物検定に必要な抗体およ びその他の蛋白質を分解するかもしれないという問題である。この問題はいろい ろな方法で克服が可能である。たとえば、プロテアーゼを慎重に選ぶ、蛋白質分 解を起こさないようにするための化学変態の選択する、基質反応によって拮抗的 に置換することが可能な阻害剤を含む阻害プロテアーゼを使用する、等である。 代替方法としては、プロテアーゼを、プロテアーゼに共役するオリゴヌクレオチ ドプローブを使って核酸を探査するような他の非蛋白質ベース分析物上で用いる 方法である。その他の、プロテアーゼの代わりに使用する酵素の組には、その基 質およびヌクレアーゼを燐酸化するキナーゼ類がある。 リボヌクレアーゼ類およびデオキシヌクレアーゼ類は変異する特異性がある。 それぞれ、RNaseT1、RnaseU2、およびRnase CL3のようなエンドヌクレアーゼ類 、標的G、A、Cヌクレオチド類である。プロテアーゼに対する基質として少量の ポリペプチドの使用する類似の方法において、少量のオリゴヌクレオチドをヌク レアーゼと共に使用してもよい。燐酸チオアートのようなヌクレアーゼ耐性ヌク レオチド、メチルホスフォナート、ボラノホスフォナート、およびペプチド核酸 を、生成物だけを産出する方向へさまざまなヌクレアーゼの特異性を向かわせる ために、基質内に混入することができる。質量分析で簡単にたやすく検出できる ペプチドとは違って、質量分析計内での分析を向上さ、せたやすくするためには 、ポリペプチドの添加によりオリゴヌクレオチドや、または他の分子を変態させ ることが好ましい。 もう一つの組の酵素は、制限エンドヌクレアーゼである。制限酵素の使用は、 上記した第２の場合に該当する。この場合、基質は化学的に関係づけられていて もよいが、その組の酵素がそれを確認しかつ変態させる限り、構造上のさまざま な変化が部分的にそれらの特異性を変化させるという問題である。この場合、構 造上の変更は基質上の配列での変化である。基質それ自身、一つまたは複数の制 限エンドヌクレアーゼおよび分割部位を含む小さな二重螺旋オリゴヌクレオチド である。上記したヌクレアーゼの使用に類似して、また本発明の別のセクション で記述したように、質量分析器内での分析と選択性を向上させ、たやすくするた めに、ポリペプチドまたは他の分子を追加することで、オリゴヌクレオチドを変 態させることが好ましい。多くの制限エンドヌクレアーゼがパリンドローム配列 を確認するため、二量体を形成するパリンドロームオリゴヌクレオチド基質を使 用することで、シグナルレベルを２倍に高めることも可能である。各分割イベン トは、二つの同一の生成物を形成する。より長い共半量体もまた、より長い、マ ルチ質量標識付け基質を作って、生成される。 抗体は、これら分析評価で用いられる唯一の標的確認分子ではない。標的結合 特性を持つファージディスプレイのような方法から誘導されるポリペプチドだけ でなく、興味深い結合活性を見せる、さまざまな本来の蛋白質を代わりに使って もよい。標的物は、蛋白質以外のものであってもよく、また、酵素共同因子、ホ ルモン、神経伝達物質を含む生物学上意味のある小さい分子、また多糖類を含む その他の生物高分子物質、および最も重要な核酸などがある。核酸ハイブリダイ ゼーション相互作用は、標的物および確認分子どちらもが核酸から成り立ってい るところで用いられてもよい。核酸およびその他非ペプチド確認分子が、さまざ まな連鎖化学的性質を通して、電子対を共有して(そのうちのいくつかは、この ＸＸＸセクション（節）に開示されている)、または、アビジンが酵素転換基質 に共役されているビオチン／アビジン連鎖を通して電子対を共有しないで、転換 基質内に含まれる酵素に結合してもよい。当業者はその他の連鎖方法を確認して もよい。 次の各例は、本発明の好ましい実施態様を例証するために加えられているもの である。当業者により、以下の各例に公表されている技術は、本発明の実施にお いてよく機能するために、本発明者が発見した技術の典型を示すものであり、し たがってその実施のために好ましい方法であると見なすことができるものである ことを評価されたい。しかし、当業の熟練者は、本開示に照らして、多くの変更 が、開示された特定の実施態様において可能であり、本発明の精神と範囲を出る ことなく同じまたは類似の結果を得ることができることを理解されるべきである 。 例１ ペプチド型オリゴヌクレオチドの合成 A．ペプチド結合型ヌクレオシド5'三燐酸塩の調製 ペプチド結合型ヌクレオシド5'-三燐酸塩の調製には、アリルアミノ置換のdNT Pの合成およびカップリングが含まれる。例を図6Aに示す。Langerら(1981年)の 手 順により、5-(3-アミノアリル)-2'-デオキシウリジン5'-三燐酸塩(c)を調製した 。pH5〜7での酢酸水銀(II)によるdUTP(a)の処理は、5-水銀化誘導体(b)を提供す る。その後、パラジウム触媒存在下でのアリル化は、適切に保護されたペプチド (FMOC基で保護されたリジンおよびN-末端アミン類)のNHS-エステル(d)に結合し たcを提供した。ペプチドの塩基脱保護は、所望の生成物(e)の構造を生じた。あ るいは、アリルアミノ−ヌクレオチド(c)を連続的にヘテロ二機能性架橋試薬mal -sac-HNSA(Bachem Bioscience Inc.，King of Prussia,PA)およびN-末端システ インペプチドで処理して、複合体(f)を提供した。 B．ペプチド標識したホスホラミダイトの調製 図6Bに示したように、5'-が保護されたアリルアミノヌクレオシドからペプチ ドヌクレオシドホスホラミダイト複合体を調製した。ウリジン(h)の選択的ジメ トキシトリチル化は、5'-DMTエーテル(ｉ)を提供する。それは、パラジウム触媒 で水銀ヌクレオシドを介してアリル化されたものである(Daleら,1973、およびLa ngerら,1981)。適切に保護されたペプチドのNHSエステルの処理と、ホスホラミ ダイトへの複合体の変換(Sproatら,1987)は、所望の化合物(k)を提供した。 C．5'標識オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体の合成 オリゴヌクレオチドg(図6C)(配列番号10)を、標準の固相ホスホラミダイト化 学を用いて調製した。S-S結合を介した5'−アミノ修飾は、5'末端へのチオ修飾 因子C6 S-Sおよびアミノ修飾因子C6dT(Glen Research Inc.，Sterling，VA)の 連続添加によって達成した。末端第一アミノ基を介して、オリゴヌクレオチドを ヘテロ二機能性試薬のmal-sac-HNSA(Bachem California Inc.，Torrance,CA)に 結合させ、排除クロマトグラフィーによって精製し、N-末端システインチオール を介してペプチドに配列CGR GSG Kで共有結合させた。その複合体をイオン交換 クロマトグラフィーで精製し、MALDI-TOPマススペクトル分析によって分析した( 図7X)。図7X中のm/z8401のピークは、所望の複合体と一致する。 D．3'標識オリゴヌクレオチドの合成 3'燐酸化オリゴヌクレオチドを配列5'-TGAGGTGCGTGTTTGTGTGCCTGTp-3'(配列番 号1)で標準のホスホラミダイト化学によって合成した。非複合のオリゴヌクレオ チドのMALDIマススペクトルを図7Aに示す。修飾したホスホラミダイト(C6-amino modifier,Glen Research Inc.，Sterling，VA)として合成の間結合している第 一アミノ基で、オリゴヌクレオチドの3'末端T残基を修飾した。ヘテロ二機能性 のカツプリング剤mal-sac-HNSA(Bachem Inc.，Torrance，CA)を用いて、活性の アミノ基を介してオリゴヌクレオチドをペプチドに結合した。オリゴヌクレオチ ドへのカップリングに用いたペプチドの配列は、CGYGPKKKRKVGG(配列番号2)(Sig ma Chemical Co.，St．Louis，MO)であった。オリゴヌクレオチドにペプチド を結合する反応は、N-末端システイン残基上の反応的なメルカプト基で生じる。 標準の手順によって実施するカップリング反応の後に、逆相HPLCによってその粗 製結合生成物を精製した。所望の結合生成物を含む分画は、MALDI-MSによって同 定し、混ぜ合わせ、蒸発乾固した。乾燥させた物質を少量の水に溶解し、260nm のUV吸光度によってその濃度を検出した。オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体 のMALDIマススペクトルを図7Bに示す。m/z 8622.8の主なピークは所望の生成物 とよく一致しているが、7051.7のピークは未反応のオリゴヌクレオチド(約20%) の残余の量による。 Ｅ．内部標識オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体の合成 配列5’-GGT TTA CAT GTT CCA A(aminoT)A TGA T-3'(配列番号11)のオ リゴヌクレオチドを、アミノ−修飾因子C6 dT(Glen Research Inc.,Sterling，V A)を用いた標準のホスホラミダイト化学によって調製し、内部アミノ修飾と結合 させた。内部第一アミノ基を介して、オリゴヌクレオチドをヘテロ二機能性試薬 mal-sac-HNSA(Bachem Ca1ifornai Inc.，Torrance，CA)に結合させ、排除クロ マトグラフィーによって精製し、N-末端システインチオールを介して、ペ プチドに配列CGT RGS GKG TGで共有結合させた。その複合体をイオン交換ク ロマトグラフィーによって精製し、MALDI-T0F質量分析によって分析した(図7X) 。図菖中のm/z 8075のピークは、所望の複合体に一致する。 例2 特異的標的配列の検出 ハイブリッド形成の研究におけるプローブとしてのオリゴヌクレオチド-ペプ チド複合体の有用例として、標的DNAとして合成した相補鎖を用いてモデル系を 考案した。42-merをモデル標的として、配列5'-CTCCCAGGACAGGCACAAACACGCACCTC AAAGCTGTTCCGT-3'(配列番号3)で合成した。標的の検出は、MALDI-MSによる分析 で、3'-5'２本鎖特異的エキソヌクレアーゼIIIを用いた消化によるプローブから のペプチド物質標識(配列番号2)の遊離に基づいた。 1×エキソヌクレアーゼIII緩衝液（66mMトリス塩酸，pH8.0;5mM DTT;6.6mM塩 化マグネシウム;50ng/mL BSA)9μLに溶解したプローブ1pmolと標的1pmolの混合 物を、沸騰水中で２分間加熱することによってアニールし、その後、約20分間か けて室温までゆっくりとその混合物を冷却した。エキソヌクレアーゼIII(USE，C leveland，OH)を、1×緩衝液中に貯蔵濃度の17.5U/μLから0.35U/μLまで希釈し 、１μL分量を、アニールした標的プローブ溶液に添加した。４つのコントロー ルを含み、試験溶液と同時に実施した。コントロール試料Aは標的とプローブの 両方を含むがエキソヌクレアーゼIIIは含んでおらず、コントロール試料Bはプロ ーブとエキソヌクレアーゼIIIは含むが標的は含んでおらず、コントロール試料C はランダム非相補性36-merとともにプローブとエキソヌクレアーゼIIIを含み、 コントロール試料DはエキソヌクレアーゼIIIのみを含んでいた。その混合物を室 温で30分間インキュベートした。その溶液の１μL分量を取り出し、MALDI-MS試 料プレートの2,5-ジヒドロキシ安息香酸の多結晶質スポットの上に加 えた。試験試料とコントロール試料A、BおよびCの陽イオンマススペクトルの結 果を図8A、図8B、図8C、および図8Dに示す。図8Aの試験試料のみ2045.3でピーク を示し、遊離したペプチドーヌクレオチド複合体に対し推測する質量は、感度の 良い迅速な方法によって標的配列の存在を特異的に検出することが可能であるこ とを本発明者がこのモデル系で実証している。 ペプチドの選択的な酵素の開裂 トリス塩酸(pH=7.8)に溶解した酸化型のウシインシュリン鎖B(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)をエンドプロテイナーゼGlu-C(w/w比率20:1，Sigma Ch emical Company，St.Louis,MO)で2時間37℃で処理し、MALDI-TOF質量分析によ って検出した。分析(図XX)は、インシュリン(配列番号12)は、グルタミル残基の カルボキシル側で、３つの断片、m/z 1533(FVNQHLC[SO₃H]GSHLVE)(配列番号13) 、m/z 1089(RGFFYTPKA)(配列番号14)、およびm/z 919(ALYLVC[SO₃H]GE)(配列 番号15)へ効果的に開裂することを示した。マススペクトル中の3つのピークの相 対的強度は、3つの断片中の(イオン化可能な)塩基の官能性の数を反映している 。最大分子量の断片は2つの中程度の塩基ヒスチジン残基を含んでおり、そのた めスペクトルにおいて適度に可視されるのみである。中間の断片は強塩基のリジ ンおよびアルギニン残基を含んでおり、したがって極度のピークを表示する。最 小の断片はプロトン付加が可能な末端のアミノ基のみを有しており、そのためス ペクトルにおいてかろうじて検出可能である。 例3 物質標識プライマーおよびrtPCRTMを使用したmRNAの検出 リボソームのタンパク質L7遺伝子に対する一対のPCR^TMプライマーを、各3'-末 端付近で結合した修飾アミノチミジン(Glen Research，Sterim,VA)で標準のホ スホラミダイト化学によって合成した。順方向プライマーの配列は5'-ATCTGAAGT CAGTAAAT*GAAC-3'(配列番号4)であり、逆方向プライマーの配列は5'- ATTTACCAGAGAT*CGAG-3'(配列番号5)であった。配列中、T*はアミノ修飾チミジン を表わす。各プライマーは、ヘテロ二機能性結合物mal-SAC-HNSA(Bachem Corp. ，Torrance CA)を介して、ペプチド上のメルカプト基とアミノ修飾チミジンの アミノ基との間の標準的なカップリング反応によって独自のペプチドで物質標識 され、イオン交換HPLCによって精製した。順方向プライマーに対し使用したペプ チド物質標識は配列CGYGPKKKRKVGG(配列番号2)を有し、逆方向プライマーに対し 使用したペプチドはCKNLNKDKQVYRATHR(配列番号6)であった。 逆転写反応は、安定した癌細胞系から分離した10μgの全RNAで実施し、第一鎖 cDNAを生成した。反応は20μl全容量で実施し、反応にはオリゴdT₁₅プライマー( 配列番号9)0.5mg、およびAMV逆転写酵素25単位を含んでいた。10μl反応液中の 順方向および逆方向の各物質標識プライマー10pmolとTaq DNAポリメラーゼ0.25 単位を用いて、PCR反応を第一鎖cDNA1μlで実施した。rtPCR産物を、メーカーの 指示に従い、Microcon-30限外ろ過ユニット(Amicon,Inc.，Beverly，MA)によっ て精製した。フィルターユニットからDNAを回収した後、真空遠心分離機で蒸発 乾固させ、それを水3.5μlに再懸濁した。 その後、T7遺伝子6の二本鎖特異的な5'-3'エキソヌクレアーゼを用いた消化反 応を行った。10×緩衝液(660mMトリス,pH8，6.6mM塩化マグネシウム)0.5μlを添 加した精製済みPCR生成物3.5μlに対し、T7遺伝子6エキソヌクレアーゼ(Amersha m Inc.)の1μl(5単位)で反応させた。コントロールの消化は、同時間で行い、 同一の緩衝液に遊離の順方向プライマー5pmol、酵素5単位を含んでいた。37℃で 60分間インキュベートさせた消化反応液は、引き続いて酵素の熱不活性化(85℃ 、15分間)処理した。各消化物に、陰イオン交換樹脂(DEAE Sephadex A-25，Aldr ich Chemical Co.，Milwaukee，Wl)の小部分を添加し、その上清の1μlを取り 出し、MALDI-T0F質量分析(陽イオン、2、5-ジヒトロキシ安息香酸マトリックス) によって分析した。消化したPCR^TM産物およびコントロールのマススペク トルの結果を図15Aおよび図15Bにそれぞれ示す。 例4 cDNAプラスミドの混合物の検出 それぞれ独自の挿入を含んでいる、第7の一本鎖MISプラスミドクローン50ngと ６つの一本鎖MISプラスミドクローン各100ngの混合物を脱塩し、メーカーの指示 によりMicrocon-30限外ろ過ユニットで濃縮した。回収後、DNAを蒸発乾固させ、 水1μlに再懸濁した。各2.5pmolの7つの物質標識プローブ混合物を加えた。各プ ローブは混合物中の各クローンに対する挿入断片の部位に相補的であり、独自の ペプチド物質標識に結合した。その混合物を95℃まで30秒間加熱してハイブリッ ド化させたプローブを、次いで45℃で1分間インキュベーションした。37℃まで その混合物を冷却した後、エキソヌクレアーゼ1110.35単位を添加し、消化を60 分間実施した。反応物を室温まで冷却させ、その後、DEAEセファデックスA25陰 イオン交換樹脂(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wl)の小部分を加えた。上清 の1μ1量を取り出し、MALDI-TOF質量分析(陽イオン、2、5-ジヒドロキシ安息香 酸マトリックス)によって分析した。遊離した物質標識の混合物のマススペクト ルの結果を図16に示す。 例5 物質標識プライマーおよびビオチン化したジデオキシヌクレオシド三燐酸塩を用 いたSNP分析 化学上遊離可能な物質標識を含むあるプライマー(「プライマーA」)を合成し、 例1Cに記述した方法によって精製した。また、２つの合成した鋳型鎖を標準の固 相合成技術によって合成した。プライマーA(Primer A)の配列は、5'-LTSS-GTGCT CAAGAACTACATGG-3'(配列番号16)であり、鋳型鎖の配列は、5'-TACTCCAGTTCCATGT AGTTCTTGAGCAC-3'(配列番号17)(鋳型1T)および5'-TACTCCAGTACCATGTAGTTCTTGAGC AC-3'(配列番号18)(鋳型1A)である。配列中、LT はアミノ修飾チミジンに結合した物質標識を示しており、SSはジスルフィドを含 有する基の化学的開裂を示し、鋳型鎖中の太字体の塩基記号はプライマーの3'末 端に隣接した多型の部位を表している。配列CGRGSGK(配列番号19)を有する合成 ペプチドで、プライマーを物質標識した。2つのサイクルシークエンス反応を実 施した。各反応は、全容量20μL中に、物質標識プライマーA2pmol、鋳型1Tまた は鋳型1Aのいずれか100fmol、ビオチン-ddUTP(Boehringer-Mannheim,Inc.)200pm ol、および熱安定性DNAポリメラーゼAmpliTaq-FS(Perkin-Elmer Inc.)2.4単位を 含んでいる。双方の反応は、代表的なホットスタート条件を用いて開始した。反 応は、全35サイクルについて、90℃で30秒間変性させ、50℃で10秒間アニーリン グし、65℃で10秒間伸延することから構成される代表的な温度サイクリングプロ グラムによって実施した。終了時に、ストレプトアビジン被覆の磁性ビーズ上に 伸延したビオチン化生成物を捕捉することによって、シークエンシング反応物を 精製した。ビーズを洗浄して伸延していないプライマーを除去し、次いで、ジス ルフィド結合を開裂し、溶液中に物質標識を遊離するゆるやかな還元剤でビーズ 結合生成物を処理して、物質標識を遊離した。上清の1μL量を取り出し、MALDI- TOF質量分析(陽イオン、2、5-ジヒドロキシベンゾール酸マトリックス)によって 分析した。ビオチン-ddUTPで伸延する正確な鋳型を含んでいる反応のマススペク トル結果と、正確でない鋳型を含んでいる反応のマススペクトルの結果を図17A および図17Bにそれぞれ示す。適切なヌクレオチド結合の予測のように図17Aのス ペクトルでシグナルのみ見ることができるので、これらの結果は、ビオチン化さ れたジデオキシヌクレオシド三燐酸塩と物質標識プライマーを用いたSNP分析の 実施可能性を実証している。 例6 物質標識プライマーとビオチン化ジデオキシヌクレオシド三燐酸塩を用いた多重 SNP分析 それぞれに独自の化学的に遊離可能な物質標識を含んでいる2つのプライマー( 「プライマーB」および「プライマーC」)を合成し、例1Cに記述した方法によっ て精製した。さらに各々に対する合成鋳型鎖を標準の固相合成技術により合成し た。プライマーBの配列は、5'-LTSS-TCGGAGTCAACGGATTTG-3'(配列番号20)であり 、また、対応する鋳型鎖の配列は、5’-TCCAGTTCTCAAATCCGTTGACTCCGA-3'(「鋳 型2T」)(配列番号21)である。プライマーCおよびその鋳型鎖(「鋳型3T」)は、配 列5'-LTSS-GATGTCTGTATATGTTGCACTG-3'(配列番号22)、および5'-AAGTTGACTCTCAG TGCAACATATACAGACATC3'(配列番号23)をそれぞれ有している。配列中、LT、SSお よび太字体は、例5に記述した意味と同じ意味を持つ。プライマーBは、合成ペプ チドCAGGRGGGKGGA(配列番号24)で物質標識されており、プライマーCは、合成ペ プチドCASGRGSGKGSA(配列番号25)で物質標識されている。 プライマーA、プライマーB、プライマーCおよび各々に対応する鋳型で、多重 サイクルシークエンス反応を行った。反応は、全容量20μL中に、各物質標識プ ライマー2pmol、鋳型1T、鋳型2Tおよび鋳型3Tを各100fmol、ビオチン-ddATP(Clo netech，Inc.)200pmol、および熱安定性DNAポリメラーゼAmpliTaq-FS(Perkin-El mer Inc.)2.4単位を含んでいる。反応は、全35サイクルについて、90℃で30秒間 変性させ、50℃で10秒間アニーリングし、65℃で10秒間伸延することから構成さ れる代表的な温度サイクリングプログラムによって実施した。終了時に、ストレ プトアビジン被覆の磁性ビーズ上に伸延したビオチン化生成物を捕捉することに よって、シークエンシング反応物を精製した。ビーズを洗浄して伸延していない プライマーを除去し、次いで、ジスルフィド結合を開裂し、溶液中に物質標識を 遊離するゆるやかな還元剤でビーズ結合生成物を処理して、物質標識を遊離した 。上清の1μL量を取り出し、MALDI-TOF質量分析(陽イオン、2、5-ジヒドロキシ ベンゾール酸マトリックス)によって分析した。プライマーA、BおよびCのそれぞ れに関連してA,BおよびCと標識したピークで予測したそれぞれの物 質標識に対するシグナルを示したマススペクトルの結果を、図18に示す。これは 、物質標識プライマーを利用した多重SNP分析の実施可能性を実証している。 例7 物質標識プライマーおよび標準のジデオキシヌクレオシド三燐酸塩をプラスした ビオチン化ヌクレオシド三燐酸塩を用いたSNP分析 2つのサイクルシークエンシングを、プライマーA、および、鋳型1T(配列番号1 7)または鋳型1A(配列番号18)のいずれかを用いて行った。各反応は、物質標識プ ライマー2pmolおよび鋳型100fmolを含んでいる。各反応における三燐酸塩は、ビ オチン-dCTP(Clonetech，Inc.)，dATPおよびddTTPをそれぞれ200pmolからなって いる。反応は、全容量20mL中で熱安定性DNAポリメラーゼAmpliTaqFS(Perkin-Elm er Inc.)2.4単位で行った。反応は、全35サイクルについて、90℃で30秒間変性 させ、50℃で10秒間アニーリングし、65℃で10秒間伸延することから構成される 代表的な温度サイクリングプログラムによって実施した。終了時に、ストレプト アビジン被覆の磁性ビーズ上に伸延したビオチン化生成物を捕捉することによっ て、シークエンシング反応物を精製した。ビーズを洗浄して伸延していないプラ イマーを除去し、次いで、ジスルフィド結合を開裂し、溶液中に物質標識を遊離 するゆるやかな還元剤でビーズ結合生成物を処理して、物質標識を遊離した上清 の1μL量を取り出し、MALDI-TOF質量分析(陽イオン、2、5-ジヒドロキシベンゾ ール酸マトリックス)によって分析した。鋳型ITを含む反応および鋳型1Aを含む 反応について得られたマススペクトルを、図19A[XX3a]および図19B[XX3bに]それ ぞれ示した。 例8 物質標識を標識付けした変性塩基プライマーとビオイン化ジデオキシヌクレオシ ド三燐酸塩を用いた伸延による配列変形の同定 プライマーAに関係し、3’-末端塩基の同一性においてのみ異なった2つのプラ イマーを合成し、例1Cに記述した方法による物質標識した。プライマーDの配列 は、5'-LTSS-GTGCTCAAGAACTACATGA-3'(配列番号26)であり、プライマーEの配列 は、5'-LTSS-GTGCTCAAGAACTACATGT-3'(配列番号27)である。配列中、LTとSSは、 例5に記載した意味を有している。さらに、標準の固相合成技術を使用して、合 成鋳型鎖（「鋳型4A」）を合成した。鋳型鎖の配列は、5'-TACTCCAGTTACATGTAGT TCTTGAGCAC-3'(配列番号28)であり、配列中、太字体は鋳型1Tと異なる塩基を示 している。プライマーDおよびプライマーEは、プライマーAに結合したペプチド と異なる2つの独自の合成ペプチドで物質標識されている。プライマーDに結合し たペプチドは、CAGGRGGGKGGA(配列番号29)であり、一方、プライマーEに結合し たペプチドは、CASGRGSGKGSA(配列番号30)である。 2つのサイクルシークエンス反応を行った。各反応は、全容量20μL中に、物質 標識したプライマーA、プライマーD、およびプライマーEを各2pmol、鋳型ITまた は鋳型4Aのいずれか100fmol、ビオチン-ddATP(Clonctech，Inc.)200pmol、およ び熱安定性DNAポリメラーゼAmpliTaq-FS(Perkin-Elmer Inc.)2.4単位を含んでい る。双方の反応は、代表的なホットスタート条件を使用して開始した。反応は、 全35サイクルについて、90℃で30秒間変性させ、60℃で10秒間アニーリングし、 65℃で10秒間伸延することから構成される代表的な温度サイクリングプログラム によって実施した。終了時に、ストレプトアビジン被覆の磁性ビーズ上に伸延し たビオチン化生成物を捕捉することによって、シークエンシング反応物を精製し た。ビーズを洗浄して伸延していないプライマーを除去し、次いで、ジスルフィ ド結合を開裂し、溶液中に物質標識を遊離するゆるやかな還元剤でビーズ結合生 成物を処理して、物質標識を遊離した上清の１μL量を取り出し、MALDI-TOF質量 分析(陽イオン、2、5-ジヒドロキシベンゾール酸マトリックス)によって分析した 。鋳型に一致したプライマーEおよび鋳型に一致したプライマーAに関するマスス ペクトルの結果を、それぞれ図20Aおよび図20Bに示す。プライマ ーEが鋳型に完全に一致する場合、マススペクトルで見られる顕著な物質標識シ グナルはプライマーE由来である。同様に、プライマーAが反応の中で鋳型に完全 に一致する場合、マススペクトルで見られる顕著な質量標識シグナルはプライマ ーA由来である。この例は、固定配列に隣接している可変配列を決定する、変性 した独特の物質標識プライマーの混合物使用の利用可能性を実証している。 例9 物質標識の一本鎖選択的化学的遊離 骨格鎖で架橋5'-S-Pホスホジエステル結合を含んでいる化学的に開裂可能なオ リゴヌクレオチドプローブ(配列番号31)を、PCT特許出願WO96/37630に開示され ている開裂部位で、修飾したホスホラミダイト試薬と結合する標準の固相合成技 術によって合成した。25-merプローブの配列は、5'-CCTGGCAAACTCAACTAGGC(sT)G TCC-3'(配列番号31)であり、配列中、sTは開裂部位を示す。配列5'-GATCCGGACAG CCTAGTTGAGTTTGCCAGGTAAGA-3'(配列番号32)で、相補的な35-merオリゴヌクレオ チドを同様に合成した。 プローブと補体の各10pmolの混合物を95℃で3分間加熱し、次いで70℃で10分 間インキュベーションし、続いて50℃で10分間インキュベーションすることによ って、互いにハイブリッド化して、1Mトリエチルアンモニウム酢酸塩緩衝液10pm ol中に二本鎖DNAを形成した。混合物は、室温になるようにし、最終濃度が0.14m Mになるように硝酸銀を添加した。銀が促進する開裂反応を室温(20℃)で60分間 進行させ、その後、過度のジチオスレイトールを添加することによって反応を抑 制した。試料を蒸発させた後に、3-HPA MALDIマトリックス溶液を添加してDNA を再溶解した。溶液を質量分析計試料プレートLにスポットし、分析した。マス スペクトルおよび補体無しのコントロール開裂のマススペクトルの結果を、図21 Aおよび図21Bにそれぞれ示す。コントロール反応のスペクトルは、使用した条件 下では、一本鎖のオリゴヌクレオチドが約90%まで完全な開裂を生じた ことを示し、一方、二本鎖のスペクトルは、同一条件下で、最高約5%の開裂しか 生じていないことを示している。これは、物質標識の遊離にあたって、ハイブリ ッド化したプローブとハイブリッド化していないプローブとの間でdiminiscrate する化学的開裂試薬の利用可能性が実証されている。 例10 RNA転写産物にハイブリッド化したDNAプローブのエキソヌクレアーゼIII消化に よる物質標識の遊離 標準のホスホラミダイト化学によって、リボソームタンパク質L7遺伝子に対す る一対のPCRプライマーを合成した。順方向プライマーは、5'-末端で、T7 RNA ポリメラーゼのプロモーター領域である伸延を含んでいた。順方向プライマーの 配列は、5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCTGAGGATTGTA-GAGC-3'(配列番号33)で あり、逆方向プライマーの配列は、5'-TCCAACAGTATAGATCTCATG-3'(配列番号34) である。それぞれ独自の物質標識を含む一対のプローブをさらに合成した。PCR 生成物の異なった鎖にそれぞれハイブリッド化すると同じに、そのうち一つだけ は転写RNAの鎖にハイブリッド化するようにそれらのプローブを設計した。上流 鎖プローブに使用されるペプチド物質標識は、配列CGYGPKKKRKVGG(配列番号35) を有しており、下流鎖(RNAに特異的)プローブに対するペプチドは、CKNLNKDKQVY RATHRB(配列番号36)であった。 物質標識プローブの合成は、例1Eに記述している。逆転写反応を安定した癌細 胞系から分離した全RNA10μlで行い、第一鎖cDNAを生成した。反応は全容量20μ Lで行い、オリゴdTOプライマー0.5μlg、AMV逆転写酵素25単位を含んでいた。PC R反応は、反応液20μL中のT7-順方向プライマーおよび逆方向プライマーを各10p mol、Taq DNAポリメラーゼ1単位を用いて、第一鎖cDNA1μLで行った。 その後、RT-PCR生成物の2μl分量を、T7 RNAポリメラーゼ100単位、RNAsin阻 害剤20単位、および各1mM濃度のrNTPを含む20μlの転写反応液に使用した。 転写反応は、37℃で2時間行った。その後、上記の二本鎖特異的プローブ各5pmol 使用して転写反応生成物1μlをプローブ化した。コントロールとして、転写反応 生成物の代わりにRT-PCR生成物1μlを使用した。95℃まで3分間加熱し、65℃で1 時間インキュベートし、その後37℃まで冷却することによって、プローブと標的 を1×エキソヌクレアーゼIII緩衝液中でハイブリッド化した。その後、その混合 物にエキソヌクレアーゼIIIを添加し、37℃で1時間、消化を促進した。上清の1 μL量を取り出し、MALDI-TOF質量分析(陽イオン、2、5-ジヒドロキシベンゾール 酸マトリックス)によって分析した。消化したRNA転写生成物およびコントロール のマススペクトルの結果を図22Aおよび図22Bにそれぞれ示す。RNA鎖特異的プロ ーブ物質標識シグナルのみ転写反応試料中に見られ、一方、両方のプローブ物質 標識シグナルは、RT-PCR生成物がプローブ化された場合に見られた。RNA転写産 物が存在する場合に、RNA鎖特異的プローブのみがマススペクトル中にシグナル を生じるという事実、ならびに、両方のプローブからのシグナルが残存性のRT-P CR生成物からのみ得られる場合に見えるであろうという事実は、物質標識を遊離 するRNA転写産物にハイブリッド化するプローブを特異的に消化するのに酵素エ キソヌクレアーゼIIIを使用することかできることを示している。 例11 ペプチド物質標識またはDNAに対するマトリックス選択性 ジスルフィド結合で分子を開裂する穏やかな還元剤でプライマーAおよびプラ イマーCの各々2pmol分量を処理し、別々のペプチドおよびDNA断片を生成した。 各プライマーについて、1μ1分量を2、5-ジヒドロキシ安息香酸とともに質量分 析計試料プレート上にスポットし、別の1μl分量をマトリックス3-HPAとともに スポットした。2、5-ジヒドロキシ安息香酸で得られたプライマーCのマススペク トルを図23Aに示す。それは、DNA断片の予測された質量において、非常に弱く、 不充分に分割されたわずかのシグナルとともに、強いペプチドシグナルを示して いる。対照的に、3-HPA(図23B)で得られたマススペクトルは、DNA断片に対する 強く鋭いシグナルとペプチド断片に対する弱いシグナルを示している。プライマ ーAに対して得られた対応スペクトルは、図23C(2,5-DHB)および図23D(3-HPA)中 に示す。これらの結果は、物質標識を運ばないプローブの大部分が多量に存在す る場合に、遊離した物質標識されたプローブ部分の選択的検出が可能であること を実証している。 例12 制限酵素結合免疫吸着分析における特異的生体分子（T）の検出 物質標識の遊離を介しての標的生体分子の検出例として、ELISA技術を基礎と したモデル系を考案した。この分析は、質量分析によって最終的に検出される物 質標識基質を消化するためのDNA制限酵素を組み合わせる。この例は、可溶性抗 原を検出するための抗体サンドイッチELISA法について記述する。Ausubelら(199 7年)によって記述されているELISAをここで引用により援用する。プローブの合 成(EcoRI制限部位を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドへの物質標識結合)に ついては、例1に記述している。2本鎖のプローブは、相補的なオリゴヌクレオチ ドのハイブリッド形成により調製した。抗原Tの標準溶液を、分析の検定用に調 製した(1〜1000ng/mL、分析の直線飛程に依存)。さらに、特異的な捕獲抗体(Ant i-T)および制限酵素EcoRI(AntiT-EcoRI)に交差結合した標的識別を調製した(特 異的抗体Ing当たりEcoRI0.1単位;1mL当たり10単位)。 手順 1．捕獲抗体(10ug/mL)でマイクロウエルlディッシュ(Immulonまたは等量)のウ エルをコートし、その後、メーカーの指示によって一晩結合させる。阻止緩衝液 (0.05%のトゥイーン20、0.25%ウシ血清アルブミンの緩衝溶液)でウエルを満たし てプレートの残存性結合能力を阻止し、室温で30分間インキュベートする。水で 3回プレートをすすぎ、残余の水を除去する。 2．ウエルに対し、（阻止緩衝液中の）抗原Tの既知のおよび未知の量の溶液、 50μLを結合させ、少なくとも2時間インキュベートする。水でプレートを3回洗 浄し、次に、10分間、阻止緩衝液で処理する。水で再び3回すすぐ。 3．各ウエルに、(0.5単位のEcoRI活性を含む)Anti T-EcoRI50μLを添加し、 室温で2時間インキュベートする。0.25%BSAを含んでいる1XEcoRI緩衝液を用いて 、プレートを3回洗浄する。 4．各96ウエルデイッシュに対する混合物。 二本鎖プローブ140μL(物質標識された オリゴヌクレオチド10pmol、7μMストッ ク)、 EcoRI緩衝液(10×)100μL、 水760μL 5．各ウエルに対し、上記混合物の10μLを添加し、線形応答を得るために、T 濃度で適当な時間37℃でインキュベートする(1時間まで)。65℃、２０分間で酵 素を不活性化し、その後、4℃まで冷却する。DHBでその混合1μlをスポットし、 水2μLで2回乾燥したスポットを洗浄し、遊離した物質標識を分析する。 ここに開示し、特許請求したすべての化合物および方法は調製可能であり、本 開示により過度の実験を行うことなく実施することができる。本発明の組成物お よび方法を好ましい態様に関して記述したが、発明の概念、意図および範囲から 外れることなく、組成物、方法およびここで記載した方法のステップまたは配列 に変更を適用してもよいことは、当業者に明白である。さらに具体的には、化学 的、生理学的の両方に関係しているある試剤は、同一か類似した結果をもたらす 限り、ここに記述された試剤にかえて代用してもよいことは明白である。当業者 に対し明白なそれらすべての類似した代用および変更は、添付した特許請求の範 囲によって定義される本発明の意図、範囲および概念内に入る。 参考文献 以下の参照文献は、本明細書に示される方法及び詳記を補足する例示的な方法 及び詳記の程度で、引用することにより、本明細書に特に組み込まれるものとす る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ポラート，ダニエル・ジェイ アメリカ合衆国、94025 カリフォルニア、 メンロ・パーク、アーバー・ロード 855 (72)発明者 シェイラー，トーマス・エイ アメリカ合衆国、94122 カリフォルニア、 サン・フランシスコ、フォース・アヴェニ ュー 1384、ナンバー ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Rx、ReおよびＭを含んで成るリリースタグ化合物であって、 Rxは反応基であり、 Reは放出基であり、 Ｍは質量分析法により検出可能な合成ポリマーまたはバイオポリマーを含む不揮 発性の質量標識である上記化合物。 ２．Rx、ReおよびＭを含んで成るリリースタグ化合物であって、 Rxは質量標識ヌクレオシド三リン酸を用いて合成される反応基であり、 Reは放出基であり、 Ｍは質量分析法により検出可能な質量標識である上記化合物。 ３．Rx、ReおよびＭを含んで成るリリースタグ化合物であって、 Rxは質量標識ヌクレオシドホスホルアミドを用いて合成される反応基であり、 Reは放出基であり、 Ｍは質量分析法により検出可能な質量標識である上記化合物。 ４．Rx、ReおよびＭを含んで成るリリースタグ化合物であって、 Rxは１つのヌクレオチドを含む第一のオリゴヌクレオチドまたはそれに付着させ た第二のオリゴヌクレオチドを含む反応基であり、 Reは放出基であり、 Ｍは質量分析法により検出可能な質量標識であり、 前記ヌクレオチドまたは前記第二のオリゴヌクレオチドは、前記第一のオリゴ ヌクレオチドを相補的な核酸配列に第一のオリゴヌクレオチドをハイブリッド形 成させた後に付加されることを特徴とする上記化合物。 ５．Rx、ReおよびＭを含んで成るリリースタグ化合物であって、 Rxはヌクレアーゼブロック部分を含み、 Reは放出基であり、 Ｍは質量分析法により検出可能な質量標識である上記化合物。 ６．Rx、ReおよびＭを含んで成るリリースタグ化合物であって、 Rxは制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであり、 Reは制限エンドヌクレアーゼにより切断可能なホスホジエステル結合を含む放出 基であり、 Ｍは質量分析法により検出可能な質量標識である上記化合物。 ７．Rx、ReおよびＭを含んで成るリリースタグ化合物であって、 Rxは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、 Reは化学的切断が可能な放出基であり、 Ｍは質量分析法により検出可能な質量標識であり、 ReはRx内部に位置し、化学的切断可能な放出基における切断が放出基における 二本鎖オリゴヌクレオチドの存在により阻害されることを特徴とする上記化合物 。 ８．(a)標的分子を入手するステップと、 (b)増幅標的分子を生成するために標的分子を増幅するステップと、 (c)反応基、放出基および質量標識を含むプローブを得るステップと、 (d)増幅標的分子とプローブをハイブリッド形成させ、プローブと増幅標的分子 との複合体を生成するステップと、 (e)プローブと増幅標的分子との複合体から質量標識を解離し、解離された質量 標識を得るステップと、 (f)質量分析法により解離された質量標識の質量を決定するステップと を含む標的分子を検出する方法。 ９．(a)反応基、放出基および質量標識を含むプローブを得るステップと、 (b)標的分子を入手するステップと、 (c)標的分子をプローブに接触させ、プローブと増幅標的分子との複合体を生成 するステップと、 (d)プローブと増幅標的分子との複合体から質量標識を選択的に解離するステッ プと、 (e)質量分析法により解離された質量標識の質量を決定するステップと を含む標的分子を検出する方法。 １０．(a)反応基、放出基および質量標識をそれぞれ含む複数のプローブを得 るステップと、 (b)標的分子を複数のプローブに接触させ、標的分子はプローブの反応基に付着 された状態で、プローブと増幅標的分子との複合体を生成するステップと、 (c)プローブと増幅標的分子との複合体から質量標識を解離し、解離された質量 標識を生成するステップと、 (d)質量分析法により解離された質量標識の質量を決定するステップと、ここで 、プローブと増幅標的分子との複合体の各反応基は質量標識の独自のセットと結 合されている、 を含む標的分子の検出方法を多重化する方法。 １１．(a)反応基、放出基および質量標識をそれぞれ含む複数のプローブを得 るステップと、 (b)標的分子を複数のプローブに接触させ、プローブと標的核酸分子との複合体 を生成するステップと、 (c)プローブと標的核酸分子との複合体から質量標識を選択的に解離するステッ プと、ここで、該複合体は溶液中に存在し、 (d)質量分析法により解離された質量標識の質量を決定するステップと を含む遺伝子の発現を監視する方法。 １２．(a)mRNAプールを入手するステップと、 (b)mRNAプールのサブセットを増幅し、複数の増幅核酸産物を生成するステッ プと、 (c)複数のプローブを得るステップと、ここで、各プローブは、反応基、放出基 および質量標識を含み、 (d)複数の増幅核酸産物を複数のプローブに接触させ、プローブと増幅標的分子 との複合体を生成するステップと、 (e)プローブと増幅標的分子との複合体から質量標識を選択的に解離するステッ プと、 (f)質量分析法により解離された質量標識の質量を決定するステップと を含む遺伝子の発現を監視する方法。 １３．(a)標的分子を反応基、放出基および不揮発性の質量標識を含むプロー ブと接触させ、プローブと増幅標的分子との複合体と未反応のプローブを生成す るステップと、 (b)プローブと増幅標的分子との複合体から質量標識を解離し、解離された質量 標識を生成するステップと、 (c)有機基質から解離された質量標識を選択的に吸着し、吸着された質量標識を 生成するステップと、 (d))質量分析法により吸着された質量標識の質量を決定するステップと を含む標的分子を検出する方法。 １４．(a)標的核酸を増幅し、増幅核酸産物を生成するステップと、 (b)1つ以上の第一の分子を得るステップと、ここで、第一の分子は反応基、放出 基、不揮発性質量標識を含み、 (c)増幅ステップ中に前記第一の分子を増幅核酸産物の中に組み入れ、組み入れ られた質量標識分子と組み入れられない質量標識分子を生成するステップと、 (d)増幅核酸産物の中に組み入れられた質量標識を解離し、解離された質量標識 を生成するステップと、 (e)質量分析法により解離された質量標識の質量を決定するステップと を含む標的分子を検出する方法。 １５．(a)反応基、放出基、不揮発性の質量標識を含むプローブを入手するス テップと、 (b)プローブを標的核酸分子と接触させ、プローブ:核酸分子複合体を生成するス テップと、 (c)ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブに付着させることにより プローブと核酸分子との複合体の質量を変え、質量を変えた質量標識を生成する ステップと、 (d)質量を変えた質量標識を解離するステップと、 (e)質量分析法により質量を変えた質量標識の質量を決定するステップと を含む標的核酸分子の存在の検出方法。 １６．(a)基質を得るステップと、 (b)標的分子をアフィニティ-リガンド-酵素接合体と接触させ、アフィニティ-リ ガンド-酵素接合体と標的分子との複合体を生成するステップと、 (d)アフィニティ-リガンド-酵素接合体と標的分子との複合体を基質と接触させ 、質量を変えた産物を生成するステップと、 (e)質量分析法により質量を変えた質量標識の質量を決定するステップと を含む酵素結合アフィニティーアッセイにおける特異的な生体分子の検出方法。