DE10011480A1

DE10011480A1 - Nukleinsäure und hieraus abgeleitete Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen Nachweis von Aquaporin-Genen aus Vitis vinifera

Info

Publication number: DE10011480A1
Application number: DE10011480A
Authority: DE
Inventors: Blanco Isabel Maria Baiges; Albert Mas; Anton Rudolf Schaeffner
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2000-03-09
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2001-09-20
Also published as: AU3928901A; EP1261738A2; WO2001066793A2; WO2001066793A3

Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Aquaporin-Genen, -Genfragmenten und hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene aus Vitis vinifera.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren und hieraus abgeleitete Oligonukleotide zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Aquaporin-Genen, Genfragmenten, hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene aus Vitis vinifera.

Aquaporine sind Transmembran-Proteine, die in Pflanzen in der Plasmamembran und in der vakuolären Membran (Tonoplast) vorliegen. Sie werden zu einer Familie von major intrinsic proteins (MIPs) gezählt und als PIP (plasma intrinsic protein) bzw. TIP (tonoplast intrinsic protein) bezeichnet.

Bezüglich ihrer Funktion ist bekannt, daß sie die Permeabilität von Membranen für Wasser erhöhen und bei der Regulation des Wasserhaushalts von Pflanzen, z. B. in die und aus den Leitgefäßen, oder beim Zellgrößenwachstum, beteiligt sind. Es konnte auch gezeigt werden, daß die Expression bekannter Aquaporine durch Trocken- und Salzstress beeinflußt wird.

Wein (Vitis vinifera) stellt eine wichtige Kulturpflanze dar, die gerade in ariden Gebieten eine große wirtschaftliche Bedeutung hat. Ob und in welchem Umfang in Vitis vinifera Aquaporine vorkommen, konnte bis jetzt nicht oder nur unzureichend geklärt werden. Trotz des wirtschaftlichen Stellenwertes von Weinpflanzen konnten bisher keine für Aquaporine codierenden oder zumindest keine vollständigen codierenden Nukleinsäuren aus Vitis vinifera isoliert werden. Ferner fehlen detaillierte Daten bezüglich des Expressionsmusters und der Expressionshöhe derartiger Nukleinsäuren bzw. Proteine in Vitis vinifera.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Nukleinsäuren und hieraus abgeleitete Oligonukleotide bereitzustellen, die spezifisch für Aquaporin-Gene aus Vitis vinifera sind und mit denen eine spezifische Amplifikation, ein spezifischer quantitativer und/oder qualitativer Nachweis von Aquaporin-Genen und -Genfragmenten und von hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene aus Vitis vinifera ermöglicht wird.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Nukleinsäuren gelöst, die in SEQ ID NO: 1-28 offenbart sind, sowie durch Derivate dieser Sequenzen. Von der Erfindung umfaßt werden auch die komplementären, reversen und revers-komplementären Sequenzen, wobei jeweils eine oder mehrere dieser Sequenzen in Nachweis- oder Amplifikationsverfahren eingesetzt werden können. Die Sequenzen sind jeweils spezifisch für Aquaporin-Gene oder - Fragmente von Aquaporin-Genen von Vitis vinifera auf DNA- oder RNA-Ebene.

Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung mit den Ausführungsbeispielen. Die nachfolgende Beschreibung und die Ausführungsbeispiele bilden bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung, d. h. die Erfindung ist nicht hierauf beschränkt. Abwandlungen sind dem Fachmann ohne weitere erfinderische Tätigkeit auf Grundlage der hier offenbarten Oligonukleotide möglich, insoweit diese vom Erfindungsgedanken umfaßt werden.

Die Abb. 1-3 zeigen die Expression von Aquaporin-Genen in verschiedenen Geweben von Vitis vinifera unter Verwendung von Sonden gemäß der Erfindung. Die Abb. 4 zeigt die Sequenz spezifischer Sonden (kleine Buchstaben), d. h. einschließlich der flankierenden Abschritte, die zur Synthese spezifischer Oligonukleotide (Großbuchstaben) in 5'-3'-Richtung (5'-Ende) (Vorwärts-Richtung) bzw. in 3'-5'-Richtung (3'-Ende) (revers) eingesetzt wurden.

Erfindungsgemäß werden somit Nukleinsäuren und hieraus abgeleitete Derivate bereitgestellt, die z. B. als Sonden und Primer einsetzbar sind, um beispielsweise einen spezifischen Nachweis von Aquaporin-Genen aus Vitis vinifera sowie eine Amplifikation der hierfür codierenden Gene und daraus abgeleiteter Genfragmente und den Nachweis der Expression von Aquaporin-Proteinen zu ermöglichen.

Unter "Derivate" und "Abwandlungen" sind erfindungsgemäß solche Nukleinsäuren zu verstehen, bei denen zumindest 1, aber auch 2, 3, 4 oder mehr Nukleotide an einem oder beiden Enden der Nukleinsäuren oder auch im Inneren der Nukleinsäuren fehlen oder durch andere Nukleotide ersetzt wurden. Voraussetzung hierbei ist immer, daß eine spezifische Bindung an Aquaporin-Gene und -Genfragmente aus Vitis vinifera beibehalten bleibt, so daß die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst werden kann. Die Nukleinsäuren können aber auch Teile größerer DNA-Einheiten sein und deshalb auch integriert in Vektoren, beispielsweise in Plasmide, vorliegen.

Von der Erfindung umfaßt werden auch Fragmente der erfindungsgemäß bereitgestellten Nukleinsäuren und der hieraus bereitgestellten Nukleinsäuren und der hieraus abgeleiteten Oligonukleotide. Unter "Fragmente" werden erfindungsgemäß Nukleinsäuren verstanden, die mehr als 12, bevorzugt mehr als 15, mehr als 20, mehr als 25 oder mehr als 30 und bis zu 50 Nukleotide verstanden. Der Begriff Oligonukleotide umfaßt Fragmente von 12-50 Nukleotiden und Teilbereiche hiervon. Diese Sequenzen können beliebig aus den hier vorgestellten Nukleinsäuresequenzen zusammengestellt werden, soweit sie zumindest 12 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweisen. Unter den Ausdruck "Derivate" sind die vorstehend beschriebenen Fragmente und Oligonukleotide zu subsumieren.

Ausgehend von den vorstehend offenbarten Nukleinsäuresequenzen kann der Fachmann durch Austesten feststellen, welche Derivate und Abwandlungen, insbesondere welche Oligonukleotide, die aus diesen Nukleinsäuren abgeleitet werden können, zu speziellen Nachweisverfahren, beispielsweise Hybridisierungsverfahren und PCR-Verfahren, geeignet und welche nicht oder weniger geeignet sind. Die Nukleinsäuren und Oligonukleotide der Erfindung können auch beispielsweise in größeren DNA- oder RNA-Sequenzen vorliegen, z. B. flankiert von Restriktionsenzymschnittstellen.

Amplifikations- und Nachweisverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Nur beispielsweise sei hier auf dem Fachmann bekannte Laborhandbücher verwiesen, die diese Methodik beschreiben, beispielsweise auf Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor und alle nachfolgenden Auflagen. PCR-Verfahren sind z. B. beschrieben in Newton, PCR, BIOS Scientific Publishers Limited, 1994 und nachfolgende Auflagen.

Die Erfindung umfaßt auch solche Abwandlungen der vorliegend beanspruchten Nukleinsäuren und Derivate und Oligonukleotide, die mit diesen, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, hybridisieren. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen werden insbesondere 0,2 × SSC (0,03 M NaCl, 0,003 M Natriumcitrat, pH 7) bei 65°C verstanden. Bei kürzeren Fragmenten, beispielsweise Oligonukleotiden aus bis zu 20 Nukleotiden, liegt die Hybridisierungstemperatur unter 65°C, beispielsweise bei über 55°C, bevorzugt über 50°C, jeweils aber unter 65°C. Stringente Hybridisierungstemperaturen sind abhängig von der Größe bzw. Länge der Sonde und ihrer Nukleotidzusammensetzungen und sind vom Fachmann durch Handversuche zu ermitteln.

Wie ausgeführt werden die Oligonukleotide der Erfindung, die sich von den hier beschriebenen Nukleinsäuren ableiten, beispielsweise in Nachweisverfahren und Ampliflkationsverfahren von Aquaporin-Genen aus Vitis vinifera eingesetzt. Der Fachmann kann hier die bereits an sich bekannten Verfahren mit den vorliegenden Oligonukleotiden einsetzen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit der genannten Gene zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgt der Nachweis über die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder der DNA der Probe durch beispielsweise PCR- und Hybridisierungstechniken, um das Vorliegen spezifischer DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen. Alle offenbarten Oligonukleotide sind in revers komplementärer Orientierung auch als Primer für eine reverse Transkription von mRNA einsetzbar.

Zur Detektion weisen die Nukleinsäuren und Oligonukleotide bevorzugt eine Markierung auf. Beispiele hierfür sind eine radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder Markierung mit Alkalischer Phosphatase. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegen die Oligonukleotide an eine Festphasenmatrix gebunden vor. Weitere chemische Modifikationen der Nukleinsäuren und Oligonukleotide sind möglich, um beispielsweise die PCR- Verfahren, Hybridisierungsverfahren usw. zu erleichtern. Derartige Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt.

Insbesondere geeignet sind die erfindungsgemäßen Oligonukleotide in Nachweisverfahren wie einer Polymerase Kettenreaktion (PCR), einer Reversen Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), einer in situ PCR, einem Dot Blot, einem Northern Blot, einem Reverse Northern Blot, einer in situ Hybridisierung, einem Differential Display oder einem Southern Blot.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der wie oben beschriebenen Oligonukleotide als Marker in Transformations- und/oder Züchtungsverfahren.

Hierdurch wird es in vorteilhafter Weise möglich, bei einem Züchtungsverfahren von Vitis vinifera, das die Bereitstellung von z. B. gegen Trockenheit widerstandsfähigeren Pflanzen zum Ziel hat, mittels derartiger genetischer Marker Aussagen treffen zu können, die andernfalls erst durch einen Test der Pflanzen unter den jeweiligen Wuchsbedingungen möglich ist. Dadurch kann das Züchtungsverfahren schneller und wirtschaftlicher zum Erfolg gebracht werden.

Bei den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren und Amplifikationsverfahren wird die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe entweder direkt aus der Pflanzenzelle isoliert oder die Pflanzenzellen werden in geeigneter Weise aufgeschlossen oder durchlässig gemacht, so daß ein direkter Kontakt der Primer und Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Proben ermöglicht wird, ohne daß vorher umfangreiche und zeitraubende Reinigungsprozeduren durchgeführt werden müssen. So sind die Oligonukleotide der Erfindung in einer Ausführungsform auch bei in situ-Hybridisierungen und in situ-PCR- Verfahren einsetzbar. Selbstverständlich ist die Anwendung nicht nur auf Pflanzenzellen beschränkt, sondern ist auf alle Zellen anwendbar, die auf das Vorliegen von Aquaporin- Genen oder -Fragmenten oder die Expression von Aquaporinen, jeweils aus Vitis vinifera, untersucht werden sollen.

Bei der Hybridisierung sind Reaktionspuffer und Waschpuffer aus folgenden funktionellen Komponenten zusammengesetzt:

a) Puffersystem zur Einstellung und Stabilisierung des pH-Wertes zwischen 7 und 8 (z. B. Tris/HCl oder Citrat-Puffer).
b) Wasser als 'Lösungsmittel'.
c) Eventuell Chelatbildner, die bei niedrigen Konzentrationen monovalenter Kationen den Einfluß zweiwertiger Kationen (z. B. Ca²⁺), die als Verunreinigung in Chemikalien enthalten sein können, verhindern. Wird insbesondere im Waschpuffer eingesetzt.
d) Detergenz zur Erniedrigung der Oberflächenspannung von wäßrigen Lösungen.
e) Nichtionische, aprotische Verbindungen (z. B. Formamid) schwächen die Bindungs energie von Nukleinsäure-Duplexmolekülen.
f) Salz (funktionelle Einheit sind Kationen, die die negativen Ladungen der Nukleinsäure- Phosphatgruppen neutralisieren und dadurch die Duplexbildung von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren erleichtern (z. B. Na⁺ in NaCl).

Z. B. haben die folgenden Faktoren Einfluß auf das Zustandekommen von spezifischen Hybriden aus den Nukleinsäuren und den hieraus abgeleiteten Oligonukleotiden mit dem Zielmolekül:

Die Komponenten e) und f) beeinflussen die Bindungsstärken von Nukleinsäure- Duplexmolekülen. Erhöhung der monovalenten Kationen in der Reaktions- bzw. Waschlösung stabilisiert die gebildeten Duplexmoleküle, während mit zunehmendem Gehalt an z. B. Formamid die Duplexbindungen geschwächt werden.

Eine geeignete Nukleinsäure- bzw. Oligonukleotidkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden (je höher die Temperatur, um so schwächer die Bindung der Hybride).

Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen versteht man die Reaktionsbedingungen (die richtige Wahl der vier Faktoren), unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Oligonukleotiden und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird.

Unter stringenten Reaktionsbedingungen für Oligonukleotide wird beispielsweise eine Hybridisierungstemperatur von ca. 5-10°C unter dem jeweiligen Oligonukleotidschmelzpunkt verstanden. Die Stabilität der DNA/DNA- oder RNA/DNA- Hybriden muß selbst bei niedrigen Salzkonzentrationen entsprechend 0,1 × SSC/0,5% SDS gewährleistet sein. Auf diese Weise kann der Ablauf unerwünschter Kreuzreaktionen mit anderen Genen verhindert werden. Die jeweiligen Temperaturbedingungen können jedoch in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Nukleinsäure-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts kann beispielsweise durch Autoradiographie im Falle radioaktiv markierter Primermoleküle oder durch Fluorimetrie bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden erfolgen.

Der Fachmann kann in an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungsverfahren anpassen, um tatsächlich stringente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermöglichen. Geeignete Stringenzbedingungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Oligonukleotide als Vorwärts- und Rückwärts-Primer für eine PCR-Reaktion eingesetzt.

Das PCR-Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Material sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt werden. Ein Beispiel für eine PCR ist wie folgt:

- Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Probe bei 94°C mindestens 2 Minuten lang;
- Bindung der als Primer fungierenden Oligonukleotide 1 Minute lang bei ca. 50°C an die beiden komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA;
- zweiminütige Verlängerungsreaktion der einzelnen Primer entlang der DNA-Matrize bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxyribonukleosidtriphosphaten mittels einer thermostabilen DNA-Polymerase;
- 30 bis 40 Reaktionszyklen jeweils bestehend aus: DNA-Denaturierung bei 94°C (30 Sekunden lang), gefolgt von Primerbindung bei 60°C (1 Minute lang), und Primerverlängerung bei 72°C (30 Sek. lang);
- Endreaktion zur Auffüllung der beiden 3'-Enden am Reaktionsprodukt bei 72°C (ca. 5-8 Minuten lang).

Die jeweiligen PCR-Bedingungen werden vom Fachmann anhand bekannter Vorschriften bestimmt. So werden die Hybridisierungstemperaturen/Annealingtemperaturen für die PCR aus der Länge und der Sequenz der Oligonukleotide nach dem Fachmann bekannten Algorithmen berechnet. Beispielsweise wurden für die in SEQ ID NO 8-21 angegebenen Nukleinsäuren (Oligonukleotide) und ihre komplementären Formen eine Hybridisierungstemperatur von 55°C für 30 Sek. (typisch für kurze Fragmente) eingesetzt. Die initiale Denaturierung erfolgt beispielsweise bei 94°C für 2 Minuten, wobei diese Bedingungen selbstverständlich in Abhängigkeit von den verwendeten Nukleinsäuren variierbar sind; so kann die Temperatur beispielsweise auch bei 95°C oder darüber liegen und/oder die Denaturierungszeiten können länger sein. Während der Zyklen werden bevorzugt 30 Sekunden lang denaturiert. Die Polymerisationszeit, bevorzugt bei 72°C, liegt bei bevorzugt 30 Sek., da es sich bei den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO 8-21 um relativ kurze DNA-Fragmente handelt.

In Abhängigkeit von der Länge und der Zusammensetzung der Nukleinsäuren müssen die Bedingungen angepaßt werden.

Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primersequenzen entstandenen, charakteristischen, spezies-spezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gelelektrophoretisch oder fluorimetrisch unter Verwendung fluoreszenz markierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar.

In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Sonden mit der zu untersuchenden DNA- oder RNA-Probe zur Hybridisierung gebracht, wobei stringente Hybridisierungsbedingungen gewählt werden. Stringente Bedingungen müssen für die jeweilige Anwendung empirisch ermittelt werden. Die vorstehend beschriebenen Bedingungen können als Anhaltspunkte dienen.

Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe kann sowohl bei der PCR-Reaktion bzw. RT-PCR als auch bei der Hybridisierungsreaktion entweder in extrahierter Form vorliegen oder in Form von komplexen Gemischen, bei denen die zu untersuchende DNA oder RNA nur einen sehr kleinen Anteil an der Fraktion der speziellen biologischen Probe bildet. Die zu untersuchenden Zellen können somit entweder in gereinigter Form vorliegen oder beispielsweise "verunreinigt" im Gewebeverband. Sowohl in situ PCR oder in situ RT-PCR sind mit den hier beschriebenen Oligonukleotiden durchführbar.

Zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Aquaporin-Genen und ihrer Expression durch die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Oligonukleotide können aus dem Stand der Technik bekannte Strategien eingesetzt werden, um beispielsweise eine gewebespezifische, stressabhängige oder kultivarspezifische Expression festzustellen.

Beispiele hierfür sind:

a) RT-PCR

Die Oligonukleotide der Erfindung werden zur PCR-Ampliflkation von Fragmenten an cDNA Matrizen eingesetzt, die nach einer reversen Transkription mit oligo(dT) oder mit diesen Oligonukleotiden am 3'-Ende erzeugt werden. Die Expression kann dann qualitativ, in Verbindung mit geeigneten Standards und Techniken, wie einem internen Standard und einer quantitativen PCR, auch quantitativ ausgewertet werden.

b) DOT Blot/Microarray Reverser Northern

Die von den Nukleinsäuren der Erfindung abgeleiteten Fragmente, die beispielsweise als DNA, RNA oder PNA vorliegen können, inbesondere in Form von Oligonukleotiden, werden als Sonden auf Dot Blots oder DNA Microarrays zur qualitativen und/oder quantitativen Analyse der Expression der Aquaporin-Gene aus Vitis vinifera eingesetzt. Unter PNA versteht man Nukleinsäuren, bei denen die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat und nicht wie üblich an ein Zucker-Phosphat-Rückgrat gekoppelt sind. Hierdurch werden eine höhere Stabilität und bessere Hybridisierungseigenschaften erzielt, und derartige PNA-Verbindungen sind insbesondere für Microarray-Analyseverfahren geeignet.

Die aus den in der vorliegenden Erfindung vorgestellten Nukleinsäuren abgeleiteten Fragmente, insbesondere deren Oligonukleotide, werden hierzu auf einen festen Träger synthetisiert und nach vorheriger Isolierung (beispielsweise über Amplifizierung nach Klonierung in einen Vektor oder, bevorzugt, über eine PCR-Reaktion) auf einen festen Träger, beispielsweise Glas, Nylon oder Nitrozellulose, aufgebracht.

Der Dot Blot und Microarray wird anschließend in einem reversen Northern-Experiment mit markierter cDNA hybridisiert, die aus RNA von Vitis-Pflanzen hergestellt wurde. Übliche Markierungen wie beispielsweise radioaktive Markierungen oder Fluoreszenzmarkierungen sind hierzu einsetzbar. Damit ist die Messung und der Vergleich der Transkription der durch die Nukleinsäuren definierten Vitis-Aquaporine möglich. Diese Verfahren können zur Analyse des Wachstumszustandes und der Wachstumsbedingungen von Vitis-Pflanzen, bevorzugt unter Wasser-limitierenden Bedingungen, eingesetzt werden, oder auch zum Vergleich von verschiedenen Vitis-Kultivaren.

Die Herstellung der Oligonukleotide der Erfindung erfolgt in an sich üblicher und bekannter Weise. Die Sonden können beispielsweise in Vektoren insertiert werden und nach Vermehrung wieder herausgeschnitten werden, sie können als Matrize durch PCR oder auch synthetisch hergestellt werden. Auch eine Herstellung in Form von z. B. PNA (Peptide based nucleic acid) oder derivatisierte Nukleinsäuren, um die Stabilität, die Hybridisierungseigenschaften oder Bindungseigenschaften an feste Träger zu verändern, ist möglich.

Die hier vorgestellten Oligonukleotide können zu einem quantitativen und qualitativen Nachweis von Aquaporin-Genen und ihrer Expression aus Vitis vinifera benutzt werden und dann mit Eigenschaften wie der Trockentoleranz und/oder der Salztoleranz der Kultivaren korreliert werden. Damit können diese Merkmale auch in Züchtungsprogrammen verfolgt werden.

Die in der vorliegenden Patentanmeldung beanspruchten Nukleinsäuren und die von diesen abgeleiteten Derivate, insbesondere auch deren Fragmente und Oligonukleotide, wurden durch die Sequenzierung vollständiger cDNA Klone (SEQ ID NO 29-35) von Aquaporin- Genen aus Vitis vinifera abgeleitet. Hierzu wurden Vitis vinifera cDNA-Fragmente verwendet, um eine Vitis vinifera cDNA-Bibliothek zu durchmustern. Diese Sonden wurden mittels einer RT-PCR-Reaktion unter Verwendung von degenerierten Primern erhalten, die gegen konservierte Regionen von Pflanzengenen gerichtet waren, die für TIP oder PIP kodieren. Es wurden 7 vollständige Nukleinsäuren isoliert, die im anliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO 29-35 dargestellt sind. Die spezifischen Sonden wurden nach Vergleich dieser Sequenzen von 3'-Endsequenzen abgeleitet. Die in SEQ ID NO 8-21 dargestellten Oligonukleotide wurden zur Quantifizierung der Transkripte der zugehörigen Aquaporin-Gene aus Vitis vinifera eingesetzt. Hierzu wurde entweder eine RT- oder eine PCR- oder eine Dot Blot-Analyse mit PCR-Fragmenten, die die gesamten, in SEQ ID NO 1-7 dargestellten Nukleinsäuresequenzen abdecken, eingesetzt. Die Spezifität der Sonden begründet sich dabei auf folgende Beobachtungen:

- In allen Fällen wurde nur ein einzelnes PCR-Produkt amplifiziert;
- alle PCR-Produkte besaßen die aus den Gensequenzen vorhergesagten Größen, z. B. 160 bp für SEQ ID NO 1.

Alternativ zu diesen PCR-Fragmenten, die die gesamte Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO 1-7 abdecken, können auch Fragmente hiervon nach Regeln, die dem Fachmann geläufig sind, abgeleitet und in PCR-Verfahren eingesetzt werden. Dies gilt ebenso für die Verwendung in Microarrays, bei denen Fragmente der hier vorgestellten Nukleinsäuren, insbesondere DNA-, RNA- und/oder DNA-Fragmente, beispielsweise Oligonukleotide, auf den Trägern fixiert oder hieran synthetisiert wurden.

Der Nachweis der Expression mittels Dot Blot/reverse Northern-Analyse wurde beispielsweise zur Bestimmung der Gewebespezifität der Expression in Wurzeln und Blättern der Aquaporine aus Vitis vinifera, wie sie in SEQ ID NO 29-35 dargestellt sind, zu untersuchen. Beispielsweise wurden zwei Mitglieder mittels RT-PCR analysiert, um Tagesrhythmen in der Expression zu untersuchen. Der Nachweis über RT-PCR wurde bevorzugt mit 0,2-0,4 µg Gesamt-RNA aus Vitis-Pflanzen nach reverser Transkription mit Oligo (dT) und 25-30 Zyklen bei der PCR-Amplifikation durchgeführt. Ebenso kann aber auch eine reverse Transkription direkt durch ein Oligonukleotid erfolgen, das spezifisch für Aquaporin-Gene aus Vitis vinifera ist.

Nachfolgend einige konkrete Beispiele zu Anwendungsmöglichkeiten der hier beschriebenen Nukleinsäuren und deren Fragmente.

Vitis Aquaporin Expression in verschiedenen Geweben

Es wurden Untersuchungen mit Hilfe reverser Northernhybridisierungen über Dotblots, die DNA der beanspruchten Sequenzen SEQ 1-7 enthielten, durchgeführt. Beispielhaft sind die Ergebnisse für 3 Gene gezeigt, also die Auswertung von jeweils einer Sonde nach Hybridisierung mit markierter cDNA, die an RNA aus den verschiedenen Geweben isoliert wurde:
Vitis PIP1-1 (SEQ1) (Abb. 1),
Vitis PIP2-1 (SEQ4) (Abb. 2),
Vitis TIP1 (SEQ6) (Abb. 3).

Sonden für die Gene Vitis GDH (Glutamate Dehydrogenase) und Vitis-malic (Malic Enzyme) wurden als nahezu konstitutive Vergleichswerte mitbestimmt.

Die gezeigten Beispiele weisen Vitis PIP1-1 als besonders in der Wurzel, hier wiederum in lateralen Wurzeln exprimiertes Gen aus, während PIP2-1 gleichmäßiger in allen untersuchten Geweben exprimiert wird. TIP1 wiederum ist präferentiell in der Wurzel und besonders in Wurzelspitzen exprimiert.

Die Sequenzen SEQ ID NO. 29-40 zeigen:
SEQ ID NO. 29: Vitis vinifera Plasma Membran intrinsisches Protein (Vitis PIP1-1), cDNA, vollständige Sequenz.
SEQ ID NO. 30: Proteinsequenz zu SEQ ID NO. 29.
SEQ ID NO. 31: Vollständige cDNA von Vitis MIP 1 Protein. Mögliches Wassertunnelprotein. Arabidopsis PIP-1-ähnliches Protein (PIP1-2).
SEQ ID NO. 32: Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO. 31.
SEQ ID NO. 33: Vollständige cDNA von Vitis MIP1 Protein. Mögliches Wassertunnelprotein. Arabidopsis PIP1-ähnliches Protein. (Vitis PIP1-3).
SEQ ID NO. 34: Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO. 33.
SEQ ID NO. 35: Vollständige cDNA von Vitis MIP1 Protein; mögliches Wassertunnelprotein; Arabidopsis PIP-2 ähnliches Protein (Vitis PIP2-1).
SEQ ID NO. 36: Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO. 35.
SEQ ID NO. 37: Vollständige cDNA von Vitis MIP1 Protein. Mögliches Wassertunnelprotein. Arabidopsis PIP2-ähnliches Protein (PIP2-2).
SEQ ID NO. 38: Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO. 37.
SEQ ID NO. 39: TIP 1 aus Vitis vinifera.
SEQ ID NO. 40: TIP 2 aus Vitis vinifera.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nukleinsäuren zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Aquaporin-Genen, -Genfragmenten oder hiervon abgeleiteter RNA oder der Expression dieser Gene, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine der nachfolgenden Nukleinsäuren oder ihre komplementäre oder reverse oder revers-komplementäre Form oder eine Kombination hiervon sowie die hiervon abgeleitete RNA oder Derivate hiervon umfassen, die je spezifisch an für Aquaporin-Gene oder Genfragmente kodierende DNA oder hiervon abgeleitete RNA binden, wobei die Nukleinsäuren die Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 1-28 umfassen und sie jeweils spezifisch für Vitis vinifera sind.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Fragment mit mindestens 12 Nukleotiden, bevorzugt mit 12-50 Nukleotiden, ist.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat unter stringenten Bedingungen, insbesondere 0,2 × SSC (0,03 M NaCl, 0,003 M Natriumcitrat, pH 7) bei 50 bis 65°C, mit einer der Nukleinsäuren hybridisiert.

4. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Nukleotid hinzugefügt, deletiert und/oder ausgetauscht ist, wobei die spezifische Bindung an Aquaporin-Gene oder -Genfragmente von Vitis vinifera beibehalten bleibt.

5. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei oder drei oder vier der Nukleotide, zusammenhängend oder einzeln, an einem oder beiden Enden oder im Inneren der Oligonukleotide durch ein anderes Nukleotid ersetzt oder deletiert sind, wobei je die spezifische Bindung beibehalten bleibt.

6. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid chemisch modifiziert vorliegt.

7. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Markierung aufweist.

8. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung einer radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder Alkalische- Phosphatase-Markierung ist.

9. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Festphasenmatrix gebunden vorliegt.

10. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat gebunden vorliegen.

11. Verfahren zum spezifischen Nachweis oder zur Amplifikation von Aquaporin-Genen, Genfragmenten oder hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene mit den nachfolgenden Schritten:

- Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer zu untersuchenden Probe mit zumindest einer der Nukleinsäuren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche; und
- Nachweis der Hybridisierung der Nukleinsäuren mit der RNA oder DNA der Probe, um das Vorliegen Aquaporin-spezifischer DNA- und/oder RNA- Sequenzen aus Vitis vinifera aufzuzeigen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren als Primer in PCR-Verfahren oder als Sonden in Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden.

13. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß entweder

a) die zu untersuchende DNA in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Kontakt gebracht wird mit einer der Nukleinsäuren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und im Verlauf der PCR-Amplifikation durch Verlängerung der Nukleinsäuresequenzen (Primer-Sequenzen) ein charakteristisches DNA-Markerfragment entsteht und dieses Fragment nachgewiesen wird; oder
b) zumindest eine der Nukleinsäuren mit der zu untersuchenden DNA oder RNA zur Hybridisierung gebracht wird und das Produkt dieser Hybridisierungsreaktion nachgewiesen wird.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen unter stringenten Bedingungen erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die stringenten Bedingungen wie folgt definiert sind:
für eine Hybridisierung: 0,2 × SSC (0,03 M NaCl, 0,003 M Natriumcitrat, pH 7) bei 50 bis 65°C;
für PCR-Bedingungen:
Annealingbedingungen 55°C, 30 Sek.
Denaturierung: 94°C, 2 Min.
Zyklus-Denaturierung: 94°C, 30 Sek.
Polymerisation 72°C, 30 Sek.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder RNA in isolierter Form eingesetzt wird oder im biologischen Material in für die Hybridisierungsreaktion oder Polymerase-Ketten-Reaktion zugänglicher Form vorliegend eingesetzt wird.

17. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die zu untersuchende DNA denaturiert wird, um Einzelstränge zu erhalten;
b) die Nukleinsäure an den komplementären Einzelstrang der zu untersuchenden DNA gebunden wird;
c) die Nukleinsäure mittels einer DNA-Polymerase verlängert wird;
d) die Hitze-Denaturierungs-Oligonukleotid-Bindungs- und Verlängerungszyklen wiederholt werden, um eine nachweisbare Menge des PCR-Produkts zu erhalten; und
e) das erhaltene PCR-Produkt nachgewiesen wird.

18. Testkit zum Nachweis von Aquaporin-Genen und -Genfragmenten aus Vitis vinifera oder deren Expression, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest eine Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche enthält.

19. Mikroarray, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.

20. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zum spezifischen qualitativen und/oder quantitativen Nachweis oder zur Amplifikation von Aquaporin-Genen oder -Genfragmenten oder der Expression dieser Gene oder Fragmente aus Vitis vinifera.