WO2005010209A2 - Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren Download PDF

Info

Publication number
WO2005010209A2
WO2005010209A2 PCT/EP2004/008363 EP2004008363W WO2005010209A2 WO 2005010209 A2 WO2005010209 A2 WO 2005010209A2 EP 2004008363 W EP2004008363 W EP 2004008363W WO 2005010209 A2 WO2005010209 A2 WO 2005010209A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mrna
cdna
rna
guanidine
molecular species
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/008363
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2005010209A3 (de
Inventor
Tanja Wille
Christian Korfhage
Eric Lader
Original Assignee
Qiagen Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen Gmbh filed Critical Qiagen Gmbh
Priority to EP04763506A priority Critical patent/EP1651776A2/de
Priority to CA002533119A priority patent/CA2533119A1/en
Priority to US10/565,989 priority patent/US20060281092A1/en
Priority to JP2006520816A priority patent/JP2006528482A/ja
Priority to AU2004259851A priority patent/AU2004259851A1/en
Publication of WO2005010209A2 publication Critical patent/WO2005010209A2/de
Publication of WO2005010209A3 publication Critical patent/WO2005010209A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Definitions

  • the present invention relates to a method for reverse transcription and / or amplification of a product from a reverse transcription of a pool of nucleic acids of a certain type, this pool of nucleic acids originating from a complex biological sample or an enzymatic reaction.
  • nucleic acids Due to the increasing specificity and sensitivity in the preparation of nucleic acids, this has become increasingly important not only in the field of basic biotechnological research, but also increasingly in medical fields, primarily for diagnostic purposes. Since many molecular biological applications require the separation of certain nucleic acids from one another, the main focus here is on improving and / or simplifying methods for separating and / or isolating nucleic acids. This particularly includes the separation of individual nucleic acid types from complex biological samples and / or from products of enzymatic reactions.
  • the potential nucleic acid sources are first unlocked using methods known per se.
  • the nucleic acids are then isolated using methods which are also known per se.
  • the isolated nucleic acids should not only be free from interfering cell components and / or metabolites. In order to increase the specificity and sensitivity of such applications, an additional purification of individual nucleic acid types is often necessary.
  • RNA deoxyribonucleic acids
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • copy DNA cDNA
  • genomic DNA gDNA
  • messenger RNA mRNA
  • transfer RNA tRNA
  • rRNA ribosomal RNA
  • small nuclear RNA snRNA
  • pDNA plasmid DNA
  • viral DNA viral RNA etc.
  • modified or artificial nucleic acids or also nucleic acid analogues such as peptides nucleic acids (PNA) or Locked Nucleic Acids (LNA) etc.
  • PNA peptides nucleic acids
  • LNA Locked Nucleic Acids
  • RT-PCR reverse transcription reactions with polymerase chain reaction
  • array analysis are among the most frequently used methods.
  • a common feature of these methods is that the mRNA of interest (apart from exceptions, e.g. through direct labeling of RNA) is not measured directly, but is first rewritten into the corresponding cDNA.
  • Current systems however, already have a fundamental problem at this point when working with biological material, particularly in the field of molecular biology and / or diagnostics.
  • RNA transcripts are also reversely transcribed.
  • biological starting materials such as brain, liver or muscle tissue, whole blood, isolated leukocytes or other biological materials, as well as in products of enzymatic reactions, certain transcripts are present in very large numbers (such as globin mRNA transcripts in RNA preparations from whole blood or rRNA transcripts in all total RNA isolations), these RNA transcripts are also reverse transcribed to a certain degree, for example by unspecific priming and / or mispriming.
  • oligo-dT primers are frequently used in common methods for priming the reverse transcription, so that only mRNAs that have a poly- Have a tail. Nevertheless, despite the use of oligo-dT primers, unspecific priming and / or mispriming, other types of RNA, such as rRNA, tRNA, snRNA etc., are also reverse-transcribed to a certain degree, so that a reduction is often also found here the sensitivity of the downstream analyzes of the mRNAs cannot be excluded.
  • RNA level many methods require analysis of gene expression patterns at the RNA level, such as. B. Array analyzes, a reverse transcription of the mRNA of interest with a subsequent cDNA double-strand synthesis.
  • This double-strand synthesis is necessary so that the double-stranded cDNA generated in this way can be amplified and / or labeled in a subsequent in vitro transcription (IVT).
  • IVT in vitro transcription
  • the reaction mixture here also contains the total RNA used and cDNA single strands in which no double strands were synthesized, in addition to the synthesized ds-cDNA.
  • RNA from a sample that contains both types of nucleic acid includes digestion with RNase.
  • the RNase must be added as a separate enzyme for the second strand synthesis in an additional pipetting step, which makes such processes very time-consuming and cost-intensive.
  • the RNase can only be partially removed completely from the sample.
  • the object of the present invention is to provide an efficient method for the selective reverse transcription and / or amplification of the nucleic acid (s) of interest which enables the production of a highly pure nucleic acid from a complex biological sample or Enables an enzymatic reaction that can or can be measured as sensitively as possible in a desired downstream analysis.
  • This object is achieved according to the invention by a method for reverse transcription and / or amplification of a product of a reverse transcription of a pool of nucleic acids of a type (A) from a biological sample or an enzymatic reaction, characterized by the selective suppression of the reverse transcription of at least one unwanted nucleic acid of type (A) and / or the selective suppression of the amplification of a product of a reverse transcription of at least one undesired nucleic acid of type (A).
  • the method according to the invention is characterized in particular by the fact that by selectively suppressing the reverse transcription of at least one undesired nucleic acid of a type (A) and / or by selectively suppressing the amplification of a product of a reverse transcription of at least one undesired nucleic acid of a type (A) , which is present in a pool of nucleic acids of type (A) originating from a complex biological sample or an enzymatic reaction, certain nucleic acids of type (A) or amplification products thereof in highly pure form and free of undesired nucleic acids of type (A) or their amplification products be separated.
  • Biological starting materials in the sense of the invention are complex biological samples, such as tissue samples from neuronal, liver or muscle tissue etc., isolated cells (e.g. leukocytes), whole blood and / or samples contaminated with whole blood (e.g. tissue samples from blood vessels or other highly perfused tissues) as well as other biological materials.
  • biological starting materials for the purposes of the invention also includes the products of enzymatic reactions, such as, for example, products of at least one nucleic acid amplification reaction (for example an IVT).
  • the nucleic acid of type (A) is mRNAs, which may be natural mRNAs or those derived from in vitro transcription reactions.
  • the term “undesired nucleic acid of type (A)” in the context of the invention is understood to mean at least one mRNA which in each case accounts for a share of 20% or more in the total mRNA.
  • certain undesired mRNAs can be found in samples certain starting materials may be present in very high numbers of copies, such as globin mRNAs in RNA isolated from whole blood, cytochrome mRNAs in RNA isolated from muscle cells or myelin mRNAs in RNA isolated from neuronal tissue. The proportion of these mRNA (s) can do more here account for more than 40% or even more than 60% of the total mRNA.
  • the method according to the invention efficiently suppressed the reverse transcription of at least one undesired one Nucleic acid of a type (A), and / or the amplification of a product of a reverse transcription of at least one undesired nucleic acid of a type (A), in particular globin mRNA. Regardless of whether the whole blood sample was taken promptly or was taken up and stored in a stabilizing reagent.
  • the blood samples used in the method according to the invention are converted into a stabilizing reagent immediately upon acceptance to maintain the RNA status.
  • Known compounds such as tetra-alkyl ammonium salts in the presence of an organic acid (WO 02/00599 / QIAGEN GmbH, Hilden, DE) or guanidine compounds in a mixture with a buffer substance, a reducing agent and / or a detergent (e.g. WO 01/060517 / Antigen intents GmbH, Stuttgart, DE) can be used.
  • WO 01/060517 / Antigen principless GmbH, Stuttgart, DE can be used.
  • Such a procedure enables blood collection tubes in which the stabilizing reagent is already contained (PaxGene / PreAnalytix, Hombrechticon, CH).
  • the individual method steps can also be designed differently.
  • the method according to the invention is based on method step a), carrying out a reverse transcription reaction of an RNA from a biological sample or an enzymatic reaction in the presence of at least one oligo-dT primer.
  • process steps b) carrying out a cDNA second-strand synthesis, and c), purifying the ds-cDNA formed in b) with simultaneous depletion of all single-stranded nucleic acids from the reaction product of b).
  • an amplification of the cDNA can be carried out.
  • the first method step (a) is carried out according to methods known per se in the prior art with common reagents, such as, for example, a commercial reverse transcriptase (e.g. Superscript II RT / Invitrogen) and in the presence of at least one commercially available oligo-dT Primers (T7-oligo-dT 2 Primer / Operon, Cologne, DE).
  • common reagents such as, for example, a commercial reverse transcriptase (e.g. Superscript II RT / Invitrogen) and in the presence of at least one commercially available oligo-dT Primers (T7-oligo-dT 2 Primer / Operon, Cologne, DE).
  • nucleic acids different from type (A) for priming the reverse transcription frequently use commercially available oligo-dT primers or derivatives and / or fusions from oligo-dT primers, such as, for example, primers with sequences for a T7 RNA polymerase promoter at the 5'-end and oligo-dT sequences at the 3'-end, so that only mRNAs which have a poly-A sequence at the 3'-end are preferably reverse transcribed.
  • the nucleic acids different from type (A) are essentially different RNA types than mRNAs (e.g. rRNA, tRNA, snRNA, gDNA and plastid DNA), the so-called non-mRNA templates ,
  • a cDNA second-strand synthesis can then optionally be carried out using a method known per se, including the common reagents.
  • an RNase H is added as a separate enzyme before the start of the second strand synthesis, the mRNA hybridized to the cDNA after the first strand synthesis being degraded by the activity of the enzyme (while the non-hybrid RNA is not a substrate for the RNase H).
  • the reaction is carried out in such a way that the RNase H digestion is incomplete, so that shorter RNA fragments remain. These RNA fragments serve as primers for the subsequent second strand synthesis.
  • a specific reverse transcriptase e.g. LabelStar RT / QIAGEN GmbH, Hilden, DE
  • a specific reverse transcriptase which has an intrinsic RNase H activity has, so that the cDNA second strand synthesis can be carried out much faster, easier and cheaper (see Example 1).
  • the reaction mixture usually also contains the total RNA used and cDNA single strands (e.g. ss cDNA, viral cDNA etc.) on which no double strands were synthesized (inter alia because the synthesis of the double strand does not happen with 100% efficiency).
  • ss cDNA e.g. ss cDNA, viral cDNA etc.
  • these different nucleic acid types are also "carried over" into a subsequent amplification reaction and / or thus into the hybridization batch on the array without an effective purification step.
  • the various unlabeled nucleic acids in solution compete for the binding with the labeled cRNA transcripts to the probes on the array
  • the probes on the array compete with the unlabeled nucleic acid transcripts in solution for binding to the labeled ones cRNAs instead. Since the balance of these competitive reactions is not entirely on the side of the hybridization of the labeled cRNAs to the probes on the array, the presence of the unlabeled nucleic acids leads to a reduction in the signals on the array.
  • the unwanted hybridization of one or more overrepresented labeled or unlabeled nucleic acid transcripts to the probes on the array can be further reduced by adding unlabeled oligonucleotides that have the reverse complementary sequence to the undesired nucleic acid transcripts.
  • These reversely complementary oligonucleotides can be, for example, oligonucleotides transcribed in vitro or synthetically produced. The consequent reduction in the unspecific hybridization of overrepresented transcripts increases the sensitivity of the array analysis.
  • a conventional purification of the reaction mixture of the enzymatic reaction can take place after step b).
  • the actual purification step takes place, for example, by using "silica spin column technologies" known in the art. (eg with the commercially available GeneChip Sample Cleanup Module / Affymetrix, Santa Clara, US). After the addition of a binding buffer containing chaotropic salts, the reaction mixture is separated using a commercially available spin column (eg MinElute Cleanup Kit / QIAGEN GmbH, Hilden, DE).
  • Process step c) according to the invention can not only advantageously replace an upstream isolation of mRNA, but at the same time it enables the depletion of all single-stranded nucleic acids (ss DNAs and RNAs) from the reaction product from step b), with purification of the ds-cDNA. Furthermore, the use of the washing step according to the invention enables the production of a ds-cDNA with a high degree of purity, which leads to an enormous increase in sensitivity in a subsequent GeneChip analysis (see Example 10).
  • At least one single-stranded nucleic acid transcript can also be separated from other single-stranded transcripts by using the washing step according to the invention.
  • the oligonucleotides which are complementary to the single-stranded target sequence and which form a double-stranded nucleic acid hybrid with the target sequence are used.
  • all non-hybridized, and thus still single-stranded, transcripts are separated from the nucleic acid mixture.
  • the nucleic acids originating from step b) are first bound in their entirety to a silica matrix and then the silica matrix is washed with a guanidine-containing washing buffer to deplete the single-stranded nucleic acids.
  • cDNA molecules were primarily synthesized which are complementary to the mRNA molecules of the starting RNA (ie no cDNA synthesis based on rRNA, tRNA, snRNA molecules) .
  • the reaction solution has been added to the silica spin columns, or added to the silica particles, the method described above allows the depletion of all single-stranded nucleic acids in one washing step with a washing buffer according to the invention.
  • the washing step according to the invention can advantageously be used in any process in which purification of double-stranded nucleic acids with simultaneous depletion of single-stranded nucleic acids is desired.
  • the washing step according to the invention can thus also take place after the optional process step d) shown below (carrying out an amplification of the cDNA).
  • the silica matrix used for the purification can comprise one or more silica membrane (s) or particles with a silica surface, in particular magnetic silica particles, and can be contained in a spin column or other common devices for nucleic acid purification.
  • the guanidine-containing washing buffer used for the washing step according to the invention preferably contains guanidine isothiocyanate and / or guanidine thiocyanate, preferably in a concentration of 1 M to 7 M, particularly preferably from 2.5 M to 6 M and very particularly preferably from 3 M to 5.7 M.
  • guanidine hydrochloride can also be used according to the invention, with a concentration of 4 M to 9 M, preferably 5 to 8 M.
  • the washing buffer used in the washing step according to the invention can contain one or more buffer substance (s) in a total concentration of 0 mM to
  • the pH of the washing buffer is preferably in the range from pH 5 to 9, particularly preferably in the range from pH 6 to 8, with common buffer substances (such as Tris, Tris-HCl, MOPS, MES, CHES, for example) for setting the corresponding pH , HEPES, PIPES and / or sodium citrate), preferably with a total concentration of the buffer substances 20 mM to 40 mM, can be used.
  • common buffer substances such as Tris, Tris-HCl, MOPS, MES, CHES, for example
  • wash buffer composition can be added.
  • chelating agents for example EDTA, EGTA or other suitable compounds
  • detergents for example Tween 20, Triton X 100, Sarcosyl, NP40 etc.
  • Wash buffer 7 4.5 M guanidine isothiocyanates * 0.1 M EDTA, pH 8.0
  • Wash buffer 8 7.0 M guanidine hydrochloride, pH 5.0
  • Guanidine thiocyanates can be used in combination with or instead of guanidine isothiocyanates.
  • washing step according to the invention described above can thus be used to deplete rRNA from double-stranded eukaryotic cDNA synthesis products.
  • Another application is the separation of single-stranded viral nucleic acids from eukaryotic or prokaryotic, double-stranded genomic DNA (see Example 4).
  • the washing step according to the invention for the depletion of single-stranded nucleic acids from double-stranded nucleic acids is advantageous for various downstream analyzes.
  • the sensitivities could also be increased, for example in amplification reactions or other applications (such as, for example, ribonuclease protection assays, Northern or Southern blot analyzes, primer extension analyzes, etc.).
  • an unwanted high number of existing mRNA transcripts such as globin mRNA transcripts from a whole blood sample, for subsequent downstream analyzes can also be caused by the presence of a molecule Species to suppress an RT and / or amplification reaction of the unwanted mRNA transcripts are eliminated.
  • the process steps a) and / or d) in the presence of at least one molecular species for the selective suppression of the reverse transcription of at least one undesired mRNA and / or for the selective suppression of the amplification of those from the undesired one or more mRNA (s) produced single or double-stranded cDNA (s), are carried out.
  • the molecular species bind to the unwanted nucleic acids of type (A) or cleave them, thereby preventing the reverse transcription of the unwanted mRNAs.
  • Amplification in the sense of the invention includes various reaction types, such as in vitro transcription, a polymerase chain reaction (PCR), a ligase chain reaction (LCR), a nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) or a self-sustained sequence replication (3SR) etc. understood.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • NASBA nucleic acid sequence-based amplification
  • 3SR self-sustained sequence replication
  • method step a) is therefore carried out in the presence of at least one molecule species for the selective suppression of the reverse transcription of at least one undesired mRNA, the reverse transcription of the overrepresented transcripts being interrupted by binding of the molecule species to these mRNAs becomes. These transcripts are therefore no longer available for cDNA labeling, double-strand synthesis and / or the subsequent amplification.
  • Molecular species within the meaning of the invention can be complementary to the mRNA or to one of the cDNA strands DNA or RNA oligonucleotides (antisense oligonucleotides) or their derivatives, e.g. B. oligonucleotides containing modified or artificial nucleotides, quenchers, fluorophores or other modifications, in a length of 10 to 60 nucleotides, preferably 12 to 30 nucleotides.
  • the molecule species can be a nucleic acid analogue which is complementary to the mRNA or to one of the cDNA strands, with modified nucleic acids, such as PNAs (peptide nucleic acids), LNA (locked nucleic acids), and / or GripNAs also being used as the nucleic acid analogue can be used.
  • modified nucleic acids such as PNAs (peptide nucleic acids), LNA (locked nucleic acids), and / or GripNAs also being used as the nucleic acid analogue can be used.
  • the molecule species used for sequence-specific blocking binds preferably in the 3 'region of the nucleic acid to be blocked (the mRNA or one of the cDNA strands).
  • Preferred molecular species are PNAs that have a length of 12 to 20 nucleotide analogs, preferably 13 to 16 nucleotide analogs (PE Biosystems, Rothstadt, DE) and / or GripNAs that have a length of 12 to 30 nucleotide analogs, preferably 14 to 20 Have nucleotide analogs (ActiveMotif) and / or LNAs which have at least one nucleotide which is a 'locked nucleotide' and which have a length of 14 to 30 nucleotides, preferably 15 to 22 nucleotides (Operon, Cologne, DE) , used.
  • a single molecule for sequence-specific blocking of a specific target sequence it is also possible to use several molecules complementary to different regions within one or more specific target sequence (s). Furthermore, it can also prove to be advantageous to use a single molecule for sequence-specific blocking which acts against several different target RNAs or target cDNAs if the molecule is complementary to a homologous region of different target RNAs or target cDNAs.
  • molecule species which is used for sequence-specific blocking for example, to prevent nucleic acid polymerization (for example an RT)
  • this molecule species must have a modification at its 3 'end (for example by acetylation, phosphorylation, carboxylation or other suitable modifications) which prevent the molecular species from not serving as primers themselves and consequently initialize an elongation beginning at the 3 'end of the molecular species.
  • the labeling of RNA is prevented by hybridizing the RNA with tightly binding molecules.
  • RNAzymes As an alternative to blocking the target sequence, as already mentioned at the beginning, there is also the possibility of cleaving specific unwanted or undesired mRNAs in a sequence-specific manner by means of certain molecular species.
  • Molecular species such as DNAzymes, ribozymes, in particular hammerhead ribozymes and / or hairpin ribozymes, can be used for this purpose. These molecules are preferably directed against the 3 'region of the unwanted RNA and are used before the reverse transcription is carried out.
  • Ribozymes consisting of RNA or RNA derivatives or fusion products of such ribozymes can be used for this embodiment of the invention.
  • the complementary sequence of the ribozymes preferably has a length of 12 to 30 nucleotides, particularly preferably a length of 15 to 25 nucleotides.
  • one or more DNA oligonucleotide (s), PNA (s) and / / are advantageously used as molecular species for selective suppression or for blocking the reverse transcription or amplification of the undesired mRNA, in particular the globin sequences. or LNA (s) which have the sequences listed below are used.
  • the DNA oligonucleotide has the function of blocking the reverse transcription of globin mRNA invention according to a sequence from the following group which is complementary to human alpha 1 globin mRNA and / or alpha 2 globin mRNA.
  • alpha_473 5 ' CTC GAG CTT AAC GGT - phosphate group - 3' alpha_465: 5TAA CGG TAT TTG GAG - phosphate group - 3 'alpha_ 465_long: 5 ' TAA CGG TAT TTG GAG GTC AGC ACG GTG CTG - phosphate group - 3 '
  • the DNA oligonucleotide has a sequence from the following group according to the invention for blocking the reverse transcription of globin mRNA: is complementary to human beta globin mRNA.
  • beta_554 5 ' GTA GTT GGA CTT AGG - phosphate group - 3 ' beta_594: 5 ' ATC CAG ATG CTG AAG - phosphate group - 3 ' beta_554_long: 5 ' GTA GTT GGA CTT AGG GAA CAA AGG AAC CTT - phosphate group - 3 '
  • the PNA has one according to the invention for blocking the reverse transcription of globin mRNA Sequence from the following group, which is complementary to human alpha 1 globin mRNA and / or alpha 2 globin mRNA.
  • alpha_473 N- CTC CAG CTT AAC GGT -C * alpha_465: N- TAA CGG TAT TTG GAG -C * alpha_363: N- GTC ACC AGC AGG CA -C * alpha_393: N- GTG AAC TCG GCG -C * alpha_473 ** : N- TGG CAA TTC GAC CTC -C * alpha_465 ** : N- GAG GTT TAT GGC AAT -C * alpha_363 **: N- ACG GAC GAC CAC TG -C * alpha_393 ** : N- GCG GCT CAA GTG - C * If the molecular species is a PNA and the globin mRNA is a beta globin mRNA, the PNA has a sequence from the following group according to the invention for blocking the reverse transcription of globin mRNA, which is complementary to human beta Globin mRNA.
  • beta-554 N- GTA GTT GGA CTT AGG -C * beta-594: N- ATC CAG ATG CTC AAG -C * beta-539: N- CCC CAG TTT AGT AGT -C * beta-541: N- CAG TTT AGT AGT TGG -C * beta-579: N- GCC CTT CAT AAT ATC -C * beta-554 ** : N- GGA TTC AGG TTG ATG -C * beta-594 **: N- GAA CTC GAT GAC CTA - C * beta-539 **: N- TGA TGA TTT GAC CCC -C * beta-541 ** : N- GGT TGA TGA TTT GAC -C * beta-579 ** : N- CTA TAA TAG TTC CCG -C *
  • N indicates the amino terminus of the oligomers and C * the carboxy terminus of the oligomers, and the sequences provided with (**) are reverse-oriented to the above sequences.
  • the molecular species is an LNA which has at least one nucleotide which is a locked nucleotide 1
  • the globin mRNA is an alpha 1 globin mRNA and / or an alpha 2 globin mRNA
  • the LNA for blocking the reverse transcription of globin mRNA has a sequence from the following group which is complementary to human alpha 1 -globin mRNA and / or alpha 2-globin mRNA.
  • alpha_473 5 ' CTC CAG CTT AAC GGT - octane diol - 3 ' alpha_465: 5 TAA CGG TAT TTG GAG - octane diol - 3 ' alpha_363: 5 ' GTC ACC AGC AGG CA - octane diol - 3 ' alpha_393: 5 ' GTG AAC TCG GCG - Octane diol - 3 '
  • the molecular species is an LNA which has at least one nucleotide which is a 'locked nucleotide', and the globin mRNA is a beta globin mRNA
  • the LNA for blocking the reverse transcription of globin mRNA has a sequence from the following group which is complementary to human beta globin mRNA.
  • beta-554 5 ' GTA GTT GGA CTT AGG - octane diol - 3 ' beta-594: 5 ' ATC CAG ATG CTC AAG - octane diol - 3 ' beta-539: 5 ' CCC CAG TTT AGT AGT - octane diol - 3 ' beta 541: 5 'CAG TTT AGT AGT TGG - octane diol - 3 ' beta-579: 5 ' GCC CTT CAT AAT ATC - octane diol - 3 '
  • locked nucleotides are primarily enzymatically non-degradable nucleotides, which, however, do not serve as a starting molecule for a polymerase can, since they have no free 3'-OH end.
  • RNA preparations which have a high proportion of overrepresented transcripts e.g. globin mRNA transcripts
  • the products of the reverse transcription are amplified (preferably by in vitro transcription, optionally) with a subsequent DNase digestion and a cRNA purification), and / or if at least one washing step according to the invention is carried out, there are advantageously no RT products or amplification products resulting therefrom, which significantly increases the sensitivity of the gene expression analysis of low or low expressed transcripts can be.
  • the use of the cRNA and / or cDNA resulting from the method according to the invention in an array-based gene expression analysis is extremely advantageous since no RT products result from highly expressed transcripts and / or amplification products from RT products of highly expressed transcripts on the arrays are hybridized and thus a reduction in the signal intensities and the associated loss of sensitivity in the array analysis is avoided.
  • Band L RNA size standard, band 1: generated cRNA at a final PNA concentration of 10 ⁇ M, band 2: generated cRNA at a final PNA concentration of 1.0 ⁇ M, band 3: generated cRNA at a final PNA concentration of 0, 1 ⁇ M, band 4: generated cRNA at a final PNA concentration of 0.01 ⁇ M, band 5: generated cRNA at a final PNA concentration of 0.001 ⁇ M band 11: generated cRNA without addition of PNAs (comparative sample).
  • Fig. 3 shows the correlation of the signal intensities of the sample in which only Jurkat RNA was used with that of the sample in which Jurkat RNA was analyzed with added globin in vitro transcripts.
  • Fig. 4 shows the amount of RNA in a sample before and after purification with different washing conditions.
  • Fig. 5 amount of single-stranded cDNA of a sample before and after purification with different washing conditions.
  • RNA and gDNA before and after purification (with different washing conditions) on a formaldehyde agarose gel, where:
  • Band 1 the genomic DNA (before cleanup); Band 2: the RNA (before cleanup); Band 3: the genomic DNA mixed with the RNA (before the cleanup); Lanes 4 and 5: the genomic DNA mixed with the RNA (after the cleanup); (Purification was carried out under standard conditions using an ethanol-containing washing buffer) Lanes 6 and 7: the genomic DNA mixed with the RNA (after the cleanup); (The purification was carried out under standard conditions with an additional washing step with a washing buffer 1 containing chaotrophic salts).
  • Table 1 Results of a GeneChip analysis on U133A GeneChips using different reverse transcriptases.
  • the LabelStar reverse transcriptase for the first strand synthesis of the cDNA, the signal intensities for the ribosomal RNA transcripts (18S rRNA and 28S rRNA) could be greatly reduced. Priming with the LabelStar RT as a reverse transcriptase is therefore much more specific for mRNA.
  • RNA was isolated from whole human blood. The following cDNA synthesis was carried out as in Example 1 with two different reverse transcriptases (SuperScript RT and LabelStar RT) starting from oligo-dT-T7 primers. The cDNA second-strand synthesis was then carried out under identical conditions for the different batches. After purification of the reactions, an IVT was carried out with subsequent purification of the cRNA including a DNase digestion. The DNase digestion ensures that only the generated RNA and not the contaminating cDNA is measured in the subsequent TaqMan RT-PCR analysis (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) of the cRNA.
  • DNase digestion ensures that only the generated RNA and not the contaminating cDNA is measured in the subsequent TaqMan RT-PCR analysis (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) of the cRNA.
  • RNA of a blood donor was isolated as in Example 1 using the PAXgene Blood RNA System (PreAnalytix, Hombrechticon, CH).
  • PAXgene Blood RNA System PreAnalytix, Hombrechticon, CH.
  • Affymetrix target preparation was carried out according to the Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual" (standard protocol). This approach was compared to a second approach in which the conditions during annealing of the cDNA primer were varied:
  • RNA of a blood donor was isolated as in Example 1 using the PAXgene Blood RNA System (PreAnalytix, Hombrechticon, CH).
  • PAXgene Blood RNA System PreAnalytix, Hombrechticon, CH.
  • PNA sequences PE Biosystems
  • alpha_465 N- TAA CGG TAT TTG GAG -C *
  • beta_554 N- GTA GTT GGA CTT AGG -C *
  • RNA 5 ⁇ g RNA were used for reverse transcription per approach.
  • the cDNA synthesis was carried out according to the manufacturer's instructions in the Technical Manual (Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual"), the PNA sequences listed above which were complementary to the alpha and beta globin transcripts being additionally added.
  • both PNAs (alpha_465 and beta_554) and the primers were incubated in a conventional cDNA synthesis reaction buffer (buffer from Superscript RT / Invitrogen) for 10 min at 70 ° C. and subsequently for 5 min at 42 ° C.
  • the PNAs were added in a final concentration of 0.001 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 1, 0 ⁇ M and 10 ⁇ M. Subsequently, all other components required for the RT (such as additional reaction buffer, nucleotides, dithiothreitol (DTT) and the reverse transcriptase) were added and the samples were incubated at 42 ° C. for 1 h. Both the cDNA double strand synthesis, as well as the in vitro transcription and the cleanup of the cRNA were carried out according to the manufacturer's instructions in the Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual". The comparison and control samples without PNAs were treated identically.
  • FIGS. 1 and 2 show the influence of alpha_465 and beta_554 PNAs on the generation of cRNAs, whereby it also becomes clear that the addition of alpha and beta Globin transcripts of complementary PNA oligomers lead to a reduction in the cRNA fragments, which result in a clear band when analyzed on the Agilent 2100 bioanalyzer.
  • These cRNA fragments were generated from the globin transcripts (mRNA) of the starting materials (whole blood). The extent of the reduction depends on the concentration of the PNAs.
  • RNA of a blood donor was isolated from human whole blood (without erythrocyte lysis) as in Example 1 using the PAXgene Blood RNA System (PreAnalytix, Hombrechticon, CH). For each approach, 1.7 ⁇ g RNA was used in a reverse transcription.
  • the cDNA synthesis was carried out with the reverse transcriptase Omniscript (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) according to the manufacturer's instructions (except that the RT was carried out at 42 ° C. instead of 37 ° C.).
  • the cDNA synthesis was primed with a T7-oligo-dT 2 primer (Operon, Cologne, DE).
  • PNAs sequences see below
  • PNAs were added at a final concentration of 0.5 ⁇ M, 1.0 ⁇ M and 1.5 / M and the mixture was incubated first at 70 ° C. for 10 min and then at 37 ° C. for 5 min , The reverse transcriptase was then added and the samples were incubated at 42 ° C. for 1 h.
  • the comparison and control samples without PNAs were treated identically.
  • Identical primers were used for the amplification of alpha 1 -globin cDNA transcripts and alpha 2-globin cDNA transcripts.
  • the following PNA sequences were used to block the reverse transcription of the alpha and beta globin transcripts:
  • alpha_473 N- CTC CAG CTT AAC GGT -C * alpha_465: N- TAA CGG TAT TTG GAG -C * Sequences that are complementary to human beta globin mRNA:
  • beta_554 N- GTA GTT GGA CTT AGG -C * beta 594: N- ATC CAG ATG CTC AAG -C *
  • Table 3 Influence of PNAs complementary to alpha and beta globin on a two-step RT-PCR reaction.
  • the use of the PNAs beta_554 and beta_594 leads to a reduction in the cDNA amount of beta globin by approximately 99% and 80%, respectively. If these PNAs are used in a final concentration of 0.5 ⁇ M, the transcript level for alpha globin remains unaffected.
  • PAXgene Blood RNA System PreAnalytix, Hombrechticon, CH.
  • the target samples for the RNA samples of both donors were prepared using the following protocol variants:
  • Target preparation using PNAs to block the reverse transcription of the globins In comparison to the standard protocol, the following protocol changes were carried out in the batches using the PNAs: The PNAs were primed together with the T7-oligo (dT) 24 before the cDNA synthesis (Operon, Cologne, DE) pipetted to RNA. Several incubation steps were carried out to attach the primer and the PNAs to the RNAs (10 min 70 ° C; 5 min 45 ° C; 2 min 42 ° C). All further steps were carried out as in the standard protocol. Approaches were compared using different PNA combinations and PNA concentrations.
  • the globin signal intensities on the arrays could be reduced by 40-60%. Furthermore, the proportion of genes that were rated "present" on the array was increased from approximately 32% to approximately 43%.
  • the T7-oligo (dT) 24 primer and the PNA oligonucleotide were in water - the starting RNA, the T7-oligo (dT) 24 primer and the PNA oligonucleotide were in 3.5 mM (NH 4 ) 2SO 4 before
  • T7-oligo (dT) 2 primer Three different approaches were compared:
  • Jurkat RNA 2.
  • Jurkat RNA with spiked globin in vitro transcripts 3.
  • PNAs peptide nucleic acids
  • the following protocol changes were made in the approach using the PNAs:
  • the PNAs were before the Pipette cDNA synthesis together with the T7-Oligo (dT) 2 primer to the RNA ..
  • Several incubation steps were carried out to attach the primer and the PNAs (10 min 70 ° C; 5 min 45 ° C; 2 min 42 ° C). All further steps were carried out as in the standard protocol.
  • the signal intensities for the globin mRNA transcripts could be reduced by 40 - 60% by using the PNAs.
  • the proportion of genes which was assessed as "present” on the array could be reduced to the original proportion (Jurkat RNA without in vitro transcripts) in the sample in which the globin was added in vitro transcripts by using the PNA oligonucleotides ,
  • the signals for the globin mRNAs were not completely suppressed by the use of the PNA oligonucleotides, but the reduction in the globin signal intensities was sufficient to increase the "present call" rate to the original level.
  • FIG. 3 shows the correlation of the signal intensities of the sample, in which only Jurkat RNA was used, with that of the sample, in which Jurkat RNA was analyzed with added globin in vitro transcripts and using PNA. At this The genes that describe the globin mRNA transcripts have been removed from the analysis.
  • the correlation coefficient of the signal intensities is 0.9847. This value indicates that the use of the PNAs did not have any non-specific influence on other transcripts represented on the array.
  • Example 8 The experiment described in Example 8 was repeated with variation of the PNA oligonucleotide concentrations.
  • concentration of the oligonucleotide PNA alpha_465 was doubled to 600 nM during the attachment to the globin mRNA.
  • samples were purified using silica spin columns (MinElute Cleanup Kit / QIAGEN GmbH, Hilden, DE). The samples were treated with different washing conditions. Samples 1 and 2 were cleaned according to the manufacturer's cleanup protocol. Samples 3 and 4 were also cleaned primarily in accordance with the manufacturer's Cleanup protocol, but in addition, after application to the silica spin columns or before washing with an ethanol-containing wash buffer, the samples were cleaned in an additional washing step with 700 ⁇ l of washing buffer 1 (containing 3.5 M guanidine isothiocyanate, 25 mM sodium citrate, with a pH of 7.0).
  • washing buffer 1 containing 3.5 M guanidine isothiocyanate, 25 mM sodium citrate, with a pH of 7.0.
  • RNA was quantified by RT-PCR analysis (TaqMan analysis / QIAGEN GmbH, Hilden, DE) for p16 RNA (specifically for the detection of RNA) (see FIG. 4).
  • the amount of single-stranded cDNA in the eluate was quantified under the different washing conditions (see FIG. 5).
  • a TaqMan PCR system was used to detect p16 cDNA.
  • Example 10 5 ⁇ g of genomic double-stranded nucleic acid (dsDNA) and 5 g of single-stranded nucleic acid (RNA) - isolated from HeLa cells - were mixed. After binding to a silica membrane in the presence of a chaotrope and alcohol (MinElute Kit / QIAGEN GmbH, Hilden, DE), the samples were washed under two different conditions before the elution (cleanup): a) washing with washing buffer containing ethanol according to the manufacturer's instructions for the MinElute Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) b) Prior washing with 700 ⁇ l of washing buffer 1 (3.5 M guanidine isothiocyanate and 25 mM sodium citrate, pH 7.0) before washing with an ethanol-containing washing buffer according to the manufacturer's instructions for the MinElute Kit ( QIAGEN GmbH, Hilden, DE) The samples were analyzed on a denatured formaldehyde agarose gel (before and after the cleanup). The data in FIG.
  • RNA was isolated from whole human blood using the PAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, DE).
  • a target preparation for Affymetrix GeneChip analyzes according to the Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual" was carried out with 6 ⁇ g of the isolated RNA.
  • the cDNA synthesis was primed with an oligo dT-T7 primer.
  • the second strand was then cDNA synthesis.
  • the resulting approaches were followed the binding of the nucleic acids to the silica spin column in two different ways - using the MinElute Cleanup Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) - washed or cleaned a) washing on the silica spin column according to the manufacturer's instructions for the MinElute Kit without an additional washing step b ) Washing on the silica spin column including an additional washing step with washing buffer 1 (3.5 M guanidine isothiocyanate and 25 mM sodium citrab pH 7.0) before washing with an ethanol-containing washing buffer according to the manufacturer's instructions for the MinElute Kit.
  • washing buffer 1 3.5 M guanidine isothiocyanate and 25 mM sodium citrab pH 7.0
  • the purified cDNA was subsequently rewritten into cRNA in an in vitro transcription reaction, and biotinylated nucleotides were incorporated in the process.
  • the samples were purified according to the Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual", fragmented and hybridized on a U133A gene chip.
  • the proportion of "present calls" on the gene chip increases from 34.7% to 38.2% (by 10%).
  • the scaling factor for the sample without the additional washing step is approx. 33% higher than for the sample that was treated with the additional washing step. This is an indication of an overall higher signal intensity of the gene chip that was hybridized with the sample that was treated with the additional washing step.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur reversen Transkription und/oder Amplifikation eines Produktes aus einer reversen Transkription eines Pools von Nukleinsäuren eines bestimmten Typs, wobei dieser Pool von Nukleinsäuren aus einer komplexen biologischen Probe oder einer enzymatischen Reaktion stammt.

Description

Verfahren zur reversen Transkription und/oder Amplifikation von Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur reversen Transkription und/oder Amplifikation eines Produktes aus einer reversen Transkription eines Pools von Nukleinsäuren eines bestimmten Typs, wobei dieser Pool von Nukleinsäuren aus einer komplexen biologischen Probe oder einer enzymatischen Reaktion stammt.
Aufgrund der zunehmenden Spezifität und Sensibilität bei der Präparation von Nukleinsäuren, hat diese in den letzten Jahren nicht nur im Bereich der biotechnologischen Grundlagenforschung, sondern verstärkt auch in medizinischen Bereichen, vornehmlich für diagnostische Zwecke, stetig an Bedeutung gewonnen. Da viele molekularbiologische Applikationen die Separation bestimmter Nukleinsäuren voneinander erfordern, liegt hierbei das Hauptaugenmerk auf der Verbesserung und/oder der Vereinfachung von Verfahren zur Trennung und/oder Isolierung von Nukleinsäuren. Dazu zählen insbesondere die Separation einzelner Nukleinsäure-Typen aus komplexen biologischen Proben und/oder aus Produkten enzymatischer Reaktionen.
Hierbei werden die potentiellen Nukleinsäure-Quellen zunächst mit Hilfe an sich bekannter Verfahren aufgeschlossen. Anschließend werden die Nukleinsäuren unter Verwendung von ebenfalls an sich bekannten Verfahren isoliert. Finden in der Folge derartiger Isolierungs- prozedere weitere Verfahrensschritte beziehungsweise Downstream-Analysen wie Transkriptions- und/oder enzymatische Amplifikationsreaktionen Anwendung, sollten die isolierten Nukleinsäuren jedoch nicht nur frei von störenden Zellbestandteilen und/oder Metaboliten vorliegen. Um die Spezifität und Empfindlichkeit derartiger Applikationen zu erhöhen, ist häufig noch eine zusätzliche Aufreinigung einzelner Nukleinsäure-Typen erforderlich.
Unter unterschiedlichen Nukleinsäure-Typen im Sinne der Erfindung werden alle einzel- oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und/oder Ribonukleinsäuren (RNA), wie beispielsweise copy DNA (cDNA), genomische DNA (gDNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA), small nuclear RNA (snRNA), bakterielle DNA, Plasmid DNA (pDNA), virale DNA oder virale RNA etc., und/oder modifizierte oder artifizielle Nukleinsäuren oder auch Nukleinsäure-Analoga, wie Peptide Nucleic Acids (PNA) oder Locked Nucleic Acids (LNA) etc., verstanden. Zur Analyse von Genexpressionsmustern insbesondere auf der Ebene von RNA sind zahlreiche Methoden bekannt. Neben diversen anderen Methoden zählen reverse Transkriptions-Reaktionen mit Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) sowie Array-Analysen zu den am häufigsten angewandten Verfahren. Eine Gemeinsamkeit dieser Verfahren ist, dass die interessierende mRNA (bis auf Ausnahmen, z. B. durch direktes Labeling von RNA) nicht direkt gemessen wird, sondern zuvor in die entsprechende cDNA umgeschrieben wird. Derzeit gängige Systeme weisen jedoch beim Arbeiten mit biologischem Material speziell im Bereich der Molekularbiologie und/oder der Diagnostik bereits an dieser Stelle ein grundlegendes Problem auf.
Um die interessierende(n) mRNA(s) in der gewünschten Downstream-Analyse möglichst sensitiv messen zu können, muss bevorzugt auch nur diese RNA revers transkribiert werden. Da in vielen biologischen Ausgangsmaterialien, wie beispielsweise Gehirn-, Leberoder Muskelgewebe, Vollblut, isolierten Leukozyten oder anderen biologischen Materialien sowie in Produkten enzymatischer Reaktionen jedoch bestimmte Transkripte in sehr hohen Kopienzahlen vorliegen (wie beispielsweise Globin mRNA Transkripte in RNA Präparationen aus Vollblut oder rRNA Transkripte in allen Total-RNA-Isolierungen), werden beispielsweise durch unspezifisches Priming und/oder Mispriming auch diese RNA-Transkripte bis zu einem gewissen Grad revers transkribiert. Diese aus den sogenannten non-mRNA-Templates synthetisierten cDNAs sowie die aus den nicht interessierenden, gegebenenfalls überexpri- mierten mRNAs hergestellten cDNAs verursachen jedoch eine wesentliche Verminderung der Empfindlichkeit der Downstream-Analysen der interessierenden mRNA(s).
Zur Vermeidung von unspezifischem Priming und/oder Mispriming der non-mRNA-Templates werden in gängigen Verfahren zum Priming der reversen Transkription häufig handelsübliche oligo-dT-Primer verwendet, damit bevorzugt nur mRNAs revers transkribiert werden, die am 3'-Ende einen poly-A tail aufweisen. Dennoch werden trotz der Verwendung von oligo-dT- Primern, durch unspezifisches Priming und/oder Mispriming auch andere RNA-Typen, wie beispielsweise rRNA, tRNA, snRNA etc., bis zu einem gewissen Grad revers transkribiert, so dass auch hier häufig eine Verminderung der Empfindlichkeit der Downstream-Analysen der mRNAs nicht auszuschließen ist.
Diese unerwünschte reverse Transkription von non-mRNA-Templates, die nicht über einen poly-A tail verfügen, wird derzeit häufig toleriert, da alternative Verfahren zur Abreicherung von beispielsweise rRNA, tRNA und snRNA Transkripten sehr aufwendig und kostenintensiv sind, zu einem Sequenz-Bias führen, und häufig schlechte Ausbeuten aufweisen.
Darüber hinaus erfordern viele Methoden zur Analyse von Genexpressionsmustern auf RNA Ebene, wie z. B. Array-Analysen, eine reverse Transkription der interessierenden mRNA mit einer anschließenden cDNA-Doppelstrangsynthese. Diese Doppelstrangsynthese ist notwendig, damit die so generierte doppelsträngige cDNA in einer nachfolgenden in vitro Transkription (IVT) amplifiziert und/oder gelabelt werden kann. Nach Beendigung dieser enzymatischen Reaktion enthält auch hier der Reaktionsansatz neben der synthetisierten ds- cDNA noch die eingesetzte total RNA sowie cDNA Einzelstränge, an denen keine Doppelstränge synthetisiert wurden. Diese verschiedenen einzelsträngigen Nukleinsäure Typen werden ebenfalls mit in die nachfolgende IVT sowie in den Hybridisierungsansatz auf dem Array „verschleppt" und führen ebenfalls zur Verminderung der Signale auf dem Array.
Um die Sensitivität derartiger Applikationen zu erhöhen ist eine zusätzliche Aufreinigung von DNA mit gleichzeitiger Abreicherung von RNA erforderlich. Zu den derzeitigen Verfahren zur Abreicherung der RNA aus einer Probe, die beide Nukleinsäure-Typen enthält, zählt der Verdau mit RNase. Hierbei muss jedoch die RNase als separates Enzym für die Zweitstrangsynthese in einem zusätzlichen Pipetierschritt zugegeben werden, was derartige Verfahren sehr zeit- und kostenintensiv macht. Zudem kann die RNase nur teilweise wieder vollständig aus der Probe entfernen werden.
Zur Überwindung der aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile liegt der vorliegenden Erfindung die A u f g a b e zugrunde, ein effizientes Verfahren zur selektiven reversen Transkription und/oder Amplifikation der interessierenden Nukleinsäure(n) bereitzustellen, das die Herstellung einer hochreinen Nukleinsäure aus einer komplexen biologischen Probe bzw. einer enzymatischen Reaktion ermöglicht, die in einer gewünschten Downstream- Analyse möglichst sensitiv vermessen werden kann bzw. können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur reversen Transkription und/oder Amplifikation eines Produktes einer reversen Transkription eines Pools von Nukleinsäuren eines Typs (A) aus einer biologischen Probe oder einer enzymatischen Reaktion g e l ö s t, gekennzeichnet durch die selektive Unterdrückung der reversen Transkription mindestens einer unerwünschten Nukleinsäure des Typs (A) und/oder die selektive Unterdrückung der Amplifikation eines Produktes einer reversen Transkription mindestens einer unerwünschten Nukleinsäure des Typs (A).
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass durch die selektive Unterdrückung der reversen Transkription mindestens einer unerwünschten Nukleinsäure eine Typs (A), und/oder durch die selektive Unterdrückung der Amplifikation eines Produktes einer reversen Transkription mindestens einer unerwünschten Nukleinsäure eine Typs (A), welche in einem aus einer komplexen biologischen Probe oder einer enzymatischen Reaktion stammenden Pool von Nukleinsäuren des Typs (A) vorliegt, bestimmte Nukleinsäuren des Typs (A) oder Amplifikationsprodukte dieser in hochreiner Form und frei von unerwünschten Nukleinsäuren des Typs (A) oder deren Amplifikationsprodukten separiert werden.
Biologischen Ausgangsmaterialien im Sinne der Erfindung sind komplexe biologischen Proben, wie beispielsweise Gewebeproben aus neuronalem, Leber- oder Muskelgewebe etc., isolierte Zellen (z. B. Leukozyten), Vollblut und/oder mit Vollblut kontaminierte Proben (z. B. Gewebeproben aus Blutgefäßen oder anderen stark durchbluteten Geweben) sowie andere biologische Materialien. Des weiteren fallen unter den Begriff biologischen Ausgangsmaterialien im Sinne der Erfindung ebenfalls die Produkte von enzymatischen Reaktionen, wie beispielsweise Produkte mindestens einer Nukleinsäure- Amplifikationsreaktion (z. B. einer IVT).
Bei der Nukleinsäure des Typs (A) handelt es sich im Sinne der vorliegenden Erfindung um mRNAs, wobei diese natürliche oder aus in vitro Transkriptions-Reaktionen stammende mRNAs sein können. Ferner wird unter dem Begriff „unerwünschte Nukleinsäure des Typs (A)" im Sinne der Erfindung mindestens eine mRNA verstanden, die jeweils einen Anteil von 20% oder mehr an der gesamt-mRNA ausmacht. Wie vorstehend bereits erwähnt können bestimmte unerwünschte mRNAs in Proben aus bestimmten Ausgangsmaterialien in sehr hohen Kopienzahlen vorhanden sein, wie etwa Globin-mRNAs in aus Vollblut isolierter RNA, Cytochrom-mRNAs in aus Muskelzellen isolierter RNA oder Myelin-mRNAs in aus neuronalem Gewebe isolierter RNA. Hier kann der Anteil dieser mRNA(s) auch mehr als 40% oder sogar mehr als 60% an der gesamt-mRNA ausmachen.
Überraschenderweise stellte sich heraus, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine effiziente Unterdrückung der reversen Transkription mindestens einer unerwünschten Nukleinsäure eine Typs (A), und/oder der Amplifikation eines Produktes einer reversen Transkription mindestens einer unerwünschten Nukleinsäure eine Typs (A), insbesondere von Globin-mRNA ermöglicht. Unabhängig davon, ob die Vollblutprobe zeitnah entnommen wurde, oder in einem Stabilisierungsreagenz aufgenommen und gelagert wurde.
Vorteilhafterweise werden die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Blutproben zur Erhaltung des RNA-Status unmittelbar bei der Abnahme in ein Stabilisierungsreagenz überführt. Als Stabilisierungsreagenzien können beispielsweise bekannte Verbindungen, wie Tetra-Alkyl-Ammoniumsalze in Gegenwart einer organischen Säure (WO 02/00599 / QIAGEN GmbH, Hilden, DE) oder Guanidin-Verbindungen in einer Mischung mit einer Puffersubstanz, einem Reduktionsmittel und/oder einem Detergenz (WO 01/060517 / Antigen Produktions GmbH, Stuttgart, DE) verwendet werden. Eine derartige Vorgehensweise ermöglichen Blutentnahmeröhrchen in denen das Stabilisierungsreagenz bereits enthalten ist (PaxGene / PreAnalytix, Hombrechticon, CH).
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können zudem die einzelnen Verfahrensschritte unterschiedlich gestaltet werden. Aufgebaut wird das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auf dem Verfahrensschritt a), der Durchführung einer reversen Transkriptions-Reaktion einer RNA aus einer biologischen Probe oder einer enzymatischen Reaktion in Anwesenheit mindestens eines oligo-dT Primers. Optional können im Anschluss an a) die Verfahrensschritte b), die Durchführung einer cDNA-Zweitstrangsynthese, und c), die Aufreinigung der in b) gebildeten ds-cDNA unter gleichzeitiger Abreicherung aller einzel- strängigen Nukleinsäuren aus dem Reaktionsprodukt von b) durchgeführt werden. Ferner kann nach a) und/oder b) und/oder c) eine Amplifikation der cDNA durchgeführt werden.
Nach einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der erste Verfahrensschritt (a) nach im Stand der Technik an sich bekannten Methoden mit gängigen Reagenzien, wie beispielsweise einer handelsübliche Reversen Transkriptase (z. B. Superscript II RT / Invitrogen) sowie in Anwesenheit mindestens eines handelsüblichen oligo-dT Primers (T7-oligo-dT2 Primer / Operon, Köln, DE), durchgeführt.
Wie bereits eingangs erwähnt, werden in gängigen Verfahren zur Verminderung der reversen Transkription der zum Typ (A) unterschiedlichen Nukleinsäuren zum Priming der reversen Transkription häufig handelsübliche oligo-dT-Primer oder Derivate und/oder Fusionen aus oligo-dT-Primern, wie beispielsweise Primer mit Sequenzen für einen T7- RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende und oligo-dT Sequenzen am 3'-Ende, verwendet, so dass bevorzugt nur mRNAs revers transkribiert werden, die am 3'-Ende eine poly- A Sequenz aufweisen. Dabei handelt es sich bei den zum Typ (A) unterschiedlichen Nukleinsäuren in Sinne der Erfindung im Wesentlichen um anderer RNA-Typen als mRNAs (z. B. rRNA, tRNA, snRNA, gDNA sowie plastidäre DNA), die sogenannten non-mRNA- Templates.
Im Anschluss an den Verfahrensschritt a) kann dann optional eine cDNA-Zweitstrang- synthese mit einer an sich bekannten Methode, inklusive der gängigen Reagenzien, durchgeführt werden. So wird beispielsweise vor dem Start der Zweitstrangsynthese eine RNase H als separates Enzym zugegeben, wobei die nach der Erststrangsynthese an die cDNA hybridisierte mRNA durch die Aktivität des Enzyms abgebaut wird (während die nicht als Hybrid vorliegende RNA nicht Substrat für die RNase H ist). Die Reaktion wird so durchgeführt, dass der RNase H-Verdau nur unvollständig abläuft, so dass kürzere RNA- Fragmente verbleiben. Diese RNA-Fragmente dienen als Primer für die nachfolgende Zweitstrangsynthese.
Zur Vermeidung von zusätzlichen Pipetierschritten sowie zur Einsparung von Material etc. wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhafterweise eine spezifische Reverse Transkriptase (z. B. LabelStar RT / QIAGEN GmbH, Hilden, DE) eingesetzt, die über eine intrinsische Rnase H-Aktivität verfügt, so dass die cDNA-Zweitstrangsynthese wesentlich schneller, einfacher und kostengünstiger durchgeführt werden kann (s. Beispiel 1).
Nach Beendigung dieser enzymatischen Reaktion enthält der Reaktionsansatz üblicherweise neben der synthetisierten ds-cDNA auch noch die eingesetzte gesamt-RNA sowie cDNA Einzelstränge (z. B. ss cDNA, virale cDNA etc.), an denen keine Doppelstränge synthetisiert wurden (u. a. deswegen, weil die Synthese des Zweistrangs nicht mit 100%iger Effizienz geschieht). Diese verschiedenen Nukleinsäure-Typen werden ohne einen effektiven Reinigungsschritt auch in eine nachfolgende Amplifikationsreaktion und/oder damit in den Hybridisierungsansatz auf dem Array mit „verschleppt". Während der Hybridisierung konkurrieren dort die verschiedenen in Lösung befindlichen unmarkierten Nukleinsäuren mit den markierten cRNA Transkripten um die Bindung an die Sonden auf dem Array. Weiterhin findet eine Kompetition der Sonden auf dem Array mit den in Lösung befindlichen unmarkierten Nukleinsäuretranskripten um die Bindung an die markierten cRNAs statt. Da das Gleichgewicht dieser Wettbewerbsreaktionen nicht komplett auf Seite der Hybridisierung der markierten cRNAs an die Sonden auf dem Array liegt, führt die Gegenwart der unmarkierten Nukleinsäuren zur Verminderung der Signale auf dem Array.
Die ungewollte Hybridisierung eines oder mehrerer überrepräsentierter markierter oder unmarkierter Nukleinsäuretranskripte an die Sonden auf dem Array kann weiterhin vermindert werden durch die Zugabe von unmarkierten Oligonukleotiden, die die revers komplementäre Sequenz zu den unerwünschten Nukleinsäuretranskripten aufweisen. Bei diesen revers komplementären Oligonukleotiden kann es sich beispielsweise um in vitro transkribierte oder synthetisch hergestellte Oligonukleotide handeln. Durch die daraus folgende Verminderung der unspezifischen Hybridisierung überrepräsentierter Transkripte wird eine Steigerung der Sensitivität der Array Analyse erzielt.
Zu Vermeidung des „Verschleppens" der unterschiedlichen Nukleinsäure-Typen kann im Anschluss an Schritt b) eine konventionelle Aufreinigung des Reaktionsansatzes der enzymatischen Reaktion erfolgen. Der eigentliche Aufreinigungsschritt erfolgt beispielsweise durch den Einsatz von im Stand der Technik bekannten "Silica-Spin-Column Technologien" (z. B. mit dem kommerziell erhältlichen GeneChip Sample Cleanup Module / Affymetrix, Santa Clara, US). Hierbei wird das Reaktionsgemisch nach der Zugabe eines chaotrope Salze enthaltenden Bindungspuffers zur Trennung über eine handelsübliche Spinsäule (z. B. MinElute Cleanup Kit / QIAGEN GmbH, Hilden, DE) gegeben. Da es jedoch hierbei vielfach zu Verunreinigungen des Eluats durch „verschleppte" RNA aus der gesamt-RNA kommt, wird in gängigen Aufreinigungsverfahren zur Eliminierung der eingesetzte gesamt-RNA aus der Probe ein RNase-Verdau vorgeschaltet. Der RNase-Verdau ist jedoch durch das Mehr an Material und die zusätzlichen Arbeitsschritte sehr kosten- und zeitintensiv. Zudem kann die RNase nachfolgend nicht immer vollständig aus der Probe entfernt werden, was beispielsweise bei einer anschließenden Amplifikation, in der die Probe mit RNA in Kontakt gebracht wird, ungünstigerweise zur Degradation dieser RNA führt.
Überraschenderweise stellte sich heraus, dass der RNase-Verdau durch einen zusätzlichen Waschschritt im Anschluss an die Bindung der unterschiedlichen Nukleinsäuren an das Säulenmaterial überflüssig wird. So kann der erfindungsgemäße Verfahrensschritt c) nicht nur vorteilhafterweise eine vorgeschaltete Isolierung von mRNA ersetzten, sondern er ermöglicht gleichzeitig die Abreicherung aller einzelsträngigen Nukleinsäuren (ss DNAs und RNAs) aus dem Reaktionsprodukt aus Schritt b), unter Aufreinigung der ds-cDNA. Ferner wird durch den Einsatz des erfindungsgemäßen Waschschritts die Herstellung einer ds-cDNA mit einem hohen Reinheitsgrad ermöglicht, was zu einer enormen Steigerung der Empfindlichkeit in einer nachfolgenden GeneChip-Analyse führt (s. Beispiel 10).
Neben der Abreicherung einzelsträngiger RNA und cDNA kann durch Einsatz des erfindungsgemäßen Waschschritts auch sequenzspezifisch mindestens ein einzelsträngiges Nukleinsäuretranskript von anderen einzelsträngigen Transkripten separiert werden. Hierbei werden die zur einzelsträngigen Zielsequenz revers komplementäre Oligonukleotide verwendet, die mit der Zielsequenz ein doppelsträngiges Nukleinsäurehybrid bilden. Bei anschließender Aufreinigung unter Einsatz des erfindungsgemäßen Waschschritts werden alle nicht hybridisierten, und somit weiterhin einzelsträngigen Transkripte aus dem Nukleinsäuregemisch separiert.
Zur Aufreinigung der ds-cDNA werden gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt c) zunächst die aus Schritt b) stammenden Nukleinsäuren in ihrer Gesamtheit an eine Silicamatrix gebunden und anschließend die Silicamatrix zur Abreicherung der einzelsträngigen Nukleinsäuren mit einem Guanidin-haltigen Waschpuffer gewaschen. Wurde bei der Durchführung der reversen Transkription der gesamt-RNA mit oligo-dT Primern geprimt, so wurden vorrangig cDNA Moleküle synthetisiert, die komplementär zu den mRNA Molekülen der Ausgangs-RNA sind (d. h. keine cDNA Synthese ausgehend von rRNA, tRNA, snRNA Molekülen). Nachdem die Reaktionslösung auf die Silica Spinsäulen gegeben wurde, oder zu dieser Silicapartikel hinzugegeben wurden, erlaubt nun das oben beschriebene Verfahren die Abreicherung aller einzelsträngigen Nukleinsäuren in einem Waschschritt mit einem erfindungsgemäßen Waschpuffer.
Vorteilhafterweise kann der erfindungsgemäße Waschschritt in jeglichen Verfahren Einsatz finden, in denen eine Aufreinigung doppelsträngiger Nukleinsäuren mit gleichzeitiger Abreicherung einzelsträngiger Nukleinsäuren gewünscht ist. So kann der erfindungsgemäße Waschschritt auch im Nachgang an den im Folgenden dargestellten optionalen Verfahrensschritt d) (der Durchführung einer Amplifikation der cDNA) erfolgen.
Die zur Aufreinigung verwendete Silicamatrix kann eine oder mehrere Silicamembran(en) oder Partikel mit einer Silicaoberfläche, insbesondere magnetische Silicapartikel, umfassen, und in einer Spinsäule oder anderen gängigen Vorrichtungen zur Nukleinsäureaufreinigung enthalten sein. Der für den erfindungsgemäßen Waschschritt verwendete Guanidin-haltige Waschpuffer enthält bevorzugt Guanidinisothiocyanat und/oder Guanidinthiocyanat, vorzugsweise in einer Konzentration von 1 M bis 7 M , besonders bevorzugt von 2,5 M bis 6 M und ganz besonders bevorzugt von 3 M bis 5,7 M. Als eine Alternative zu Guanidinisothiocyanat und/oder Guanidinthiocyanat, kann erfindungsgemäß ebenso Guanidin Hydrochlorid, mit einer Konzentration von 4 M bis 9 M, vorzugsweise von 5 bis 8 M.
Als weitere Bestandteile kann der im erfindungsgemäßen Waschschritt e ngesetzte Wasch- puffer eine oder mehrere Puffersubstanz(en) in einer Gesamtkonzentrati on von 0 mM bis
40 mM und/oder ein oder mehrere Additiv(e) in einer Gesamtkonzentrati on von 0 mM bis
100 mM und/oder ein oder mehrere Detergenz(ien) in einer Gesamtkonzentration von
0 %(v/v) bis 20 %(v/v) enthalten.
Der pH-Wert des Waschpuffers liegt bevorzugt im Bereich von pH 5 bis 9, besonders bevorzugt im Bereich von pH 6 bis 8, wobei zur Einstellung des entsprechenden pH-Wertes gängige Puffersubstanzen (wie beispielsweise Tris, Tris-HCI, MOPS, MES, CHES, HEPES, PIPES und/oder Natriumeitrat), vorzugsweise mit einer Gesamtkonzentration der Puffersubstanzen 20 mM bis 40 mM, verwendet werden.
Ferner können abhängig von den einzelnen Reaktionsbedingungen weitere geeignete Additive, wie beispielsweise Chelatbildner (z. B. EDTA, EGTA oder andere geeignete Verbindungen) und/oder Detergentien (z. B. Tween 20, Triton X 100, Sarcosyl, NP40 etc.) der Waschpufferzusammensetzung hinzugefügt werden.
Die folgende Aufstellung zeigt bevorzugte Zusammensetzungen des im erfindungsgemäßen Waschschritt verwendeten Waschpuffers:
- Waschpuffer 1 : 3,5 M Guanidinisothiocyanate * 25 mM Natrium Citrat, pH 7,0
- Waschpuffer 2: 5.67M Guanidinisothiocyanate * 40 mM Natrium Citrat pH 7,5 - Waschpuffer 3: 5,0M Guanidinisothiocyanate * 35 mM Natrium Citrat pH 7,5
- Waschpuffer 4: 4,5 M Guanidinisothiocyanate * 32 mM Natrium Citrat pH 7,5
- Waschpuffer 5: 4,0 M Guanidinisothiocyanate * 28 mM Natrium Citrat pH 7,5
- Waschpuffer 6: 3,5 M Guanidinisothiocyanate * 25 mM Natrium Citrat pH 7,5
- Waschpuffer 7: 4,5 M Guanidinisothiocyanate * 0,1 M EDTA, pH 8,0
- Waschpuffer 8: 7,0 M Guanidin Hydrochloride, pH 5,0
- Waschpuffer 9: 5,6 M Guanidin Hydrochloride 20% Tween-20
* Guanidinthiocyanate kann hierbei in Kombination mit oder anstelle von Guanidinisothiocyanate verwendet werden.
Der vorstehend beschriebene Einsatz des erfindungsgemäßen Waschschritts kann somit zur Abreicherung von rRNA aus doppelsträngigen eukariontischen cDNA Syntheseprodukten Anwendung finden. Eine weitere Applikation ist die Separation einzelsträngiger viraler Nukleinsäuren von eukariontischer oder prokaryontischer, doppelsträngiger genomischer DNA (s. Beispiel 4).
Wie bereits erwähnt, ist der erfindungsgemäße Waschschritt zur Abreicherung einzelsträngiger Nukleinsäuren von doppelsträngigen Nukleinsäuren für diverse Downstream-Analysen vorteilhaft. So könnten neben Array-Analysen auch die Sensitivitäten beispielsweise in Amplifikationsreaktionen oder anderen Anwendungen (wie beispielsweise Ribonuklease Protection Assays, Northern oder Southern Blot Analysen, Primer Extension Analysen etc.) gesteigert werden. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass einerseits bereits die Durchführung einzelner Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens die Reinheit der aus den unterschiedlichen Proben gewonnenen interessierenden Nukleinsäure verbessert, andererseits jedoch insbesondere die Kombination einzelner Verfahrensschritte in unterschiedlicher Art und Weise synergetische Effekte erzeugt, die zur Herstellung mindestens einer hochreinen Nukleinsäure des Typs (A) beiträgt.
Neben der Erhöhung der Spezifität durch spezifisches Priming von cDNA-Synthesen mit einer entsprechenden Reversen Transkriptase, kann eine ungewollt hohe Anzahl vorhandener mRNA-Transkripte, wie beispielsweise Globin-mRNA-Transkripte aus einer Vollblutprobe, von nachfolgenden Downstream-Analysen auch durch die Anwesenheit einer Molekül-Spezies zur Unterdrückung einer RT- und/oder Amplifikationsreaktion der ungewünschten mRNA Transkripte eliminiert werden.
So können gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verfahrensschritte a) und/oder d) in Anwesenheit mindestens einer Molekül-Spezies zur selektiven Unterdrückung der reversen Transkription mindestens einer unerwünschten mRNA und/oder zur selektiven Unterdrückung der Amplifikation der aus der / den unerwünschten mRNA(s) hergestellten einzel- oder doppelsträngigen cDNA(s), durchgeführt werden.
Im Verfahrensschritt a) binden die Molekül-Spezies an die unerwünschten Nukleinsäuren des Typs (A) oder spalten diese, um dadurch die reverse Transkription der unerwünschten mRNAs zu verhindern.
Unter Amplifikation im Sinne der Erfindung werden verschiedenen Reaktionstypen, wie beispielsweise eine in vitro Transkription, eine Polymerase Chain Reaction (PCR), eine Ligase Chain Reaction (LCR), eine Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) oder eine self-sustained Sequence Replication (3SR) etc. verstanden.
Je nach Art der biologischen Probe oder des enzymatischen Reaktionsproduktes kann es von Vorteil sein, die Molekül-Spezies sowohl im Verfahrensschritt a), als auch nachfolgend im Verfahrensschritt d) einzusetzen. Dabei können die eingesetzten Molekül-Spezies in allen Verfahrensschritten gleich oder unterschiedlich sein. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher der Verfahrensschritt a) in Anwesenheit mindestens einer Molekül-Spezies zur selektiven Unterdrückung der reversen Transkription mindestens einer unerwünschten mRNA durchgeführt, wobei die reverse Transkription der überrepräsentierten Transkripte durch Binden der Molekül-Spezies an diese mRNAs unterbrochen wird. Somit stehen diese Transkripte für das cDNA Labeling, die Doppelstrangsynthese und/oder die nachfolgende Amplifikation nicht mehr zur Verfügung.
Molekül-Spezies im Sinne der Erfindung können zur mRNA oder zu einem der cDNA- Stränge komplementäre DNA- oder RNA-Oligonukleotide (antisense-Oligonukleotide) oder deren Derivate, z. B. Oligonukleotide, enthaltend modifizierte oder artifizielle Nukleotide, Quencher, Fluorophore oder andere Modifikationen, in einer Länge von 10 bis 60 Nukleotiden, vorzugsweise 12 bis 30 Nukleotiden sein.
Zusätzlich können die Molekül-Spezies ein zur mRNA oder zu einem der cDNA-Stränge komplementäres Nukleinsäure-Analogon sein, wobei als Nukleinsäure-Analogon auch modifizierte Nukleinsäuren, wie PNAs (peptide nucleic acids), LNA (locked nucleic acids), und/oder GripNAs verwendet werden können. Hierbei bindet die Molekül-Spezies, welche zum sequenz-spezifischen Blocken eingesetzt wird, vorzugsweise in der 3'-Region der zu blockierenden Nukleinsäure (der mRNA oder einem der cDNA-Stränge).
Als bevorzugte Molekül-Spezies werden PNAs die eine Länge von 12 bis 20 Nukleotidanaloga, vorzugsweise von 13 bis 16 Nukleotidanaloga aufweisen (PE Biosystems, Weiterstadt, DE) und/oder GripNAs, die eine Länge von 12 bis 30 Nukleotidanaloga, vorzugsweise von 14 bis 20 Nukleotidanaloga aufweisen (ActiveMotif), und/oder LNAs, die mindestens ein Nukleotid aufweist, welches ein 'locked nucleotide' ist, und die eine Länge von 14 bis 30 Nukleotide, vorzugsweise von 15 bis 22 Nukleotide, aufweisen (Operon, Köln, DE), verwendet.
Alternativ zur Nutzung eines einzigen Moleküls zur Sequenz-spezifischen Blockierung einer spezifischen Zielsequenz können auch mehrere Moleküle komplementär zu verschiedenen Regionen innerhalb einer oder mehrerer spezifischen Zielsequenz(en) eingesetzt werden. Weiterhin kann es sich auch als vorteilhaft erweisen, ein einziges Molekül zur Sequenzspezifischen Blockierung einzusetzen, welches gegen mehrere unterschiedliche Ziel-RNAs oder Ziel-cDNAs gerichtet ist, wenn das Molekül komplementär zu einer homologen Region verschiedener Ziel-RNAs oder Ziel-cDNAs ist.
Wenn die Molekül-Spezies, welche zum sequenzspezifischen Blocken eingesetzt wird, beispielsweise zur Verhinderung einer Nukleinsäure-Polymerisation (z. B. einer RT) eingesetzt wird, muss diese Molekül-Spezies an ihrem 3'-Ende eine Modifikation aufweisen (z. B. durch Acetylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung oder andere geeignete Modifikationen), die verhindern, dass die Molekül-Spezies nicht selbst als Primer dienen und folglich eine Elongation beginnend am 3'-Ende der Molekül-Spezies initialisieren. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wird das Markieren von RNA durch die Hybridisierung der RNA mit fest bindenden Molekülen verhindert.
Alternativ zum Blockieren der Zielsequenz gibt es, wie eingangs bereits erwähnt, auch die Möglichkeit, bestimmte ungewollte bzw. unerwünschte mRNAs mittels bestimmter Molekül- Spezies sequenzspezifisch zu spalten. Zu diesem Zweck können Molekül-Spezies wie beispielsweise DNAzyme, Ribozyme, insbesondere hammerhead ribozymes und/oder hairpin ribozymes, eingesetzt werden. Diese Moleküle sind vorzugsweise gegen die 3'- Region der ungewollten RNA gerichtet und werden vor Durchführung der reversen Transkription eingesetzt. Für diese Ausführungsform der Erfindung können Ribozyme bestehend aus RNA oder RNA-Derivaten oder Fusionsprodukte solcher Ribozyme eingesetzt werden. Die komplementäre Sequenz der Ribozyme weist vorzugsweise eine Länge von 12 bis 30 Nukleotiden, besonders bevorzugt eine Länge von 15 bis 25 Nukleotiden, auf.
Vorteilhafterweise werden als Molekül-Spezies zur selektiven Unterdrückung bzw. zur Blockierung der reversen Transkription oder Amplifikation der unerwünschten mRNA, insbesondere der Globin-Sequenzen, erfindungsgemäß ein(e) oder mehrere DNA-Oligonukleo- tid(e), PNA(s) und/oder LNA(s), welche die im Folgenden aufgeführten Sequenzen aufweisen, eingesetzt.
Handelt es sich bei der Molekül-Spezies um ein DNA-Oligonukleotid, und ist die Globin- mRNA eine alpha 1-Globin-mRNA und/oder eine alpha 2-Globin-mRNA, weist das DNA- Oligonukleotid zur Blockierung der reversen Transkription von Globin-mRNA erfindungs- gemäß eine Sequenz aus der folgenden Gruppe auf, die komplementär zu humaner alpha 1 -Globin-mRNA und / oder alpha 2-Globin-mRNA ist. alpha_473: 5'CTC GAG CTT AAC GGT - Phosphatgruppe - 3' alpha_465: 5TAA CGG TAT TTG GAG - Phosphatgruppe - 3' alpha_ 465_long: 5' TAA CGG TAT TTG GAG GTC AGC ACG GTG CTG - Phosphatgruppe - 3'
Handelt es sich bei der Molekül-Spezies um ein DNA-Oligonukleotid, und ist die Globin- mRNA eine beta Globin-mRNA, weist das DNA-Oligonukleotid zur Blockierung der reversen Transkription von Globin-mRNA erfindungsgemäß eine Sequenz aus der folgenden Gruppe auf, die komplementär zu humaner beta Globin-mRNA ist. beta_554: 5'GTA GTT GGA CTT AGG - Phosphatgruppe - 3' beta_594: 5'ATC CAG ATG CTG AAG - Phosphatgruppe - 3' beta_554_long: 5'GTA GTT GGA CTT AGG GAA CAA AGG AAC CTT - Phosphatgruppe - 3'
Handelt es sich bei der Molekül-Spezies um eine PNA, und ist die Globin-mRNA eine alpha 1 -Globin-mRNA und/oder eine alpha 2-Globin-mRNA, weist die PNA zur Blockierung der reversen Transkription von Globin-mRNA erfindungsgemäß eine Sequenz aus der folgenden Gruppe auf, die komplementär zu humaner alpha 1 -Globin-mRNA und / oder alpha 2-Globin-mRNA ist. alpha_473: N- CTC CAG CTT AAC GGT -C* alpha_465: N- TAA CGG TAT TTG GAG -C* alpha_363: N- GTC ACC AGC AGG CA -C* alpha_393: N- GTG AAC TCG GCG -C* alpha_473**: N- TGG CAA TTC GAC CTC -C* alpha_465**: N- GAG GTT TAT GGC AAT -C* alpha_363**: N- ACG GAC GAC CAC TG -C* alpha_393**: N- GCG GCT CAA GTG -C* Handelt es sich bei der Molekül-Spezies um eine PNA, und ist die Globin-mRNA eine beta Globin-mRNA, weist die PNA zur Blockierung der reversen Transkription von Globin-mRNA erfindungsgemäß eine Sequenz aus der folgenden Gruppe auf, die komplementär zu humaner beta Globin-mRNA ist. beta-554: N- GTA GTT GGA CTT AGG -C* beta-594: N- ATC CAG ATG CTC AAG -C* beta-539: N- CCC CAG TTT AGT AGT -C* beta-541 : N- CAG TTT AGT AGT TGG -C* beta-579: N- GCC CTT CAT AAT ATC -C* beta-554**: N- GGA TTC AGG TTG ATG -C* beta-594**: N- GAA CTC GAT GAC CTA -C* beta-539**: N- TGA TGA TTT GAC CCC -C* beta-541 **: N- GGT TGA TGA TTT GAC -C* beta-579**: N- CTA TAA TAG TTC CCG -C*
Wobei N den Aminoterminus der Oligomere und C* den Carboxyterminus der Oligomere angibt, und die mit den (**) versehenen Sequenzen zu den vorstehenden Sequenzen revers-orientiert sind.
Handelt es sich bei der Molekül-Spezies um eine LNA, die mindestens ein Nukleotid aufweist, welches ein 'locked nucleotide1 ist, und ist die Globin-mRNA eine alpha 1 -Globin- mRNA und/oder eine alpha 2-Globin-mRNA, weist die LNA zur Blockierung der reversen Transkription von Globin-mRNA erfindungsgemäß eine Sequenz aus der folgenden Gruppe auf, die komplementär zu humaner alpha 1 -Globin-mRNA und / oder alpha 2-Globin-mRNA ist. alpha_473: 5 'CTC CAG CTT AAC GGT - Oktandiol - 3' alpha_465: 5 TAA CGG TAT TTG GAG - Oktandiol - 3' alpha_363: 5' GTC ACC AGC AGG CA - Oktandiol - 3' alpha_393: 5' GTG AAC TCG GCG - Oktandiol - 3'
Handelt es sich bei der Molekül-Spezies um eine LNA, die mindestens ein Nukleotid aufweist, welches ein 'locked nucleotide' ist, und ist die Globin-mRNA eine beta Globin- mRNA, weist die LNA zur Blockierung der reversen Transkription von Globin-mRNA erfindungsgemäß eine Sequenz aus der folgenden Gruppe auf, die komplementär zu humaner beta Globin-mRNA ist. beta-554: 5' GTA GTT GGA CTT AGG - Oktandiol - 3' beta-594: 5' ATC CAG ATG CTC AAG - Oktandiol - 3' beta-539: 5' CCC CAG TTT AGT AGT - Oktandiol - 3' beta-541 : 5' CAG TTT AGT AGT TGG - Oktandiol - 3' beta-579: 5' GCC CTT CAT AAT ATC - Oktandiol - 3'
Dabei können in den genannten LNA-Sequenzen einzelne oder alle Positionen in den Oligonukleotiden mit den sogenannten „locked nucleotides" substituiert sein können. Bei diesen „locked nucleotides" handelt es sich vornehmlich um enzymatisch nicht abbaubare Nukleotide, die jedoch einer Polymerase nicht als Startmolekül dienen können, da sie kein freies 3'-OH-Ende aufweisen.
Werden RNA Präparationen, die einen hohen Anteil überrepräsentierter Transkripte (z. B. Globin-mRNA Transkripte) aufweisen, in Anwesenheit der vorstehend dargestellten Molekül- Spezies revers transkribiert und/oder die Produkte der reversen Transkrption amplifiziert (vorzugsweise durch eine in vitro Transkription, optional mit einem anschließenden DNase- Verdau sowie einer cRNA Aufreinigung), und/oder wird zumindest ein erfindungsgemäßer Waschschritt durchgeführt, liegen vorteilhafterweise keine RT-Produkte oder daraus hervorgegangenen Amplifikationsprodukte vor, wodurch die Sensitivität der Gen- Expressions-Analyse niedrig oder niedriger exprimierter Transkripte wesentlich erhöht werden kann.
Insbesondere der Einsatz der aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden cRNA und/oder cDNA in einer Array-basierenden Gen-Expressions-Analyse ist äußerst vorteilhaft, da keine RT-Produkte hervorgegangen aus hochexprimierten Transkripte und / oder Amplifkationsprodukte aus RT-Produkten hochexprimierter Transkripte auf den Arrays hybridisiert werden und somit eine Verminderung der Signalintensitäten sowie der damit verbundene Verlust an Sensitivität in der Array-Analyse vermieden wird. Nachfolgend soll nun die vorliegende Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen sowie der nachstehenden Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Es zeigt:
Fig. 1 den Einfluss verschiedener Endkonzentrationen von alpha_465 und beta_554 PNAs auf die Generierung von cRNAs als bildliche Darstellung der cRNA-Analyse auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer wie auf einem Gel, mit:
Bande L: RNA-Größenstandard, Bande 1 : generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 10 μM, Bande 2: generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 1 ,0 μM, Bande 3: generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 0,1 μM, Bande 4: generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 0,01 μM, Bande 5: generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 0,001 μM Bande 11 : generierte cRNA ohne Zugabe von PNAs (Vergleichsprobe).
Fig. 2 den Einfluss verschiedener Endkonzentrationen von alpha_465 und beta_554 PNAs auf die Generierung von cRNAs. Dargestellt als elektropherographische Abbildung der cRNA-Analyse auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer, mit den Kurven:
Türkis (1): generierte cRNA ohne Zugabe von PNAs (Vergleichsprobe) Gelb (2): generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 0,001 μM. Pink (3): generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 0,01 μM. Braun (4): generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 0,1 μM. Dunkelblau (5): generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 1 ,0 μM. Grün (6): generierte cRNA bei einer PNA Endkonzentration von jeweils 10 μM.
Fig. 3 die Korrelation der Signalintensitäten der Probe, in der nur Jurkat RNA verwendet wurde, mit denjenigen der Probe, in der Jurkat RNA mit zugesetzten Globin in vitro Transkripten analysiert wurde. Fig. 4 die RNA Menge einer Probe vor und nach der Aufreinigung mit verschiedenen Waschbedingungen.
Fig. 5 Menge an einzelsträngiger cDNA einer Probe vor und nach der Aufreinigung mit verschiedenen Waschbedingungen.
Fig. 6 die Anwesenheit von RNA und gDNA vor und nach der Aufreinigung (mit verschiedenen Waschbedingungen) auf einem Formaldehyd-Agarosegel, wobei:
Bande 1 : die genomische DNA (vor dem Cleanup); Bande 2: die RNA (vor dem Cleanup); Bande 3: die genomische DNA gemischt mit der RNA (vor dem Cleanup); Bande 4 und5: die genomische DNA gemischt mit der RNA (nach dem Cleanup); (die Aufreinigung erfolgte unter Standardbedingungen mit einem ethanol haltigen Waschpuffer) Bande 6 und 7: die genomische DNA gemischt mit der RNA (nach dem Cleanup); (die Aufreinigung erfolgte unter Standardbedingungen mit einem zusätzlichen Waschschritt mit einem chaotrophe Salze enthaltenden Waschpuffer 1 ) zeigt.
Ausführunαsbeispiele
Beispiel 1 :
Mit Hilfe des PAXgene Blood RNA Isolation Kit (PreAnalytix, Hombrechticon, CH) wurde RNA aus humanem Vollblut isoliert. Nachfolgend wurde eine Gen-Expressions-Analyse unter Verwendung der Affymetrix U133A GeneChips durchgeführt. Die Target Präparation erfolgte gemäß dem „Expression Analysis Technical Manual" für Affymetrix GeneChip Analysen (Affymetrix, Santa Clara, US). Es wurden in zwei Ansätzen jedoch zwei verschiedene reverse Transkriptasen verwendet. Ansatz 1 : erfolgte gemäß dem Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual" mit der Superscript II RT (Invitrogen) als reverse Transkriptase; und
Ansatz 2: erfolgte ebenfalls gemäß dem Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual", jedoch mit 1 /I der LabelStar RT (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) als reverse Transkriptase. Zudem wurde zusätzlich der zur LabelStar RT gehörende Reaktionspuffer für die cDNA-Zweitstrangsynthese verwendet.
Pro Ansatz wurden 6 μg der isolierten RNA ausgehend von einem oligo-dT-T7 Primer (Operon, Köln, DE) revers transkribiert. Die cDNA Zweitstrang Synthese sowie alle weiteren Schritte der Probenvorbereitung für die GeneChip Analyse wurden ebenfalls nach Anleitung des Affymetrix „Expression Analysis Technical Manual" durchgeführt, wobei die beiden verschiedenen Ansätze identisch behandelt wurden. Im Anschluss erfolgte die Hybridisierung der Proben auf Affymetrix U 133 A GeneChips. Zum Vergleich der Ergebnisse der beiden Ansätze, wurden beide Arrays mit den gleichen Signalintensitäten auf TGT = 1000 skaliert.
Danach wurden beide Ansätze mit dem cDNA Cleanup des GeneChip Sample Cleanup Modules AHx gemäß dem Technical Manual des Herstellers bearbeitet (weitere Informationen s. Beispiel 12).
Die nachstehend in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass durch die Verwendung der LabelStar Reversen Transkriptase (spezifisches Priming der cDNA Synthese) der Anteil der als „present" gewerteten Gene auf dem Gen Chip von 34,7% auf 39% (um 12%) anstieg.
Figure imgf000020_0001
Tabelle 1 : Ergebnisse eine GeneChip-Analyse auf U133A GeneChips unter Verwendung unterschiedlicher reverser Transkriptasen. Durch Verwendung der LabelStar Reversen Transkriptase für die Erststrangsynthese der cDNA konnten die Signalintensitäten für die ribosomalen RNA-Transkripte (18S rRNA und 28S rRNA) stark verringert werden. Somit ist das Priming mit der LabelStar RT als reversen Transkriptase wesentlich spezifischer für mRNA.
Diese Abreicherung der rRNAs bedingt ferner einen niedrigeren Scaling Faktor sowie eine höhere Rate an „present calls" auf dem Array. (Der Scaling Faktor ist für die Probe mit der LabelStar RT Reversen Transkriptase um ca. 50% niedriger als bei der Probe, die mit der SuperScript revers transkribiert wurde.)
Beispiel 2:
RNA wurde aus humanem Vollblut isoliert. Die nachfolgende cDNA Synthese wurde wie in Beispiel 1 mit zwei verschiedenen Reversen Transkriptasen (SuperScript RT und LabelStar RT) ausgehend von oligo-dT-T7 Primern durchgeführt. Im Anschluss erfolgte die cDNA-Zweitstrangsynthese unter identischen Bedingungen für die verschiedenen Ansätze. Nach Aufreinigung der Reaktionen erfolgte eine IVT mit anschließender Aufreinigung der cRNA inklusive eines DNase Verdaus. Der DNase Verdau gewährleistet, dass in der nachfolgenden TaqMan RT-PCR Analyse (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) der cRNA ausschließlich die generierte RNA, und nicht die kontaminierende cDNA gemessen wird.
Im Anschluss daran wurden zwei verschiedene TaqMan RT-PCR Analysen durchgeführt:
- Quantifizierung der 18S rRNA - Quantifizierung der p16 mRNA (exemplarisch für alle mRNA Transkripte)
Es zeigte sich, dass beim Einsatz der LabelStar RT die quantifizierte Menge an 18S rRNA etwa 8-fach niedriger war, als bei Verwendung der Superscript RT. Die Menge an quantifizierter p16 mRNA hingegen ist für beide Reverse Transkriptasen vergleichbar.
Daraus ergibt sich, dass durch die Verwendung der LabelStar RT die rRNA spezifisch abgereichert wird, während die mRNA Transkripte mit identischer Effizienz revers transkribiert werden. Beispiel 3:
Die RNA eines Blutspenders wurde wie in Beispiel 1 unter Verwendung des PAXgene Blood RNA Systems (PreAnalytix, Hombrechticon, CH) isoliert. In Vorbereitung der anschließenden Affymetrix GeneChip Analyse wurde die Affymetrix Target Präparation nach Angaben des Affymetrix „Expression Analysis Technical Manual" durchgeführt (Standard Protokoll). Dieser Ansatz wurde mit einem zweiten Ansatz verglichen, bei dem die Bedingungen während des Annealing des cDNA Primers variiert wurden:
Bedingungen zum Annealing des cDNA Primer Annealing:
- Standard Protokoll: Inkubation für 10 min bei 70°C Schnelles Abkühlen auf Eis Nachfolgend cDNA Synthese bei 42°C
- Vergleichsansatz: Inkubation für 10 min bei 70°C Inkubation für 5 min bei 45°C Inkubation für 2 min bei 42°C Nachfolgend cDNA Synthese bei 42°C
Die anschließende GeneChip-Analyse auf Affymetrix U133A Gen Chips zeigte folgende in der Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse: (Skalierung der Signalintensitäten auf TGT = 1000):
Figure imgf000022_0001
Tabelle 2: Ergebnisse eine GeneChip-Analyse auf U133A GeneChips
Die geänderten Bedingungen während der Anlagerung des cDNA Primers führen zu reduzierten Signalintensitäten für die ribosomalen RNAs. Beispiel 4:
Die RNA eines Blutspenders wurde wie in Beispiel 1 unter Verwendung des PAXgene Blood RNA Systems (PreAnalytix, Hombrechticon, CH) isoliert. Zum Blockieren der reversen Transkription der Globin Transkripte (mRNAs) wurden die folgenden PNA-Sequenzen (PE Biosystems) hinzugefügt, die komplementär zu den 3'-Regionen der Globin Transkripte sind.
PNA-Sequenz, komplementär zu humaner alpha 1 -Globin-mRNA und alpha 2-Globin-mRNA: alpha_465: N- TAA CGG TAT TTG GAG -C*
PNA-Sequenz, komplementär zu humaner beta Globin-mRNA: beta_554: N- GTA GTT GGA CTT AGG -C*
Pro Ansatz wurden 5 μg RNA in eine Reverse Transkription eingesetzt. Die cDNA-Synthese wurde gemäß den Herstellerangaben im Technical Manual (Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual") durchgeführt, wobei zusätzlich die oben aufgeführten, zu den alpha und beta Globin Transkripten komplementären, PNA-Sequenzen zugefügt wurden. Vor dem Start der cDNA Synthese wurden beide PNAs (alpha_465 and beta_554) und die Primer in einem herkömmlichen cDNA Synthesereaktionspuffer (Puffer der Superscript RT / Invitrogen) für 10 min bei 70°C und nachfolgend für 5 min bei 42°C inkubiert. Vor Zugabe der Reversen Transkriptase wurden die PNAs in einer Endkonzentration von 0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM, 1 ,0 μM und 10 μM zugesetzt. Nachfolgend wurden alle weiteren für die RT benötigten Komponenten (wie zusätzliche Reaktionspuffer, Nukleotide, Dithiothreitol (DTT) und die reverse Transkriptase) zugegeben und die Proben für 1 h bei 42°C inkubiert. Sowohl die cDNA Doppelstrang-Synthese, als auch die in vitro Transkription und das Cleanup der cRNA wurden gemäß der Herstellerangaben im Affymetrix "Expression Analysis Technical Manual" durchgeführt. Die Vergleichs- bzw. Kontrollproben ohne PNAs wurden dabei identisch behandelt.
Nach dem Cleanup der cRNA wurden die Proben auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Böblingen, DE) analysiert. Die entsprechenden Ergebnisse sind den Figuren 1 und 2 zu entnehmen. Sie zeigen den Einfluss von alpha_465 und beta_554 PNAs auf die Generierung von cRNAs, wobei zudem deutlich wird, dass die Zugabe von zu alpha und beta Globin Transkripten komplementären PNA Oligomeren zu einer Reduktion der cRNA Fragmente führt, welche eine deutliche Bande bei der Analyse auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer ergeben. Diese cRNA Fragmente wurden aus den Globin Transkripten (mRNA) der Ausgangsmaterialien (Vollblut) generiert. Das Ausmaß der Reduktion ist dabei von der Konzentration der PNAs abhängig.
Beispiel 5:
Die RNA eines Blutspenders wurde wie in Beispiel 1 unter Verwendung des PAXgene Blood RNA Systems (PreAnalytix, Hombrechticon, CH) aus humanem Vollblut (ohne Erythrozytenlyse) isoliert. Pro Ansatz wurden 1 ,7 μg RNA in eine Reverse Transkription eingesetzt. Die cDNA-Synthese wurde mit der reversen Transkriptase Omniscript (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) gemäß den Herstellerangaben (ausgenommen dessen, dass die RT bei 42°C anstatt bei 37°C erfolgte) durchgeführt. Geprimt wurde die cDNA-Synthese mit einem T7-oligo-dT2 Primer (Operon, Köln, DE). Vor Zugabe der Reversen Transkriptase wurden PNAs (Sequenzen s. u.) in einer Endkonzentration von 0,5 μM, 1 ,0 μM und 1 ,5 /M zugesetzt und der Ansatz zuerst 10 min bei 70°C und dann 5 min bei 37°C inkubiert. Nachfolgend wurden die Reverse Transkriptase zugegeben und die Proben für 1 h bei 42°C inkubiert. Die Vergleichs- bzw. Kontrollproben ohne PNAs wurden dabei identisch behandelt.
Im Anschluss an die cDNA-Synthese wurden TaqMan-PCR-Reaktionen durchgeführt, bei denen die Menge an alpha und beta Globin cDNA anhand einer Standardreihe quantifiziert wurden.
Für die Amplifikation von alpha 1 -Globin cDNA-Transkripte und alpha 2-Globin cDNA- Transkripte wurden identische Primer verwendet. Zur Blockierung der reversen Transkription der alpha und beta Globin Transkripte wurden die folgenden PNA-Sequenzen verwendet:
Sequenzen, die komplementär zu humaner alpha 1 -Globin-mRNA und alpha 2-Globin-mRNA sind:
alpha_473: N- CTC CAG CTT AAC GGT -C* alpha_465: N- TAA CGG TAT TTG GAG -C* Sequenzen, die komplementär zu humaner beta Globin-mRNA sind:
beta_554: N- GTA GTT GGA CTT AGG -C* beta 594: N- ATC CAG ATG CTC AAG -C*
Figure imgf000025_0001
Tabelle 3: Einfluss von zu alpha und beta Globin komplementären PNAs auf eine Two-step RT-PCR Reaktion.
Die in Tabelle 3 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass der Einsatz der PNAs alpha_473 und/oder alpha_465 zur Reduktion der cDNA Menge der alpha Globin Transkripte um mehr als 95 % führt. Der Transkriptspiegel an beta Globin bleibt beim Einsatz des PNA alpha_473 unbeeinf lusst, wenn die PNA Endkonzentration nicht höher als 0,5 μM ist.
Die Verwendung der PNAs beta_554 und beta_594 führt zur Reduktion der cDNA Menge an beta Globin um ca. 99 % bzw. 80 %. Werden diese PNAs in einer Endkonzentration von 0,5 μM verwendet, bleibt der Transkriptspiegel für alpha Globin unbeeinflusst.
Beispiel 6:
Von zwei verschiedenen Blutspendern wurde RNA mit Hilfe des PAXgene Blood RNA Systems (PreAnalytix, Hombrechticon, CH) isoliert. Für die nachfolgende Gen-Expressions- Analyse mit Affymetrix U133A Gen Chips erfolgte für die RNA Proben beider Spender die Target Präparation mit folgenden Protokollvarianten:
1. Standardprotokoll (nach Affymetrix Expression Analysis Technical Manual)
2. Target Präparation unter Einsatz von PNAs zur Blockierung der reversen Transkription der Globine: Im Vergleich zum Standardprotokoll wurden bei den Ansätzen unter Verwendung der PNAs folgende Protokolländerungen durchgeführt: Die PNAs wurden vor der cDNA Synthese gemeinsam mit dem T7-Oligo(dT)24 Primer (Operon, Köln, DE) zur RNA pipettiert. Zum Anlagern des Primers und der PNAs an die RNAs erfolgten mehrere Inkubationsschritte (10 min 70°C; 5 min 45°C; 2 min 42°C). Alle weiteren Schritte wurden wie im Standardprotokoll durchgeführt. Dabei wurden Ansätze unter Verwendung verschiedener PNA Kombinationen und PNA Konzentrationen miteinander verglichen.
Für jede der gesamt-RNA-lsolate wurden folgende PNA Kombinationen und PNA Endkonzentrationen (während der Annealingreaktion) eingesetzt:
Figure imgf000026_0001
Tabelle 4: PNA Kombinationen und Endkonzentrationen
Nach erfolgter Target Präparation erfolgte die Gen-Expressions-Analyse mit Hilfe von Affymetrix U133A Arrays. Zur Auswertung wurden alle Array Daten auf Signalintensitäten von TGT= 500 skaliert.
Figure imgf000027_0001
Tabelle 5: Auswertung alle Array Daten nach erfolgter Gen-Expressions-Analyse auf Affymetrix U133A Arrays
Durch die Verwendung der PNAs konnten die Globin Signalintensitäten auf den Arrays um 40 - 60% gesenkt werden. Weiterhin wurde der Anteil der Gene, die auf dem Array als „present" bewertet wurden, von ca. 32 % auf ca. 43% erhöht.
Beispiel 7:
RNA wurde aus humanem Vollblut mittels PAXgene Blood RNA System (PreAnalytix, Hombrechticon, CH) isoliert. Während der Target Präparation für die Affymetrix GeneChip- Analyse wurde zur Blockade der cDNA Synthese von alpha Globin-mRNA das PNA Oligonukleotid alpha_465 eingesetzt. Während der Anlagerung der PNAs an die Globin mRNA Transkripte wurden zwei verschiedene Bedingungen miteinander verglichen:
- die Ausgangs-RNA, die T7-oligo(dT)24 Primer und das PNA Oligonukleotid lagen in Wasser vor - die Ausgangs-RNA, die T7-oligo(dT)24 Primer und das PNA Oligonukleotid lagen in 3,5 mM (NH4)2SO4 vor
Die nachfolgende GeneChip-Analyse mittels Affymetrix U133A Arrays zeigte, dass die Anlagerung des PNA Oligonukleotids in Gegenwart von Ammoniumsulfat zu einer Erhöhung der „present call" Rate von 40,7% zu 42,8% führt.
Beispiel 8:
RNA wurde aus Jurkat Zellen (Zellinie; akute lymphoblatische Leukämie) isoliert. In diese RNA wurden in vitro Transkripte eingespiked, die den alpha-1 -Globin, alpha-2-Globin und Beta Globin mRNA Sequenzen entsprechen. Diese in vitro Transkripte trugen am 3'-Ende eine poly-A Sequenz, so dass sie, wie natürlich vorkommende mRNA Transkripte durch priming mit einem T7-oligo (dT)2 Primer in cDNA umgeschrieben werden konnten. Drei verschiedene Ansätze wurden miteinander verglichen:
1. Jurkat RNA 2. Jurkat RNA mit eingespikten Globin in vitro Transkripten 3. Jurkat RNA mit eingespikten Globin in vitro Transkripten unter Verwendung von Peptid Nukleinsäuren (PNAs) zur Blockade der Globin cDNA Synthese
Verwendete PNAs im dritten Reaktionsansatz:
PNA alpha_465 in einer Endkonzentration (während der PNA Anlagerung) von 300 μM PNA beta_594 in einer Endkonzentration (während der PNA Anlagerung) von 1 μM PNA beta_579 in einer Endkonzentration (während des PNA Anlagerung) von 1μM PNA beta_554 in einer Endkonzentration (während der PNA Anlagerung) von 1 μM Diese verschiedenen Proben wurden der Target Präparation nach Anleitung im Affymetrix „Expression Analysis Technical Manual" unterzogen sowie eine GeneChip-Analyse auf Affymetrix U133A Arrays durchgeführt. Im Gegensatz zum Standardprotokoll wurden bei dem Ansatz unter Verwendung der PNAs folgende Protokolländerungen durchgeführt: Die PNAs wurden vor der cDNA Synthese gemeinsam mit dem T7-Oligo(dT)2 Primer zur RNA pipettiert. Zum Anlagern des Primers und der PNAs erfolgten mehrere Inkubationsschritte (10 min 70°C; 5 min 45°C; 2 min 42°C). Alle weiteren Schritte wurden wie im Standardprotokoll durchgeführt.
Figure imgf000029_0001
Tabelle 6: Ergebnisse der GeneChip-Analyse
Die Signalintensitäten für die Globin mRNA Transkripte konnten durch die Verwendung der PNAs um 40 - 60% gesenkt werden. Der Anteil an Genen, die auf dem Array als „present" bewertet wurde, konnte bei der Probe, bei der die Globin in vitro Transkripte zugegeben wurde, durch Einsatz der PNA Oligonukleotide auf den ursprünglichen Anteil (Jurkat RNA ohne in vitro Transkripte) zurückgeführt werden.
Die Signale für die Globin mRNAs wurden durch den Einsatz der PNA Oligonukleotide nicht vollständig unterdrückt, jedoch reichte die Reduktion der Globin Signalintensitäten aus, um die „present call" Rate auf das ursprüngliche Niveau zu erhöhen.
In Figur 3 ist die Korrelation der Signalintensitäten der Probe, in der nur Jurkat RNA verwendet wurde, mit denjenigen der Probe dargestellt, in der Jurkat RNA mit zugesetzten Globin in vitro Transkripten und unter PNA Verwendung analysiert wurde. Bei dieser Abbildung sind die Gene, die die Globin-mRNA Transkripte beschreiben, aus der Analyse herausgenommen worden.
Der Korrelationskoeffizient der Signalintensitäten beträgt 0,9847. Dieser Wert weist darauf hin, dass durch die Verwendung der PNAs keine unspezifische Beeinflussung anderer auf dem Array repräsentierter Transkripte erfolgt ist.
Beispiel 9:
Das in Beispiel 8 beschriebene Experiment wurde unter Variation der PNA Oligonukleotid- konzentrationen wiederholt. Dazu wurde die Konzentration des Oligonukleotids PNA alpha_465 während der Anlagerung an die Globin-mRNA auf 600 nM verdoppelt.
Figure imgf000030_0001
Tabelle 7: Einfluss der Globin in vitro Transkripte durch die Verwendung der PNA Oligonukleotide
Auch unter diesen Bedingungen kann der negative Einfluss der Globin in vitro Transkripte durch die Verwendung der PNA Oligonukleotide rückgängig gemacht werden.
Beispiel 10:
gesamt-RNA wurde aus HeLa Zellen isoliert. Vier Proben dieser gesamt-RNA mit einer Konzentration von 2,14μg/μl wurden mit 42 ng/μl cDNA (generiert aus der gesamt-RNA der HeLa Zellen) vermischt, mit einem Bindungspuffer aus dem Superscript ds-cDNA Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) versetzt und einer RT sowie einer nachfolgenden Doppelstrang cDNA Synthese unterzogen.
Nach Durchführung der enzymatischen Reaktionen erfolgte eine Aufreinigung der Proben über Silika Spin Säulen (MinElute Cleanup Kit / QIAGEN GmbH, Hilden, DE). Dabei wurden die Proben mit unterschiedlichen Waschbedingungen behandelt. Die Proben 1 und 2 wurden gemäß dem Cleanup - Protokoll des Herstellers aufgereinigt. Die Aufreinigung der Proben 3 und 4 erfolgte ebenfalls in erster Linie gemäß dem Cleanup - Protokoll des Herstellers, zudem wurden die Proben jedoch, nach dem Aufbringen auf die Silika Spin Säulen bzw. vor dem Waschen mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer, in einem zusätzlichen Waschschritt mit 700 μl des Waschpuffers 1 (enthaltend 3,5 M Guanidinisothiocyanate, 25 mM Natrium Citrate, mit einem pH-Wert von 7,0) gewaschen.
Nach Elution der aufgereinigten Nukleinsäuren wurde der Anteil an RNA per RT-PCR Analyse (TaqMan-Analyse / QIAGEN GmbH, Hilden, DE) für p16 RNA (spezifisch zum Nachweis von RNA) quantifiziert (s. Fig. 4).
Zusätzlich wurde die Menge an einzelsträngiger cDNA im Eluat unter den verschiedenen Waschbedingungen quantifiziert (s Fig. 5). Dazu wurde ein TaqMan PCR System zum Nachweis von p16 cDNA angewendet.
Die Ergebnisse aus Figur 4 und Figur 5 zeigen deutlich, dass der zusätzliche Waschschritt mit dem erfindungsgemäßen Waschpuffer zu einer äußerst effizienten Abreicherung einzelsträngiger Nukleinsäuren (RNA und cDNA) führt.
Beispiel 11 :
Gemäß Beispiel 10 wurden hier 5μg genomische doppelsträngige Nukleinsäure (dsDNA) und 5 g einzelsträngige Nukleinsäure (RNA) - isoliert aus HeLa Zellen - vermischt. Nach Bindung an eine Silicamembran in Gegenwart eines Chaotrops und Alkohol (MinElute Kit / QIAGEN GmbH, Hilden, DE) wurden die Proben unter zwei verschiedenen Bedingungen vor der Elution gewaschen (Cleanup): a) Waschen mit ethanolhaltigem Waschpuffer gemäß der Herstellerangaben für das MinElute Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) b) Vorgeschaltetes Waschen mit 700 μl des Waschpuffers 1 (3,5 M Guanidinisothiocyanat und 25 mM Natrium Citrat, pH 7,0) vor dem Waschen mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer gemäß der Herstellerangaben für das MinElute Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) Die Proben wurden auf einem denaturierten Formaldehyd-Agarosegel analysiert (vor und nach dem Cleanup). Die Daten in Figur 6 zeigen deutlich eine effiziente Abreicherung der RNA in den Proben, die mit dem chaotrophe Salze enthaltenden Waschpuffer in einem zusätzlichen Waschschritt behandelt wurden, während die genomische DNA erhalten bleibt.
Beispiel 12:
Wie in Beispiel 1 wurde auch hier aus humanem Vollblut mit Hilfe des PAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) RNA isoliert. Mit jeweils 6μg der isolierten RNA wurde eine Target Präparation für Affymetrix GeneChip Analysen gemäß dem Affymetrix „Expression Analysis Technical Manual" durchgeführt. Die cDNA Synthese mit einem oligo dT-T7 Primer geprimt. Im Anschluss erfolgte die Zweitstrang cDNA Synthese. Die resultierenden Ansätze wurden nach der Bindung der Nukleinsäuren an Silika Spinsäule auf zwei verschiedenen Arten - unter Verwendung des MinElute Cleanup Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) - gewaschen bzw. aufgereinigt. a) Waschen auf der Silika Spinsäule gemäß der Herstellerangaben für das MinElute Kit ohne zusätzlichen Waschschritt b) Waschen auf der Silika Spinsäule inklusive eines zusätzlichen Waschschritts mit dem Waschpuffer 1 (3,5 M Guanidinisothiocyanat und 25 mM Natriumcitrab pH 7,0) vor dem Waschen mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer gemäß der Herstellerangaben für das MinElute Kit.
Nachfolgend wurde die aufgereinigte cDNA in einer in vitro Transkriptions-Reaktion in cRNA umgeschrieben, und dabei biotinylierte Nukleotide eingebaut. Die Proben wurden nach Maßgabe des Affymetrix „Expression Analysis Technical Manual" aufgereinigt, fragmentiert, und auf einem U133A Gen Chip hybridisiert.
Um die Ergebnisse auf den verschiedenen Arrays vergleichbar zu machen, wurden die durchschnittlichen Signalintensitäten der Proben mit einem Skaling Faktor (TGT = 10000) multipliziert. Die Ergebnisse der GeneChip-Analyse sind der folgenden Tabelle zu entnehmen. Prozent Scaling Faktor "present calls" (TGT=10000) Probe ohne einen zusätzlichen Waschschritt 34,70 72,37 (Standardbedingungen) Probe mit einem zusätzlichen Waschschritt 38,20 54,15 (mit dem Waschpuffer 1) Tabelle 8: Ergebnisse einer GeneChip-Analyse auf U133A Gen Chips unter Verwendung unterschiedlich aufgereinigter Target Proben.
Durch den zusätzlichen Waschschritt - und der daraus resultierenden Abreicherung einzelsträngiger RNA und cDNA nach der Doppelstrangsynthese - steigt der Anteil der als "present calls" auf dem Gen Chip von 34,7% auf 38,2% (um 10%) an. Der Skaling Faktor ist für die Probe ohne den zusätzlichen Waschschritt um ca. 33% höher als bei der Probe, die mit dem zusätzlichen Waschschritt behandelt wurde. Dieses ist ein Hinweis auf eine insgesamt höhere Signalintensität des Gen Chips, der mit der Probe hybridisiert wurde, die mit dem zusätzlichen Waschschritt behandelt worden ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur reversen Transkription und/oder Amplifikation eines Produktes einer reversen Transkription eines Pools von Nukleinsäuren eines Typs (A) aus einer biologischen Probe oder einer enzymatischen Reaktion, gekennzeichnet durch die selektive Unterdrückung der reversen Transkription mindestens einer unerwünschten Nukleinsäure des Typs (A) und/oder die selektive Unterdrückung der Amplifikation eines Produktes einer reversen Transkription mindestens einer unerwünschten Nukleinsäure des Typs (A).
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichneb dass die Nukleinsäure des Typs (A) mRNA ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichneb dass die unerwünschte Nukleinsäure des Typs (A) eine mRNA ist, die einen Anteil von 20% oder mehr an der gesamt-mRNA hat.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 3, umfassend folgende Verfahrensschritte a) durchführen einer reversen Transkriptions-Reaktion einer RNA aus einer biologischen Probe oder einer enzymatischen Reaktion in Anwesenheit mindestens eines oligo-dT Primers, b) optional nach Schritt a) durchführen einer cDNA-Zweitstrangsynthese, c) optional nach Schritt b) Aufreinigung der ds-cDNA unter gleichzeitiger Abreicherung aller einzelsträngigen Nukleinsäuren aus dem Reaktionsprodukt aus Schritt b), d) optional nach Schritt a) und/oder b) und/oder c) durchführen einer Amplifikation der cDNA.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte a) und/oder d) in Anwesenheit mindestens einer Molekül-Spezies zur selektiven Unterdrückung der reversen Transkription mindestens einer unerwünschten mRNA, wobei die Molekül-Spezies die reversen Transkription der unerwünschten mRNA verhindert, und/oder zur selektiven Unterdrückung der Amplifikation eines Produktes der reversen Transkription mindestens einer unerwünschten mRNA, wobei die Molekül-Spezies die Amplifikation der aus der unerwünschten mRNA hergestellten einzelsträngigen oder doppelsträngigen cDNA verhindert, durchgeführt werden.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in der reversen Transkriptions-Reaktion eine reverse Transkriptase mit intrinsischer RNase H- Aktivität eingesetzt wird.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichneb dass es sich bei der biologischen Probe um Vollblut, Muskelgewebe oder neuronales Gewebe handelt, oder es sich um eine mit Vollblut, Muskelgewebe oder neuronalem Gewebe kontaminierte Probe handelt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe Vollblut ist, und dass das Vollblut in einem Stabilisierungsreagenz aufgenommen und/oder gelagert wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Stabilisierungsreagenz in einem Blutentnahmeröhrchen enthalten ist und das Blut unmittelbar bei der Abnahme in das Stabilisierungsreagenz überführt wird.
10. Verfahren gemäß Ansprüch e oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Stabilisierungsreagenz ein Tetra-Alkyl-Ammoniumsalz in Gegenwart einer organischen Säure enthält.
11. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Stabilisierungsreagenz mindestens eine Guanidin-Verbindung, eine Puffersubstanz, ein Reduktionsmittel und ein Detergenz enthält.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichneb dass die biologische Probe Vollblut ist, und dass die unerwünschte Nukleinsäure des Typs (A) Globin-mRNA ist.
13. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichneb dass zur Aufreinigung einer ds-cDNA in Schritt c) zunächst die aus Schritt b) und/oder die aus dem optionalen Schritt d) stammenden Nukleinsäuren in ihrer Gesamtheit an eine Silicamatrix gebunden werden und anschließend die Silicamatrix zur Abreicherung der einzelsträngigen Nukleinsäuren mit einem Guanidin-haltigen Waschpuffer gewaschen wird.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichneb dass als Silicamatrix eine oder mehrere Silicamembran(en) oder Silicapartikel, insbesondere magnetische Silicapartikel, verwendet werden.
15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichneb dass der Guanidin-haltige Waschpuffer Guanidinisothiocyanat und/oder Guanidinthiocyanat in einer Konzentration von 1 M bis 7 M, bevorzugt von 2,5 M bis 6 M und besonders bevorzugt von 3 M bis 5,7 M enthält.
16. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Guanidin-haltige Waschpuffer Guanidinhydrochlorid in einer Konzentration von 4 M bis 9 M, bevorzugt von 5 M bis 8 M, enthält.
17. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies eine zur mRNA oder zu einem der cDNA-Stränge komplementäres DNA-Oligonukleotid und/oder RNA-Oligonukleotid ist, oder ein entsprechendes Oligonukleotid aus DNA- und/oder RNA-Derivaten, oder ein entsprechendes DNA- und/oder RNA-Oligonukleotid enthaltend modifizierte oder artifizielle Nukleotide, Quencher oder Fluorophore.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies eine Länge von 10 bis 60 Nukleotiden, vorzugsweise von 12 bis 30 Nukleotiden, aufweist.
19. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichneb dass die Molekül-Spezies eine zur mRNA oder zu einem der cDNA-Stränge komplementäres Nukleinsäure-Analogon ist.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichneb dass das Nukleinsäure- Analogon PNA, LNA oder GripNA ist.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die PNA eine Länge von 12 bis 20 Nukleotidanaloga, vorzugsweise von 13 bis 16 Nukleotidanaloga, aufweist.
22. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die LNA mindestens ein Nukleotid aufweist, welches ein 'locked nucleotide' ist, und das die LNA eine Länge von 14 bis 30 Nukleotide, vorzugsweise von 15 bis 22 Nukleotide, aufweist.
23. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die GripNA eine Länge von 12 bis 30 Nukleotidanaloga, vorzugsweise von 14 bis 20 Nukleotidanaloga, aufweist.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies in der 3'-Region der mRNA oder einer der cDNA-Stränge bindet.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 und 17 bis 24, dadurch gekennzeichneb dass mehrere Molekül-Spezies eingesetzt werden, die komplementär zu verschiedenen Regionen einer oder mehrerer spezifischen mRNA(s) bzw. mindestens eines Stranges einer oder mehrerer spezifischer cDNA(s) sind.
26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 und 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Molekül-Spezies eingesetzt wird, die komplementär zu einer homologen Region verschiedener mRNAs oder cDNAs ist.
27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 und 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies an ihrem 3'-Ende eine Modifikation aufweist, die verhindert, dass eine Elongation am 3'-Ende der Molekül-Spezies initialisiert werden kann.
28. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies ein Ribozym ist.
29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies ein hammerhead ribozyme oder ein hairpin ribozyme ist.
30. Verfahren gemäß Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Ribozym aus RNA oder einem RNA-Derivat besteht oder Fusionsprodukte solcher Ribozyme verkörpert.
31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die zur unerwünschten mRNA oder cDNA komplementäre Sequenz der Ribozyme eine Länge von 12 bis 30 Nukleotiden, vorzugsweise von 15 bis 25 Nukleotiden, aufweist.
32. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies ein DNAzym ist.
33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 12 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies ein DNA-Oligonukleotid ist und die Globin-mRNA eine alpha 1 Globin- mRNA und/oder eine alpha 2 Globin-mRNA verkörpert, wobei das DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aus der Gruppe von a) 5' CTC CAG CTT AAC GGT - Phosphatgruppe - 3' b) 5' TAA CGG TAT TTG GAG - Phosphatgruppe - 3' c) 5' TAA CGG TAT TTG GAG GTC AGC ACG GTG CTC - Phosphatgruppe - 3' aufweist.
34. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 12 und 17, dadurch gekennzeichneb dass die Molekül-Spezies ein DNA-Oligonukleotid ist und die Globin-mRNA eine beta Globin- mRNA verkörpert, wobei das DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aus der Gruppe von a) 5' GTA GTT GGA CTT AGG - Phosphatgruppe - 3' b) 5' ATC CAG ATG CTC AAG - Phosphatgruppe - 3' c) 5' GTA GTT GGA CTT AGG GAA CAA AGG AAC CTT - Phosphatgruppe - 3' aufweist.
35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 12 und 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies eine PNA ist und die Globin-mRNA eine alpha 1 Globin-mRNA und/oder eine alpha 2 Globin-mRNA verkörpert, wobei die PNA eine Sequenz aus der Gruppe von a) N- CTC CAG CTTAAC GGT-C* b) N- TAA CGG TATTTG GAG -C* c) N- GTC ACC AGC AGG CA -C* d) N- GTG AAC TCG GCG -C* e) N- TGG CAATTC GAC CTC -C* f) N- GAG GTT TAT GGC AAT -C* g) N- ACG GAC GAC CAC TG -C* h) N- GCG GCT CAA GTG -C* aufweist.
36. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 12 und 20, dadurch gekennzeichneb dass die Molekül-Spezies eine PNA ist und die Globin-mRNA eine beta Globin-mRNA verkörpert, wobei die PNA eine Sequenz aus der Gruppe von a) N- GTA GTT GGA CTT AGG -C* b) N- ATC CAG ATG CTC AAG -C* c) N- CCC CAG TTT AGT AGT -C* d) N- CAG TTT AGT AGT TGG -C* e) N- GCC CTT CAT AAT ATC -C* f) N- GGA TTC AGG TTG ATG -C* g) N- GAA CTC GAT GAC CTA -C* h) N- TGA TGA TTT GAC CCC -C* i) N- GGT TGA TGA TTT GAC -C* j) N- CTA TAA TAG TTC CCG -C* aufweist.
37. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 12 und 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül-Spezies eine LNA, aufweisend mindestens ein Nukleotid, welches ein 'locked nucleotide' ist, ist und die Globin-mRNA eine alpha 1 -Globin-mRNA und/oder eine alpha 2-Globin-mRNA verkörpert, wobei die LNA eine Sequenz aus der Gruppe von a) 5' CTC CAG CTT AAC GGT - Oktandiol - 3' b) 5' TAA CGG TAT TTG GAG - Oktandiol -3' c) 5' GTC ACC AGC AGG CA - Oktandiol -3' d) 5' GTG AAC TCG GCG - Oktandiol -3' aufweist.
38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 12 und 20, dadurch gekennzeichneb dass die Molekül-Spezies eine LNA, aufweisend mindestens ein Nukleotid, welches ein 'locked nucleotide' ist, ist und die Globin-mRNA eine beta Globin-mRNA verkörpert, wobei die LNA eine Sequenz aus der Gruppe von a) 5' GTA GTT GGA CTT AGG - Oktandiol -3' b) 5' ATC CAG ATG CTC AAG - Oktandiol -3' c) 5' CCC CAG TTT AGT AGT - Oktandiol -3' d) 5' CAG TTT AGT AGT TGG - Oktandiol -3' e) 5' GCC CTT CAT AAT ATC - Oktandiol -3' aufweist.
39. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 , 4 und 5, dadurch gekennzeichneb dass die Amplifikation eine in vitro Transkription umfasst.
40. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass sich an die in vitro Transkription ein DNase-Verdau sowie die Aufreinigung der cRNA anschließt.
41. Verwendung von cRNA resultierend aus einem Verfahren gemäß Anspruch 39 oder 40 in einer Gen-Expressions-Analyse.
42. Verwendung von cDNA resultierend aus einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 38 in einer Gen-Expressions-Analyse.
43. Verwendung eines Waschpuffers, enthaltend mindestens eine Guanidin-Verbindung in einer Gesamtkonzentration von 1 M bis 9 M, wobei die Guanidin-Verbindung Guanidinisothiocyanat in einer Konzentration von 1 M bis 7 M, bevorzugt von 2,5 M bis 6 M und besonders bevorzugt von 3 M bis 5,7 M ist, und/oder die Guanidin-Verbindung Guanidinthiocyanat in einer Konzentration von 1 M bis 7 M, bevorzugt von 2,5 M bis 6 M und besonders bevorzugt von 3 M bis 5,7 M ist und/oder die Guanidin-Verbindung Guanidinhydrochlorid in einer Konzentration von 4 M bis 9 M, bevorzugt von 5 M bis 8 M ist, in einem Verfahren zur Trennung von einzelsträngigen Nukleinsäuren von doppelsträngigen Nukleinsäuren, bevorzugt in einem Verfahren zur Elution einzelsträngiger Nukleinsäuren von einer Silicamatrix und besonders bevorzugt in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
44. Verwendung gemäß Anspruch 43, wobei der Waschpuffer weiterhin eine oder mehrere Puffersubstanz(en) in einer Gesamtkonzentration von 0 mM bis 40 mM und/oder ein oder mehrere Additiv(e) in einer Gesamtkonzentration von 0 mM bis 100 mM und/oder ein oder mehrere Detergenz(ien) in einer Gesamtkonzentration von 0 %(v/v) bis 20 %(v/v), wobei der Waschpuffer einen pH-Wert von 5 bis 9 aufweist, enthält.
45. Verwendung gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtkonzentration der Puffersubstanzen 20 mM bis 40 mM beträgt.
46. Verwendung gemäß Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz Tris, Tris-HCI, MOPS, MES, CHES, HEPES, PIPES und/oder Natriumeitrat ist.
47. Verwendung gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Additiv ein Chelatbildner ist.
48. Verwendung gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner EDTA und/oder EGTA ist.
49. Verwendung gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz Tween 20, Triton X 100, Sarcosyl und/oder NP 40 ist.
50. Verwendung gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Waschpuffers in einem Bereich von 6 bis 8 liegt.
51. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 43 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Guanidin-Verbindung Guanidinisothiocyanat und/oder Guanidinthiocyanat ist und die Puffersubstanz Natriumeitrat ist, wobei der Waschpuffer einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 aufweist.
52. Verwendung gemäß Anspruch 51 , dadurch gekennzeichnet, dass der Waschpuffer Guanidinisothiocyanat und/oder Guanidinthiocyanat in einer Gesamtkonzentration von 3,2 M bis 3,8 M sowie Natriumeitrat in einer Konzentration von 20 mM bis 30 mM enthält und einen pH-Wert von 6,8 bis 7,7 aufweist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass der Waschpuffer Guanidinisothiocyanat und/oder Guanidinthiocyanat in einer Gesamtkonzentration von 3,5 M sowie Natriumeitrat in einer Konzentration von 25 mM enthält und einen pH-Wert von 7,0 aufweist.
PCT/EP2004/008363 2003-07-24 2004-07-26 Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren WO2005010209A2 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04763506A EP1651776A2 (de) 2003-07-24 2004-07-26 Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren
CA002533119A CA2533119A1 (en) 2003-07-24 2004-07-26 Method for the reverse transcription and/or amplification of nucleic acids
US10/565,989 US20060281092A1 (en) 2003-07-24 2004-07-26 Method for the reverse transcription and/or amplification of nucleic acids
JP2006520816A JP2006528482A (ja) 2003-07-24 2004-07-26 核酸の逆転写及び／または増幅方法
AU2004259851A AU2004259851A1 (en) 2003-07-24 2004-07-26 Method for the reverse transcription and/or amplification of nucleic acids

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48964303P 2003-07-24 2003-07-24
US60/489,643 2003-07-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2005010209A2 true WO2005010209A2 (de) 2005-02-03
WO2005010209A3 WO2005010209A3 (de) 2005-05-26

Family

ID=34102910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/008363 WO2005010209A2 (de) 2003-07-24 2004-07-26 Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20060281092A1 (de)
EP (1) EP1651776A2 (de)
JP (1) JP2006528482A (de)
AU (1) AU2004259851A1 (de)
CA (1) CA2533119A1 (de)
WO (1) WO2005010209A2 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006105487A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Amgen Inc. Method for selectively blocking hemoglobin rna amplification
US7126215B2 (en) 2004-03-30 2006-10-24 Intel Corporation Microelectronic packages including nanocomposite dielectric build-up materials and nanocomposite solder resist
US10131935B2 (en) * 2006-07-11 2018-11-20 Aj Innuscreen Gmbh Method for parallel isolation of viral nucleic acids
CN110382708A (zh) * 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
WO2020068559A1 (en) * 2018-09-25 2020-04-02 Qiagen Sciences, Llc Depleting unwanted rna species

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050003369A1 (en) * 2002-10-10 2005-01-06 Affymetrix, Inc. Method for depleting specific nucleic acids from a mixture
KR100878371B1 (ko) * 2005-04-19 2009-01-15 돌비 스웨덴 에이비 공간적 오디오 파라미터들의 효율적인 부호화를 위한에너지 종속 양자화
EP2479291A1 (de) * 2005-10-27 2012-07-25 Life Technologies Corporation Nucleinsäureverstärkung unter Verwendung nichtzufälliger Primer
CA2773887A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-17 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for whole transcriptome analysis
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
ES2904816T3 (es) 2012-02-27 2022-04-06 Becton Dickinson Co Composiciones para recuento molecular
EP3301188B1 (de) * 2012-04-16 2020-10-07 Life Technologies Corporation Verfahren zur herstellung von rna-bibliotheken
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
ES2934982T3 (es) 2015-03-30 2023-02-28 Becton Dickinson Co Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios
EP3286326A1 (de) 2015-04-23 2018-02-28 Cellular Research, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur gesamttranskriptomamplifikation
US20180142290A1 (en) 2015-05-28 2018-05-24 Kaarel Krjutskov Blocking oligonucleotides
WO2017044574A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
EP3494214A4 (de) * 2016-08-05 2020-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Zweitstrang direkt
AU2017331459B2 (en) 2016-09-26 2023-04-13 Becton, Dickinson And Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
WO2018232594A1 (zh) * 2017-06-20 2018-12-27 深圳华大智造科技有限公司 Pcr引物对及其应用
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
JP2022511398A (ja) 2018-10-01 2022-01-31 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ５’転写物配列の決定
EP3877520A1 (de) 2018-11-08 2021-09-15 Becton Dickinson and Company Ganze transkriptomanalyse von einzelzellen mittels random-priming
CN113195717A (zh) * 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
WO2020154247A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Cellular Research, Inc. Oligonucleotides associated with antibodies
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
CN115244184A (zh) 2020-01-13 2022-10-25 贝克顿迪金森公司 用于定量蛋白和rna的方法和组合物
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891625A (en) * 1992-06-05 1999-04-06 Buchardt Ole Use of nucleic acid analogues in the inhibition of nucleic acid amplification
WO2001032931A2 (en) * 1999-11-02 2001-05-10 Curagen Corporation Method and compositions for selectively inhibiting amplification of sequences in a population of nucleic acid molecules
WO2001060517A2 (de) * 2000-02-15 2001-08-23 Antigene Biotech Gmbh Gefäss zur nukleinsäureanalytik
WO2002000599A1 (de) * 2000-06-27 2002-01-03 Qiagen Gmbh Neue kompositionen für die isolierung und/oder stabilisierung von nukleinsäuren in biologischen materialien
CA2442092A1 (en) * 2001-03-26 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936467B2 (en) * 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
EP1253205A1 (de) * 2001-04-24 2002-10-30 LION Bioscience AG Verfahren zur Blockierung der Amplifizierung von ausgewählten Sequenzen
US7148343B2 (en) * 2001-10-12 2006-12-12 Gentra Systems, Inc. Compositions and methods for using a solid support to purify RNA
US20050003369A1 (en) * 2002-10-10 2005-01-06 Affymetrix, Inc. Method for depleting specific nucleic acids from a mixture
WO2005003370A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-13 Gene Logic, Inc. Methods for enhancing gene expression analysis

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891625A (en) * 1992-06-05 1999-04-06 Buchardt Ole Use of nucleic acid analogues in the inhibition of nucleic acid amplification
WO2001032931A2 (en) * 1999-11-02 2001-05-10 Curagen Corporation Method and compositions for selectively inhibiting amplification of sequences in a population of nucleic acid molecules
WO2001060517A2 (de) * 2000-02-15 2001-08-23 Antigene Biotech Gmbh Gefäss zur nukleinsäureanalytik
WO2002000599A1 (de) * 2000-06-27 2002-01-03 Qiagen Gmbh Neue kompositionen für die isolierung und/oder stabilisierung von nukleinsäuren in biologischen materialien
CA2442092A1 (en) * 2001-03-26 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EFIMOV VLADIMIR A ET AL: "Synthesis of polyacrylamides N-substituted with PNA-like oligonucleotide mimics for molecular diagnostic applications" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Bd. 27, Nr. 22, 15. November 1999 (1999-11-15), Seiten 4416-4426, XP002308457 ISSN: 0305-1048 *
HOMANN M ET AL: "INCORPORATION OF THE CATALYTIC DOMAIN OF A HAMMERHEAD RIBOZYME INTOANTISENSE RNA ENHANCES ITS INHIBITORY EFFECT ON THE REPLICATION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE 1" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, Bd. 21, Nr. 12, 1993, Seiten 2809-2814, XP002051227 ISSN: 0305-1048 *
NIELSEN P E ET AL: "SEQUENCE-SPECIFIC TRANSCRIPTION ARREST BY PEPTIDE NUCLEIC ACID BOUND TO THE DNA TEMPLATE STRAND" GENE, ELSEVIER BIOMEDICAL PRESS. AMSTERDAM, NL, Bd. 149, 1994, Seiten 139-145, XP002022886 ISSN: 0378-1119 *
PETERSEN M ET AL: "LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics" TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, Bd. 21, Nr. 2, Februar 2003 (2003-02), Seiten 74-81, XP004405626 ISSN: 0167-7799 *
See also references of EP1651776A2 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7126215B2 (en) 2004-03-30 2006-10-24 Intel Corporation Microelectronic packages including nanocomposite dielectric build-up materials and nanocomposite solder resist
WO2006105487A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Amgen Inc. Method for selectively blocking hemoglobin rna amplification
US10131935B2 (en) * 2006-07-11 2018-11-20 Aj Innuscreen Gmbh Method for parallel isolation of viral nucleic acids
CN110382708A (zh) * 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
WO2020068559A1 (en) * 2018-09-25 2020-04-02 Qiagen Sciences, Llc Depleting unwanted rna species
CN112771176A (zh) * 2018-09-25 2021-05-07 凯杰科技有限公司 耗竭不需要的rna物质

Also Published As

Publication number Publication date
EP1651776A2 (de) 2006-05-03
CA2533119A1 (en) 2005-02-03
AU2004259851A1 (en) 2005-02-03
US20060281092A1 (en) 2006-12-14
WO2005010209A3 (de) 2005-05-26
JP2006528482A (ja) 2006-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1651776A2 (de) Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren
EP0743367B1 (de) Verfahren zur Genexpressionsanalyse
DE69836587T2 (de) Nukleinsäuresammlung
EP2285816B1 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren
DE69836012T2 (de) Zwei-schritt hybridisierung und einfang von einem polynukleotid
DE60009323T2 (de) Methoden und zusammensetzungen zur linearen isothermalen amplifikation von polynukleotidsequenzen
EP1509623B1 (de) Vermehrung von ribonukleinsäuren
EP2446054B1 (de) Verfahren zur amplifikation von dna unter verwendung von tetraethylenglykol
DE69931928T2 (de) Reversibel inhibierende sonden
EP1772523B1 (de) Polymerase-Kettenreaktionsverfahren unter Einsatz einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Eigenschaften
DE4428651C1 (de) Verfahren zur Herstellung und Amplifikation von Nukleinsäuren
EP1072686A2 (de) Verfahren zur 5'-Cap-abhängigen Anreicherung von cDNAs
EP0754764B1 (de) Verfahren und Reagenz zur spezifischen Bestimmung von mRNA
EP1423540B1 (de) Vermehrung von ribonukleinsäuren
DE69833864T2 (de) Methoden zur dns vervielfältigung und material dafür
WO2001049880A2 (de) Primer, insbesondere für primer-abhängige nukleinsäure-syntheseprozesse und nukleinsäure-amplifikationsverfahren
DE102007051578B3 (de) Verfahren zur parallelen Amplifikation von wenigstens zwei verschiedenen Nukleinsäureabschnitten
DE60318315T2 (de) Nukleinsäure vervielfältigungsverfahren
WO2011161239A1 (de) Verfahren zum nachweis von ribonukleinsäuren
DE10011480A1 (de) Nukleinsäure und hieraus abgeleitete Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen Nachweis von Aquaporin-Genen aus Vitis vinifera
DE102006038686A1 (de) Verfahren zur nicht radioaktiven Markierung von Ribonukleinsäure
EP0871769A1 (de) Verfahren zur reduzierung der bildung von artefakten während transkription von ribonukleinsäuren in desoxyribonukleinsäuren
DE10335107A1 (de) Verfahren zur Bereitstellung eines Reaktionsgemisches für eine nachfolgende Mikroarrayanalyse
DE102004001582A1 (de) Verfahren zur Herstellung von DNS-Sonden für DNS-Abschnitte mit repetitiven Sequenzen
EP0733713A1 (de) Verfahren zur Messung Transkriptions-regulatorischer Aktivitäten von DNS-Sequenzen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004259851

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2533119

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004763506

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006520816

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2004259851

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20040726

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004259851

Country of ref document: AU

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004763506

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006281092

Country of ref document: US

Ref document number: 10565989

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10565989

Country of ref document: US