DE4438630A1 - Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-Abschnitten - Google Patents
Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-AbschnittenInfo
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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Description
Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ist innerhalb der letzten Jahre zu einem
der am häufigsten angewendeten Verfahren in der Molekulargenetik geworden,
um definierte Genabschnitte soweit zu amplifizieren, daß an ihnen weitere
Analysen z. B. Sequenzanalysen durchgeführt werden können. Dieses
Verfahren benötigt zur Durchführung die Kenntnis zweier kurzer Genabschnitte
am Anfang und am Ende der Zielsequenz. Häufig ist jedoch nur eine
benachbarte Gensequenz bekannt, wie etwa bei der Analyse umgelagerter
Genabschnitte z. B. bei den variablen Sequenzen der Antigenrezeptorgene. Es
wurde versucht, solche Sequenzen mit Hilfe von familienspezifischen Primern
oder degenerierten Primern (Zeitschrift "American Journal of Pathology"
1993, Vol. 143, No. 1, Seite 230-239) zu amplifizieren oder durch Anheften
synthetischer Sequenzen in der Anchored-PCR (Zeitschrift "Science" 1989,
Vol. 243, Seite 217-220) oder bei der Panhandle genannten Methode
(Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 1992, Vol. 20, No. 3, Seite 595-600), bei
der es zur Bildung einer Schleife kommt.
Mit allen diesen Methoden wird versucht das Problem zu lösen, daß sich
solche Genabschnitte der gängigen Vermehrung durch die PCR entziehen,
weil nur eine flankierende Seite und nicht die Anfangs- und Endsequenz
bekannt sind.
Dieses Problem wird durch die im Patentanspruch aufgeführten Merkmale
besonders schnell und einfach gelöst.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß die
Amplifikation, für die von der DNA oder der mRNA ausgegangen werden kann,
spezifisch mittels nur eines spezifischen Primers, einfach, schnell,
kostengünstig (Personal- und Materialkosten) und ohne Klonierung
(Voraussetzung S1 Sicherheitsbereich) möglich ist.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird
im folgenden näher beschrieben.
Die Synthese einer cDNA durch die reverse Transkription einer mRNA wird
nach Standardvorschrift durchgeführt, wobei ein spezifischer, zur
amplifizierenden Sequenz benachbarter Primer (3) verwendet wird.
Der Zweitstrang wird üblicherweise bei maximal 15°C synthetisiert, um
sogenannte "Haarnadelstrukturen" (4) zu vermeiden. Im Gegensatz dazu,
machen wir uns dieses Verhalten zunutze und lassen diese Reaktion bei
ca. 20°C-37°C ablaufen.
Erststrang cDNA|40 µl | ||
10 x Puffer | 32 µl | |
(188 mM Tris-HCl pH 8,3; 900 mM KCl; 46 mM MgCl₂; 37,5 mM Dithiothreitol) @ | 10 mM dNTP Mix | 6 µl |
steriles DEPC-Aqua dest | 232 µl | |
E. coli DNA Polymerase I (15 U/ml) | 8 µl | |
Inkubation 2 h bei ca. 20°C-37°C @ | 5 Min. 90°C, 4°C. |
Weiterführend ist eine Amplifikation mit diesem einen Primer allein möglich.
Aqua dest | |||
10 x Puffer | 10 µl | ||
(100 mM Tris-HCl pH 8,3; 500 mM KCl) @ | 1,5 mM MgCl₂ @ | 1,25 mM dNTP Mix | 16 µl |
1 spez. an liegender Primer (0,1 µM) @ | Doppelstrang cDNA | 1 µl | |
Taq Polymerase (5 U/ml) | 0,5 µl | ||
ad 100 µl | |||
30 Zyklen: 95°C 1 Min; 65°C 1 Min; 72°C 2 Min. |
Für jede Zielsequenz/Primer Konstellation ist eine Optimierung der
Amplifikationsbedingungen unerläßlich.
Das entstehende spezifische Produkt kann anschließend mit dem gleichen
spezifisch anliegenden Primer sequenziert werden, am besten mit einer Cycle
Sequencing Reaktion.
Claims (2)
- Selfpriming - Ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA Abschnitten, dadurch gekennzeichnet,
- - daß bei der Zweitstrangsynthese durch Bevorzugung der Haarnadelstruktur (4) des neugebildeten DNA Stranges in einem bestimmten Temperaturbereich (ca. 20°C-37°C),
- - dieser bis zur Anfangssequenz, entspricht der Primerregion (5), zurücksynthetisiert wird und dadurch
- - eine Amplifizierung der Zielsequenz mit nur einem benachbarten spezifischen Primer erreicht wird.
- Dieses ermöglicht es in einem zeit- und kostensparenden Verfahren ohne vorausgehendes Klonieren, eine ausreichende Menge eines spezifischen DNA Abschnittes für die Sequenzanalyse herzustellen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4438630A DE4438630A1 (de) | 1994-10-28 | 1994-10-28 | Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-Abschnitten |
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DE4438630A DE4438630A1 (de) | 1994-10-28 | 1994-10-28 | Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-Abschnitten |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4438630A1 true DE4438630A1 (de) | 1996-05-02 |
Family
ID=6531972
Family Applications (1)
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DE4438630A Withdrawn DE4438630A1 (de) | 1994-10-28 | 1994-10-28 | Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-Abschnitten |
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- 1994-10-28 DE DE4438630A patent/DE4438630A1/de not_active Withdrawn
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