DE4438630A1 - Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-Abschnitten - Google Patents

Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-Abschnitten

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Description

Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ist innerhalb der letzten Jahre zu einem der am häufigsten angewendeten Verfahren in der Molekulargenetik geworden, um definierte Genabschnitte soweit zu amplifizieren, daß an ihnen weitere Analysen z. B. Sequenzanalysen durchgeführt werden können. Dieses Verfahren benötigt zur Durchführung die Kenntnis zweier kurzer Genabschnitte am Anfang und am Ende der Zielsequenz. Häufig ist jedoch nur eine benachbarte Gensequenz bekannt, wie etwa bei der Analyse umgelagerter Genabschnitte z. B. bei den variablen Sequenzen der Antigenrezeptorgene. Es wurde versucht, solche Sequenzen mit Hilfe von familienspezifischen Primern oder degenerierten Primern (Zeitschrift "American Journal of Pathology" 1993, Vol. 143, No. 1, Seite 230-239) zu amplifizieren oder durch Anheften synthetischer Sequenzen in der Anchored-PCR (Zeitschrift "Science" 1989, Vol. 243, Seite 217-220) oder bei der Panhandle genannten Methode (Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 1992, Vol. 20, No. 3, Seite 595-600), bei der es zur Bildung einer Schleife kommt.
Mit allen diesen Methoden wird versucht das Problem zu lösen, daß sich solche Genabschnitte der gängigen Vermehrung durch die PCR entziehen, weil nur eine flankierende Seite und nicht die Anfangs- und Endsequenz bekannt sind.
Dieses Problem wird durch die im Patentanspruch aufgeführten Merkmale besonders schnell und einfach gelöst.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß die Amplifikation, für die von der DNA oder der mRNA ausgegangen werden kann, spezifisch mittels nur eines spezifischen Primers, einfach, schnell, kostengünstig (Personal- und Materialkosten) und ohne Klonierung (Voraussetzung S1 Sicherheitsbereich) möglich ist.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.
Beispiel Vorschrift für die mRNA (Fig. 1a Flußdiagramm) 1. Erststrangsynthese
Die Synthese einer cDNA durch die reverse Transkription einer mRNA wird nach Standardvorschrift durchgeführt, wobei ein spezifischer, zur amplifizierenden Sequenz benachbarter Primer (3) verwendet wird.
2. Zweitstrangsynthese (Haarnadelstruktur)
Der Zweitstrang wird üblicherweise bei maximal 15°C synthetisiert, um sogenannte "Haarnadelstrukturen" (4) zu vermeiden. Im Gegensatz dazu, machen wir uns dieses Verhalten zunutze und lassen diese Reaktion bei ca. 20°C-37°C ablaufen.
Erststrang cDNA|40 µl
10 x Puffer 32 µl
(188 mM Tris-HCl pH 8,3; 900 mM KCl; 46 mM MgCl₂; 37,5 mM Dithiothreitol) @ 10 mM dNTP Mix 6 µl
steriles DEPC-Aqua dest 232 µl
E. coli DNA Polymerase I (15 U/ml) 8 µl
Inkubation 2 h bei ca. 20°C-37°C @ 5 Min. 90°C, 4°C.
3. Anschluß Amplifikation (PCR)
Weiterführend ist eine Amplifikation mit diesem einen Primer allein möglich.
Aqua dest
10 x Puffer 10 µl
(100 mM Tris-HCl pH 8,3; 500 mM KCl) @ 1,5 mM MgCl₂ @ 1,25 mM dNTP Mix 16 µl
1 spez. an liegender Primer (0,1 µM) @ Doppelstrang cDNA 1 µl
Taq Polymerase (5 U/ml) 0,5 µl
ad 100 µl
30 Zyklen: 95°C 1 Min; 65°C 1 Min; 72°C 2 Min.
Für jede Zielsequenz/Primer Konstellation ist eine Optimierung der Amplifikationsbedingungen unerläßlich.
Das entstehende spezifische Produkt kann anschließend mit dem gleichen spezifisch anliegenden Primer sequenziert werden, am besten mit einer Cycle Sequencing Reaktion.

Claims (2)

  1. Selfpriming - Ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA Abschnitten, dadurch gekennzeichnet,
    • - daß bei der Zweitstrangsynthese durch Bevorzugung der Haarnadelstruktur (4) des neugebildeten DNA Stranges in einem bestimmten Temperaturbereich (ca. 20°C-37°C),
    • - dieser bis zur Anfangssequenz, entspricht der Primerregion (5), zurücksynthetisiert wird und dadurch
    • - eine Amplifizierung der Zielsequenz mit nur einem benachbarten spezifischen Primer erreicht wird.
  2. Dieses ermöglicht es in einem zeit- und kostensparenden Verfahren ohne vorausgehendes Klonieren, eine ausreichende Menge eines spezifischen DNA Abschnittes für die Sequenzanalyse herzustellen.
DE4438630A 1994-10-28 1994-10-28 Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-Abschnitten Withdrawn DE4438630A1 (de)

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